MÓDULO 2 3ª aula. Estatística - Conceitos básicos

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1 QUÍMICA ANALÍTICA AVANÇADA 1S 2015 MÓDULO 2 3ª aula Estatística - Conceitos básicos Prof. Rafael Arromba de Sousa Departamento de Química - ICE rafael.arromba@ufjf.edu.br Notas de aula:

2 Estatística Aplicada à Química Analítica Aula 2: - Conceitos e definições básicos Não existe um valor absoluto para um resultado analítico Forma correta de expressar os resultados Definição de exatidão e precisão Importância de rejeitar resultados anômalos Aula 3: - Conceitos básicos (continuação) - Noções de Quimiometria 3

3 RELAÇÃO ENTRE EXATIDÃO E PRECISÃO A Exatidão e a Precisão se relacionam de 3 formas principais: Método de análise C B A preciso e exato! preciso mas inexato impreciso e inexato valor verdadeiro Conc. do analito EXEMPLOS PRÁTICOS?? 3

4 Algumas formalidades... TERMINOLOGIAS 1) Boa precisão = Boa repetibilidade reprodutibilidade Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling. Guidelines on Analytical Terminology (CAC/GL ) 4

5 2) Precisão intermediária TERMINOLOGIAS 5

6 A ESTATÍSTICA NA ANÁLISE QUÍMICA 1. Definição do problema analítico 2. Escolha do método de análise 3. Amostragem 4. Tratamento da amostra (e separação da espécie de interesse) 5. Calibração Comparação de Resultados: 6. Medida analítica RESULTADO (MÉDIA ± INCERTEZA) 7. Avaliação dos resultados : RESULTADO OBTIDO x RESULTADO ESPERADO 8. Ação Comparação Precisões (Teste F) Médias (Teste t de Student) 6

7 Teste F (ou Teste de Snedecor) Comparar precisões (ou variâncias) de duas médias (A e B) F = S A 2 S B 2 A refere-se à média com o maior desvio SE F calculado < F crítico para a confiabilidade desejada Não existe diferença significativa entre os conjuntos de dados SE F calculado F tabelado para a confiabilidade desejada Existe diferença significativa entre os conjuntos de dados 7

8 Tabelas para os valores críticos de F Ex: Valores críticos para F ao nível de 5%* Graus lib Numer. 3 9,28 9,12 9,01 8,94 8,74 8,64 4 6,59 6,39 6,26 6,16 5,91 5,80 5 5,41 5,19 5,05 4,95 4,68 4,56 6 4,76 4,53 4,39 4,28 4,00 3, ,49 3,26 3,11 3,00 2,69 2, ,10 2,87 2,71 2,60 2,28 2,12 Denom. * A tabela indica as probabilidades dos valores serem diferentes (confiabilidade de 95% para não haver diferença significativa entre os resultados) 8

9 EXERCÍCIO Exerc 3- Comente sobre a diferença na precisão obtida nos laboratórios A e B para a determinação de Mg em uma mesma amostra de leite considerando um nível de confiança de 95%. Dados: Lab. A : 34,97; 34,85; 34,94 e 34,88 mg L -1 e Lab. B : 35,02; 34,96; 34,99; 35,07 e 34,85 mg L -1 (Precisões semelhantes, comparáveis) 9

10 Após entender os conceitos de precisão e exatidão, que erros afetam esses parâmetros? TIPOS ERROS: - SISTEMÁTICOS (rastreados e evitados) - ALEATÓRIOS (sempre presentes) 10

11 1) Erros Sistemáticos ou Determinados (Podem ser conhecidos e rastreados) Erros de Método : surgem do comportamento químico ou físico não ideal de sistemas analíticos Erros Pessoais : resultam da falta de cuidado, falta de atenção ou limitações pessoais do analista afetam a exatidão Erros Instrumentais: causados pelo comportamento não ideal de um instrumento, por calibrações falhas ou pelo uso de condições inadequadas 11

12 Erros Sistemáticos ou Determinados (Podem ser conhecidos e rastreados) Como detectar um erro sistemático? Material certificado (CRM) Método de adição e recuperação Método comparativo Testes interlaboratoriais 12

13 Não podem ser localizados 2) Erros Indeterminados (aleatórios ou randômicos) Medidas flutuam aleatoriamente ao redor da média afetam a precisão Variam de acordo com uma distribuição normal 13

14 Ex de uma Distribuição Normal (Calibração de uma pipeta) % das medidas Curva de Gauss (Perfil da distribuição) volume (ml) Histograma mostrando a distribuição de 50 medidas do volume escoado por uma pipeta de 10 ml 14 OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp)

15 Karl F. Gauss Característica de uma Distribuição Normal Os resultados são alterados ora para menos, ora para mais, por erros que parecem se dar ao acaso (aleatórios), que é um comportamento esperado e, por isso, normal 15

16 Distribuição Normal de Gauss Probabilidade de ocorrência de um resultado (Y) Y = 1 σ 2π exp - 1 (X i - µ) 2 2 σ 2 µ corresponde a média da população (situação de várias medidas) Assim, pode-se calcular uma faixa para um resultado R supondo que os desvios observados seguem uma distribuição normal 16 OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp)

17 Distribuição Normal e a Estatística Clássica Para a estatística clássica os desvios da normalidade não afetam os resultados do ponto de vista estatístico (métodos robustos) e ista idéia é apresentada no Teorema do Limite Central : Se a flutuação total numa certa variável aleatória for o resultado da soma das flutuações de muitas variáveis independentes e de importância mais ou menos igual, a sua distribuição tenderá para a normalidade, não importa qual seja a natureza das distribuições das variáveis individuais W S Gossett ( ): Desenvolveu a distribuição de Student para analisar resultados do teor de álcool em cerveja 17

18 Limites de confiança para a media de um resultado Frequência relativa 0,4 0,3 0,2 0,1 0 _ -2σ -1σ µ 0 +1σ+2σ + Distribuição Normal de Gauss µ = x ± z σ N Níveis de Confiança para Z % 50 0, , , , ,96 95,4 2, ,58 99,7 3,00 99,9 3,29 18 OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp)

19 Limites de confiança da média quando não se tem µ µ = x ± z σ N µ = x ± t S N Graus de liberdade 95% 99% 1 12,71 63,66 2 4,30 9,93 3 3,18 5,84 4 2,78 4,60 5 2,57 4,03 6 2,45 3,71 7 2,36 3,50 8 2,31 3,36 9 2,26 3, ,23 3, ,96 2,58 19 OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp)

20 Exemplo 4 (aplicação do conceito na expressão de um resultado): Um indivíduo fez quatro determinações de ferro em uma liga metálica, encontrando um valor médio de 31,40% m/m e uma estimativa do desvio padrão de 0,11% m/m. Qual o intervalo em que deve estar a média da população, com um grau de confiança de 95%? µ =? µ = x ± t S N µ = 31,40 ± (3,18 x 0,11) / 4 µ = 31,40 ± 0,17 C Fe = (31,23 31,57)% m/m 20

21 Exemplo de aplicação deste conceito (Aula 4: Experimento de amostragem) Ex: Comparação da distribuição de cores de confeitos M&M com a especificação do fabricante Amostragem dos analistas diferentes média (X) e estimativa do desvio (S) para cada cor Média do fabricante (µ) Calcula-se t com a confiança desejada e compara-se com o valor tabelado: t = µ - x S N Se o t calc < t tab não existe diferença significativa entre as médias 21

22 Outra aplicação para o Limite de confiança da média Comparação de uma média com um valor de referência quando não se tem o desvio do valor de referência e não se pode calcular Sp Valor referência IC para o resultado R Ex de situação em que o resultado obtido concorda com o valor de referência µ = x ± t S N ν t tabelado = N-1 22

23 Principalmente quando as precisões são comparáveis, pode-se também comparar as médias: Teste t, de Student Avaliar métodos diferentes t = S p x 1 - x 2 n 1 + n 2 n 1. n 2 n é o número das medidas para cada média S p corresponde a S agrupado S p = (n 1-1) S 12 + (n 2-1) S 2 2 n 1 + n 2-2 ν t tabelado = n 1 +n 2-2 SE t calculado < t crítico para o nível de confiança desejado: não existe diferença significativa entre as médias e as diferenças observadas se devem a erros aleatórios 23

24 Valores críticos para t nos níveis de 95 e 99% (P= 0,025 e P= 0,005) Graus de liberdade 95% 99% 1 12,71 63,66 2 4,30 9,93 3 3,18 5,84 4 2,78 4,60 5 2,57 4,03 6 2,45 3,71 7 2,37 3,50 8 2,31 3,36 9 2,26 3, ,23 3, ,96 2,58 Testes estatísticos são válidos quando os erros envolvidos são aleatórios Mais confiáveis serão os testes quanto maior o ν (graus de liberdade) 24

25 Outras formas de utilizar o teste-t Comparação de dados em pares (teste-t pareado) Amostras diferentes (do mesmo tipo ou de lotes diferentes) analisadas por métodos diferentes ou analistas diferentes Procedimento: 1) Organizar os dados em pares 2) Calcular o desvio padrão entre as diferenças das médias (dos pares) 3) Calcular o valor de t: t = d S d N ν t tabelado = N-1 ν= número de graus de liberdade 25

26 EXERCÍCIO Exerc 4- No seu trabalho de pós-graduação você fará comparação de resultados? Em caso afirmativo, qual teste será usado? Por quê? 26

27 Testes estatísticos para comparação de resultados -Precisão -Exatidão Testes de hipóteses -Hipótese nula (H 0 ) H 0 : µ = µ 0 (µ 0 é o valor verdadeiro ou de referência) -Hipótese alternativa (Ha) Ha: µ µ 0 27

28 Propagação de erros para um resultado R: alguns exemplos (Erros em cada etapa do processo) R = A + B C (soma e sub.) R = AB C (multiplicação e divisão) S R = ± S A2 + S B2 + S 2 C S R R = ± S A A 2 S B B S C C 2 Erros indeterminados 28

29 Propagação de Erros Para casa Exerc. 5: Considerando que o S de uma balança seja de 0,0001 g, calcule a estimativa do desvio-padrão de uma pesagem feita nesta balança. (S R = 0,0001g) 29

30 CASO DE MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE O TRATAMENTO ESTATÍSTICO INCLUE TAMBÉM: Regressão linear Curva de calibração (ou analítica) Tipos: - univariada ( convencional ) - multivariada (métodos quimiométricos) Estimativa dos Limites de detecção e quantificação Cálculos baseados na Estimativa do desvio padrão do branco para prever a detectabilidade do método 30

31 REGRESSÃO LINEAR É a reta que melhor representa a relação entre a propriedade medida (Abs, p. ex) e a concentração dos padrões Absorbância Branco Padrões Concentração(mg L -1 ) 0 1 Abs= 48,3x + 0,24 r= 0, O coeficiente de correlação (r) varia entre -1 e +1 - Quanto mais próximo da unidade, melhor é a correlação 31

32 REGRESSÃO LINEAR Uma Curva analítica linear nem sempre é possível e uma Regressão não-linear pode ser usada desde que apresente boa correlação As Regressões lineares são as mais usuais e podem ser obtidas por meio de softwares, que usam o Método dos mínimos quadrados: Para y= ax + b, com coef. correlação r : a = n Σx i y i Σx i Σy i n Σx i2 (Σx i ) 2 b = y - x n= n o de pontos (x 1 ;y 1 ) da calibração r = n Σx i y i Σx i Σy i { [nσx i2 (Σx i2 )] [nσy i2 (Σy i ) 2 ] } 1/2 32

33 REGRESSÃO LINEAR Para casa : Vide ex. 4.9 e 4.10 do Vogel Análise Química Quantitativa, 6ª Ed: Para determinar quitina por fluorescência molecular utilizou-se padrões de quitina nas seguintes concentrações: 0,10; 0,20; 0,30 e 0,40 µg ml -1 e que resultaram nos seguintes valores de emissão, respectivamente: 5,20; 9,90; 15,30 e 19,10, Cps sendo que o branco gerou leitura de 0,00 Cps. Considerando-se que um coeficiente de correlação linear superior a 0,99 é satisfatório, calcule a concentração de quitina de uma amostra cujo sinal analítico foi de 16,10 Cps. (r= 0,9987 e C quitina = 0,32 µg ml -1 ) 33

34 REGRESSÃO LINEAR E EFEITO MATRIZ Sendo a Regressão linear uma reta média pode-se calcular a incerteza dos seus coeficientes angulares e lineares As incertezas desses coeficientes podem ser usadas para avaliar a própria regressão bem como outros parâmetros Avaliação do efeito matriz no desenvolvimento de um método analítico (comparação dos coef. angulares, a): Curva de adição de padrão Curva analítica em meio ácido ( y= ax + b ) a meio alcalino a meio ácido , ± 0, , ± 0, AI Concentração de Pb (ug/l) Comparação para um nível de 95% de confiança para saber se a calibração poderia ser feita em meio ácido! 34

35 REGRESSÃO LINEAR E EFEITO MATRIZ Cálculo das incertezas de a e b : S a = S y/x S b = S y/x [ Σx i2 / nσ(x i - x ) 2 ] 1/2 [ Σ(x i x ) 2 ] 1/2 S y/x = [ Σ(y i y ^) 2 / (n-2) ] 1/2 Obtido usando a própria equação de regressão Uma observação cuidadosa dos valores de y i - y mostram que o erro da regressão é menor nas vizinhanças do centro da curva de calibração! ^ 35

36 REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO Estimativa dos LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) e LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) Representam a DETECTABILIDADE DO MÉTODO LEMBRAR: LOD instrumental é diferente do LOD método Exemplo: Para quantificar 0,02 mg.kg -1 Pb em uma amostra de peixe por GF AAS o LOQ deve ser consideravelmente menor que 0,02 mg.kg -1 Pb (Análise elementar = Amostra é digerida) Na solução final a amostra fica diluída (10x p. ex) C Pb sol. amostra = 0,02 mg kg -1 / 10 = 0,002 mg kg -1 LOQ instrumental 0,002 mg.kg -1 Pb e não 0,02 mg kg -1 36

37 REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO Estimativa dos LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) e LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) Limite de detecção: Definições É a menor concentração ou massa de analito que pode ser detectado com uma certa confiança Depende da magnitude do sinal analítico em relação à flutuação do branco: 3 S branco LOD= m m= inclinação curva analítica 37

38 REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO CÁLCULO do LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) CONSIDERAÇÃO: LOD concentração correspondente ao Menor sinal detectável Menor sinal detectável = Sinal branco + 3 S branco Para que se tenha 99% de confiança SE Curva analítica: (1) Y= m X + b b= Sinal branco Na concentração limite Y = Menor sinal detectável (2) X = LOD Substituindo (2) em (1): Sinal branco + 3 S branco = m LOD+ Sinal branco 3 S branco = LOD m 38

39 REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO O LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) No nível do LOD a medida é significativamente afetada pelo ruído instrumental (baixa precisão) As medidas quantitativas devem ser feitas num nível superior ao LOD, geralmente: LOQ= 10 S branco m PODE ser determinado experimentalmente (em função da precisão) ou considerado igual ao primeiro ponto da curva analítica 39

40 Outros Usos da Estatística no Laboratório Métodos quimiométricos para planejamento e otimização de experimentos, análise multivariada de dados e calibração multivariada A quimiometria pode ser definida como sendo a aplicação de métodos matemáticos e estatísticos no planejamento ou na otimização de procedimentos e na obtenção de informações químicas através da análise de resultados relevantes 40

41 Recomendação Literatura básica para estudos iniciais Bruns, RE; Faigle, FG. Quimiometria, Quím. Nova, 8 (1985) 84 Gemperline, PJ. Practical Guide to Chemometrics (2nd Ed), CRC Press Taylor and Francis, New York (2006) 41

42 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada - Conhecer como os diferentes parâmetros experimentais afetam o resultado do experimento (ou análise). Seleção das condições instrumentais do GF AAS Tpyr Tat tpyr Mod 42

43 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada - Estabelecer condições experimentais (instrumentais) otimizadas Sousa, RA; Silva, JCJ; Teófilo, RF; Cadore, S.; Baccan, N. Study of Instrumental Parameters for the Analysis of Milk by ICP OES Employing Factorial Design, Brazilian Meeting on Chemistry of Food and Beverages, Seleção das condições instrumentais do ICP OES 16-1,2-0,72-0,24 0, Mg II / Mg I y= P 4.34 N 0.59 A 0.69 PN 0.34 PA NA N 0,72 0-1,2-0,96-0,72-0,48-0,24 1,2 1,2 0,96 0,72 0,48 0,24 P 43

44 2- Análise multivariada de resultados Um exemplo na área de Química analítica: Dados experimentais obtidos para as diferentes amostras: ACP ACN Ca (mg L -1 ) Mg Mn 1,8 2,8 1,0 4,8 Fe 0,08 0,18 0,04 0,18 Zn 0,20 0,36 não detectado Cu 0,09 0,19 não detectado 44

45 2- Análise multivariada de resultados Considerando as variações para cada parâmetro (analito), busca-se as possíveis similaridades entre as amostras UTILIZAR: Recursos para Análise exploratória, como PCA Gráfico de scores: Amostras num espaço multidimensional PCA: Análise de Componentes Principais 45

46 Na PCA realizada compara-se o Gráfico de scores com o de loadings para se entender as separações encontradas Verificação de correlações entre dados 46

47 3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos, medicamentos e fluidos biológicos - Utiliza-se um único método analítico para detectar e quantificar vários parâmetros em uma mesma análise 47

48 3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos e medicamentos TABLE I: Correlation Coefficient Values for Both Calibration and Validation Models Obtained via PLSR 1 for All Inorganic Elements Element Correlation Coefficient Correlation Coefficient Element Calibration Validation Calibration Validation Ca K P Mg Na Cl

49 3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos e medicamentos TABLE II: Correlation Coefficient Values for Calibration and Validation Models Obtained via PLSR 1 for the Organic Compounds Correlation Coefficient Compounds Calibration Validation Glucose Urea Creatinine

50 BIBLIOGRAFIA 1) D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, Stanley R. Crouch Fundamentos de Química Analítica, 8 a Ed., CENGAGE Learning, ) J. Mendham, R. C. Denney, J. D. Barnes, M. Thomas Vogel - Análise Química Quantitativa, 6 a ed., LTC, ) D. C. Harris, Análise Química Quantitativa, 7 a ed., LTC, ) B. B. Neto, I. E. Scarminio, R. E. Bruns, Como Fazer Experimentos, Editora da Unicamp, ) J. N. Miller, J. C. Miller, Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 5th Ed, Pearson Education Limited,