ANALÍTICA AVANÇADA 2S Prof. Rafael Sousa. Notas de aula:
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- Manoel Monsanto Sabrosa
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1 ANALÍTICA AVANÇADA 2S 2011 Aulas 1 e 2 Estatística Aplicada à Química Analítica Prof. Rafael Sousa Departamento de Química - ICE rafael.arromba@ufjf.edu.br Notas de aula:
2 Discussão dos exercícios C1 C4
3 ERRATA (Vide slide 34 (Aula 1) Valores críticos para t nos níveis de 95 e 99% (P= 0,025 e P= 0,005) Graus de liberdade 95% 99% 1 12,71 63,66 2 4,30 9,93 3 3,18 5,84 4 2,78 4,60 5 2,57 4,03 6 2,45 3,71 7 2,37 3,50 8 2,31 3,36 9 2,26 3, ,23 3, ,96 2,58
4 ANALÍTICA AVANÇADA 2S 2011 Aula 2 Estatística Aplicada à Química Analítica Prof. Rafael Sousa Departamento de Química - ICE rafael.arromba@ufjf.edu.br Notas de aula:
5 Propagação de erros para um resultado R: alguns exemplos Erros em cada etapa do processo alguns exemplos R = A + B C (soma e sub.) R = AB C (multiplicação e divisão) Erros determinados: E R = E A + E B - E C E B E C E R E A E E = + - R A B C Erros indeterminados: S R = S A2 + S B2 + S C 2 S R R = ± S A A 2 S B B S C C 2
6 Propagação de Erros Exercício Considerando que o S de uma balança seja de 0,0001 g, calcule a estimativa do desvio-padrão de uma pesagem feita nesta balança.
7 EXERCÍCIO Resp: Propagação de Erros Resultado da pesagem = m frasco cheio m frasco vazio S R = S mfc2 + S mfv mfv 2 S R = (0,0001) 2 + (0,0001) 2 S R = 0,00014 = 0,0001 g
8 CASO DE MÉTODOS INSTRUMENTAIS O TRATAMENTO ESTATÍSTICO INCLUE TAMBÉM: Regressão linear Curva de calibração (ou analítica) Tipos: - univariada ( convencional ) - multivariada (métodos quimiométricos) Estimativa dos Limites de detecção e quantificação Cálculos baseados na Estimativa do desvio padrão do branco para prever a detectabilidade do método
9 REGRESSÃO LINEAR É a reta que melhor representa a relação entre a propriedade medida (Abs, p. ex) e a concentração dos padrões: Absorb bância Branco Padrões Concentração (mg L -1 ) 0 1 Abs= 48,3x + 0,24 r= 0, O coeficiente de correlação (r) varia entre -1 e +1 - Quanto mais próximo da unidade, melhor é a correlação
10 REGRESSÃO LINEAR Uma Curva analítica linear nem sempre é possível e uma Regressão não-linear pode ser usada desde que apresente boa correlação As Regressões lineares são as mais usuais e podem ser obtidas por meio de softwares,, que usam o Método dos mínimos quadrados: Para y= ax + b + b, com coef. correlação r : a = n Σxy ΣxΣy n Σx 2 (Σx) 2 b = y - x n= no de pontos (x 1 ;y 1 ) da calibração r = n Σxy ΣxΣy { [nσx 2 (Σx 2 )] [nσy 2 (Σy) 2 ] } 1/2
11 REGRESSÃO LINEAR Para casa : Para determinar quitina por fluorescência molecular utilizou-se padrões de quitina nas seguintes concentrações: 0,10; 0,20; 0,30 e 0,40 µg ml -1 e que resultaram nos seguintes valores de emissão, respectivamente: 5,20; 9,90; 15,30 e 19,10 10, Cps sendo que o branco gerou leitura de 0,0000 Cps. Considerando-se se que um coeficiente de correlação linear superior a 0,99 é satisfatório, calcule a concentração de quitina de uma amostra cujo sinal analítico foi de 16,10 10 Cps. (r= 0,9987 e C quitina = 0,32 µg ml - 1 ; Vide ex. 4.9 e 4.10 do Vogel Análise Química Quantitativa, 6ª Ed.)
12 REGRESSÃO LINEAR E EFEITO MATRIZ Avaliação do efeito matriz no desenvolvimento de um método analítico (comparação dos coef. angulares, a): Curva de adição de padrão (meio alcalino) Curva analítica em meio ácido a a ( y= ax + b ) meio alcalino meio ácido , ± 0, , ± 0, AI Concentração de Pb (ug/l) Para um nível de 95% de confiança: existe diferença significativa de sensibilidade
13 REGRESSÃO LINEAR E EFEITO MATRIZ Sendo a Regressão linear uma reta média pode-se calcular a incerteza dos seus coeficientes angulares e lineares As incertezas desses coeficientes podem ser usadas para avaliar a própria regressão bem como outros parâmetros Teste t para comparação médias
14 REGRESSÃO LINEAR E EFEITO MATRIZ Cálculo das incertezas de a e b : S a = S y/x S b = S y/x [ Σx i2 / nσ(x i - x ) 2 ] 1/2 [ Σ(xi x ) 2 ] 1/2 S y/x = [ Σ(y i ^y ) 2 / (n-2) ] 1/2 Obtido usando a própria equação de regressão para o valor xi usado na calibração Uma observação cuidadosa dos valores de y i - y mostram que o erro da regressão é menor nas vizinhanças do centro da curva de calibração! ^
15 REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO Estimativa dos LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) e LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) Limite de detecção: Definições É a menor concentração ou massa de analito que pode ser detectado com uma certa confiança LOD= 3 S branco m m= inclinação curva analítica Depende da magnitude do sinal analítico em relação à flutuação do branco e da sensibilidade da técnica
16 REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO ENTENDENDO O CÁLCULO do LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) CONSIDERAÇÃO: LOD concentração correspondente ao Menor sinal detectável Menor sinal detectável = Sinal branco + 3 S branco SE Curva analítica: Y= m X + b (1) b= Sinal branco Na concentração limite Y = Menor sinal detectável (2) X = LOD Para que se tenha 99% de confiança Substituindo (2) em (1): Sinal branco + 3 S branco = m LOD+ Sinal 3 S branco = LOD m Sinal branco
17 REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO O LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) No nível do LOD a medida é significativamente afetada pelo ruído instrumental (baixa precisão) As medidas quantitativas devem ser feitas num nível superior ao LOD, geralmente: LOQ= 10 S branco m PODE ser determinado experimentalmente (em função da precisão) ou considerado igual ao primeiro ponto da curva analítica DISCUSSÃO SOBRE FAIXA DE TRABALHO
18 REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO Estimativa dos LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) e LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) Representam a DETECTABILIDADE DO MÉTODO LEMBRAR: LOD instrumental é diferente do LOD método Exemplo: Para quantificar 0,02 mg Pb kg -1 em uma amostra de peixe por GF AAS o LOQ deve ser consideravelmente menor que 0,02 mg Pb kg -1 (Análise elementar) Amostra é digerida Na solução final a amostra fica diluída (10x p. ex) C Pb sol. amostra = 0,02 mg kg -1 / 10 = 0,002 mg kg -1 LOQ instrumental 0,002 mg Pb kg -1 e não 0,02 mg kg -1
19 Outros Usos da Estatística no Laboratório 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada Estabelecer condições instrumentais otimizadas 2- Análise multivariada de resultados Determinar parâmetros que indiquem padrões de composição, perfis de comportamento, etc 3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos e medicamentos Utilizar um único método analítico para detectar e quantificar vários parâmetros em uma mesma análise
20 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada Objetivo: Definir, com embasamento estatístico, experimentos em número suficiente para que forneçam informações com confiabilidade estatística Etapas: Triagem de variáveis (Planejamentos fracionários) Avaliação das variáveis significativas (Planejamentos fatoriais completos) Construção de modelos empíricos (modelagem matemática da variação dos resultados) Otimização experimental (utilização do modelo para que se possa chegar no resultado esperado)
21 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada Exemplo de uso em Química analítica: Seleção das condições instrumentais do GF AAS
22 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada Exemplo de uso em Química analítica: Seleção das condições instrumentais do GF AAS 1- Escolha dos parâmetros a serem avaliados (VARIÁVEIS) Tempo e temperatura de pirólise Temperatura de atomização 4 variáveis Uso de modificador químico 2- Escolha dos níveis de cada parâmetro (NÍVEIS DAS VARIÁVEIS) Tempo (10 e 20s) ) e temperatura de pirólise (1100 e 1300 o C) Temperatura de atomização (1800 e 1900 o C) 2 níveis Uso de modificador químico (sim e não)
23 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada Exemplo de uso em Química analítica: Seleção das condições instrumentais do GF AAS 2- Escolha dos níveis de cada parâmetro (NÍVEIS DAS VARIÁVEIS) Variables Level ( - ) Level (+ ) Tpyr: Pyrolysis temperature ( o C) tpyr: Pyrolysis hold time (s) Tat: Atomization temperature ( o C) Use of chemical modifier: Pd/MgNO 3 without with Planejamento 2 4, NESTE CASO Realização de 16 experimentos de acordo com o PROTOCOLO:
24 Experiment Tpyr ( o C) Tat ( o C) tpyr (s) Modifier* Integrated absorbance ** RSD Without Without Without Without Without Without Without Without With With With With With with With With
25 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada Exemplo de uso em Química analítica: Seleção das condições instrumentais do GF AAS 2- Obtenção dos dados experimentais e avaliação estatística (softwares) Tpyr Tat tpyr Mod Gráfico dos efeitos Principais Como as variáveis influenciam nos resultados (*) Statgraphics, Pirouette Pirouette, Unscrambler, Matlab,,...
26 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada Exemplo de uso em Química analítica: Seleção das condições instrumentais do GF AAS 2- Obtenção dos dados experimentais e avaliação estatística C: tpyr A: Tpyr B: Tat AC AB BC AD D: Mod CD BD Identificação de Efeitos de interação Podem ser conhecidos ao se obter um modelo matemático (Superfície de resposta) Gráfico de Pareto Quais variáveis influenciam significativamente os resultados (95% confiança)
27 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada Exemplo de uso em Química analítica: Seleção e otimização das condições instrumentais de um ICP OES Sousa, RA; Silva, JCJ; Teófilo, RF; Cadore, S.; Baccan, N. Study of Instrumental Parameters for the Analysis of Milk by ICP OES Employing Factorial Design, Brazilian Meeting on Chemistry of Food and Beverages, Factorial design with central point Parameter levels Parameter Level - Level 0 Level + Plasma power (P) / kw Nebulization flow rate (N) / L min Auxiliary flow rate (A) / L min Error estimative was calculated with a triplicate at the central point
28 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada Exemplo de uso em Química analítica: Seleção e otimização das condições instrumentais de um ICP OES (Axial configuration) - Important effects P, N, A principal effects PN, PA, NA interaction effects - Variance analysis (ANOVA) indicated it is possible to fit a linear model for these results: y= P 4.34 N 0.59 A 0.69 PN 0.34 PA NA negative...
29 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada Exemplo de uso em Química analítica: Seleção e otimização das condições instrumentais de um ICP OES Mg II / Mg I Surface response variables P and N ( A fixed on level zero) -1,2-0,72 N -0,24 0,24 0,72 0,24 0-1,2-0,96-0,72-0,48-0, ,2 0,96 0,72 0,48 P 1,2 DISCUSSÃO DOS USOS POSSÍVEIS DA SUP. RESPOSTA
30 1- Planejamento fatorial e otimização multivariada Um exemplo didático para estudar:
31 Outros Usos da Estatística no Laboratório 2- Análise multivariada de resultados Exemplo de uso em Química analítica: Obtenção dos dados experimentais para as diferentes amostras ACP ACN Ca (mg L -1 ) Mg Mn 1,8 2,8 1,0 4,8 Fe 0,08 0,18 0,04 0,18 Zn 0,20 0,36 não detectado Cu 0,09 0,19 não detectado
32 2- Análise multivariada de resultados Considerando as variações para cada parâmetro (analito), buscar as possíveis similaridades entre as amostra? UTILIZAR: Recursos para Análise exploratória, como PCA Gráfico de scores: Amostras num espaço multidimensional PCA: Análise de Componentes Principais
33 Na PCA realizada compara-se o Gráfico de scores com o de loadings para se entender as separações Verificação de correlações entre dados
34 2- Análise multivariada de resultados Um exemplo didático para estudar
35 Outros Usos da Estatística no Laboratório 3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos, medicamentos,... DADOS ANALÍTICOS (VARIÁVEIS) PROPRIEDADE(S) DA AMOSTRA (RESULTADOS) Teores Ca, P, Na, K, Mg, Cl, uréia, glicose e creatinina em amostras de urina Atomic Spectroscopy 32 (2011) 145
36 Outros Usos da Estatística no Laboratório 3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos, medicamentos,... DADOS ANALÍTICOS VARIÁVEIS PROPRIEDADE(S) DA AMOSTRA RESULTADOS Algorítimos matemáticos Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLSR) MATRIZ DE DADOS: MATRIZ DE RESPOSTAS: Y1 Y2 Y3 Y4 Yn C1 analito 1 C1 analito 2 C1analito n a 11 a 12 a 13 a 14 a 1n C2 analito 1 C2 analito 2 C2analito n a 21 a 22 a 23 a 24 a 2n CP analito 1 CP analito 2 CPanalito n a 31 a 32 a 33 a 34 a 3n a p1 a p2 a p3 a p4 a pn
37 Outros Usos da Estatística no Laboratório 3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos, medicamentos,... Ex de modelagem : Para cada analito: 1) Pré-tratamento dos dados ( alisamento, normalização,...) 2) Obtenção de modelos de regressão e avaliação Matriz de dados 16 x 2047 Matriz de respostas 16 x 1 amostras energias amostras C analito
38 Outros Usos da Estatística no Laboratório 3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos, medicamentos,... Ex de modelagem : variáveis utilizadas Variáveis selecionadas para as determinações inorgânicas Variáveis selecionadas para as determinações orgânicas
39 Outros Usos da Estatística no Laboratório 3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos, medicamentos,... Ex de modelagem : as curvas de calibração obtidas Os modelos precisam não só ter boa correlação, mas também boa previsão! Correlações < 0,9 podem ser adequadas Conjunto de treinamento Conjunto de treinamento (validação interna)
40 Outros Usos da Estatística no Laboratório 3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos, medicamentos,... Ex de modelagem : Ex de modelagem : a validação externa comprovou que os modelos realmente funcionam!
41 Outros Usos da Estatística no Laboratório 3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos, medicamentos,... Ex de modelagem : a validação externa comprovou que os modelos realmente funcionam!
42 Outros Usos da Estatística no Laboratório 3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos, medicamentos,... Recomendação de literatura: Bruns, RE; Faigle, FG. Quimiometria, Quím. Nova,, 8 (1985) 84 Gemperline, PJ. Practical Guide to Chemometrics (2nd Ed), CRC Press Taylor and Francis, New York (2006)
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