INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA À DEFICIÊNCIA HÍDRICA NA GERMINAÇÃO E CRESCIMENTO INICIAL DE SEMENTES DE FEIJOEIRO

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1 PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM AGRONOMIIA INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA À DEFICIÊNCIA HÍDRICA NA GERMINAÇÃO E CRESCIMENTO INICIAL DE SEMENTES DE FEIJOEIRO EDNA ANTÔNIA TORQUATO DE AGOSTINI Presidente Prudente SP 2010

2 PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM AGRONOMIIA INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA À DEFICIÊNCIA HÍDRICA NA GERMINAÇÃO E CRESCIMENTO INICIAL DE SEMENTES DE FEIJOEIRO EDNA ANTÔNIA TORQUATO DE AGOSTINI Dissertção presentd à Pró-Reitori de Pesquis e Pós-Grdução, Universidde do Oeste Pulist, como prte dos requisitos pr otenção do título de Mestre em Agronomi Áre de Concentrção: Produção Vegetl Orientdor: Prof. Dr. Ceci Cstilho Custódio Presidente Prudente SP 2010

3 FICHA CATALOGRÁFICA Agostini, Edn Antôni Torquto. A275i Indução de tolerânci à deficiênci hídric n germinção e crescimento inicil de sementes de feijoeiro/ Edn Antôni Torquto de Agostini. Presidente Prudente, : il. Dissertção (Mestrdo em Agronomi) Universidde do Oeste Pulist UNOESTE: Presidente Prudente SP, Biliogrfi 1. Germinção -- Testes. 2. Trtmento de sementes Testes. 3. Sementes -- Elicitor. 4. Sementes Choque frio. 5. Sementes Ácido slicílico I. Título.

4 EDNA ANTÔNIA TORQUATO DE AGOSTINI Indução de tolerânci à deficiênci hídric n germinção e crescimento inicil de sementes de feijoeiro Dissertção presentd à Pró-Reitori de Pesquis e Pós-Grdução, Universidde do Oeste Pulist, como prte dos requisitos pr otenção do título de Mestre em Agronomi. Presidente Prudente, 17 de mrço 2011 BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Ceci Cstilho Custódio Universidde do Oeste Pulist UNOESTE, Presidente Prudente - SP. Prof. Dr. Crlos Henrique dos Sntos Universidde do Oeste Pulist UNOESTE, Presidente Prudente - SP. Prof. Dr. Mrco Eustáquio de Sá Universidde Estdul Pulist Julio de Mesquit Filho UNESP, Ilh Solteir - SP.

5 AGRADECIMENTOS Este trlho deve muito lgums pessos, por diferentes rzões, e eu gostri de grdecer especilmente: À minh orientdor, Profª. Dr. Ceci Cstilho Custódio pel mizde, humildde e tmém pelo compnheirismo nos momentos mis difíceis dest jornd. Ao migo Prof. Dr. Nelson Bros Mchdo Neto que me incentivou e creditou n relizção deste trlho quem eu confio e dmiro. À Frncisline Anelize Grci Sntos, Lindur Helen d Silv, Mrci Guerto e Lucin Mchdo Guerto por quem tenho muito crinho e grtidão infind pel jud prestd no decorrer d minh pesquis. À Keid Rieiro Kruger que com crinho me recei e me judv conforme necessidde. À Jóice Crvlho n qul minhs ids e vinds presenciou minh lut e me deu forçs té o presente momento. À Ctriny Crl Alemn, quem tenho muito crinho, pois não mediu esforços em me judr.

6 DEDICATÓRIA Dedico este trlho primeirmente Deus, pois sempre senti presenç em minh vid. A minh fmíli (Ademilson e Rfel) pelo mor e crinho receido n minh lut diári té complet relizção deste trlho. Aos meus pis, irmãos, cunhdos e sorinhos pel legri d existênci. Aos professores Ceci e Nelson pel relizção deste trlho, quem eu desejo que se cumprm tods s ênçãos, pois sem eles não teri se cumprido.

7 Há homens que lutm um di e são ons. Há outros que lutm um no e são melhores. Há os que lutm muitos nos e são muito ons. Porém, há os que lutm tod vid. Esses são os imprescindíveis." Bertolt Brecht

8 RESUMO Indução de tolerânci à deficiênci hídric n germinção e crescimento inicil de sementes de feijoeiro As condições mientis desfvoráveis fzem com que os vegetis pssem por dptções e form como se protegem é essencil, podendo umentr produção e qulidde dos limentos. O feijão (Phseolus vulgris L) é de grnde vlor econômico e de relevnte interesse gronômico. Trtndo-se de um cultur de sensiilidde à tempertur e deficiênci hídric, podem ocorrer climtções e lterções no metolismo celulr, entre els síntese de proteíns de defes. O ojetivo deste trlho foi estudr o efeito do ácido slicílico e do choque frio plicdos às sementes pr possível tolerânci à restrição hídric, durnte o início do processo de germinção, por meio de vriáveis fisiológics e expressão de proteíns solúveis. As sementes form emeids em sustrto ppel tempertur constnte de 25 C em águ ou solução quos correspondente 2,5 vezes o peso do sustrto seco, sendo prte ds sementes em águ e prte em solução de ácido slicílico à concentrção de 0,01 Mm, pels primeirs 24 hors. Metde ds sementes emeids em águ como s emeids em ácido slicílico form trnsferids pr o choque frio, por 24 hors, à tempertur de 7 C. A seguir tods s sementes form trnsferids pr um sustrto simulndo diferentes potenciis osmóticos: 0,0; -0,3; -0,6; -1,2 MP induzidos por mnitol, sendo considerdo potencil zero o sustrto umedecido com águ, compondo qutro cominções sem choque sem ácido slicílico (SCHSAS), com choque sem ácido slicílico (CCHSAS), sem choque com ácido slicílico (SCHCAS) e com choque com ácido slicílico (CCHCAS). Os trtmentos form vlidos por germinção, clssificção de vigor, comprimento de prte ére e riz, mss sec d prte ére e riz e relção riz/prte ére. Após vlição d germinção, dus mostrs de cinco plântuls normis, por repetição, form utilizds pr determinção de prolin (plântul tod) e extrção de proteíns totis e nálise por eletroforese SDS PAGE de prte ére e riz. Os resultdos form nlisdos considerndo o delinemento inteirmente csulizdo em rrnjo ftoril de 4x4 (cominção dos trtmentos com ácido slicílico e choque frio e níveis de deficiênci de águ no sustrto), empregndo-se Tukey (5% de proilidde) pr comprção de médis dos trtmentos qulittivos e nálise de regressão polinomil pr os níveis de deficiênci. As nálises de eletroforese form vlids por imgem detectndo-se presenç e usênci de nds. A germinção não foi influencid pelos trtmentos com ácido slicílico e choque, ms diminuiu com progressão d deficiênci de águ. O vigor foi lterdo pelos trtmentos de ácido slicílico e choque, sendo que o trtmento com ácido slicílico influiu positivmente enqunto o choque negtivmente. O trtmento com ácido slicílico proporcionou miores comprimentos e msss secs de prte ére e totl ds plântuls, principlmente nos níveis intermediários de deficiênci de águ. A expressão de proteíns dos trtmentos CCHCAS e SCHCAS revelou o mesmo pdrão eletroforético tnto pr prte ére qunto pr riz com mior intensidde de expressão nos potenciis osmóticos menores. O perfil de nds dos trtmentos CCHSAS e SCHSAS presentou lterção revelndo lgums nds diferencidors. Plvrs Chve: Choque térmico. Choque frio. Ácido orgânico. Ácido slicílico. Estresse hídrico.

9 ABSTRACT The induced tolernce to wter stress in the germintion nd erly growth of en seeds Plnts re lwys exposed to ggression of iotic nd iotic gents. Their protection pthwy is essentil, nd it would increse the food production. Nvy ens (Phseolus vulgris L) re of high economic importnce nd of gronomic vlue. It is susceptile crop to temperture nd to wter stress, wht could led to metolic ltertions s the synthesis of protein defences. The ojective of this work ws to study the effect of slicylic cid nd the cold shock pplied to germinting seeds over the wter deficit tolernce, during the eginning of the germintion process y mens of physiologicl vriles nd solule protein expression. Seeds were emedded in moistened pper sustrte, hlf of the smple in wter nd hlf in the slicylic cid (0.01mM) in the first 24 hours. Prt of oth tretments ws then sujected to cold shock 24 hours t 7 C. After tht ll seeds, from oth tretments were sujected to different mnnitol induced wter potentils: 0;-0.3; -0.6 nd -1.2 MP. Wter ws considered the zero potentil. Four comintions were considered: without shock nd slicylic cid (SCHSAS), with shock nd without slicylic cid (CCHSAS), without shock with slicylic cid (SCHCAS) nd with shock nd slicylic cid (CCHCAS). Tretments were evluted y germintion, vigour clssifiction, shoot nd root dry weight nd length, s y the rte shoot/root. After germintion evlution, five norml seedlings were used to protein nd nother five to proline extrction. Proline ws determined in the whole seedling nd protein in shoot nd in the root, eing compred y SDS-PAGE. Results were nlyzed s completely rndom design in fctoril design (4x4 s comintion of slicylic cid cold shock with the wter restriction) y the Tukey s test (P< 5%) for verge comprisons nd with polynomil regression for wter deficit. Electrophoretic ptterns were nlyzed y sence presence of nds. Germintion ws not ffected y slicylic cid or y the cold shock tretments, ut y the increse in the wter deficit. Vigour ws ltered y slicylic cid nd y the shock, eing the lst one ffecting positively nd the cold shock negtively. Slicylic cid incresed length nd weight, especilly in the intermediry levels of wter deficit. Protein expression of the tretments CCHCAS nd SCHCAS showed the sme electrophorecticl ptterns for shoot nd root, with n increse in the expression for the lower potentils. The pttern of CCHSAS nd SCHSAS tretments exhiited some different nds. keywords: Therml shock. Cold shock. Orgnic Acid. Slycilic cid. Wter defict.

10 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 10 2 REVISÃO DE LITERATURA 12 3 OBJETIVO 17 4 MATERIAL E MÉTODOS 18 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 21 5 CONCLUSÃO 37 REFERÊNCIAS 38

11 10 1 INTRODUÇÃO O feijão comum (Phseolus vulgris L.) é um dos principis limentos d populção rsileir especilmente de ix rend. N miori ds regiões predomin explorção do feijoeiro por pequenos gricultores, com uso reduzido de insumos e ixs produtividdes. O Brsil produz cerc de 3,3 milhões de tonelds de feijão comum com produtividde médi de 882,6 kg h -1 (CONAB, 2010); em áres irrigds produtividde lcnç kg h -1, sendo o segundo mior produtor mundil de feijão. O miente está em constnte modificção climátic em virtude do uso desenfredo dos recursos nturis pelo homem, gerndo necessidde de estudos que detectem s possiiliddes d produção vegetl em mientes com limitções hídrics e nutricionis. A plnt de feijão é sensível o estresse hídrico pós semedur; vlores, no solo, de -0,15 MP induzem os primeiros sintoms de deficiênci n folh primári e -0,35 MP podem reduzir drsticmente germinção e elongção de céluls (DOURADO NETO; FANCELLI, 2000). Dentre os ftores externos, em mientes tropicis, águ é um dos principis, tundo n tivção de diferentes processos metólicos, que culmin com germinção de sementes. A germinção de sementes é o desenvolvimento do emrião e formção de um plântul norml. Crvlho e Nkgw (2000) ressltm que germinção ds sementes pode sofrer lterções por ftores internos, relciondos à longevidde e vigor e tmém ftores externos como águ, tempertur e oxigênio. Algums sustâncis podem colorr melhorndo eficiênci de processos metólicos, os elicitores, ou tundo diretmente em rots metólics de respost o miente desfvorável permitindo dptções às mudnçs mientis. Um desss sustâncis é o ácido slicílico. Por outro ldo, lguns procedimentos tmém podem colorr ns reções ds plnts o estresse. Assim, choque térmico, ou sej, um curto período de tempertur desfvorável pode induzir climtção d plnt outro ftor desfvorável, iótico como deficiênci de águ ou tempertur ix, ou mesmo iótico como ptógenos. Esss resposts,

12 11 crcterizds como de um estresse produzindo defess tivs n plnt um gm de outros estresses são conhecids como tolerânci cruzd. A investigção dests sustâncis e possíveis resposts cruzds é importnte pr gricultur, principlmente tendo em vists s perspectivs futurs de lterções mientis decorrentes d crescente utilizção de comustíveis fósseis e os umentos n concentrção de gses n tmosfer gerndo o efeito estuf e o quecimento glol. Além disso, emergênci e o estelecimento inicil são considerds s fses mis crítics de um cultur devido à sensiilidde os ftores externos dversos e pelo menor prto de resposts que dispõe plântul, sendo ssim gricultur necessit de estudos nests áres, mesmo considerndo que s condições tuis de clim não sejm modificds.

13 12 2 REVISÃO DE LITERATURA O feijão comum (Plseolus vulgris L.) pertence à fmíli Fcee, originári do continente mericno. O ciclo do feijão vri de dis, o que o torn um cultur proprid pr compor sistems grícols de intensivos tecnificdos. O produto finl d cultur é o grão, um dos limentos ásicos pr populção rsileir (FARIAS, 2009). O desenvolvimento do feijoeiro compreende dus fses distints ásics, sendo els denominds de fse vegettiv e fse reprodutiv. A fse vegettiv é crcterizd pelo desdormento ds folhs primáris té o primeiro otão florl. A fse reprodutiv trnscorre d emissão do primeiro otão florl té o pleno preenchimento ds vgens com posterior mturção dos grãos (DOURADO NETO; FANCELLI, 2000). O feijoeiro é pouco tolernte deficiênci hídric, o que pode umentr ou reduzir seu ciclo com mudnçs em lgums fses de seu desenvolvimento. Assim como disponiilidde hídric implic em seu desenvolvimento, fertilidde do solo é importnte pr fvorecer o potencil produtivo d espécie (DOURADO NETO; FANCELLI, 2000). A melhori do desempenho do feijão comum está ssocid à otenção de novos cultivres com crcterístics gronômics desejáveis, umentndo o desempenho em diversos locis, nos nos grícols e épocs de semedur (LEMOS et l., 2004). O feijão é cultivdo prticmente em tods s regiões do Brsil, em grnde diversidde de condições mientis. Todos os cultivres, lguns em mior outros em menor gru, são sensíveis condições climátics dverss. As sementes, durnte germinção, são prticulrmente sensíveis os ftores mientis estressntes como flt de águ e tempertur ix ou muito lt. Estresses mientis estão ligdos diretmente com lterções no pdrão de síntese de proteíns específics, em função do tipo de estresse (ARAÚJO; PINHEIRO; RUMJANEK, 1998). A flt de águ pode fetr significtivmente s etps de seu desenvolvimento, reduzindo seu ciclo iológico. A tempertur próxim de 25 C fvorece germinção ds sementes e emergênci ds plântuls, e ixo de 12 C pode comprometer tx e velocidde d germinção e contriui pr um umento de plântuls normis. (DOURADO NETO; FANCELLI, 2000).

14 13 De cordo com Sntos et l. (1992) o potencil osmótico de soluções slins pode presentr vlores negtivos em relção às céluls emrionáris, dificultndo sorção de águ que semente necessit pr germinr. A slinizção é um ftor limitnte o desenvolvimento e produtividde ds plnts, por fetr principlmente disponiilizção de recursos hídricos e estr diretmente relciond o potencil osmótico por torná-lo mis negtivo, resultndo no umento d pressão de turgor d célul (ESTEVES; SUZUKI, 2008). Durnte escssez hídric, podem ocorrer grndes mudnçs n plnt. Esss mudnçs dependem d severidde, durção e nturez do estresse, do genótipo e fse do desenvolvimento d plnt. (KRAMER, 1974). A redução d germinção cusd por estresse hídrico é triuíd à redução ds tividdes enzimátics. Isso ocorre não só por dificultr o movimento de sorção, ms tmém por fcilitr entrd de íons em quntiddes tóxics no período de sorção de águ. Em condições totis de águ disponível, s sementes podem sorver rpidmente águ, cusndo rupturs em seus tecidos e sérios dnos à germinção (BRAGA et l., 1999). A águ constitui mtriz onde ocorre grnde prte dos processos ioquímicos e fisiológicos tivndo processos importntes no desenvolvimento d plântul, tendo importnte influênci ns proprieddes e estrutur ds memrns, proteíns, ácidos nucléicos e outros componentes celulres (BRAY, 1995; TAIZ; ZEIGER, 2004). Mchdo Neto (2006) e Ávil et l. (2007) citm que solução osmótic de mnitol pode se destcr dentre outrs soluções que tem sido usds pr simulr um miente com ix umidde, crcterizndo deficiênci hídric. Sementes de feijão com potenciis fisiológicos diferentes, sumetidos o estresse hídrico induzido por mnitol, presentm diminuição n germinção, isso ocorrendo n primeir contgem, velocidde de germinção, mss sec de plântuls, comprimento de rízes e prte ére e um umento de normlidde ns plântuls em potenciis de 0,4 0,6 (BRAGA et l., 1999), porém pós seis dis so deficiênci 1,2MP hvi germinção, em lortório, em cultivres de feijoeiro (MACHADO NETO et l., 2006). Em feijão médi de tempertur idel seri entre 18 e 31 C, mínim entre 8 e 13 C, máxim entre 35 e 39 C; cim iniirm drsticmente germinção (MACHADO NETO et l., 2006). A deficiênci hídric induz síntese de HSPs (Het Shock Protein) específics e /ou o umento de determindos grupos em vegetis mis tolerntes,

15 14 ssim como o estresse térmico (ARAÚJO; PINHEIRO; RUMJANEK, 1998). De form semelhnte, resistênci os choques de clor e frio podem ser umentdos por elevd concentrção de compostos fenólicos (RIVERO et l., 2001) ou envolvimento por lguns minoácidos (MACHADO NETO et l., 2004). A expressão elicitor iológico refere-se mcromoléculs, oriunds tnto ds plnts, como dos ptógenos. Um série de compostos incluindo oligosscrídeos, glicoproteíns e peptídeos medim indução ds reções de defes (JUNG et l., 2000; KÚC, 2000; BENHAMOU; NICOLE, 1999). Diverss podem ser s resposts de tolerânci dos orgnismos os estresses como respost diferencil de cultivres Custódio et l. (2002); Mchdo Neto et l. (2004) ; Teixeir et l. (2008), vi tivção Nepomuceno et l. (2001); Verdoy et l. (2004) ou destivção Nepomuceno et l. (2000) de genes que codificrão proteíns específics, finlizndo com diverss resposts fisiológics, metólics e de desenvolvimento. Entre ests resposts o estresse podemos encontrr ftores de trnscrição Zhu (2001), proteíns de diverss clsses, como s BiP Binding Protein, Klinski et l. (1995), peroxidses Siegel (1993), proteíns LEA (Lte emryogenesis undnt protein - Verdoy et l. (2004)), proteíns rics em prolin (PRPs) - Verdoy et l. (2004) e proteíns de choque térmico (Het Shock Protein - (HSPs)), s quis deverim ser específics o estresse de clor, porém, tmém são sintetizds n presenç de estresse hídrico ou como respost universl o estresse sendo encontrds desde procriotos té em eucriotos (VIERLING, 1991). Não existem estudos que comprovem completmente s funções fisiológics ds HSPs, entretnto, existem evidêncis consideráveis demonstrndo que termotolerânci está correlciond com síntese e cúmulo de HSPs (JINN et l., 1993; SCHIRMER; LINDIQUIST; VIERLING, 1994; PARK et l., 1996; PRANDL et l., 1998; RISTIC et l., 1998; KUK et l., 2000; ARAÚJO; RUMJANEK; PINHEIRO 2003).Qundo ocorre termotolerânci, pr conter os efeitos do estresse, plnt sofre climtção por meio de mudnçs no fluxo metólico por meio d supressão de rots metólics, envolvendo produção de espécies retivs de oxigênio e induzindo síntese de proteíns de choque térmico (HSPs) (CUSTÓDIO et l, 2009). Segundo Mc Cue et l. (2000), váris forms de comte o estresse são citds, entre els plicção exógen ou estimulo à síntese

16 15 endógen dos ácidos orgânicos, slicílico, scórico e cítrico, sendo que destes o primeiro pode gir como indutor de proteíns de tolerânci o estresse. O ácido slicílico (AS) é um composto pertencente o grupo dos compostos fenólicos e que está presente em grnde prte ds plnts (MAIA et l, 2000). Apresent inúmers funções, destcndo-se iniição d germinção e do crescimento; interferênci n sorção de rízes, redução d trnspirção e cus scisão folir (KERBAUY, 2008). Porém, Crvlho et l. (2007) concluirm que plicção de ácido slicílico em sementes de clêndul, plnt medicinl pertencente à fmíli Astercee, contriuiu positivmente n germinção e no índice de velocidde de germinção considerndo níveis de estresse hídrico e térmico 35 C. Mi et l. (2000) estudrm que o ácido slicílico promoveu umento d percentgem de germinção em plântuls de soj, lém de estimulr o comprimento de rízes e incrementr o peso d mtéri verde. O ácido slicílico tem mostrdo cpcidde de tivr peroxidses tendo um importnte ppel no processo ioquímico com iossíntese de suerin e lignin que estão envolvids no reforço ds predes ds céluls, e esss sustâncis são de grnde importânci pr proteção d plnt (SAKHABUTDINOVA, FATKHUTDINOVA; SHAKIROVA, 2004). Durnte períodos de deficiênci hídric, muits mudnçs ocorrem n plnt. Um ds resposts o estresse hídrico ns céluls ds plnts é o cúmulo de prolin. Durnte sec s plnts superiores tivmente cumulm çucres, ácidos orgânicos e íons no citosol pr diminuir o potencil osmótico e conseqüentemente mnter o potencil hídrico e o turgor ds céluls. O cúmulo de prolin ns plnts ocorre qundo ests estão sumetids condições de estresse hídrico, térmico ou slino (MAIA et l., 2007). O resultdo deste minoácido cumuldo é respost do umento no fluxo de glutmto, que é metolizdo pel Pirrolin-5-Crixilto Sintetse (P5CS), sendo est enzim que regul o tx de iossíntese de prolin (HARE; CRESS, 1997). Com diminuição no potencil osmótico d célul ocorre um umento n síntese de P5CS e ssim sendo um umento n cumulção de prolin, e isso tem sido proposto como juste osmótico. Muits plnts cumulm solutos orgânicos ou osmóticos comptíveis que interferem ns funções ds enzims que são constituídos de minoácidos, prticulrmente prolin em respost diferentes tipos de estresse (TAIZ; ZEIGER, 2004). De cordo com Mi et l. (2007), ocorreu um créscimo de prolin nos tecidos folires prtir d diminuição do conteúdo reltivo de águ destes tecidos e

17 16 este cúmulo ocorreu em virtude do umento ds tividdes ds enzims envolvids n síntese de minoácidos ou d iniição d oxidção d prolin. Como se verific, n litertur, ind são poucos os estudos sore os compostos que conferem resistênci o feijoeiro em condições de estresse hídrico nest fse tão crític que é germinção ds sementes e emergênci ds plântuls. Dess form, se fzem necessários, estudos que usquem ests informções, lém de se tmém uscr conhecimentos sore os produtos que possm ser utilizdos pr estimulr formção destes compostos.

18 17 3 OBJETIVO Este trlho teve como ojetivo estudr o efeito do ácido slicílico, do choque frio e d cominção dos dois n indução de tolerânci à deficiênci de águ em sementes de feijoeiro durnte germinção e no crescimento inicil.

19 18 4 MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi desenvolvido nos lortórios de Sementes e Genétic d Universidde do Oeste Pulist -UNOESTE- loclizdo em Presidente Prudente-SP. Form utilizds sementes de feijão (Phseolus vulgris L) do cultivr Crioc 80 SH com procedênci de Snto Anstácio/SP. As sementes form dividids em dus porções, sendo prte emeid em águ e prte em solução quos de ácido slicílico 0,01mM (CARVALHO et l., 2007) em ppel tolh pr germinção. Utilizou-se proporção de 2,5 vezes o peso do sustrto seco em águ ou solução quos e s sementes form mntids tempertur constnte de 25 o C, ns primeirs 24 hors. Tnto s sementes emeids em águ como s emeids em ácido slicílico form trnsferids pr o choque frio, por 24 hors, à tempertur de 7 C (CUSTÓDIO et l., 2009). Assim otiverm-se qutro cominções de choque frio e ácido slicílico como segue: SCHSAS, sem choque e sem ácido slicílico ou trtmento testemunh; SCHCAS, sem choque com ácido slicílico; CCHSAS, com choque sem ácido slicílico e CCHCAS com choque e com ácido slicílico. A seguir tods s sementes form trnsferids pr um sustrto simulndo diferentes potenciis hídricos: 0; -0,3; -0,6; -1,2 MP induzidos por mnitol, sendo considerdo potencil zero o sustrto umedecido com águ. Os potenciis form otidos dissolvendo-se 0; 22,29; 44,58 e 89,17g de mnitol por litro de águ, estelecidos pel equção de Vn t Hoff (TAIZ; ZEIGER, 2004). Cd prcel, pr vlição d germinção, foi formd de 50 sementes com 4 repetições. As sementes form disposts em 3 folhs de ppel tolh, sendo dus como se e um como coertur, enrolds e colocds em sco plástico. Relizou-se um únic contgem no sétimo di pós o início d emeição. As plântuls form clssificds em plântuls normis fortes, normis frcs, normis e morts. A germinção foi considerd som ds porcentgens de plântuls normis fortes e frcs. Pr clssificção de vigor foi considerd porcentgem de plântuls normis fortes (NAKAGAWA, 1999). Pr vlição dos comprimentos e msss secs form instlds 4 repetições de 10 sementes colocds pr germinr ns mesms condições d germinção que, os sete dis, form medids qunto o comprimento d prte

20 19 ére (considerou-se o hipocótilo), comprimento de riz, mss sec de prte ére e riz. A vlição d mtéri sec foi seprdmente, d riz e prte ére (sem os cotilédones), sumetids à secgem so tempertur de 60 C por 72 hors, resfrid em dessecdor e pesd pr otenção ds msss. A relção riz/prte ére foi clculd dividindo-se mss d riz pel mss d prte ére (NAKAGAWA, 1999). Dus mostrs de cinco plântuls normis, por repetição, otids d vlição d germinção, o sétimo di, form seprds pr determinção de prolin (plântul tod) e extrção de proteíns totis (individulizds em riz e prte ére). Cd frção de tecido, por repetição, foi mcerdo com nitrogênio líquido e colocdo em tuos de ensio com tmpão de extrção Tris-HCL (0,625 mm) ph 6,8, contendo, 2% duodecil sulfto de sódio (SDS); 20% glicerol e 5% 2-mercptoetnol n proporção de 1:10 (p:v) de mostr de tecido vegetl pr o tmpão de extrção. Os tuos form gitdos e mntidos por, no mínimo, um hor em tempertur miente e depois quecido de três cinco minutos té tingir eulição. Posteriormente, solução foi centrifugd 9500rpm por 10 minutos. O sorendnte foi congeldo em tuos Eppendorf. As proteíns form quntificds de cordo com Brdford (1976), sendo os vlores plotdos contr um curv de clirção construíd com lumin ovin 0,5 g ml -1 n fix de zero 100µg. A eletroforese, seguindo método de SDS-PAGE, foi conduzid de cordo com Lemli (1970) em um sistem composto por um gel de corrid contendo 12,5% de crilmid-iscrilmid (30:0,8), Tris Glicin SDS ph 8,8, e um gel de empilhmento com 2,5% de crilmid-iscrilmid, Tris HCl ph 6,8. A corrid de eletroforese SDS-PAGE foi relizd em cu verticl ligd à fonte elétric por 30 minutos 50V e 20mA por 4 hors em condições refrigerds. O tmpão de corrid foi composto de Tris (25mM) - Glicin (38mM) - SDS (0,7mM), ph8,8. Alíquots, contendo mesm quntidde de proteín por trtmento (20µg), form colocds por poço. Os géis form fixdos com isopropnol:ácido cético:águ (4:1:5) por 30 minutos e permnecerm em solução contendo 2% Coomssie Blue R250 té precerem s nds de proteín. Qundo colorção mostrou-se muito escur o gel foi descordo com 10% de ácido cético. Posteriormente, foi relizd foto documentção digitl em trnslumindor permitindo cptur, visulizção e o processmento de imgens de nds protéics revelds nos géis.

21 20 A nálise do pdrão eletroforético de cd trtmento foi feit trvés de comprção visul e detecção diferencil d presenç/usênci de nds e o peso ds nds clculdo por interpolção hrmônic. Pr se determinr quntidde de prolin utilizou-se o método descrito por Btes, Wldren e Tere (1973) modificdo por Mchdo Neto et l. (2004), mcerndo-se mg de mteril fresco (plântul tod) em 5 10 ml de ácido sulfoslicílico 3%. Relizndo filtrgem do mteril dquirido. Retirou-se 2 ml do mteril otido em um tuo de ensio com 2 ml de ácido cético glcil. As mostrs form mntids em nho mri fervente por um hor. Após este período resfriou-se em nho de gelo e em seguid fez-se leitur em espectrofotômetro 520nm, em triplicts. O experimento foi conduzido seguindo o delinemento esttístico inteirmente csulizdo com qutro repetições por trtmento. Os trtmentos form rrnjdos em esquem ftoril 4x4, sendo qutro cominções de choque frio e ácido slicílico e 4 potenciis osmóticos produzidos por concentrções de mnitol. Os ddos form nlisdos qunto à vriânci pelo teste F com 5% de significânci, comprção de médis entre s cominções de choque frio e ácido slicílico pelo teste Tukey (P<0,05) e nálise de regressão polinomil pr os níveis de potencil osmótico. Form considerds s equções significtivs com miores coeficientes de determinção (R 2 ). Os ddos em porcentgem form trnsformdos em rco seno (x ) 1/2 enqunto os demis não sofrerm trnsformção. Pr nálise utilizou-se o progrm Sisvr (FERREIRA, 2008).

22 21 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultdos otidos ns diverss vlições estão contidos ns figurs de 1 7. Qunto à germinção, s sementes sumetids os trtmentos, de choque frio e ácido slicílico, e os potencis osmóticos (Figur 1A) não diferirm em nenhum dos potenciis estuddos. No entnto, germinção foi decrescente com o umento d deficiênci de águ. A médi inicil (potencil zero) foi de 96,6% decrescendo 6,8% pr cd MP de diminuição no potencil osmótico. A diminuição d germinção em função do umento d restrição hídric é stnte reltd n litertur. No entnto, dentro de um mesmo potencil pode ocorrer resposts diferentes de germinção e vigor como oservrm Mchdo Neto et l. (2006) e Custódio, Slomão e Mchdo Neto (2009). Mores; Menezes e Psqulli (2005) oservrm, em sementes de feijão com o uso de NCl e PEG 6000, que porcentgem de germinção mnteve-se cim de 90% té -0,2 MP, pós houve redução drástic sendo mior em PEG Por outro ldo existem estudos indicndo que ocorreu melhor desempenho n germinção ds sementes de feijão que pssrm por choque térmico, principlmente 7 o C, ntes d restrição hídric no início do desenvolvimento, como estudrm Custódio et l. (2009). Qunto o vigor (Figur 1B), considerndo o trtmento SCHSAS foi possível identificr um juste qudrático. O potencil relciondo o mior vigor foi clculdo em -0,26 MP. Neste mesmo trtmento foi possível vlir que prtir de -0,26 MP, restrição hídric resultou em diminuição do desempenho ds sementes, demonstrndo fisiologicmente necessidde hídric que semente tem pr o seu desenvolvimento posterior. No trtmento sem SCHCAS (Figur 1B) ocorreu um juste liner que crcterizou redução no vigor d semente com o umento d restrição hídric, ou sej, qundo fornecido mior quntidde de águ à semente, oservou-se um vigor clculdo de 77,4% e à medid que se elevou restrição hídric ocorreu decréscimo linerizdo no vigor. Brccini et l. (1998), Mores e Menezes (2003) e Custódio, Slomão e Mchdo Neto (2009) estudrm que, em sementes, o vigor é mis fetdo do que germinção em condições de deficiênci hídric por soluções osmótics.

23 22 N nálise dos efeitos do trtmento CCHSAS (Figur 1B) não houve diferenç significtiv, ou sej, não ocorreu diferenç entre s médis considerndo o umento do potencil osmótico. No entnto, foi possível oservr, pr o trtmento CCHCAS, o juste qudrático, onde o mior vigor ds sementes foi oservdo no potencil de -0,50 MP. Enqunto no potencil zero o trtmento CCHCAS (Figur 1B) presentou menor médi, diferindo dos demis trtmentos, no potencil mis restritivo, -1,2 MP, testemunh, ou sej, s sementes não trtds é que presentrm médis inferiores os trtmentos CCHSAS e SCHCAS. Nos níveis intermediários de restrição de águ s diferençs entre os trtmentos form menos expressivs. No nível -0,3 MP não houve diferenç, e, no nível -0,6 MP, o trtmento testemunh foi superior, emor não diferindo do trtmento CCHSAS. O ácido slícilico plicdo às sementes de rroz cv. EMBRAPA 7 TAIM, presentou efeito iniitório n porcentgem de germinção, segundo Silveir, Mores e Lopes (2000). Esses resultdos corroorm os de Keruy (2008) que consider o ácido slicílico um composto fenólico que present inúmers funções destcndo-se iniição d germinção.

24 23 SCHSAS SCHCAS CCHSAS CCHCAS Médi Interção (Trtmentos * Potenciis) não significtiv Trtmentos não diferem pelo teste Tukey (P>0,05) y(médi)= 96,6 + 6,857x R 2 =0,9594** -1,2-0,9-0,6-0,3 0 Potencil osmótico (MP) (A) Germinção (%) xx SCHSAS SCHCAS CCHSAS CCHCAS (B) 100 y( )=75, ,7575x -35,8585x 2 R 2 =0,9203** y( )=77,40 +15,7619x R 2 =0,9029** y( )=médi=69,37 ns y( )=61, ,4242x -30,3030x 2 R 2 =0,9391** -1,2-0,9-0,6-0,3 0 Potencil osmótico (MP) Clssificção do vigor (%) xx FIGURA 1 - Germinção (A) e clssificção de vigor (B) de sementes de feijão trtds com choque frio (7 o C 24h) e ácido slicílico (0,01 mm 48h) e sumetids à níveis de potencil osmótico do sustrto otidos com soluções de mnitol. Dentro de um mesmo potencil, letrs iguis indicm diferençs não significtivs pelo teste Tukey (P>0,05)

25 24 Não houve significânci n interção trtmento d semente x potencil d águ pr o crescimento d prte ére (Figur 2A) que presentou um decréscimo centudo té -1,2 MP, seguindo juste liner decrescente, com comprimento, no potencil zero, de 10,7 cm e decréscimo de 7,05 cm pr cd MP de umento n restrição de águ. No entnto, nlisndo os trtmentos utilizdos, houve diferenç significtiv pr o comprimento d prte ére, ocorrendo um crescimento mior pr s plnts testemunh, seguids ds trtds com ácido slicílico (SCHCAS), ds trtds com choque (CCHSAS) e por fim ds trtds com choque e com ácido slicílico (CCHCAS). Nunes et l. (2009) concluirm que ocorreu um decréscimo no tmnho ds plântuls de Crotlri junce, à medid que os potenciis osmóticos ficrm negtivos, considerndo um fix de 0,4 2,0 MP. Conus et l. (2009) prtir d nálise de vriânci, detectou que ocorreu um diminuição d prte ére do milho trtdos com soluções osmótics de KCl e CCl 2, no potencil osmótico de 0,2 MP. Pr o comprimento d riz (Figur 2B), nlisndo o trtmento SCHSAS, oservou-se que ocorreu um juste liner significtivo. Com o umento d restrição hídric ocorreu um decréscimo no comprimento d riz fto igulmente oservdo por Queiroz, Almeid e Fernndes (1998). Ao inserir o choque térmico e não empregr o ácido slicílico ocorreu juste qudrático com menor crescimento de riz, clculdo em -0,89 MP o ponto de mínimo crescimento, demonstrndo que pens o choque frio não foi suficiente pr tenur os efeitos d diminuição d águ pr o crescimento d riz. Os trtmentos SCHCAS e CCHCAS presentrm juste qudrático com mior crescimento de riz clculdo pr -0,35 e -0,39 MP. Com mior disponiilidde de águ, o trtmento SCHCAS foi superior, CCHCAS intermediário e os outros dois inferiores. N mior restrição de águ, -1,2 MP, o trtmento sem choque com ácido slicílico continuou sendo superior emor não tenh diferido do com choque com ácido slicílico (CCHCAS). Qundo é nlisdo o comprimento totl (Figur 2C), os trtmentos SCHCAS, SCHSAS, e CCHCAS presentrm juste liner com comprimentos, no potencil zero, clculdos de 25,59, 22,38 e 16,81 cm, com decréscimos de 14,81, 14,29 e 5,05 cm pr cd MP de umento n restrição de águ. O trtmento CCHCAS presentou juste qudrático com ponto de máximo de 0,21 MP.

26 25 No comprimento totl foi possível verificr que o ácido slicílico foi determinnte, pois qundo não empregdo junto com o choque frio, ocorreu mior comprimento totl d plântul; sendo verificdo o inverso qundo se empregou ácido slicílico. No potencil zero o trtmento superior em relção os demis foi com uso do ácido slicílico (SCHCAS), emor não tenh diferido d testemunh. O resultdo deste trlho foi contrário o firmdo n litertur por Keruy (2008) que consttou que o ácido slicílico tendeu iniir o crescimento ds plnts. No potencil de águ mis drástico não houve diferenç entre os trtmentos, enqunto no potencil -0,6 MP tmém houve destque pr o uso de ácido slicílico (SCHCAS) que foi superior os demis trtmentos e à testemunh. Skhutidinov et l. (2003) concluirm que o uso do ácido slicílico em plântuls de trigo reduziu deficiênci hídric e ção prejudicil d slinidde e celerou resturção dos processos de crescimento.

27 26 SCHSAS SCHCAS CCHSAS CCHCAS Médi Interção (Trtmentos * Potenciis) não significtiv Trtmentos diferem pelo teste Tukey (P<0,05) y(médi)=10, ,0516x R 2 =0,9873** Médis = 10,653 = 8,012 = 5,575c = 3,893d -1,2-0,9-0,6-0,3 0 Potencil osmótico (MP) SCHSAS SCHCAS CCHSAS CCHCAS y( )=6, ,914x R 2 =0,9065** y( )=13,642-10,35x -14,46x 2 R 2 =0,999** y( )=6,01-12,016x -6,712x 2 R 2 =0,9776** y( )=10,377-9,922x -12,642x 2 R 2 =0,9388** c c -1,2-0,9-0,6-0,3 0 Potencil osmótico (MP) c (A) c c (B) Comprimento d prte ére (cm) xx Comprimento d riz (cm) xx SCHSAS SCHCAS CCHSAS CCHCAS y( )=22,38 +14,29x R 2 =0,9756** y( )=25,59-14,81x R 2 =0,918** y( )=16,39 +10,498x R 2 =0,9573** y( )=16,81-5,05x -12,597x 2 R 2 =0,9333** (C) Comprimento totl (cm) xx -1,2-0,9-0,6-0,3 0 Potencil osmótico (MP) 0 FIGURA 2 - Comprimento d prte ére (A), d riz (B) e comprimento totl (C) de sementes de feijão trtds com choque frio (7 o C 24h) e ácido slicílico (0,01 mm 48h) e sumetids à níveis de potencil osmótico do sustrto otidos com soluções de mnitol. Dentro de um mesmo potencil, letrs iguis indicm diferençs não significtivs pelo teste Tukey (P>0,05)

28 27 Pr mss sec de prte ére (Figur 3A) foi possível verificr pr todos os trtmentos que ocorreu redução d mss com diminuição do potencil osmótico, denotndo que redução d disponiilidde hídric promoveu menor desenvolvimento de prte ére com menor trnslocção ds reservs cotiledonres pr prte ére. Todos os trtmentos presentrm justes lineres sendo mior mss de prte ére em totl disponiilidde hídric (0,547g) pr o trtmento SCHCAS, com redução d mss um tx de 0,362g pr cd um MP de redução do potencil osmótico. O trtmento CCHSAS presentou menor mss inicil clculd em 0,299g com decréscimo de 0,192g pr cd um MP de redução no potencil. Houve diferenç significtiv entre os trtmentos nos potenciis 0; -0,3 e -0,6 MP, enqunto no máximo de restrição hídric não houve diferenç entre os trtmentos. Os trtmentos SCHCAS e SCHSAS presentrm mior mss sec do que nos trtmentos em que foi utilizdo choque frio, CCHSAS e CCHCAS. Didonet (2002) verificou que ocorreu umento d mss sec de prte ére do feijão comum cv. Pérol em 50%, em virtude do choque térmico empregdo às sementes. Custódio et l. (2009) tmém consttrm melhor desempenho, ds sementes de feijão cv. IAPAR 81, que pssrm por choque, de 7 o C por 24 hors ou 33 o C por 24 hors, à restrição hídric no início do desenvolvimento. Não houve significânci n interção entre os trtmentos e os potenciis pr mss sec d riz (Figur 3B), ssim os resultdos form vlidos seprdmente. Com relção à restrição de águ, todos os trtmentos presentrm redução d mss de riz (Figur 3B). Coelho et l. (2010) estudrm que s sementes de feijão so estresse hídrico e trtmentos osmóticos com mnitol, CCl 2, NCl e MgCl 2 presentrm redução ns msss secs de prte ére e de riz, demonstrndo que sofrerm interferênci d diminuição d águ, como foi possível verificr n Figur 3 A e Figur 3 B. O juste, considerndo médi, foi liner decrescente com mss inicil de 0,159g e redução d mss de riz de 0,066g pr cd MP de redução no potencil osmótico. Considerndo pens os trtmentos empregdos ns sementes, o superior foi testemunh com médi de 0,1425g diferindo-se dos trtmentos com choque, com e sem ácido slicílico. O trtmento SCHCAS ficou em posição intermediári não diferindo dos superiores e dos inferiores.

29 28 SCHSAS SCHCAS CCHSAS CCHCAS y( )=0, ,312x R 2 =0,9278** y( )=0,547 +0,362x R 2 =0,9757** y( )=0,299 +0,1926x R 2 =0,8811** y( )=0,413 +0,28x R 2 =0,9797** c c (A) 0,8 0,6 0,4 0,2 Mss sec d prte ére (g) xx -1,2-0,9-0,6-0,3 0 Potencil osmótico (MP) 0 SCHSAS SCHCAS CCHSAS CCHCAS Médi Interção (Trtmentos * Potenciis) não significtiv Trtmentos diferem pelo teste Tukey (P<0,05) y(médi)=0, ,066x R 2 =0,9177* Médis = 0,1425 = 0,1286 = 0,1162 = 0,1128 (B) 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 Mss sec d riz (g) xx -1,2-0,9-0,6-0,3 0 Potencil osmótico (MP) 0 FIGURA 3 - Mss sec d prte ére (A) e d riz (B) de sementes de feijão trtds com choque frio (7 o C 24h) e ácido slicílico (0,01 mm 48h) e sumetids à níveis de potencil osmótico do sustrto otidos com soluções de mnitol. Dentro de um mesmo potencil, letrs iguis indicm diferençs não significtivs pelo teste Tukey (P>0,05)

30 29 Pr mss sec totl (Figur 4A) não ocorreu significânci d interção entre o potencil osmótico e os trtmentos. Qunto à redução d disponiilidde de águ, mss sec totl sofreu redução representd por juste liner com mss sec de 0,595g no potencil zero e redução de 0,353g pr cd MP de redução no potencil osmótico. Qunto os trtmentos, testemunh e o trtmento SCHCAS form superiores os trtmentos com choque, com e sem ácido slicílico. Ou sej, qundo não foi utilizdo o choque térmico e foi utilizdo o ácido slicílico ocorreu mior cúmulo de mss sec totl. Singh e Ush (2003) oservrm em trigo um umento n mtéri sec significtivmente mior no trtmento com ácido slicílico, ess cpcidde de eliminr efeito dverso do estresse hídrico, podem ter implicções de melhori significtiv pr superr rreir de rendimento decorrentes à limitções de águ. N relção riz/prte ére (Figur 4B) consttou-se que pr os trtmentos SCHSAS e SCHCAS e CCHCAS ocorreu incremento n relção riz/ prte ére considerndo-se o juste liner, ou sej, ocorreu mior crescimento de rízes qundo houve menor disponiilidde hídric, em detrimento d prte ére, estndo relciondo um medid de sorevivênci d plnt à restrição hídric. No cso do trtmento com CCHSAS, onde não ocorreu uso do ácido slicílico, houve juste exponencil o que demonstrou que com potencil osmótico de -0,89 MP resultou em um relção riz/prte ére máxim. Nos potenciis zero e - 1,2MP não houve diferenç entre os trtmentos. Nos potenciis -0,3 e -0,6MP s miores relções form encontrds no trtmento CCHSAS e s menores no trtmento SCHCAS. Os demis ficrm em posição intermediári. Coelho et l. (2010) verificrm que pr relção riz/prte ére ocorreu decréscimo pens pr solução osmótic com CCl 2, sendo que pr s soluções de mnitol, KCl e MgCl 2 os resultdos não form significtivos pr relção riz/prte ére.

31 30 SCHSAS SCHCAS CCHSAS CCHCAS Médi Interção (Trtmentos * Potenciis) não significtiv Trtmentos diferem pelo teste Tukey (P<0,05) y(médi)=0,595 +0,353x R 2 =0,9778** Médis = 0,4600 = 0,4856 = 0,3145 = 0,3788 (A) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 Mss sec totl (g) xx -1,2-0,9-0,6-0,3 0 Potencil osmótico (MP) 0 SCHSAS SCHCAS CCHSAS CCHCAS y( )=0,3542-0,3062x R 2 =0,9246** y( )=0,2553-0,3602x R 2 =0,8754** y( )=0,4389-0,8082x -0,4456x 2 R 2 =0,9429** y( )=0,247-0,59x R 2 =0,9360** (B) 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 Relção riz/prte ére xx -1,2-0,9-0,6-0,3 0 Potencil osmótico (MP) 0 FIGURA 4 - Mss sec totl (A) e relção riz/prte ére (B) e de sementes de feijão trtds com choque frio (7 o C 24h) e ácido slicílico (0,01 mm 48h) e sumetids à níveis de potencil osmótico do sustrto otidos com soluções de mnitol. Dentro de um mesmo potencil, letrs iguis indicm diferençs não significtivs pelo teste Tukey (P>0,05)

32 31 Em todos os trtmentos ocorreu umento do cúmulo de prolin (Figur 5) em relção o umento d restrição hídric com justes lineres crescentes, permitindo inferir que prolin foi um elemento do metolismo que fvoreceu o justmento d plântul às condições de estresse hídrico. A utilizção do ácido slicílico, do choque frio ou de mos crretou mior cúmulo de prolin, no mior potencil osmótico, demonstrndo possiilidde dos trtmentos plicdos às sementes terem tudo como sinlizdores tenundo os efeitos do estresse hídrico. Nos trtmentos sem estresse hídrico e com estresse moderdo, - 0,3 e -0,6MP, não houve diferenç no cúmulo de prolin ns plântuls. Mchdo Neto et l. (2004) verificrm que o cúmulo d prolin não foi liner e não foi dependente d tempertur. Hussein, Bl e Gllh (2007) oservrm em plnts de milho que tods concentrções de minoácidos form reduzidos pelo estresse slino, com exceção d prolin e d glicin. Pxedes, Ferreir e Gomes Filho (2009) consttrm que s folhs de feijão cupí, qundo túrgids, mntiverm o teor de prolin constnte. Porém, s sumetids à deficiênci de águ, cumulrm prolin ojetivndo um juste osmótico e defes contr desidrtção. A prolin tem proprieddes de juste osmótico sem cusr dnos os tecidos, qundo comprdo os justes efetudos por íons (LIMA et l., 2004). Skhutdinov et l. (2003) reltm que pode se esperr que o trtmento prévio com uso do ácido slicílico contriui pr o cúmulo de prolin so estresse, como foi verificdo neste trlho.

33 32 SCHSAS SCHCAS CCHSAS CCHCAS y( )=16, ,77x R 2 =0,8350** y( )=-45, ,74x R 2 =0,8963** y( )=-47, ,12x R 2 =0,9493** y( )=-24,59-890,32x R 2 =0,9305** Teor de prolin (ug ḡ 1 ) xx -1,2-0,9-0,6-0,3 0 Potencil osmótico (MP) 0 FIGURA 5 - Determinção do teor de prolin em plântuls otids de sementes de feijão trtds com choque frio (7 o C 24h) e ácido slicílico (0,01 mm 48h) e sumetids à níveis de potencil osmótico do sustrto otidos com soluções de mnitol. Dentro de um mesmo potencil, letrs iguis indicm diferençs não significtivs pelo teste Tukey (P>0,05) As proteíns de choque térmico ou estresse (HSPs) são proteíns que estão em tod prte d plnt e ltmente conservds. A respost e expressão são induzids por um grnde vriedde de contecimentos tnto fisiológicos como mientis permitindo que s céluls possm soreviver à condições onde normlmente morrerim (PARCELLIER et l., 2003). Sendo ssim, o ndemento de proteíns pode vrir pr cd mteril, espécie, potencil osmótico e estresse. Chu-Yung, Roerts e Key (1984) reltm que o ppel pr HSPs é de proteger s funções vitis e estruturis durnte o estresse térmico, permitindo ssim voltrem s funções normis rpidmente qundo s temperturs fvoráveis são estelecids. A disfunção de um proteín pode ser cusd por estresses ióticos. Mnter proteíns em su conformção funcionl são spectos importntes pr sorevivênci d célul so estresse. As proteíns de choque térmico (HSPs) são responsáveis pelo enrolmento, montgem, trnslocção, degrdção e tmém podem judr n renturção de proteíns e memrns so condições de estresse.

34 33 As proteíns LEA (Lte Emryogenesis Aundnt) estão ligds o estresse hídrico pel dessecção ou resfrimento, no entnto destcrm que s proteíns LEA form cpzes de suprimir gregção d proteín e intivção so estresse hídrico e que podem mnter su tividde enzimátic n desidrtção (GOYAL; WALTON; TUNNACLIFFE, 2005). A expressão ds proteíns d prte ére ds plântuls de feijão cujs sementes não form trtds com ácido slicílico nem com choque frio e ind não form sumetids à restrição de águ foi presentd n colun 7B d Figur 6B e C, presentndo nds com 106, 102, 67, 55, 40, 30, 22, 19 e 17kD representtivs do metolismo norml d prte ére ds plântuls. O perfil eletroforético d plicção d deficiênci de águ ns sementes não trtds (SCHSAS) foi presentdo ns coluns 8, 9 e 10B (Figurs 6B e C) onde se pode verificr expressão dicionl ds nds de 76 e 45kD n colun 9B (-0,6MP) lém d dição d expressão ds nds 90 e 85kD n colun 10B (-1,2MP) que podem sem interpretds como resultdo d respost metólic o trtmentos de restrição hídric plicdos. A menor restrição hídric, -0,3MP, colun 8B não presentou perfil diferente d testemunh, colun 7B. As sementes trtds pens com choque frio (CCHSAS) presentrm um nd diferencidor, em relção à testemunh (colun 7B), de 45kD nos potenciis zero e -0,3MP (Figur 6B e C - coluns 2 e 3B). Nos potenciis mis ixos ocorreu perd complet do pdrão protéico (Figur 6B e C - coluns 4 e 6B). Nos trtmentos com ácido slicílico, com choque (CCHCAS) ou sem choque frio (SCHCAS), notou-se expressão dicionl, em relção à colun 7B, ds nds 94, 88, 85, 81, 65, 45 e 37kD e usênci d nd de 67kD em todos os níveis de potencil osmótico, coluns 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 e 10A (Figur 6A e C). A expressão desss proteíns, pode ter efeitos n melhor repost fisiológic, como n mss sec com melhor desempenho com ácido slicílico. Singh e Ush (2003) reltm que mss sec ds plnts de trigo com estresse hídrico e plicção do ácido slicílico foi significtivmente mior que sem plicção do ácido slicílico. Rdwn et l. (2010) pesquisndo folhs de feijão infectdos com vírus mosico e trtds com ácido slicílico, reltm que o ácido slicílico induziu formção de novs nds de 36 e 68kD, indicndo que o ácido slicílico desempenh um ppel importnte n indução de resistênci.

35 34 A expressão ds proteíns d riz ds plântuls de feijão cujs sementes não form trtds com ácido slicílico nem com choque frio e ind não form sumetids à restrição de águ foi presentd n colun 7B d Figur 7B e C presentndo nds com 63, 50, 45, 43, 40,30, 26, 22, 19 e 17kD representtivs do metolismo norml d riz ds plântuls. O perfil eletroforético d plicção d deficiênci de águ ns sementes não trtds (SCHSAS) foi presentdo ns coluns 8, 9 e 10B (Figur 7B e C) onde se pode verificr expressão dicionl ds nds de 102 e 88kD ns coluns 9 e 10B (-0,6 e - 1,2MP) que podem sem interpretds como resultdo d respost metólic o trtmentos de restrição hídric plicdos. A menor restrição hídric, -0,3MP, colun 8B não presentou perfil diferente d testemunh, colun 7B. As sementes trtds pens com choque frio (CCHSAS) presentrm qutro nds diferencidors, em relção à testemunh (colun 7B), de 116, 106, 102 e 90kD em todos os potenciis (Figur 7B e C - coluns 2, 3, 4 e 5B). Nos trtmentos com ácido slicílico, com (CCHCAS) ou sem choque frio (SCHCAS), notou-se expressão dicionl, em relção à colun 7B, ds nds 106, 102kD e usênci ds nds de 50 e 26kD em todos os níveis de potencil osmótico, coluns 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 e 10A (Figur 7A e C).

36 35 A B 1A 2A 3A 4A 5A 6A 7A 8A 9A 10A 1B 2B 3B 4B 5B 6B 7B 8B 9B 10B C FIGURA 6 - Pdrão de nds de proteíns solúveis de prte ére de plântuls otids de sementes de feijão trtds com choque frio (7 o C 24h) e ácido slicílico (0,01 mm 48h) e sumetids à níveis de potencil osmótico do sustrto otidos com soluções de mnitol. A Esquerd CCHCAS; 1A pdrão moleculr; 2A 0MP; 3A -0,3MP; 4A -0,6MP; 5A pdrão moleculr; 6A -1,2MP; A Direit SCHCAS 7A 0MP; 8A - 0,3MP; 9A -0,6MP; 10A -1,2MP; B Esquerd CCHSAS; 1B pdrão moleculr; 2B 0MP; 3B -0,3MP; 4B -0,6MP; 5B -1,2MP; B Direit SCHSAS; 6B pdrão moleculr; 7B 0MP; 8B -0,3MP; 9B -0,6MP; 10B -1,2MP. C Esquem do perfil eletroforético de proteíns presentdo n prte A e B dest figur

37 36 A B 1A 2A 3A 4A 5A 6A 7A 8A 9A 10A 1B 2B 3B 4B 5B 6B 7B 8B 9B 10B C FIGURA 7 - Pdrão de nds de proteíns solúveis de riz de plântuls otids de sementes de feijão trtds com choque frio (7 o C 24h) e ácido slicílico (0,01 mm 48h) e sumetids à níveis de potencil osmótico do sustrto otidos com soluções de mnitol. A Esquerd CCHCAS; 1A pdrão moleculr; 2A 0MP; 3A -0,3MP; 4A -0,6MP; 5A -1,2MP; A Direit SCHCAS; 6A pdrão moleculr; 7A 0MP; 8A -0,3MP; 9A -0,6MP; 10A -1,2MP; B Esquerd CCHSAS; 1B pdrão moleculr; 2B 0MP; 3B -0,3MP; 4B -0,6MP; 5B pdrão moleculr; 6B -1,2MP; B Direit SCHSAS; 7B 0MP; 8B -0,3MP; 9B -0,6MP; 10B -1,2MP. C Esquem do perfil eletroforético de proteíns presentdo n prte A e B dest figur

38 37 6 CONCLUSÃO O trtmento ds sementes com ácido slicílico, 0,01 mm por 48 hors, mostrou-se promissor por tenur prcilmente deficiênci de águ durnte o crescimento inicil de plântuls de feijão.

39 38 BIBLIOGRAFIA ARAÚJO, J. L. S.; PINHEIRO, M. M.; RUMJANEK, N. G. Proteíns de choque térmico e tolerânci lts temperturs em plnts. Seropédic: Emrp Agroiologi, p. (Emrp CNPAB. Documentos, 80). ARAÚJO, J. L.; RUMJANEK, N. G.; PINHEIRO, M. M. Smll het shock proteins genes re differentilly expressed in distinct vrieties of common en. Brzilin Journl Plnt Physiology, v. 15, n. 1, p , ÁVILA, M. R. et l. Influênci do estresse hídrico simuldo com mnitol n germinção de sementes e crescimento de plântuls de cnol. Revist Brsileir de Sementes, v. 29, n. 1, p , BATES, L. S.; WALDREN, R. P.; TEARE, I. D. Rpid determintion of free proline for wter stress studies. Plnt nd Soil, v. 39, p , BENHAMOU, N.; NICOLE, M. Cell iology of plnt immuniztion ginst microil infection: the potencil of induced resistnce in controlling plnt diseses. Plnt Physiology nd Biochemistry, v. 37, n. 10, p , BRACCINI, A. L. et l. Influênci do potencil hídrico induzido por polietilenoglicol n qulidde fisiológic de semente de soj. Pesquis Agropecuári Brsileir, v. 33, n. 9, p , BRADFORD, M. M. A rpid nd sensitive method for the quntittion of microgrm quntities of protein utilising the principle of protein-dye inding. Anlyticl Biochemistry, v. 72, n. 1/2, p , BRAGA, L. F. et l. Efeito d disponiilidde hídric do sustrto n qulidde fisiológic de sementes de feijão. Revist Brsileir Sementes, v. 21, n. 2, p , BRAY, C. F. Biochemicl processes during the osmopriming of seeds. In: KIGEL, J.; GALILI, G. Seed development nd germintion. New York: Mrcel Dekker, p CARVALHO, N. M. de; NAKAGAWA, J. (Ed.). Sementes: Ciênci, Tecnologi e Produção. Joticl: FUNEP, p.