EM MICROBIOLOGIA. Lavras, maio de 2012

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1 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL EM MICROBIOLOGIA Prof. Dr. Whasley Ferreira Duarte Lavras, maio de

2 8 4 < 0,5 8 4 SUMÁRIO Planejamento experimental Definição de bioestatística O que são as técnicas de planejamento e otimização? Objetivos do uso das técnicas de planejamento e otimização em microbiologia Por que otimizar i experimentos na microbiologia? i Etapas da otimização de experimentos em microbiologia Principais técnicas utilizadas na otimização em microbiologia Uso do Delineamento Composto Central e Plackett-Burman Programas computacionais Exemplo Bibliografia 2

3 EXPERIMENTO PLANEJADO...alterações em??????? variáveis de modo que seja possível observar as mudanças na variável resposta... This manuscript presents interesting information. However, despite several novel data, manuscript is diluted and contains too much non-interesting data COMO PLANEJAR?

4 EXPERIMENTO PLANEJADO Objetivo (s)... Variáveis: quais poderão exercer efeito... Caracterização do problema. Faixa de trabalho: níveis de cada variável... Estatística: técnica que melhor se adequada...

5 EXPERIMENTO PLANEJADO Variáveis resposta? Condução do experimento... Análise dos dados... d Objetivo (s)...

6 EXPERIMENTO PLANEJADO =... Resultados OBJETIVOS We are pleased to inform you that your manuscript, has been accepted for publication in the Journal of... Conclusões

7 BIOESTATÍSTICA A bioestatística é a aplicação da estatística ao campo biológico. Planejamento Interpretação Execução Bioestatística Avaliação Coleta dos dados 7

8 TENDÊNCIAS Análise Multivariada: utilização de simultânea de todas as variáveis na interpretação teórica do dados obtidos Análise de Componentes Principais: verificação de como amostras se relacionam. Técnicas de Planejamentos Experimentais 8

9 TENDÊNCIAS - MICROBIOLOGIA 9

10 TENDÊNCIAS - MICROBIOLOGIA Temperatura Fungos ph Bactérias Microbiologia Inoculo Fósforo Carbono Nitrogênio 10

11 PLANEJAMENTO E OTIMIZAÇÃO DE EXPERIMENTOS 11

12 Variável dependente / independente Variáveis independentes (fatores): aquelas cujos efeitos serão estudados. Variáveis dependentes: aquelas utilizadas como resposta. 12

13 8 4 < 0,5 8 4 O QUE SÃO AS TÉCNICAS DE OTIMIZAÇÃO? Técnicas estatísticas que fornecem informações seguras com a realização de um número reduzido de ensaios experimentais 13

14 8 4 O QUE SÃO AS TÉCNICAS DE OTIMIZAÇÃO? 1 fator por vez Otimização 14

15 8 4 VANTAGENS DA OTIMIZAÇÃO Redução do nº de experimentos e / qualidade resultados Análise simultânea dos fatores Várias respostas ao mesmo tempo Cálculo do erro experimental Conhecimento do profissional i 15

16 8 4 VANTAGENS DA OTIMIZAÇÃO Nº ar rtigos Período Fonte: FSTA 16

17 8 4 OBJETIVO DOS USO DAS TÉCNICAS DE OTIMIZAÇÃO Minimizar: tempo e custo Maximizar: rendimento, produtividade, qualidade Confiabilidade dos resultados 17

18 8 4 PORQUE OTIMIZAR EM MICROBIOLOGIA? Grande nº de variáveis Adequação às tendências (Ex. consumidor) Robustez das respostas Aplicação para técnicas analíticas (Ex. HPLC) Rendimento / custo / qualidade 18

19 8 4 ETAPAS DO PROCESSO DE OTIMIZAÇÃO Variáveis independentes (fatores) Experimento (validação) Delineamento experimental (triagem ou não) Cálculos Variáveis dependentes Experimento 19

20 8 4 ETAPAS DO PROCESSO DE OTIMIZAÇÃO Definir objetivos Considerar todas as variáveis independentes Realizar ar os experimentos Cálculos Elaborar os modelos das respostas ANAVA para verificar ajuste do modelo Superfície de resposta Validar os resultados experimentais 20

21 8 4 PRINCIPAIS TÉCNICAS UTILIZADAS PARA OTIMIZAR EXPERIMENTOS EM MICROBIOLOGIA Experimento em uma etapa: Delineamento Composto Central (DCC) e Fatorial Completo Experimentos sequenciais: Plackett-Burman e Fatoriais Fracionados 21

22 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL (DCCR) Efeito de 5 diferentes concentrações de glicose, Extrato de levedura e NaCl no cultivo de Lentinus edodes 3 Fatores em 5 níveis Todas as combinações (matriz) 5 x 5 x 5 = 125 ensaios Delineamento Composto Central 17 ensaios Fonte: Biochemical Engineering Journal,

23 8 4 < 0,5 8 4 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL (DCCR) Valores codificados: +1 e -1 Fatores Valores codificados 1 +1 Glicose (g/l) NaCl (g/l) 1 2 Extrato levedura (g/l) 2 6 Pontos fatoriais 2 n Ext trato leve edura 2 3 = 8 ensaios Glicose 23

24 8 4 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL (DCCR) Pontos axiais 2 x n = 6 8 pontos fatoriais + 6 pontos axiais = 14 ensaios 24

25 8 4 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL (DCCR) ±α = (2 n ) 1/4 N α ±1,41 ±1,68 ±2,00 ±2,37 ±2,82 25

26 8 4 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL (DCCR) Pontos centrais 3 Número total de ensaios = pontos fatoriais + axiais + central = 17 3 Fatores: extrato levedura, NaCl e glicose 5 níveis: -1,68, -1, 0, 1 e 1,68 26

27 8 4 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL (DCCR) Ensaios Glicose (g/l) NaCl (g/l) Extrato levedura (g/l) , , , , , ,68 0 Crescimento micelial (g/l) 17 ensaios 27

28 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL (DCCR) Ensaios Glicose (g/l) NaCl (g/l) Extrato levedura (g/l) Crescimento micelial (g/l) L. edodes 1 0 (20) 0 (1,5) 0 (4,0) 3, (20) 0 (1,5) 168(7 1,68 (7,3) 307 3, (10) 1 (2,0) 1 (6,0) 3,28 4 1,68 ( 3,2) 0 (1,5) 0 (4,0) 3, (30) 1 (1,0) 1 (6,0) 3,44 6 1(30) 1 (2,0) 1 (2,0) 1,51 7 0(20) 0 (1,5) 0 (4,0) 3,54 8 1(10) 1 (1,0) 1 (2,0) 3,46 9 1(30) 11 (1,0) 11 (2,0) 343 3, (30) 1 (2,0) 1 (6,0) 3, (20) 1,68 (2,3) 0 (4,0) 3, (10)( ) 1 (1,0) 1 (6,0) 1, (30) 1 (2,0) 1 (2,0) 3, ,68(36,8) 0 (1,5) 0 (4,0) 3, (20) 0 (1,5) 0 (4,0) 3, (20) 0 (1,5) 1,68 (0,64) 3, (20) 1,68 (0,66) 0 (4,0) 3,44 28

29 8 4 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL (DCCR) des (g/l) sa L. edod Biomass 29

30 8 4 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL (DCCR) des (g/l) sa L. edod Biomass 30

31 8 4 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL (DCCR) des (g/l) sa L. edod Biomass 31

32 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL (DCCR) Modelo p valor R 2 Linear 0,04 0,90 Quadrático 0,03 0,97 Cúbico 0,21 0,96 Y = ax 2 + bx + c Produção máxima (otimizada) de biomassa de L. edodes = 3,56 g/l Glicose = 15,0 g/l NaCl = 0,5 g/l Extrato levedura = 5,55 g/l 32

33 8 4 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL (DCCR) s preditos Valores Valores reais 33

34 8 4 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL (DCCR) Validação Valor predito para biomassa de L. edodes d = 356 3,56 g/l Ensaio: Glicose = 15,0 g/l NaCl = 0,5 g/l Extrato levedura = 5,5 g/l Valor obtido para biomassa de L. edodes = 3,65 g/l 34

35 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL FACE CENTRADA (DCCF) α = 1 α = (2 n ) 1/4 35

36 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL FACE CENTRADA (DCCF) Ex.: Avaliar efeito da temperatura e concentração de sólidos solúveis totais (Brix) na produção de compostos voláteis por Saccharomyces cerevisiae na fermentação da polpa de jabuticaba. Variáveis independentes: brix e temperatura Variável dependente: d composto voláteis Número de ensaios: 12 Design do experimento: DCCF Pontos centrais: 6 Análise dos dados: Otimização: Validação: Fonte: Journal of Food Science,

37 8 4 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL FACE CENTRADA (DCCF) Ensaios Brix Temperatura Composto voláteis (mg/l) , , , , , , , , , , , , , ,59 37

38 8 4 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL FACE CENTRADA (DCCF) Y = *Temp *Brix+38.16*Temp*Brix+75 Brix * Temp *Brix 2 38

39 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL FACE CENTRADA (DCCF) Otimização? i Concentração estimada: 976 mg/l Condições ótimas:? Temperatura: -1(20ºC) Brix: +1 (22 ºBrix) 39

40 USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL FACE CENTRADA (DCCF) Validação: Temperatura: -1 (20 ºC) Brix: +1 (22 ºBrix) Condições ótimas: 964 mg/l 40

41 8 4 FATORIAIS FRACIONADOS E PLACKETT & BURMAN Grande nº experimentos: 5 fatores Composto Central = 45 ensaios Fatorial completo = 3125 ensaios Fatorial fracionado Plackett & Burman Triagem 41

42 8 4 FATORIAIS FRACIONADOS E PLACKETT & BURMAN Grande nº experimentos 5 ou mais fatores Fatorial fracionado Fração do experimento Ex.: 8 fatores = 2 4 = 16 ensaios =2 3 = 8 ensaios (não viável) Plackett & Burman acima de 8 fatores Ensaios múltiplos de 4 Sempre: fatores + 4 ensaios (mínimo) Ex.: 8 fatores 12 ensaios 42

43 8 4 FATORIAIS FRACIONADOS E PLACKETT & BURMAN Analisar 11 fatores = 2048 ensaios Fatorial fracionado experimentos 43

44 8 4 FATORIAIS FRACIONADOS E PLACKETT & BURMAN Plackett-Burman analisar 11 fatores 16 experimentos 44

45 8 4 PLACKETT & BURMAN Plackett-Burman analisar 11 fatores Ensaios ph Inóculo Temperatura Glicose Extrato Levedura Peptona K 2 HPO 4 MgSO 4 CaCl 2 CuSO 4 MnSO

46 8 4 FATORIAIS FRACIONADOS Fatorial Francionado analisar 11 fatores = 32 ensaios Ensaios ph Inóculo Temperatura Glicose Extrato Levedura Peptona K 2 HPO 4 MgSO 4 CaCl 2 CuSO 4 MnSO

47 8 4 FATORIAIS FRACIONADOS Fatorial Francionado analisar 11 fatores = 32 ensaios Ensaios ph Inóculo Temperat ura Glicose Extrato Levedura Peptona K 2 HPO 4 MgSO 4 CaCl 2 CuSO 4 MnSO

48 8 4 FATORIAIS FRACIONADOS E PLACKETT & BURMAN Fator p valor ph 0,44 Inóculo 0,03 Temperatura 021 0,21 Glicose 0,02 Extrato Levedura 0,81 Peptona 0,31 K2HPO4 0,25 MSO4 MgSO ,01 CaCl2 0,92 CuSO4 0,37 MnSO4 0,15 48

49 8 4 DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL 2 fatores com efeito significativo Ensaios Glicose (g/l) Inóculo (g/l) , ,41 5 1, ,41 Etanol (g/l) 11 ensaios Glicose: 10 e 20 g/l Inóculo: 2 e 4% 49

50 8 4 DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL (g/l) Etanol ( 50

51 8 4 DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL Modelo p valor R 2 Linear 0,04 0,90 Y = ax + b Produção máxima (otimizada) de etanol (g/l) Glicose = 18,0 g/l Inóculo = 3,5 % 51

52 8 4 PROGRAMAS COMPUTACIONAIS Gratuitos ou pagos Específicos Abrangentes Facilidade de uso 52

53 PROGRAMAS COMPUTACIONAIS 53

54 PROGRAMAS COMPUTACIONAIS 54

55 PROGRAMAS COMPUTACIONAIS 55

56 PROGRAMAS COMPUTACIONAIS Design Experts Plackett-Burman 56

57 PROGRAMAS COMPUTACIONAIS Design Experts Fatoriais Fracionados 57

58 EXEMPLO Objetivo: otimizar degradação de fenol por Candida tropicalis 58

59 VARIÁVEIS? 9 variáveis procedimento mais adequado? 59

60 60

61 CONSIDERAÇÕES FINAIS Experimentos em Microbiologia: efeitos de muitos fatores Ganho de tempo, produtividade, qualidade Número reduzido de experimentos Técnicas de otimização. 61

62 BIBLIOGRAFIA BÁSICA RECOMENDADA - Rodrigues, M.I. & Rodrigues, A.F.L. Planejamento de experimentos e otimização de processos. Ed. Campinas, SP: Casa do Espírito, Amigo, Fraternidade, Fé e Amor, Calado, V. & Montgomery, D.C. Planejamento de experimentos usando o Statistica. Ed. e-papers, RJ, Filho, P.F. Introdução ao planejamento e análise estatística de experimentos. Apostila. Disponível em: Acesso em 23 de junho de Montgomery, D.C. Design and Analysis of Experiments. Ed. Jonh Wiley & Sons, New York, Nwabueze, T.U. Basic steps in adapting response surface methodology as mathematical modelling for bioprocess optimisation in the food systems. International Journal of Food Science & Technology, n. 45, p ,