Aulas 2 e 3. Estatística Aplicada à Química Analítica

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1 QUÍMICA ANALÍTICA AVANÇADA 1S 2014 Prof. Rafael Arromba de Sousa Departamento de Química ICE Aulas 2 e 3 Estatística Aplicada à Química Analítica Notas de aula: rafael.arromba@ujfj.edu.br

2 Estatística Aplicada à Química Analítica Aula 2: - Conceitos e definições básicos Não existe um valor absoluto para um resultado analítico Forma correta de expressar os resultados Rejeição de resultados e conceitos de exatidão e precisão Aula 3 - Conceitos básicos (continuação) - Noções sobre Quimiometria 3

3 RELAÇÃO ENTRE EXATIDÃO E PRECISÃO A Exatidão e a Precisão se relacionam de 3 formas principais: Método de análise C B A preciso e exato! preciso mas inexato impreciso e inexato valor verdadeiro Conc. do analito DISCUSSÃO DE EXEMPLOS PRÁTICOS... 3

4 TERMINOLOGIAS 1) Boa precisão = Boa repetibilidade reprodutibilidade Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling. Guidelines on Analytical Terminology (CAC/GL ) 4

5 2) Precisão intermediária TERMINOLOGIAS 5

6 A ESTATÍSTICA NA ANÁLISE QUÍMICA 1. Definição do problema analítico 2. Escolha do método de análise 3. Amostragem 4. Tratamento da amostra (e separação da espécie de interesse) 5. Calibração Comparação de Resultados: 6. Medida analítica RESULTADO (MÉDIA ± INCERTEZA) 7. Avaliação dos resultados : RESULTADO OBTIDO x RESULTADO ESPERADO 8. Ação Comparação Precisões (Teste F) Médias (Teste t de Student) 6

7 Teste F (ou Teste de Snedecor) Comparar precisões (ou variâncias) de duas médias (A e B) F = S A 2 S B 2 A refere-se à média com o maior desvio SE F calculado < F crítico para a confiabilidade desejada Não existe diferença significativa entre os conjuntos de dados SE F calculado F tabelado para a confiabilidade desejada Existe diferença significativa entre os conjuntos de dados 7

8 Tabelas para os valores críticos de F Ex: Valores críticos para F ao nível de 5%* Graus lib Numer. 3 9,28 9,12 9,01 8,94 8,74 8,64 4 6,59 6,39 6,26 6,16 5,91 5,80 5 5,41 5,19 5,05 4,95 4,68 4,56 6 4,76 4,53 4,39 4,28 4,00 3, ,49 3,26 3,11 3,00 2,69 2, ,10 2,87 2,71 2,60 2,28 2,12 Denom. * A tabela indica as probabilidades dos valores serem diferentes (confiabilidade de 95% para não haver diferença significativa entre os resultados) 8

9 EXERCÍCIO Exerc 3- Comente sobre a diferença na precisão obtida nos laboratórios A e B para a determinação de Mg em uma mesma amostra de leite considerando um nível de confiança de 95%. Dados: Lab. A : 34,97; 34,85; 34,94 e 34,88 mg L -1 e Lab. B : 35,02; 34,96; 34,99; 35,07 e 34,85 mg L -1. (Precisões semelhantes, comparáveis) 9

10 Principalmente quando as precisões são comparáveis, pode-se também comparar as médias: Teste t, de Student Avaliar métodos diferentes t = S p x 1 - x 2 n 1 + n 2 n 1. n 2 n é o número das medidas para cada média S p corresponde a S agrupado S p = (n 1-1) S 12 + (n 2-1) S 2 2 n 1 + n 2-2 ν t tabelado = n 1 +n 2-2 SE t calculado < t crítico para o nível de confiança desejado: não existe diferença significativa entre as médias e as diferenças observadas se devem a erros aleatórios 10

11 Valores críticos para t nos níveis de 95 e 99% (P= 0,025 e P= 0,005) Graus de liberdade 95% 99% 1 12,71 63,66 2 4,30 9,93 3 3,18 5,84 4 2,78 4,60 5 2,57 4,03 6 2,45 3,71 7 2,37 3,50 8 2,31 3,36 9 2,26 3, ,23 3, ,96 2,58 Testes estatísticos são válidos quando os erros envolvidos são aleatórios Mais confiáveis serão os testes quanto maior o ν (graus de liberdade) 11

12 Outras formas de utilizar o teste-t Comparação de uma média com um valor de referência quando não se tem o desvio do valor de referência e não Se pode calcular Sp Valor referência IC para o resultado R Ex de situação em que o resultado obtido concorda com o valor de referência = x t S N t = - x S N ν t tabelado = N-1 SE t calculado < t crítico para o nível de confiança desejado: não existe diferença significativa entre os valores 12

13 Outras formas de utilizar o teste-t Comparação de dados em pares (teste-t pareado) Amostras diferentes (do mesmo tipo ou de lotes diferentes) analisadas por métodos diferentes ou analistas diferentes Procedimento: 1) Organizar os dados em pares 2) Calcular o desvio padrão entre as diferenças das médias (dos pares) 3) Calcular o valor de t: t = d S d N ν t tabelado = N-1 ν= número de graus de liberdade 13

14 EXERCÍCIO Exerc 4- No seu trabalho de pós-graduação você fará comparação de resultados? Em caso afirmativo, qual teste será usado? Por quê? 14

15 Entendendo os erros TIPOS: - SISTEMÁTICOS (rastreados e evitados) - ALEATÓRIOS (sempre presentes) 15

16 Erros Sistemáticos ou Determinados (Podem ser conhecidos e rastreados) Erros de Método : surgem do comportamento químico ou físico não ideal de sistemas analiticos Erros Pessoais : resultam da falta de cuidado, falta de atenção ou limitações pessoais do analista afetam a exatidão Erros Instrumentais: causados pelo comportamento não ideal de um instrumento, por calibrações falhas ou pelo uso de condições inadequadas 16

17 Erros Sistemáticos ou Determinados (Podem ser conhecidos e rastreados) Como detectar um erro sistemático? Material certificado (CRM) Método de adição e recuperação Método comparativo Testes interlaboratoriais 17

18 Erros Indeterminados (aleatórios ou randômicos) Não podem ser localizados Medidas flutuam aleatoriamente ao redor da média afetam a precisão Variam de acordo com uma distribuição normal 18

19 % das medidas Ex de uma Distribuição Normal (Calibração de uma pipeta) Curva de Gauss (Perfil da distribuição) volume (ml) Histograma mostrando a distribuição de 50 medidas do volume escoado por uma pipeta de 10 ml OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp) 19

20 Karl F. Gauss Característica de uma Distribuição Normal Os resultados são alterados ora para menos, ora para mais, por erros que parecem se dar ao acaso (aleatórios), que é um comportamento esperado e, por isso, normal 20

21 Distribuição Normal de Gauss Probabilidade de ocorrência de um resultado (Y) Y = 1 2 exp - 1 (X i - ) µ corresponde a média da população (situação de várias medidas) Assim, pode-se calcular uma faixa para um resultado R supondo que os desvios observados seguem uma distribuição normal e que os parâmetros amostrais se aproximam bastante dos populacionais OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp) 21

22 Distribuição Normal e a Estatística Clássica Para a estatística clássica os desvios da normalidade não afetam os resultados (métodos robustos) e isto é apresentado no Teorema do Limite Central : Se a flutuação total numa certa variável aleatória for o resultado da soma das flutuações de muitas variáveis independentes e de importância mais ou menos igual, a sua distribuição tenderá para a normalidade, não importa qual seja a natureza das distribuições das variáveis individuais 22

23 Frequência relativa Limites de confiança da média 0, ,3 0,2 0,1 0 _ 0 + Distribuição Normal de Gauss = x z N Níveis de Confiança para Z % 50 0, , , , ,96 95,4 2, ,58 99,7 3,00 99,9 3,29 23 OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp)

24 Limites de confiança da média quando não se tem µ = x z N = x t S N Graus de liberdade 95% 99% 1 12,71 63,66 2 4,30 9,93 3 3,18 5,84 4 2,78 4,60 5 2,57 4,03 6 2,45 3,71 7 2,37 3,50 8 2,31 3,36 9 2,26 3, ,23 3, ,96 2,58 24 OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp)

25 Exemplo 4 (aplicação do conceito na expressão de um resultado): Um indivíduo fez quatro determinações de ferro em uma liga metálica, encontrando um valor médio de 31,40% m/m e uma estimativa do desvio padrão de 0,11% m/m. Qual o intervalo em que deve estar a médiada população, com um grau de confiança de 95%? µ =? = x t S N µ = 31,40 ± (3,18 x 0,11) / 4 µ = 31,40 ± 0,17 C Fe = (31,23 31,57) % m/m 25

26 Exemplo de aplicação deste conceito (Aula 4: Experimento de amostragem) Ex: Comparação da distribuição de cores de confeitos M&M com a especificação do fabricante Amostragem dos analistas diferentes média (X) e estimativa do desvio (S) para cada cor Média do fabricante (µ) Calcula-se t com a confiança desejada e compara-se com o valor tabelado: t = - x S N Se o t calc < t tab não existe diferença significativa entre as médias 26

27 Propagação de erros para um resultado R: alguns exemplos (Erros em cada etapa do processo) R = A + B C (soma e sub.) R = AB C (multiplicação e divisão) Erros determinados: E R = E A + E B - E C E R R = E A A E B + - B E C C Erros indeterminados: S R = S A2 + S B2 + S C 2 S R R = S A A S B + B S C C 27 2

28 Propagação de Erros Para casa Exerc. 5: Considerando que o S de uma balança seja de 0,0001 g, calcule a estimativa do desvio-padrão de uma pesagem feita nesta balança. (S R = 0,0001g) 28

29 CASO DE MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE O TRATAMENTO ESTATÍSTICO INCLUE TAMBÉM: Regressão linear Curva de calibração (ou analítica) Tipos: - univariada ( convencional ) - multivariada (métodos quimiométricos) Estimativa dos Limites de detecção e quantificação Cálculos baseados na Estimativa do desvio padrão do branco para prever a detectabilidade do método 29

30 Absorbância REGRESSÃO LINEAR É a reta que melhor representa a relação entre a propriedade medida (Abs, p. ex) e a concentração dos padrões: Padrões Abs= 48,3x + 0,24 r= 0,9987 Branco 0 Concentração (mg L -1 ) 1 - O coeficiente de correlação (r) varia entre -1 e +1 - Quanto mais próximo da unidade, melhor é a correlação 30

31 REGRESSÃO LINEAR Uma Curva analítica linear nem sempre é possível e uma Regressão não-linear pode ser usada desde que apresente boa correlação As Regressões lineares são as mais usuais e podem ser obtidas por meio de softwares, que usam o Método dos mínimos quadrados: Para y= ax + b, com coef. correlação r : a = n Σx i y i Σx i Σy i n Σx i2 (Σx i ) 2 b = y - x n= n o de pontos (x 1 ;y 1 ) da calibração r = n Σx i y i Σx i Σy i { [nσx i2 (Σx i2 )] [nσy i2 (Σy i ) 2 ] } 1/2 31

32 REGRESSÃO LINEAR Para casa : Vide ex. 4.9 e 4.10 do Vogel Análise Química Quantitativa, 6ª Ed: Para determinar quitina por fluorescência molecular utilizou-se padrões de quitina nas seguintes concentrações: 0,10; 0,20; 0,30 e 0,40 µg ml -1 e que resultaram nos seguintes valores de emissão, respectivamente: 5,20; 9,90; 15,30 e 19,10, Cps sendo que o branco gerou leitura de 0,00 Cps. Considerando-se que um coeficiente de correlação linear superior a 0,99 é satisfatório, calcule a concentração de quitina de uma amostra cujo sinal analítico foi de 16,10 Cps. (r= 0,9987 e C quitina = 0,32 µg ml -1 ) 32

33 REGRESSÃO LINEAR E EFEITO MATRIZ Sendo a Regressão linear uma reta média pode-se calcular a incerteza dos seus coeficientes angulares e lineares As incertezas desses coeficientes podem ser usadas para avaliar a própria regressão bem como outros parâmetros Avaliação do efeito matriz no desenvolvimento de um método analítico (comparação dos coef. angulares, a): Curva de adição de padrão Curva analítica em meio ácido ( y= ax + b ) a meio alcalino a meio ácido , ± 0, , ± 0, AI Concentração de Pb (ug/l) Para um nível de 95% de confiança: não existe diferença significativa de sensibilidade entre os diferentes meios 33

34 REGRESSÃO LINEAR E EFEITO MATRIZ Cálculo das incertezas de a e b : S a = S y/x S b = S y/x [ Σx i2 / nσ(x i - x ) 2 ] 1/2 [ Σ(x i x ) 2 ] 1/2 S y/x = [ Σ(y i y ^) 2 / (n-2) ] 1/2 Obtido usando a própria equação de regressão Uma observação cuidadosa dos valores de y i - y mostram que o erro da regressão é menor nas vizinhanças do centro da curva de calibração! ^ 34

35 REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO Estimativa dos LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) e LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) Representam a DETECTABILIDADE DO MÉTODO LEMBRAR: LOD instrumental é diferente do LOD método Exemplo: Para quantificar 0,02 mg Pb kg -1 em uma amostra de peixe por GF AAS o LOQ deve ser consideravelmente menor que 0,02 mg Pb kg -1 (Análise elementar) Amostra é digerida Na solução final a amostra fica diluída (10x p. ex) C Pb sol. amostra = 0,02 mg kg -1 / 10 = 0,002 mg kg -1 LOQ instrumental 0,002 mg Pb kg -1 e não 0,02 mg kg -1 35

36 REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO Estimativa dos LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) e LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) Definições Limite de detecção: É a menor concentração ou massa de analito que pode ser detectado com uma certa confiança Depende da magnitude do sinal analítico em relação à flutuação do branco: 3 S branco LOD= m m= inclinação curva analítica 36

37 REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO CÁLCULO do LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) CONSIDERAÇÃO: LOD concentração correspondente ao Menor sinal detectável Menor sinal detectável = Sinal branco + 3 S branco Para que se tenha 99% de confiança SE Curva analítica: (1) Y= m X + b b= Sinal branco Na concentração limite Y = Menor sinal detectável (2) X = LOD Substituindo (2) em (1): Sinal branco + 3 S branco = m LOD+ Sinal branco 3 S branco = LOD m 37

38 REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO O LIMITE DE DETECÇÃO (LOQ) No nível do LOD a medida é significativamente afetada pelo ruído instrumental (baixa precisão) As medidas quantitativas devem ser feitas num nível superior ao LOD, geralmente: LOQ= 10 S branco m PODE ser determinado experimentalmente (em função da precisão) ou considerado igual ao primeiro ponto da curva analítica 38

39 Outros Usos da Estatística no Laboratório Métodos quimiométricos para planejamento e otimização de experimentos, análise multivariada de dados e calibração multivariada A quimiometria pode ser definida como sendo a aplicação de métodos matemáticos e estatísticos no planejamento ou na otimização de procedimentos e na obtenção de informações químicas através da análise de resultados relevantes 39

40 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada - Conhecer como os diferentes parâmetros experimentais afetam o resultado do experimento (ou análise). Seleção das condições instrumentais do GF AAS Tpyr Tat tpyr Mod 40

41 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada - Estabelecer condições experimentais (instrumentais) otimizadas Sousa, RA; Silva, JCJ; Teófilo, RF; Cadore, S.; Baccan, N. Study of Instrumental Parameters for the Analysis of Milk by ICP OES Employing Factorial Design, Brazilian Meeting on Chemistry of Food and Beverages, Seleção das condições instrumentais do GF AAS 16-1,2-0,72-0,24 0, Mg II / Mg I y= P 4.34 N 0.59 A 0.69 PN 0.34 PA NA N 0,72 0-1,2-0,96-0,72-0,48-0,24 1,2 1,2 0,96 0,72 0,48 0,24 P 41

42 2- Análise multivariada de resultados Um exemplo na área de Química analítica: Dados experimentais obtidos para as diferentes amostras: CAP ACN Ca (mg L -1 ) Mg Mn 1,8 2,8 1,0 4,8 Fe 0,08 0,18 0,04 0,18 Zn 0,20 0,36 não detectado Cu 0,09 0,19 não detectado 42

43 2- Análise multivariada de resultados Considerando as variações para cada parâmetro (analito), busca-se as possíveis similaridades entre as amostras UTILIZAR: Recursos para Análise exploratória, como PCA Gráfico de scores: Amostras num espaço multidimensional PCA: Análise de Componentes Principais 43

44 Na PCA realizada compara-se o Gráfico de scores com o de loadings para se entender as separações encontradas Verificação de correlações entre dados 44

45 3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos e medicamentos - Utiliza-se um único método analítico para detectar e quantificar vários parâmetros em uma mesma análise Recomendação de literatura: Bruns, RE; Faigle, FG. Quimiometria, Quím. Nova, 8 (1985) 84 Gemperline, PJ. Practical Guide to Chemometrics (2nd Ed), CRC Press Taylor and Francis, New York (2006) 45

46 BIBLIOGRAFIA 1) D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, Stanley R. Crouch Fundamentos de Química Analítica, 8 a Ed., CENGAGE Learning, ) J. Mendham, R. C. Denney, J. D. Barnes, M. Thomas Vogel - Análise Química Quantitativa, 6 a ed., LTC, ) D. C. Harris, Análise Química Quantitativa, 7 a ed., LTC, ) B. B. Neto, I. E. Scarminio, R. E. Bruns, Como Fazer Experimentos, Editora da Unicamp, ) J. N. Miller, J. C. Miller, Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 5th Ed, Pearson Education Limited,