UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS UNIDADE UNIVERSITÁRIA DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS CURSO DE BACHARELADO EM QUÍMICA INDUSTRIAL

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS UNIDADE UNIVERSITÁRIA DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS CURSO DE BACHARELADO EM QUÍMICA INDUSTRIAL GABRIELLA COSTA SIMULAÇÃO DO TEMPO DE VIDA DE PRATELEIRA PARA LEITES PROBIÓTICOS Anápolis GO Agosto 2014

2 GABRIELLA COSTA SIMULAÇÃO DO TEMPO DE VIDA DE PRATELEIRA PARA LEITES PROBIÓTICOS Trabalho de Curso II submetido ao corpo docente da Coordenação do Curso de Química Industrial da Universidade Estadual de Goiás como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Bacharel em Química Industrial. Orientador: Profº. Lauro Bernardino Coelho Junior Anápolis GO Agosto 2014

3 COSTA, Gabriella. Simulação do Tempo de Vida de Prateleira para Leites Probióticos. Simulação do Tempo de Vida de Prateleira para Leites Probióticos / Gabriella Costa TC (Graduação), Universidade Estadual de Goiás, Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, Anápolis, Orientador: Profº. Lauro Bernardino Coelho Junior. 1. Leites. 2. Probióticos. 3. Contagem. 4. ph. 5. Acidez. I. Ciências Exatas. II. Química Industrial.

4 GABRIELLA COSTA SIMULAÇÃO DO TEMPO DE VIDA DE PRATELEIRA PARA LEITES PROBIÓTICOS Trabalho de Curso submetido ao corpo docente da coordenação de curso de Química Industrial da Universidade Estadual de Goiás como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Bacharel em Química Industrial Aprovado em, de agosto de 2014 Profº. Lauro Bernardino Coelho Junior (orientador) Profª. Drª. Kelly Nobre Marra (membro) Profª. Ms. Suzana Maria Loures de Oliveira Marcionilio (membro)

5 AGRADECIMENTOS A Deus, por estar sempre comigo, sem Ele nada disso teria sido possível. A Universidade Estadual de Goiás, pela oportunidade. A minha mãe, pelo apoio incondicional, incentivo, carinho e orações. A minha irmã, pela compreensão, força e incentivo nos momentos mais difíceis. A minha avó, pela preocupação, paciência e pelas orações. Ao meu orientador, Professor Lauro Bernardino Coelho Junior pela oportunidade de desenvolver este trabalho e pela confiança em mim depositada. A banca examinadora pela disponibilidade em avaliar este trabalho. Ao meu namorado Eduardo pelo amor, paciência, carinho, apoio e incentivo incondicionais. Ao meu amigo Leyser por toda a ajuda, companheirismo, amizade e carinho. Ao meu amigo João Paulo por toda a ajuda, disponibilidade e amizade. Enfim, a todos os amigos e colegas que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.

6 RESUMO Este trabalho teve por finalidade desenvolver um modelo de simulador baseado em planilha eletrônica acessível e simplificada, no caso o Excel, para estimar o shelf-life de leites probióticos utilizando os dados experimentais obtidos através de estudos feitos e publicados com leites suplementados com microrganismos probióticos. Os microrganismos e/ou culturas mistas utilizados no simulador foram Streptoccus termophilus, Bifidobacterium longum e Lactobacilus acidophilus; Streptococcus termophilus, Bifidobacterium longum, Lactobacilus bulgaricos, Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium. breve; Streptococcus thermophilus, Lactobacilus bulcaricus, Lactobacilus acidophilus e Bifidobacterium; Lactobacilus casei e Bifidobacterium longum; e Lactobacilus acidophilus, Streptococcus thermophilus e Bifidobacterium bifidum. Os parâmetros levados em consideração foram a contagem microbiológica (UFC/mL), ph e acidez (% ácido láctico/100 ml) em relação aos dias. Com o simulador proposto pode-se predizer o shelf-life de leites probióticos levando em consideração a legislação que estabelece um número mínimo de células viáveis de 1 x 10 6 UFC.mL 1, ph maior que 4,0 e acidez entre 0,6 e 1,5 % para que o produto seja considerado probiótico. Assim, o desenvolvimento do simulador foi considerado satisfatório, pois mesmo com o pequeno número de dados utilizados pode-se ter uma visão clara do comportamento de leites probióticos durante o armazenamento refrigerado. Palavras chave: Leites, probióticos, vida de prateleira, simulador, contagem, ph, acidez.

7 ABSTRACT This essay aimed to develop a simulator model based on an accessible and simplified electronic spreadsheet, in this case Excel, to estimate probiotic milk shelf-life using experimental data obtained through performed and published studies with probiotic microorganisms supplemented milk. The microorganisms and/or mixed cultures ran by the simulator were Streptoccus termophilus, Bifidobacterium longum e Lactobacilus acidophilus; Streptococcus termophilus, Bifidobacterium longum, Lactobacilus bulgaricos, Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium. breve; Streptococcus thermophilus, Lactobacilus bulcaricus, Lactobacilus acidophilus e Bifidobacterium; Lactobacilus casei e Bifidobacterium longum; e Lactobacilus acidophilus, Streptococcus thermophilus e Bifidobacterium bifidum. The considered parameters were the microbiological count (UFC/mL), ph and acidity (% lactic acid/100 ml) related to those days. Using the presented simulator, we could predict the probiotic milk shelf-life considering that legislation establishes the minimum number of viable cells in 1 x 10 6 UFC.mL 1, ph higher than 4,0 and acidity between 0,6 and 1,5% in order to the product to be branded as probiotic. Therefore, the simulator development was considered satisfactory because even with such a small amount of used data, we could clearly see probiotic milk behavior while refrigerated storing. Key-words: Milk, probiotic, shelf-life, simulator, count, ph, acidity.

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Mecanismo de atuação dos probióticos Figura 2 - Gráficos que mostram benefícios relacionados ao consumo de leite fermentado Figura 3 - Equações ajustadas para cada parâmetro de cada cultura Figura 4 Simulador de contagem, ph e acidez em relação aos dias Figura 5 - Simulador de contagem, ph e acidez em relação aos dias Figura 6 - Simulador de contagem, ph e acidez em relação aos dias

9 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Características físico-químicas de leites fermentados Tabela 2 - Outras características físico-químicas de alguns leites fermentados Tabela 3 - Contagem de microrganismos específicos Tabela 4 - Análise estatística - Str. termophilus Tabela 5 - Análise estatística - B. longum Tabela 6 - Análise estatística - L. acidophilus Tabela 7 - Análise estatística Mistura 1(Str. Termophilus, B. longum, L. acidophilus) Tabela 8 - Análise estatística - Mistura 2 (Str. Termophilus, B. longum, L. bulgaricos, B. infantis, B. breve) Tabela 9 - Análise estatística - Mistura 3 (Str. Thermophilus, L. bulcaricus, L. acidophilus, Bifidobacterium) Tabela 10 - Análise estatística - Mistura 4 (L. casei, B. longum; T=5 C) Tabela 11 - Análise estatística - Mistura 5 (L. casei, B. longum; T=10 C) Tabela 12 - Análise estatística - Mistura 6 (L. acidophilus; Str. thermophilus e B. bifidum)... 38

10 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 - UFC/mL Exp. x UFC/mL Sim. - Str. termophilus 31 Gráfico 2 - ph Exp. x ph Sim. - Str. termophilus. 31 Gráfico 3 - % ácido láctico Exp. x % ácido láctico Sim. - Str. termophilus. 31 Gráfico 4 - UFC/mL Exp. x UFC/mL Sim. - B. longum. 31 Gráfico 5 - ph Exp. x ph Sim - B. longum. 31 Gráfico 6 - % ácido láctico Exp. x % ácido láctico Sim. - B.longum. 31 Gráfico 7 - UFC/mL Exp. x UFC/mL Sim. - L. acidophilus. 31 Gráfico 8 - ph Exp. x ph Sim - L. acidophilus 31 Gráfico 9 - % ácido láctico Exp. x % ácido láctico Sim. - L. acidophilus 31 Gráfico 10 - UFC/mL Exp. x UFC/mL Sim. - Mistura 32 Gráfico 11 - ph Exp. x ph Sim. - Mistura 32 Gráfico 12 - % ácido láctico Exp. x % ácido láctico Sim. - Mistura 32 Gráfico 13 - UFC/mL Exp. x UFC/mL Sim. - Mistura Gráfico 14 - ph Exp. x ph Sim. Mistura Gráfico 15 - UFC/mL Exp. x UFC/mL Sim. - Mist Gráfico 16 - ph Exp. x ph Sim. Mist Gráfico 17 - % ácido láctico Exp. x % ácido láctico Sim. - Mist Gráfico 18 - UFC/mL Exp. x UFC/mL Sim. - Mist Gráfico 19 - ph Exp. x ph Sim Mist Gráfico 20 - % ácido láctico Exp. x % ácido láctico Sim. - Mist Gráfico 21 - UFC/mL Exp. x UFC/mL Sim. - Mist Gráfico 22 - ph Exp. x ph Sim Mist Gráfico 23 - % ácido láctico Exp. x % ácido láctico Sim. - Mist Gráfico 24 - UFC/mL Exp. x UFC/mL Sim. - Mistura 6 38

11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO TEÓRICA E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA LEITES FERMENTADOS ORIGEM E DEFINIÇÃO LEITE FERMENTADO OU CULTIVADO E IOGURT LEGISLAÇÃO PROBIÓTICOS EMBALAGENS E SHELF-LIFE MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DO SHELF LIFE ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA ANÁLISE SENSORIAL ESTUDOS DA VIABILIDADE DE BACTÉRIAS PROBIÓTICAS DURANTE O SHELF-LIFE DE LEITES PROBIÓTICOS SIMULAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO PROPRIEDADES E VANTAGENS MODELAGEM LEGISLAÇÃO E ROTULAGEM MATERIAIS E MÉTODOS LEVANTAMENTO DE DADOS PUBLICADOS ELABORAÇÃO DA PLANILHA PARA SIMULAÇÃO VALIDAÇÃO DA PLANILHA DE SIMULAÇÃO RESULTADOS E DISCUSSÃO LEVANTAMENTO DE DADOS SIMULAÇÃO E COMPARAÇÃO ENTRE DADOS EXPERIMENTAIS COLETADOS E SIMULADOS CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 41

12 10 1 INTRODUÇÃO Os alimentos funcionais tiveram seu início primeiramente no Japão na década de 80. Desde então se notou um interesse contínuo e crescente nos alimentos que apresentam ingredientes ou substâncias funcionais, ou seja, aqueles que ajudam ou modulam o sistema fisiológico do organismo de modo a promover a saúde (GALLINA, 2011). Observa-se que com o aumento do envelhecimento os consumidores estão buscando produtos mais funcionais e dietas mais saudáveis, com isso, a indústria de alimentos apresenta a tendência de produção de alimentos com baixas calorias, mediante a substituição de açúcares por edulcorantes e/ou redução no seu teor de gordura como também a produção de iogurtes e leites funcionais e probióticos (ANTUNES et al., 2007). De acordo com estudos, o mercado brasileiro de produtos funcionais cresce cerca de 20% ao ano, sendo que os leites fermentados com bactérias ácido lácticas, como o iogurte, são importantes carreadores de probióticos. Esses leites fermentados constituem os produtos mais inovadores dentre os lácteos em termos de ingredientes funcionais e representam 80% do mercado de refrigerados. Estimativas mostram que o mercado global de iogurtes deverá superar 67 bilhões de dólares até 2015 (GALLINA, 2010). Segundo o Regulamento Técnico de Substâncias Bioativas e Probióticos Isolados com Alegação de Propriedades Funcionais e/ou de Saúde, Resolução RDC nº 2, de janeiro de 2002, entende-se por probióticos os microrganismos vivos capazes de melhorar o equilíbrio microbiano intestinal produzindo efeitos benéficos à saúde do indivíduo (BRASIL, 2008). Contudo, para garantir esse efeito benéfico torna-se necessário que o produto esteja dentro do seu prazo de validade. A vida de prateleira ou shelf life de um produto pode ser definida como o tempo decorrido entre a produção e a embalagem do produto até o ponto que este se torna inaceitável ao consumo e pode ser influenciada por diversos fatores (VALENTEI, 2013). Ela pode ser prevista através de estudos das condições de processo já descritas na literatura, como tempo de crescimento, inativação e sobrevivência dos microrganismos presentes no alimento. Desta maneira o objetivo deste trabalho será o de construir uma planilha que permita a simulação do tempo de vida de prateleira para leites probióticos, sendo esta uma ferramenta barata e rápida, através do software Excel, visando à otimização de processos que nos dias atuais é essencial para maximizar rendimentos, produtividade e viabilidade comercial, minimizando os custos de um produto com as especificações desejadas e que estão de acordo com a legislação vigente.

13 11 2 REVISÃO TEÓRICA E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 LEITES FERMENTADOS ORIGEM E DEFINIÇÃO Nenhum outro grupo ou categoria de alimentos é tão importante ou tem sido tão relacionado ao bem estar nutricional em todo o mundo quanto os produtos fermentados. Desde tempos remotos que a fermentação dos alimentos é um processo comumente utilizado tanto na conservação quanto na prevenção de doenças (FANI, 2013). Existem registros ancestrais do uso de fermentados pelos sumérios, babilônicos e egípcios e inscrições datadas de mais de 1000 anos a.c. do uso da soja fermentada pelos chineses. O leite fermentado, por exemplo, foi produzido pela primeira vez acidentalmente por nômades. O leite proveniente da ordenha era guardado em recipientes feitos de estômago de bode e ao ser submetido ao clima árido e seco da região da Eurásia resultou na proliferação de bactérias, as quais modificaram a estrutura daquele alimento, tornando-o sensorialmente atrativo para aqueles indivíduos (YILDIZ, 2010). Outra teoria sobre a origem vem da Turquia, onde o leite fresco era guardado em sacos feitos de pele de cabra. Os sacos eram transportados por camelos e em contato com o calor do corpo do animal favoreciam a multiplicação de bactérias lácticas, dessa forma o leite era transformado em iogurte (ROBERT, 2008). Abraão acreditava que sua longevidade estava associada ao consumo de leite fermentado. Cientistas, como Hipócrates, prescreviam o leite fermentado como remédio no tratamento de distúrbios estomacais e intestinais (CARNEIRO, 2012). A palavra fermentação se tornou popular antes dos estudos de Pasteur com vinhos, sendo definida como um processo no qual transformações químicas são realizadas em um substrato orgânico pela ação de enzimas produzidas por microrganismos. Portanto, a fermentação é um processo que causa alterações químicas, biológicas e enzimáticas nos alimentos que atuam no aparelho digestivo produzindo enzimas que facilitam a digestão correta dos alimentos, a absorção correta dos minerais como o ferro e o zinco e ativam a síntese de várias vitaminas. Além disso, também estimulam as defesas imunitárias, ajudando a tratar várias patologias e impedindo o aparecimento de outras (FANI, 2013).

14 12 Durante a fermentação, as proteínas, as gorduras e a lactose do leite sofrem hidrólise parcial, tornando o produto facilmente digerível, por isso pode ser considerado um agente regulador das funções digestivas (OLIVEIRA; SILVA, 2011). Graças às atividades dos organismos fermentadores muitos alimentos são produzidos com aroma e sabor característicos. Vários desses alimentos fermentados possuem uma vida útil consideravelmente maior do que a matéria-prima da qual foram feitos, além de serem mais estáveis (MARTINS, 2006). Durante o processo de fermentação ocorre mudanças nas características bioquímicas do alimento, como queda do ph e produção de ácidos orgânicos, sendo o ácido láctico o mais comum (REIS, 2013). Dentre os vários alimentos que vêm sendo utilizados como veículos para suplementação com microrganismos probióticos, os produtos lácteos fermentados constituem, sem dúvida, o principal. (GRANATO et al., 2010; ZARE et al., 2012) LEITE FERMENTADO OU CULTIVADO E IOGURT De acordo com a definição contida na legislação vigente, entende-se por leite fermentado ou cultivado o produto cuja fermentação se realiza com um ou vários dos seguintes cultivos: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium ssp, Streptococus salivarius subsp. thermophilus e/ou outras bactérias ácido-lácticas que, por sua atividade, contribuem para a determinação das características do produto final (BRASIL, 2007). Já o iogurte é uma forma de leite fermentado em que o açúcar foi transformado em ácido láctico devido à ação das bactérias Streptococcus salivarius subsp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (CODEX ALIMENTARIUS, 2011), podendo ser acrescido ou não de outras bactérias ácido-lácticas. Na fermentação do iogurte, inicialmente o Streptococcus thermophilus metaboliza a lactose produzindo ácido láctico, que diminui o ph favorecendo o crescimento dos lactobacilos. Por sua vez, o Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus libera, a partir da degradação de proteínas lácticas, diversos aminoácidos, que estimulam o crescimento do cocos. Sendo assim, uma bactéria favorece o desenvolvimento da outra (SIEUWERTS et al., 2010). Um dos primeiros países a consumir e divulgar o iogurte para o restante do mundo foi a Bulgária. Os primeiros iogurtes comerciais foram produzidos na França e na Espanha, em 1920 e nos Estados Unidos, em A partir da década de 60, com melhorias nas

15 13 técnicas de processamento e reconhecimento da qualidade nutritiva e função terapêutica, houve um aumento no consumo deste produto (RIBEIRO et al., 2010) LEGISLAÇÃO De acordo com a IDF (International Dairy Federation), o Codex Alimentarius (2011) e o Regulamento Técnico do Mercosul, de Identidade e Qualidade do Leite Fermentado, aprovado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento e pela Secretaria de Vigilância do Brasil, leites fermentados são produtos alimentícios a base de leite, pasteurizado ou esterilizado, de diferentes espécies (vaca, ovelha, cabra e, em alguns casos, búfalo e égua) que sofrem um processo fermentativo modificando suas propriedades sensoriais, resultante da ação de bactérias específicas, obtendo-se uma coagulação e diminuição do ph do leite. Podem ser adicionados ou não de outras substâncias alimentícias e de outros produtos lácteos para a fermentação láctica desde que estes não interfiram no processo de fermentação do leite e que sejam viáveis, ativos e abundantes no produto final durante o prazo de validade (BRASIL, 2007; LERAYER et al., 2002). Essa fermentação do leite pode ser realizada com um ou vários dos seguintes cultivos: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium spp., Streptococcus thermophilus e/ou outras bactérias ácido-lácticas que podem contribuir para a determinação das características do produto final (SACCARO, 2008). As principais normas internacionais e brasileiras relacionadas ao leite fermentado ou cultivado e ao iogurte são: com relação à viabilidade das culturas, em que considera-se que a microbiota bacteriana deve ser viável durante toda a estocagem do produto. Atualmente, a recomendação é com base na porção diária de microrganismos viáveis que devem ser ingeridos, sendo o mínimo estipulado de 10 8 a 10 9 UFC/100g, o que corresponde a uma dose diária (ANVISA, 2008). Ainda, com relação aos Critérios Analíticos a quantidade de gordura deve ser de pelo menos 3% em iogurtes integrais, entre 0,5% e 3% em iogurtes com pouca gordura, que são aqueles à base de leite semidesnatado, e até 0,5% em relação aos iogurtes sem gordura, que são à base de leite desnatado. O produto final deve possuir um conteúdo proteico de pelo menos 2,8%, valor que corresponde a 33% do conteúdo de sólidos totais no leite desnatado (STAND, 2011).

16 14 Quanto ao ácido láctico em leites fermentados recomenda-se um valor entre 0,6 e 1,5%. De acordo com algumas normas que utilizam o ph para expressar esse critério, este deve encontrar-se acima de 4,0 (IDF, 1997). Os leites fermentados também devem apresentar requisitos sensoriais, como cor branca, podendo variar se houver a adição de substâncias alimentícias e/ou corantes. O aspecto deve ser de consistência firme, pastosa, semi-sólida ou líquida. O odor e o sabor devem ser característicos, de acordo com a(s) substância(s) alimentícia(s) e/ou substância(s) aromatizante/saborizante(s) adicionadas (LERAYER et al., 2002) PROBIÓTICOS O termo probióticos foi utilizado pela primeira vez em 1965 por Lilly e Stillwell (ANTUNES et al., 2007) e é definido como conjunto de microrganismos vivos que administrados em quantidades adequadas exercem efeitos benéficos à fisiologia do hospedeiro, pela regulação da imunidade local e sistêmica e por melhorar o equilíbrio microbiano intestinal (GALLIMA, 2011). Um microrganismo é considerado probiótico se for habitante normal do trato gastrointestinal, sobreviver à passagem pelo estômago e mantiver sua viabilidade e atividade no intestino (COOK et al., 2012). Para ajudar na manutenção da funcionalidade desses microrganismos probióticos na limitada atividade proteolítica de bactérias probióticas sobre a caseína do leite, por exemplo, pode-se utilizar de fontes adicionais de nutrientes para a fermentação ou mesmo de outras culturas iniciadoras, também conhecidas como fermentativas ou starter (GRANATO et al., 2010; ZARE et al., 2012). Aqui cabe ressaltar que há uma distinção entre culturas probióticas e culturas iniciadoras. Para as culturas serem denominadas probióticas é essencial que sejam comprovados os seus benefícios à saúde, enquanto que uma cultura iniciadora é aquela capaz de fermentar alimentos. Sendo assim, nem toda cultura iniciadora é probiótica e, portanto, nem todo alimento fermentado deve ser considerado probiótico (SANDERS, 2009). A influência benéfica dos probióticos sobre a microbiota intestinal inclui fatores como efeitos imunológicos ao estimular a multiplicação de bactérias benéficas contra a proliferação de bactérias prejudiciais, reforçando os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro, sendo assim há um aumento da resistência contra microrganismos patogênicos, o que os tornam importantes na prevenção e tratamento de infecções e restauração do equilíbrio

17 15 da mucosa intestinal; e efeito baseado na eliminação de produtos resultantes do metabolismo microbiano, como toxinas, o que resulta na desintoxicação do intestino de quem os consome (OELSCHLAEGE, 2010). Além disso, essa microbiota desejável pode auxiliar na manutenção da saúde ao impedir que compostos aminados indesejáveis sejam reabsorvidos e biodisponibilizando minerais como cálcio, ferro e outros nutrientes, diminuindo a incidência de doenças coronárias e ajudando a digestão; também pode estimular o sistema imunológico e atividades antitumorogênica e antimutagênica (COOK et al., 2012). Para garantir um efeito contínuo no organismo humano os alimentos probióticos devem ser ingeridos diariamente. Atualmente, a recomendação feita pela Comissão Tecnocientífica de Assessoramento em Alimentos Funcionais e Novos Alimentos, instituída junto à Câmara Técnica de Alimentos (BRASIL, 1999) é com base na porção diária de microrganismos viáveis que devem ser ingeridos, sendo o mínimo estipulado de 10 8 a 10 9 unidades formadoras de colônias (UFC) dia -1 (BRASIL, 2008). No entanto, existem fatores que afetam de forma negativa a viabilidade dos probióticos, e estes têm sido relatados em produtos lácteos fermentados, incluindo a acidez titulável, o valor de ph, a concentração de oxigênio dissolvido, temperatura de armazenamento, a interação com outros microrganismos contidos nos produtos, a concentração de ácido láctico e acético, além da concentração de proteínas (CASTRO- CISLAGHI et al., 2012). Por exemplo, pesquisas mostram que uma alta percentagem de lactobacilos vivos não resiste ao transporte e à estocagem, nem ao ácido gástrico no estômago, sendo que a sobrevivência é essencial para que esses microrganismos consigam atingir e povoar o intestino humano, só assim as bactérias probióticas conseguem promover benefícios para a saúde do hospedeiro (ANAL; SINGH, 2007; CHAMPAGNE et al., 2011). Contudo, diferentes técnicas para aumentar a resistência desses microrganismos contra condições adversas têm sido propostas, incluindo a seleção adequada em presença do ácido estomacal e de cepas resistentes à bile, adaptação ao estresse, incorporação de micronutrientes, como peptídeos e aminoácidos, e a microencapsulação (FÁVARO- TRINDADE et al., 2008; BRINQUES; AYUB, 2011; CHAMPAGNE et al., 2011). Dente os vários gêneros bacterianos e algumas leveduras utilizados como microrganismos probióticos (MENEZES; DURRANT, 2008), os principais são pertencentes aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium, que fazem parte da microbiota do intestino humano (COOK et al., 2012).

18 16 De modo geral, os lactobacilos podem ajudar na digestão da lactose em indivíduos com intolerância a esse dissacarídeo, reduzir a constipação e a diarreia infantil; ajudar na resistência a infecções por salmonela e aliviar a síndrome do intestino irritável. Já as bifidobactérias podem estimular o sistema imunológico, produzir vitamina B, inibir a multiplicação de patógenos ao proporcionar uma competição por espaço e nutrientes com outros microrganismos de gêneros menos desejáveis, reduzir a concentração de amônia e colesterol no sangue e ajudar a restabelecer a microbiota normal após tratamento com antibióticos (MANNING; GIBSON, 2004; PICARD et al., 2005; LEAHY et al., 2005; NOVIK et al., 2006). A Figura 2 mostra o destino dos probióticos no organismo humano e os seus principais mecanismos de atuação. Figura 1 - Mecanismo de atuação dos probióticos. Fonte: Adaptado de FANI (2013) De acordo com a empresa Yakult, por exemplo, os leites fermentados aumentam a quantidade os microrganismos que fazem bem e diminuem os que fazem mal ao organismo. Pela ação do ácido láctico produzido pelos Lactobaccilus casei, o ambiente intestinal se torna levemente ácido, dificultando o surgimento de bactérias nocivas e favorecendo o crescimento dos microrganismos benéficos. Na Figura 3 observa-se que o gráfico 1 mostra a contagem de bifidobactérias benéficas antes e após a ingestão de Lactobacillus casei; já o gráfico 2 mostra a contagem de bactérias nocivas representada pelos coliformes; o gráfico 3 mostra o resultado

19 17 de uma pesquisa na qual os voluntários, após consumirem o leite fermentado, apresentaram os níveis da toxina Indican 30% menor se comparado ao nível anterior, ou seja, diminuiu a quantidade de toxina liberada pelas bactérias nocivas e o gráfico 4 mostra a queda dos níveis de p-cresol, outro tipo de metabólito produzido pelas bactérias nocivas que pode dar origem a substâncias cancerígenas no organismo, após o consumo da bebida (YAKULT, 2013). Figura 2 - Gráficos que mostram benefícios relacionados ao consumo de leite fermentado. Fonte: Adaptado de FANI (2013) 2.2 EMBALAGENS E SHELF-LIFE. A vida útil dos alimentos não é determinada apenas pelo desenvolvimento de microrganismos indesejáveis, mas também pela degradação físico-química por fatores como oxigênio e luz. Por isso, a embalagem deve apresentar boas propriedades de barreira que garantam uma maior vida de prateleira do alimento e permita que haja tempo para sua distribuição e consumo. Logicamente esse aumento das propriedades de barreira leva ao aumento do custo da embalagem final e, por isso, essas propriedades devem ser corretamente

20 18 dimensionadas, levando-se em consideração o custo, vida útil, segurança, praticidade e tendências de mercado (TRIBST, 2010). Sabe-se que as bifidobactérias necessitam de condições anaeróbias para seu desenvolvimento, porém pode ser que durante a fabricação e a estocagem das bebidas lácteas em copos plásticos de polietileno, esta condição não seja alcançada satisfatoriamente. O uso de equipamentos de desaeração e de culturas mistas com Streptococcus thermophilus na produção de iogurtes favorece o atendimento desta condição. O Streptococcus thermophilus tem uma maior habilidade em utilizar o oxigênio. A utilização de embalagens de vidro no lugar das de polietileno e poliestireno também é preferível, já que estas últimas não são barreiras ao oxigênio. A seleção de espécies de bifidobactérias tolerantes ao oxigênio pode ser também uma solução para minimizar o efeito adverso deste gás em bioprodutos fermentados contendo Bifidobacterium e Lactobacillus acidophilus (ARUNACHALAM, 1999). Uma forma de aumentar a viabilidade desses microrganismos probióticos é através do prévio tratamento térmico dos leites que pode estender sua vida útil por alguns dias ou meses. Assim, a escolha da embalagem deve ser compatível com o tempo de armazenamento, considerando-se as propriedades de barreira de cada material e as condições de exposição do alimento durante a estocagem. A embalagem de vidro é considerada inerte e boa barreira aos gases, porém é necessária a adição de filtro de UV ou a pigmentação da garrafa, já que esta não apresenta proteção natural para a luz (KAREL; LUND, 2003). Além disso, seu sistema de fechamento envolve outros materiais (tampas metálicas ou plásticas) que também precisam apresentar características adequadas para essa finalidade (BOARD et al., 2001). As embalagens metálicas constituem boa barreira, especialmente, com relação à barreira aos gases, mas apresentam a recravação e a solda como pontos críticos. Deve-se considerar também a possível interação alimento-embalagem que pode causar a migração de compostos tóxicos ou o ataque da embalagem pela ação dos alimentos ácidos que podem reduzir significativamente a vida útil do produto embalado (KAREL; LUND, 2003). Já as embalagens plásticas apresentam propriedades de barreiras inferiores, tanto ao vapor de água como ao oxigênio, quando comparadas com as metálicas ou de vidro, sendo muitas vezes necessário combinar dois ou mais materiais para se obter valores de permeabilidade adequados à conservação de alimentos. As embalagens plásticas também são passíveis de apresentar permeabilidade a outros compostos orgânicos voláteis, como os aromas, que podem ser transferidos tanto do meio externo como do alimento para o meio externo. Em ambos os casos ocorre rápida deterioração do produto, motivo pelo qual a

21 19 embalagem também deve oferecer barreira para esses compostos (SARANTÓPOULOS, 1998). 2.3 MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DO SHELF LIFE O shelf life dos alimentos pode ser definido como o tempo decorrido entre a produção e a embalagem do produto até o ponto que este se torna inaceitável ao consumo e pode ser influenciada por diversos fatores, tais como as condições de processamento, tipo de embalagem, carga microbiana inicial, tempo e temperatura de armazenamento. Ela pode ser prevista através de estudos das condições de processo já descritas na literatura, como tempo de crescimento, inativação e sobrevivência dos microrganismos presentes no alimento e é influenciada por diversos fatores, dentre eles destacam-se as condições de processamento, tipo de embalagem, carga microbiana inicial, tempo e temperatura de armazenamento (VALENTEI, 2013). De um modo geral, as alterações microbiológicas são muito importantes para produtos que possuem pequeno tempo de shelf life e as alterações químicas e sensoriais são mais importantes para os produtos com médio e longo tempo de shelf life. Assim sendo, existem meios utilizados pelos produtores para prever a data final do período de armazenamento. Muitas das características sensoriais acabam por se deteriorar durante o armazenamento e é por isso uma área bem crítica, mesmo assim, uma grande variação pode ser tolerada pelos consumidores, desde que permaneçam seguros (FANI, 2011) ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA Segundo Damin et al (2009) o controle de ph é muito importante no processo de fermentação, pois a separação do soro está diretamente relacionada com esse parâmetro. A adição de um inóculo constituído por cultura mista probiótica contendo Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium animalis e Lactobacillus acidophilus favoreceu o produto nesse parâmetro por não apresentar Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, uma das bactérias do iogurte responsáveis pela produção de ácido láctico durante o resfriamento e o armazenamento refrigerado (pós-acidificação) do produto. Um estudo feito por Dualdo et al (2010) com iogurte sabor morango, verificou-se queda nos valores de ph relacionada, entre outros fatores, à presença de Lactobacillus bulgaricus, evidenciando sua característica.

22 20 Os valores de ph e acidez são importantes também na apresentação visual do produto final durante sua conservação em baixas temperaturas. Deve-se evitar, através de um rigoroso controle, que haja possíveis separações de fases, alterações indesejáveis nas características sensoriais do produto final e elevada acidez, que é influenciada pelo tempo de fermentação (BARBOSA et al, 2010; THAMER; PENNA, 2006). Com o decaimento do ph a viabilidade da microflora probiótica em produtos lácteos fermentados é afetada, de forma a observar-se uma redução nas contagens de células viáveis de Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium durante o armazenamento refrigerado (COSTA, 2013). A acidez também é um parâmetro que exerce muita influência na qualidade de produtos lácteos fermentados e um dos principais fatores que limita sua aceitação. Quanto menor for a acidez maior será a aceitabilidade do produto pelos consumidores. A produção de ácido láctico, característica de produtos fermentados, desestabiliza as micelas de caseína e ajuda na formação de gel, além de proporcionar o sabor característico e acentuar o aroma do produto. O teor de sólidos totais também influencia na acidez titulável e no tempo de coagulação (THAMER; PENNA, 2006). Segundo o manual para a fabricação de leites fermentados, Manual Ritter, que segue a resolução GMC 47/97 aprovado no Subgrupo 3 do MERCOSUL, em novembro de 1997, regulamentada tanto no Brasil como nos outros países integrantes do MERCOSUL, em relação aos leites fermentados a serem comercializados, estes devem possuir as características físico-químicas indicadas nas Tabelas 1 e 2 (MANUAL, 2004). Tabela 1 - Características físico-químicas de leites fermentados. Matéria gorda láctea Acidez Proteínas lácteas PRODUTO (g/100g) (g de ácido láctico/100g) (g/100 g) (*) Norma FIL 116 A: 1997 (*) Norma FIL 150: 1991 Com creme Min. 6,0 0,6 a 2,0 Min. 2,9 Integral 3,0 a 5,9 0,6 a 2,0 Min. 2,9 Parcialmente desnatado 0,6 a 2,9 0,6 a 2,0 Min. 2,9 Desnatado Max. 0,5 0,6 a 2,0 Min. 2,9 (*) Os leites fermentados com agregados, açucarados e/ou saborizados poderão ter conteúdo de matéria gorda e proteínas inferiores, não devendo reduzir-se a uma proporção maior do que a porcentagem de substâncias alimentícias não lácteas, açúcares acompanhados de glicídios (exceto polissacarídeos e polialcoóis) e/ou amidos modificados e/ou maltdextrina e/ou aromatizante / saborizante adicionados. Ainda dentro das características

23 21 físico-químicas os leites fermentados considerados no regulamento em questão deverão cumprir em particular os requisitos apresentados na tabela 2. Fonte: MANUAL (2004). Tabela 2 - Outras características físico-químicas de alguns leites fermentados. PRODUTO Acidez (g de ácido láctico/100g) Norma FIL 150: 1991 Etanol (% v/m) Iogurte 0,6 a 1,5 - Leite cultivado ou fermentado 0,6 a 2,0 - Leite acidófilo ou acidofilado 0,6 a 2,0 - Fonte: MANUAL (2004) ANÁLISE MICROBIOLÓGICA A resolução GMC 47/97 também diz que os leites fermentados a serem comercializados devem possuir a contagem de microrganismos específicos indicados na Tabela 3. Marques (2013) determinou a cor, o ph, fez análises de acidez titulável e ainda analisou microbiologicamente 11 formulações de uma bebida láctea fermentada à base de soro lácteo e café solúvel com atividade probiótica ao longo de 28 dias de seu armazenamento. As formulações avaliadas atenderam aos requisitos estabelecidos pela legislação brasileira (BRASIL, 2007). Os valores de ph encontrados no trabalho de Marques (2013) assemelham-se aos encontrados no trabalho de Thamer (2006) que ficaram entre 4,72 e 4,83; os valores de acidez foram baixos e não foram reveladas contaminações por microrganismos dos grupos de coliformes, fungos filamentosos e leveduras. Além disso, verificou-se em média contagens de células viáveis dos probióticos entre 10 8 e 10 9 UFC/mL para Lactobacillus acidophillus e Bifidobacterium animalis no produto fresco.

24 22 Tabela 3 - Contagem de microrganismos específicos. Contagem de bactérias Contagem de leveduras PRODUTO lácticas totais (UFC/g) Norma específicas (UFC/g) Norma FIL 117: 1988 FIL 94B: 1990 Iogurte Min (*) - Leite cultivado ou fermentado Min (*) - Leite acidófilo ou acidofilado Min (*) - (*) No caso em que se mencione o uso de bifidobactérias, a contagem será de no mínimo 10 6 UFC de Bifidobactérias/g. Fonte: MANUAL (2004) ANÁLISE SENSORIAL A Associação Brasileira de Normas Técnicas ABNT NBR define análise sensorial como uma disciplina científica usada para evocar, medir, analisar e interpretar reações das características dos alimentos e materiais como são percebidas pelos sentidos da visão, olfato, gosto, tato e audição (ABNT, 1993a). A NBR 12994, que classifica os métodos de análise sensorial dos alimentos e bebidas em discriminativos, descritivos e subjetivos. Os métodos discriminativos são de fácil interpretação, requerem pouco tempo e estabelecem diferenciação qualitativa e/ou quantitativa entre as amostras. Os métodos descritivos podem ser testes de avaliação de atributos (por meio de escalas), perfil de sabor, perfil de textura, análise descritiva quantitativa - ADQ e teste de tempo-intensidade (ABNT, 1993b). Nos testes descritivos procura-se definir as propriedades do alimento e medi-las da maneira mais objetiva possível. Os métodos subjetivos expressam a opinião do consumidor em relação ao produto. Em trabalho com a avaliação sensorial, microbiológica e de pós-acidificação durante a vida de prateleira de leites fermentados contendo Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum e Lactobacillus acidophilus, Zacarchenco et al. (2004) realizaram avaliação dos atributos sensoriais de sabor e acidez de cada produto utilizando-se equipe de provadores composta por 35 consumidores potenciais durante o armazenamento dos produtos, utilizando escala hedônica estruturada de 9 pontos, sendo verificado ao final de 21 dias de armazenamento a 4ºC a possível elaboração da bebida láctea probiótica e a viabilidade de Bifidobacterium longum e Lactobacillus acidophilus.

25 23 Ramos et al. (2013) avaliaram sensorialmente e caracterizaram as formulações de bebidas lácteas fermentadas com Bifidobacterium bifidum e Lactobacillus acidophilus sabor cajá quanto a composição centesimal e vida de prateleira a partir de análises físico-químicas, qualidade microbiológica e crescimento de bactérias lácticas, utilizando escala hedônica estruturada de 9 pontos, sendo as bebidas lácteas produzidas com 15, 20 e 25% de polpa de cajá e 40% de soro de leite ao final de 28 dias de armazenamento refrigerado aceita pelos consumidores por apresentaram resultados satisfatórios quanto à composição centesimal de acordo com a legislação vigente. Cruz et al. (2011) em estudo com iogurte probiótico adicionado de glicose oxidase realizaram um teste de aceitação, por meio de uma escala hedônica estruturada de 9 pontos, em relação aos atributos aparência, aroma, sabor, textura e impressão global de todos os produtos no 15º dia de armazenamento refrigerado, tendo as médias de aceitação variado entre os termos hedônicos não gostou nem desgostou e gostou moderadamente. 2.4 ESTUDOS DA VIABILIDADE DE BACTÉRIAS PROBIÓTICAS DURANTE O SHELF-LIFE DE LEITES PROBIÓTICOS. Gallina et al. (2011) avaliaram, quanto aos parâmetros de ph e viabilidade de formulações, leites elaborados com a adição de uma mistura contendo St. thermophilus + Lb. bulgaricus + Bifidobacterium ssp com e sem fosfooligosacarídeo (FOS) após 1, 7, 15, 21 e 28 dias. A variação de ph inicial dos produtos foi de 4,42 a 4,37 e final de 4,21 a 4,13. Observou-se que os leites fermentados estavam em conformidade com a legislação vigente, em termos de acidez (0,75-0,78g de ácido lático/100g). Nos leites fermentados contendo probióticos e sem a adição de FOS, a contagem se manteve adequada dentro dos limites estabelecidos pela legislação (10 6 UFC/g) até 15 dias. Já nos leites fermentados contendo probióticos e FOS observou-se que a contagem dos probióticos permaneceu constante durante os 28 dias, provavelmente devido ao efeito prebiótico da fibra. Zacarchenco et al. (2004) em trabalho com a avaliação sensorial, microbiológica e de pós-acidificação durante a vida de prateleira de leites fermentados contendo Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum e Lactobacillus acidophilus, observaram que uma formulação de leite fermentado apenas por Str. thermophilus apresentou a maior acidez e menor ph, enquanto a formulação de leite fermentado por B. longum apresentou a menor acidez e maior ph. As populações de Str. thermophilus e B. longum mantiveram seu ciclo

26 24 logaritmo constante até 21 dias de estocagem, tanto nos leites fermentados isoladamente como no leite elaborado pela mistura dos três microrganismos, enquanto as populações de Lb. acidophilus apresentaram redução de um ciclo logarítmico. Com isso, observou-se ser possível a elaboração da bebida láctea probiótica proposta, que mesmo apresentando o maior abaixamento de ph, manteve valores mínimos aceitáveis de acordo com a legislação (acima de 10 6 UFC/mL) após 21 dias de estocagem a 4 o C. Faria et al. (2006) avaliaram o leite de búfula fermentado por Lactobacillus casei e suplementado com Bifidobacterium longum quanto aos parâmetros de acidez, ph e a viabilidade L.casei e de B. longum. O leite fermentado suplementado com B. longum, apresentou acidez inicial de 0,69% e ph de 4,86. Após 30 dias de estocagem refrigerada a 5 ºC e a 10 ºC, a acidez e o ph estavam adequados e a viabilidade de L. casei e de B. longum foi mantida acima de 10 6 UFC/mL, podendo considerar o produto como leite fermentado probiótico. Ramos et al. (2013) desenvolveram uma formulação de bebida láctea fermentada com cultura probiótica (Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus e Bifidobacterium bifidum) sabor cajá, caracterizando-a quanto às análises microbiológicas, ph e acidez titulável. As formulações estudadas apresentaram tanto no dia da produção como em 28 dias de armazenamento refrigerado a 4 ºC, contagem do microrganismo probiótico Lactobacillus acidophilus superior ao mínimo preconizado pela legislação vigente. Kempka et al. (2008) prepararam uma bebida láctea sabor pêssego suplementada com uma cultura mista de Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium.A bebida apresentou células viáveis da cultura mista adicionada dentro dos padrões estabelecidos (1 x 10 6 UFC.mL 1 ) até o 22º dia. Pelo fato da bebida inicialmente já apresentar um baixo valor de ph (4,93), a acidez ficou bastante evidenciada a partir do 22º dia de armazenamento a 4 ºC. A qualidade sensorial definiu o término do armazenamento no 14º dia, já que a bebida apresentou uma acidez bastante elevada (0,9% de ácido lático), em torno de três vezes maior que a inicial, sendo rejeitada nas análises sensoriais. 2.5 SIMULAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO PROPRIEDADES E VANTAGENS O conceito de simulação pode ser descrito como uma tentativa de replicar ou

27 25 imitar formas do comportamento de um sistema, real ou sendo projetado, através da construção de um modelo matemático desenvolvido em um computador. A simulação traz vantagens se comparadas as de outros métodos analíticos ou experimentais, como por exemplo, permite a análise de longos períodos em um curto espaço de tempo e ajuda a organizar e a separar os parâmetros controláveis daqueles que não são controláveis e estudar a influência de cada um deles sobre os sistemas (VIEIRA, 2006). Atualmente os modelos preditivos têm sido usados como uma ferramenta de investigação e avaliação dos processos de conservação de alimentos. A modelagem preditiva tem como principal vantagem proporcionar um caminho rápido e relativamente econômico para se obter dados confiáveis no que se refere ao crescimento, inativação e sobrevivência dos microrganismos presentes no alimento. Além disso, pode predizer parâmetros como velocidade máxima de crescimento, duração da fase lag e população microbiana máxima atingida em um determinado intervalo de tempo, podendo assim, avaliar a vida de prateleira dos produtos alimentícios (SARMENTO, 2006) MODELAGEM A modelagem está baseada na hipótese de que o efeito das propriedades dos leites probióticos, como ph, acidez, contagem de microrganismos, entre outras, no shelf life dessas bebidas pode ser previsto através de modelos matemáticos derivados de estudos quantitativos dos microrganismos (DALCANTON, 2010). Pode-se avaliar a população microbiana com o tempo, avaliar como as condições ambientais afetam a velocidade de crescimento ou inativação através do uso de expressões e, portanto, conhecer informações importantes na tomada de decisão, na análise de risco, na segurança e qualidade dos alimentos. Na avaliação do shelf life e ainda no desenvolvimento de novos produtos ou processos, deve-se levar em conta que todo alimento se deteriora com o tempo, porém a velocidade com que isso ocorre depende de fatores como o sistema alimentoembalagem e armazenamento-distribuição, que podem causar alterações físicas e químicas levando à redução da vida de prateleira. Compreender e prever esse comportamento microbiológico torna necessária uma familiaridade com a terminologia matemática e estatística, pois essa microbiologia preditiva tem sido considerada sob os aspectos probabilísticos e cinéticos onde se encontra o Modelo Probabilístico, que reconhece as condições de ocorrência de um evento (crescimento x nãocrescimento) e descreve a probabilidade em que estas condições possam ser definidas

28 26 (temperatura, ph, combinações) e os Modelos Cinéticos, que relacionam-se com a velocidade de crescimento ou inativação dos microrganismos de interesse (SARMENTO, 2006). O comportamento dos microrganismos poderia ser completamente descrito mediante uma combinação de ambos. Whiting et al. (1993) foram os primeiros a propor que os modelos podem ser classificados em modelos primários, onde representa-se a curva de crescimento microbiano com o tempo, para um único conjunto de condições ambientais constantes; modelos secundários, nos quais é descrito a dependência dos parâmetros do modelo primário com relação a variáveis ambientais, como a temperatura por exemplo, e em modelos terciários, que combinam o uso de modelos primários e secundários em um pacote de programas. São rotinas de softwares que transformam modelos primários e secundários em modelos na forma de aplicativos, que podem determinar respostas microbianas em diferentes condições ou ainda comparar o crescimento de diferentes microrganismos (LONGHI, 2012). 2.6 LEGISLAÇÃO E ROTULAGEM Atualmente a rotulagem geral de alimentos é regulamentada, principalmente, pelas legislações do Ministério da Saúde Resolução RDC nº 259, de 20 de setembro de 2002 (BRASIL, 2002a), do Ministério da Agricultura Instrução Normativa nº 22, de 24 de novembro de 2005 (BRASIL, 2005) e do INMETRO Portaria nº 157, de 19 de agosto de 2002 (INMETRO, 2002). A Resolução ANVISA RDC 360/03 - Regulamento Técnico sobre Rotulagem Nutricional de Alimentos Embalados torna obrigatória a rotulagem nutricional baseada nas regras estabelecidas com o objetivo principal de atuar em benefício do consumidor e ainda evitar obstáculos técnicos ao comércio (BRASIL, 2003). Portanto, de acordo com essas legislações é obrigatório mencionar, dentre outras informações, o prazo de validade na embalagem. Além de garantir que o alimento não esteja estragado, essa data que vem estampada nas embalagens é a maneira que o fabricante tem de informar aos consumidores que o seu produto está apto a ser consumido dentro das características recomendadas de textura, odor, cor e sabor. Depois da data indicada no rótulo, o alimento não está necessariamente estragado, mas pode não corresponder aos parâmetros de qualidade da altura da compra (STAFF, 2013).

29 27 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 LEVANTAMENTO DE DADOS PUBLICADOS Para o levantamento de dados foram utilizados cinco artigos disponíveis na literatura. Todos esses artigos tiveram em comum a caracterização quanto aos parâmetros ph, acidez titulável e contagem microbiológica de leites fermentados e suplementados com algum tipo de cultura probiótica. Com isso, montou-se um banco de dados com a ajuda do software Excel da Microsoft formado por nove tipos de microrganismos ou misturas probióticas e seus respectivos valores de ph, acidez e contagem microbiológica em relação aos dias. Esse banco de dados tornou possível uma melhor visualização da tendência dos dados experimentais coletados através de gráficos e curvas de tendência. 3.2 ELABORAÇÃO DA PLANILHA PARA SIMULAÇÃO Para a elaboração da planilha de simulação inicialmente os dados experimentais coletados dos artigos publicados foram plotados em três gráficos diferentes, são eles: Cultura (e/ou Mistura de culturas) x Dias; ph x Dias e acidez x Dias; onde a cultura foi dada em UFC/mL e a acidez em % ácido láctico/100 ml. Depois disso, ajustou-se a linha de tendência (equação) para os três gráficos de cada cultura com base no valor do coeficiente de determinação R 2, sabendo-se que quanto maior o valor de R 2 melhor o modelo consegue explicar os valores observados; ou seja; mais explicativo é o modelo e melhor ele se ajusta à amostra. Na obtenção da melhor equação, além do R 2, também foi levado em consideração a tendência dos valores para cada caso, sendo a tendência da contagem microbiológica em relação aos dias a de diminuir e a da acidez a de aumentar. Por fim, as equações obtidas foram implementadas em um simulador com auxílio das funções de lógica de programação oferecidas pelo software Excel. No simulador elaborado colocou-se um campo em que o usuário pode escolher a cultura ou mistura desejada entre as nove disponíveis e então com a opção escolhida segue para um novo campo em que se pode colocar qualquer dia de estudo desejado. A partir daí, o simulador procura as equações determinadas para esse tipo de escolha e dinamicamente calcula a contagem microbiológica, o ph e a acidez para esse determinado dia.

30 VALIDAÇÃO DA PLANILHA DE SIMULAÇÃO Para validar a planilha e testar sua eficiência foi feita uma comparação entre os dados experimentais disponíveis na literatura com os resultados obtidos através da simulação. Gráficos comparativos foram feitos com os valores obtidos, são eles: UFC/mL Experimental x UFC/mL Simulado; ph Experimental x ph Simulado e % ácido láctico Experimental x % ácido láctico Simulado. Além disso, também utilizou-se a análise estatística como ferramenta para validação da planilha, sendo assim, calculou-se a Média, o Erro, a Variância e o Desvio Padrão dos dados obtidos. Esses parâmetros podem ser calculados utilizando as equações 1, 2, 3 e 4 respectivamente: média = = x i n i=1 (1) n erro = VR VS x 100 % (2) VR variância = S 2 = (x i ) 2 n 1 (3) desvio padrão = S = S (4) Sendo: = média aritmética da amostra; x i = valores que a variável x assume; n = o número de valores; VR = Valor Real; VS = Valor Simulado.