PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTIFICA CNPQ/UFPA RELATÓRIO TÉCNICO CIENTÍFICO

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1 SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTIFICA Período: fevereiro/2005 a agosto/2005 ( ) Relatório Parcial (x) Relatório Final CNPQ/UFPA RELATÓRIO TÉCNICO CIENTÍFICO IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa: Investigação Química de Plantas Amazônicas com Propriedades Biológicas Úteis. Resolução CONSEP ou Número de Portaria de Aprovação: 16771/71 Nome do Orientador: Lourivaldo da Silva Santos Titulação do Orientador: Doutor Departamento: Química Unidade: Centro de Ciências Exatas e Naturais Laboratório: Química / Pesquisa Nome do Bolsista: Isabel Cristina Serrão Ferreira Título do Plano de Trabalho: "Estudo Químico e Atividade Biológica da Biomassa Produzida por Fungo Endofítico Associado às Folhas de Virola Michellii"

2 1. INTRODUÇÃO: A espécie Virola michelii, conhecida popularmente como ucuúba preta, é uma planta da Amazônia cujas folhas são utilizadas por nativos da região como emplastos para alívio de irritações causadas por fungos e no tratamento de infecções da pele 1. Em trabalho 2 anterior foram isoladas substâncias pertencentes a classe dos flavonóides (flavonas) e lignanas furufurânicas a partir de extratos obtidos das folhas desta espécie. Neste momento a proposta é estudar os fungos associados a ela como endofíticos. Fungos endofíticos são fungos que durante um certo período de suas vidas, colonizam os tecidos internos de plantas sem causar sintomas à esta 3. As relações entre plantas e microorganismos já são conhecidas há muito tempo, entretanto, com raras exceções, acreditava-se que estas interações levavam a lesões nos tecidos vegetais 4. Mais recentemente, vem sendo registrada a presença de microorganismos no interior de tecidos vegetais sadios, especialmente bactérias e fungos, abrindo novas perspectivas para o estudo da interação planta/microorganismos 5-6. Nos anos 80 começaram a surgir na literatura relatos que evidenciavam que os microorganismos endofíticos, no caso fungos, podiam desempenhar um importante papel dentro de suas plantas hospedeiras. Foi demonstrado que a existência de um ou mais desses microorganismos podia ocasionar redução do ataque de insetos nos seus hospedeiros vegetais. Iniciaram-se as pesquisas sobre as causas dessas proteções e as variáveis envolvidas no processo. Atualmente, sabe-se que vários metabólitos secundários produzidos por esses endófitos são os agentes responsáveis pela proteção desses vegetais, o que vem a constituir um vasto campo de pesquisas na área da fitoquímica 6. Com base nessas informações, nosso grupo de pesquisa iniciou a implantação de uma nova linha de estudo no laboratório de Química/Pesquisa. Das folhas jovens da espécie Virola michelli foram isolados vários fungos que dentre esses isolados escolheu-se o fungo identificado como Pestalotiopsis

3 guepinii para realização do estudo químico e biológico da biomassa produzida por este endofítico. Neste relatório, será descrito o processo de isolamento dos fungos endofíticos da espécie Virola michelii, a obtenção dos extratos fúngico de Pestalotiopsis guepinii, o fracionamento dos extratos fúngicos, assim como os resultados dos bioensaios de alelopatia realizado com os extratos fúngicos brutos e o isolamento das substâncias ergosterol e peróxido de ergosterol obtidas do extrato hexânico. 2. OBJETIVOS: 2.1 GERAL: Isolar e cultivar fungo endofítico associado a Virola micheli e verificar as propriedades biológicas da biomassa produzida. 2.2 ESPECÍFICOS: Cultivar o fungo em diferentes meios de cultura e obter os extratos fúngicos: objetivo alcançado, pois os fungos foram isolados e escolheu-se o endofítico Pestalotiopsis guepinii para cultivo em grande escala e obtenção dos extratos brutos. Verificar as propriedades alelopáticas: objetivo alcançado, pois os bioensaios foram realizados com os extratos brutos na EMBRAPA sob a orientação do prof. Dr. Antônio Pedro da Silva Souza Filho. Os ensaios antimicrobianos dos extratos ainda não foram realizados, pois as bactérias solicitadas à FIOCRUZ não foram liberadas no período desejado pelo nosso grupo de pesquisa. Treinamento de bolsista de Iniciação Científica na técnica de isolamento e cultivo de fungos endofíticos: objetivo alcançado, e que vem sendo desenvolvido constantemente.

4 Implantação de uma nova linha de pesquisa no Laboratório de Química/Pesquisa: objetivo alcançado. 3. JUSTIFICATIVA: Apesar de devidamente comprovada a existência de microbiologia endofítica, existe uma série de razões para que se aprofundem estudos a respeito de aspectos ecológicos, genéticos, fisiológicos e químicos dessa interação. A aplicação desses microorganismos já é realidade e configura-se como avanço nas seguintes áreas: controle biológico de pragas e doenças, bioerbicidas, bioindicadores de vitalidade, vetores para introdução de genes em plantas, biorremediação de solos contaminados com poluentes e como produtores de antibióticos e outros metabólitos secundários de interesse farmacológico 7. Observou-se que alguns compostos de origem vegetal são produzidos por fungos que habitam essas plantas indicando haver um transmissor de genes entre vegetais e fungos em uma verdadeira engenharia genética in vivo 8. A quase totalidade das pesquisas desenvolvidas nessa linha tem sido realizadas com plantas de clima temperado, particularmente gramíneas que são largamente usadas na alimentação do gado, porém já foi comprovada uma maior riqueza desses microorganismos endofíticos relacionada à estação de chuvas. Assim, neste projeto elegemos como planta hospedeira a espécie Virola michelii (Myristicaceae), planta originária da região amazônica e que apresenta diversas atividades biológicas 9. O uso de fungos endofíticos abre novas áreas de exploração biotecnológica, que dita a necessidade de isolar, caracterizar e investigar os metabólitos secundários oriundos da relação planta/microorganismo, sendo que muitas dessas substâncias são inéditas e que podem ser utilizadas na indústria farmacêutica e na agricultura. Esta é uma nova linha de pesquisa que pode ser considerada implantada em nosso Laboratório.

5 4. DESENVOLVIMENTO EXPERIMENTAL 4.1 MATERIAIS Equipamentos Espectrofotômetro de ressonância Magnética Nuclear Modelo GEMINI 300- Varian. 75MHz (RMN 13 C) e 300MHz (RMN 1 H). Rotavapor MICRONAL. Autoclaves verticais- Modelo Au 75 PHOENIX Capela de fluxo laminar- Modelo PA 320 PACHANE Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência Shimadzu, composto por 2 bombas, modelo LC-10AD, detector de absorbância UV, modelo SPD- 10AV, degaseficador de membrana, modelo DGU-14A, injetor de amostras Rheodyne 7752i, com alça de amostragem de 20 ì L, interface de comunicação Shimadzu, modelo CBM 10A acoplado a microcomputador Pentium II com software de integração Class LC-10. Balança analítica Sartorius; Ultra-som Branson Solventes Isolamento e purificação de amostras: hexano, acetato de etila, diclorometano e metanol (SYNTH e QUIMEX). Espectros de RMN 1 H e 13 C: solvente deuterado CDCl 3. Solventes Grau HPLC: Acetonitrila, Metanol, isopropanol, tetrahidrofurano todos da TEDIA BRASIL. A água foi purificada em um sistema de água Milipore ELGA MAXIMA (18,2M Ω).

6 4.1.3 Substratos utilizados para o cultivo em meio sólido Arroz Uncle beens Milho Yoki para canjica Substâncias utilizadas para o cultivo em meio líquido NaNO 3 K2HPO4 MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O Água destilada Glucose Extrato de levedura Dextrose Batata inglesa Técnicas Cromatográficas Cromatografia em coluna (CC): colunas de vidro, diâmetro e altura conforme o peso da amostra. Cerca de 20g de sílica gel 60G ( e mesh, ASTM. Merck) por grama da amostra. Cromatografia em coluna à vácuo (CCV). Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC): placas de vidro de 5x10 cm ou 10x20 cm, preparadas com camadas de sílica (sílica gel 60G- Merck) de 0,5 mm de espessura. Cromatografia em Camada Delgada Preparativa (CCDP): placas de vidro de 20x20 cm, preparadas com camada de sílica (sílica gel 60 PF-254 MERCK) DE 1 mm de espessura. Cromatografia Líquida de alta eficiência (CLAE): colunas com fase estacionária C18 com dimensões de 250x4.60mm e 250x10.00 mm (Luna 5u e Synergi fusion 4u) ambas fornecidas pela Phenomenex. Para o tratamento das amostras foram utilizados cartuchos com fase estacionária C18 da Phenomenex.

7 4.2 MÉTODOS COLETA DO MATERIAL BOTÂNICO As folhas de Virola michelii foram coletadas em Belém-PA por técnicos da EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) e identificadas por Botânicos da mesma instituição em cujo herbário encontra-se depositada uma exsicata.

8 TABELA 01: Fungos endofíticos isolados de Virola michelii Parte da planta Folhas jovens Galhos Fungo isolado Pestalotiopsis guepinii Coelomyceto Paecylomyces variotii Fungo 01 Fungo 09 Fungo 14 Fungo 18 Fungo 19 Fungo 23 Fungo 24 Fungo 24 Colletotrichum gloeosporioides Paecylomices varioti Fungo 02 Fungo 08 Fungo 15 Fungo 16 Fungo 25 Os fungos isolados codificados nesta tabela ainda não foram identificados, mas o processo está em andamento.

9 4.2.3 Cultivo em meio líquido. Para o cultivo em meio CzapeK s, enriquecido com 2% de extrato de levedura, foram utilizados 36 Erlenmeyeres de 1L contendo 300 ml do meio de cultivo, os quais, após autoclavagem foi introduzido o fungo e incubado a 25ºC durante 30 dias. TABELA 2: Meio Czapek s enriquecido com 2% de extrato de levedura Reagentes Quantidades NaNO 3 3,0g K 2 HPO 4 1,0g MgSO 4.7H 2 O 0,5g KCl 0,5g FeSO 4.7H 2 O 0,01g Glicose 30g Extrato de levedura 20g H 2 O qsp 1L Obtenção dos extratos. Após os 30 dias de incubação do fungo P. guepinii no meio Czapek s foram obtidos dois materiais por filtração utilizando como filtro duas fraldas de algodão: o micélio e o filtrado. a) Extrato micelial Ao micélio foi acrescentado metanol por um período de cinco horas com dois objetivos: o metanol, por ser tóxico, destrói os esporos o que diminue o risco de contaminação durante o manuseio e o segundo é a obtenção imediata de um extrato (MeOH 1).

10 b) Extrato do Filtrado O filtrado obtido foi submetido à partição líquido-líquido com acetato de etila (3x) sempre na proporção 1:1. A fase acetato foi posteriormente concentrada para a obtenção do extrato acetato de etila. Ver fluxograma Cultivo nos cereais (arroz e milho) Para o cultivo nos cereais foram colocados 100g do cereal em de 500mL contendo 30mL de água destilada, totalizando 40 Erlenmeyers. Esse meio foi autoclavado por 45 minutos à temperatura de 121ºC. Deixou-se o material atingir a temperatura ambiente e introduziu-se o fungo nos Erlemeyeres, então estes foram incubados a 25ºC por 30 dias. a) Obtenção dos extratos Após o período de incubação foi acrescentado metanol aos frascos de Erlemeyeres com o mesmo objetivo que o descrito no item Após o período de cinco horas o cereal foi seco em estufa a 45ºC. Do material seco foram obtidos os extratos conforme mostra o fluxograma 02. b) Fracionamento dos extratos. Os extratos foram fracionados em coluna cromatográfica (CC). As frações obtidas foram purificadas por CC, por cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP), recristalização e CLAE. As estruturas dos constituintes químicos isolados foram determinadas através de métodos espectroscópicos, tais como RMN 1 H e RMN 13 C uni e bidimensional. Foram obtidos seis extratos ao todo. O extrato metanólico originado do processo de eliminação do fungo cultivado em ckzapec, o extrato da fase acetato, o extrato metanólico (MeOH-1) originado do processo de eliminação do fungo

11 cultivado em arroz, assim como os extratos hexânico, acetato de etila e metanólico (MeOH-2) originados do processo de percolação a partir do arroz seco. O extrato metanólico por não ser guardado em geladeira fungou, e, portanto foi descartado. A fase acetato de etila após concentração rendeu 1,5g de extrato que foi fracionado e as suas frações refracionadas, porém sempre resultando em frações com pouca quantidade de massa e em grandes misturas, por este motivo, resolveu-se fracionar os extratos em apenas uma etapa, com sistemas préestabelecidos num total de cinco a seis frações, em seguida essas frações seriam injetados no cromatógrafo líquido de alta eficiência para uma análise prévia do perfil cromatográfico de cada uma das frações e assim se fez. O extrato hexânico obtido da extração por percolação do meio sólido (arroz) após concentração consistiu de duas fases, uma liquida e uma sólida. O sólido foi lavado com hexano a frio e os cristais resultantes foram analisados através de técnicas uni e bidimensionais de RMN 1 H e 13 C, o que levou a identificação do esteróide ergosterol S1, ver fluxograma 03. A fase líquida foi fracionada em coluna cromatográfica de sílica gel, com o sistema de eluentes em gradiente crescente de polaridade com hexano e acetato de etila e as frações obtidas foram submetidas à análise de RMN 1 H, fluxograma 04. A fração hex/acoet 60% foi analisada por CLAE, usando um sistema isocrático MeCN:H 2 O 37%, uma coluna analítica com fase estacionária C18 da synergi fusion, de acordo com o tempo de retenção dos picos observados submeteu-se à fração a um novo fracionamento, sendo este analítico, usando um cartucho com fase estacionária C18 com 1mL de volume. Tomou-se 10mg da fração hex/acoet 60% e solubilizou-se em 1mL de MeCN:H 2 O 50% fazendo-a passar pelo cartucho seguida de dois outros sistemas, MeCN:H2O 50% e MeCN 100% de iguais volumes. Esse novo fracionamento resultou em três novas frações que analisadas por CLAE mostrou um bom resultado, ou seja, conseguiu-se separar os metabólitos em bloco de acordo com os novos tempos de retenção observados. Visto que a metodologia foi eficiente, a mesma foi repetida, porém não mais em um cartucho analítico e sim em um com 25mL de volume. As duas primeiras frações estão sendo estudadas por obter a melhor metodologia de

12 isolamento por CLAE e a terceira fração foi submetida a análises espectroscópicas levando a identificação do peróxido de ergosterol S2, o fluxograma 05 abaixo resume este procedimento experimental. As demais frações do extrato hexânico consistem de um triglicerídeo que se encontra em fase de identificação estrutural. O extrato acetato de etila obtido do processo de percolação do meio sólido (arroz) consistiu de um único triglicerídeo que também se encontra em fase de determinação estrutural. O extrato metanólico-2 obtido do meio sólido por percolação foi particionado com eluentes em gradiente crescente de polaridades, hexano, diclorometano e acetato de etila, estas fases foram submetidas as análises espectroscópicas, porém ainda não foram estuda por CLAE. O extrato metanólico-1 obtido do processo de eliminação do fungo foi submetido à partição com hexano, diclorometano e actetato de etila, onde o procedimento utilizado, assim como a fase obtida encontra-se resumidas no fluxograma 06 abaixo. A fase hexânica obtida da partição do extrato metanólico-1 foi fracionada e as suas frações analisadas no cromatógrafo líquido de alta eficiência, onde a análise cromatográfica da fração C14 hexano/acetato 20% usando um sistema isocrático MeCN:H 2 O 37% e o par de colunas analítica e semipreparativa com fase estacionária C18 da synergi fusion levou ao isolamento da substância S3 em fase de identificação estrutural. A fase diclorometânica assim como a fase acetato de etila foram fracionadas e as suas frações estão sendo analisadas no cromatógrafo líquido de alta eficiência. Os fluxogramas abaixo resumem de forma clara os procedimentos experimentais aqui descritos.

13 FLUXOGRAMA 01: Obtenção dos extratos de P. guepinii do cultivo no meiolíquido. Pestalotiopsis guepinii 1- Cultivo em czapek`s (30 dias) 2- Filtração Micélio Filtrado 1- Adição de MeOH (5 horas) 2- Filtração Partição em Acetato Resíduo Filtrado Fase AcOEt Resíduo Concentração a vácuo em evaporador rotativo Concentração a vácuo em evaporador rotativo Extrato MeOH Extrato da fase AcOEt (1,53g)

14 FLUXOGRAMA 2: Representação dos processos de obtenção dos extratos de P. guepinii do cultivo no meio sólido (arroz). Pestalotiopsis guepinii 1- Cultivo em arroz (30 dias) 2- Adição de MeOH 3- Filtração MeOH Extrato MeOH1 157,304g Concentração em evaporador rotativo 1- Extração com AcOEt 2- Filtração 3- Concentração Cereal Cereal 1- Secagem em estufa a 45ºC 2- Extração com Hexano 3- Filtração e concentração Extrato Hexanico 5,074g 1- Extração com MeOH 2- Filtração 3- Concentração Cereal Extrato AcOEt 34,3078g Cereal Extrato MeOH2 135,176g

15 FLUXOGRAMA 3 : Isolamento do ergosterol a partir do extrato bruto hexânco. Extrato Hexânico 9g Separacão dos cristais por catação Cristais 300mg Extrato Hexânico 8,5g RMN 1 H e 13 C (S1)

16 FLUXOGRAMA 4: Fracionamento do extrato hexânico Extrato Hexânico 8,5g CCVU normal concentração Hex 100% Hex/acet 20% Hex/acet 40% Hex/acet 60% Acet 100% Acet/MeOH 30% Acet/MeOH 60% MeOH 100%

17 FLUXOGRAMA 5: Estudo da fração hexano/acetato 60% originada do extrato hexânico. Hex/Acet 60% 700Mg Cartucho de 25 ml de Volume em C18 da Phenomenex Hex/Acet 60% em MeCN:H 2 O 1:1 MeCN:H2O 1:1 MeCN 100% F1 231mg F2 75mg F3 56 mg RMN 1 H e 13 C S2 56 mg

18 FLUXOGRAMA 6: Partição do extrato metanólico obtido do processo de eliminação do endofítico P.guepinii MeOH-1 105g 350 ml de H 2 O ml de MeOH solubilização adição de hexano filtração concentração Fase Hexância 1,026g Solução hidroalcóolica adição de diclorometano filtração concentração Fase diclorometância 1,045g Solução hidroalcóolica adição de acetato de etila filtração concentração Fase acetato de etila 2,366g Solução hidroalcóolica Como a biomassa foi produzida por fungo e que foi cultivaldo em um meio bastante nutritivo a possibilidade de proliferação de microorganismos é muito maior que biomassa produzida por vegetais, por este motivo, os extratos foram guardados na geladeira e dessa forma não foi possível uma total secura dos

19 mesmos, ou seja, o peso mencionado do extrato metanólico-1 é um peso aparente. A partição foi feita em duas etapas na primeira foi usado 20g e na segunda 85g o que resulta na massa exposta no fluxograma, ambas as partições foram realizadas com a mesma metodologia, usado 500 ml de cada solvente (hexano, diclorometano e acetato de etila) em triplicata. 5. ALELOPATIA. O termo alelopatia foi criado pelo pesquisador alemão Hans Molisch 10 e significa do grego allelon = mútuo, pathos = prejuízos. O conceito descreve a influência de um indivíduo sobre o outro, seja prejudicando ou favorecendo o segundo. Sugere que o efeito seja realizado por biomoléculas (denominadas aleloquímicos) produzidas por uma planta e lançadas no ambiente, seja na fase aquosa e liberadas para o solo ou substrato, seja por substâncias gasosas volatilizadas no ar que cerca as plantas 11. Rice 12 definiu alelopatia como: qualquer efeito direto ou indireto danoso ou benéfico que uma planta (incluindo microorganismo) exerce sobre outra pela produção de compostos químicos liberados no ambiente. A atividade dos aleloquímicos pode ser utilizada como alternativa estratégica ao uso de herbicidas, inseticidas e nematicidas (defensivos agrícolas). A maioria dessas substâncias provém do metabolismo secundário, porque na evolução das plantas representaram alguma vantagem contra ação de microorganismos, vírus, insetos, e outros patógenos ou predadores, seja inibindo a ação destes ou estimulando o crescimento das plantas Assim, a vegetação de uma determinada área pode ter um modelo de sucessão condicionada às plantas pré-existentes e as substâncias químicas que elas liberam no meio. Da mesma forma, nos manejos agrícolas, florestais e na horticultura, a ocupação prévia da área pode ter significativa influência sobre os cultivos que estão sendo instalados.

20 5.2 BIOENSAIOS ALELOPÁTICOS DOS EXTRATOS HEXÂNICO, ACETATO DE ETILA, MEOH- 1 E MEOH- 2. Os extratos hexânico, acetato de etila e metanólico obtidos a partir do processo de extração do meio sólido (arroz) seco e moído, assim como o extrato metanólico obtido do processo de morte do fungo Pestalotiopsis guepinii foram submetidos aos bioensaios de alelopatia na concentração de 1% (m/v), utilizando como testemunha água destilada frente as espécies invasoras de pastagens Senna obtusifolia (Mata-pasto) e Mimosa pudica (malícia). Os ensaios foram realizados em um período de 5 dias, em condições de 25 C de temperatura constante e fotoperíodo de 12 horas, visando a inibição da germinação, do desenvolvimento do hipocótilo e da radícula, onde cada ensaio foi feito em duplicata. Cada placa de petri de 9,0 cm de diâmetro recebeu 3,0 ml dos extratos. Após evaporação do solvente, adicionou-se água destilada, quando necessário, mantendo-se, dessa forma, a concentração original. Na analise da germinação cada placa de petri recebeu 10 sementes, sendo contadas diariamente e eliminadas as sementes germinadas. Nos ensaios sobre o desenvolvimento da radícula e do hipocótilo, foram utilizadas quatro sementes pré-germinadas por placa de petri. Ao final do período de cinco dias de crescimento mediu-se o comprimento da radícula e do hipocótilo para determinar a variação de desenvolvimento. As sementes das plantas invasoras utilizadas nos bioensaios foram coletadas em áreas de pastagens cultivadas no município de Castanhal, Estado do Pará. Passaram por um processo de limpeza e expurgo e foram tratadas com vista à quebra de dormência.

21 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO. 6.2 DISCUSSÂO DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS SUBSTÂNCIA S1: ERGOSTEROL HO No espectro de RMN 1 H de S1 (Fig.1) observa-se um multipleto em 3,63 ppm típico de hidrogênio ligado a carbono carbinólico. O multipleto em 5,20 ppm é característico da presença de hidrogênios olefínicos. Esses sinais juntamente com os sinais em 0,63; 0,81; 0,85; 0,94; e 1,02 (ppm) caracterizam uma substância com esqueleto esteroidal. Por se tratar de uma substância isolada de um fungo, logo pensou-se no esteróide ergosterol muito comum e abundante na maioria das espécies fúngicas. Para confirmar esta hipótese foi realizado um espectro de RMN 13 C e DEPT, onde esses dados foram comparados com os reportados na literatura 15, os quais mostram total similaridade.

22 TABELA 3: Dados de RMN 13 C (75 MHz, CDCl 3 ) de S1 em comparação com dados publicados na literatura 15. C äs 2 ä 15 C äs 2 ä ,8 38, ,0 23,1 2 31,9 32, ,1 39,4 3 70,4 69, ,8 56,0 4 40,8 41, ,0 11, ,3 140, ,2 16, ,6 119, ,4 40, ,3 116, ,6 19, ,8 140, ,0 132,2 9 46,2 46, ,5 136, ,0 37, ,8 43, ,1 21, ,9 19, ,3 28, ,1 33, ,8 43, ,1 21, ,5 54, ,6 17, SUBSTÂNCIA S2: PERÓXIDO DE ERGOSTEROL HO O O A substância S2 foi isolada em mistura com um composto graxo, este mesmo composto graxo foi isolado da mesma fração em estudo e analisado por métodos espectroscópicos de RMN 1 H e 13 C na qual foram de fundamental importância, visto que a partir de seus espectros foi possível excluir os sinais deste composto graxo dentre os do peróxido de ergosterol.

23 Ao analisar o espectro de RMN 1 H (Fig.2) da mistura, observa-se para S2 um multipleto em 3,93 ppm, típico de hidrogênio carbinólico, o conjunto de sinais entre 5,00 ppm e 5,30 ppm associado ao número de metilas nos levou a informação de que se tratava de uma substância com esqueleto esteroidal. Os dupletos em 6,24 ppm e 6,50 ppm com J=8,4 Hz sugere que estes hidrogênios estejam cis relacionados. No espectro de RMN 13 C (Fig.3) observa-se 28 sinas de carbonos (excluídos os sinais do composto graxo) o que é coerente com substâncias que apresentam esquelo esteroidal. Dentre esses, três sinais são típicos de carbono carbinólico (66,35 ppm; 79,41 ppm e 82,16 ppm). A comparação destes dados com dados da literatura mostrou uma total coincidência dos valores de deslocamento químico de S2 com o do esteróide peróxido de ergosterol Além das coincidências dos deslocamentos químicos, os espectro de COSY(Fig.4), DE, HETCOR(Fig.5) e HMBC (Fig.6) confirmam a proposta estrutral. O espectro de DEPT, mostra de forma clara onze sinais de carbonos metínicos (CH), sete sinais de carbono metilênicos (CH 2 ) e seis sinais de metilas, excluídos os sinais referentes ao composto graxo. O espectro de COSY mostra a correlação dos sinais em 6,22 ppm e 6,48 ppm referente ao acoplamento de H6 com H7 e uma outra correlação entre os sinais em 5,12 ppm (dd, J= 15,3 Hz e J= 7,2 Hz) e 5,21 ppm (dd, J= 15,3 Hz e J= 7,2 Hz) referentes aos hidrogênios H22 e H23, respectivamente, e destes com os sinais em 1,82 ppm e 1,98 ppm atribuídos pelo espectro de HETCOR aos hidrogênios H20 e H24, respectivamente. Além das correlações mencionadas, são observadas uma série de outras atribuídas aos carbonos metilênicos do peróxido de ergosterol e do composto graxo. O espectro de HETCOR mostra 5 correlações bem evidentes, a correlação dos sinais em 135,1 ppm (C6) com o sinal em 6,22 ppm (H6); 130,6 ppm (C7) com o sinal em 6,48 ppm (H7); 135,4 ppm (C22) com o sinal em 5,21 ppm (H22); 132,2 ppm (C23) com o sinal em 5,12 ppm (H23) e 66,3 ppm (C3) com o sinal em 3,93 ppm (H3).

24 Ao analisar o espectro de HMBC é possível assinalar a correlação entre H6 (6,22 ppm) com C5 (82,2 ppm), C7 (130,6 ppm) e C8 (79,4 ppm), assim como a correlação entre H7 (6,48 ppm) com C5 (82,2 ppm), C8 (79,4 ppm) e C6 (135,14 ppm). Além destas correlações também observa-se a correlação do H22 (5,21 ppm) com C20 (39,7 ppm) e com o C24 (42,7 ppm), assim como a correlação do H23 (5,12 ppm) com o C20 (39,7 ppm) e com o C24 (42,7 ppm). Esse conjunto de informações mostra de forma clara que a substância S2 em questão, é o peróxido de ergosterol. TABELA 4: Dados de RMN 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) de S2 em comparação com dados publicados na literatura 16. H äh S2 ähs 2 16 H-3 3,93 (m) 3,96 (m) H-6 6,22 (d) 6,24 (d) H-7 6,48 (d) 6,50 (d) Me-18 1,24 (s) 1,23 (s) Me-19 0,88 (s) 0,88 (s) Me-21 0,90 (d) 0,90 (d) H-20 1,82 (m) - H-22 5,21 (dd) 5,20 (dd) H-23 5,12 (dd) 5,15 (dd) H-24 1,98 (m) - Me-26 0,83 (d) 0,84 (d) Me-27 0,80 (d) 0,81 (d)

25 TABELA 5: Dados de RMN 13 C (75 MHz, CDCl 3 ) de S2 em comparação com dados publicados na literatura 17. C äs 2 ä 17 C äs 2 ä ,9 30, ,3 23,4 2 34,6 34, ,6 28,6 3 66,3 66, ,1 56,3 4 39,2 39, ,8 12,9 5 82,2 82, ,1 18, ,1 135, ,7 39, ,6 130, ,8 20,9 8 79,4 79, ,4 135,4 9 51,0 51, ,2 132, ,7 37, ,7 42, ,6 20, ,00 33, ,7 37, ,6 19, ,5 44, ,9 19, ,6 51, ,5 17,6

26 6.2 AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ALELOPÁTICAS DOS EXTRATOS BRUTOS FRENTE À GERMINAÇÃO DAS SEMENTES, DESENVOLVIMENTO DA RADÍCULA E DO HIPOCÓTILO. Nos testes realizados em geral, os extratos metanólico 1 e 2 (extratos mais polares), apresentaram maior potencial alelopatico. Das espécies receptoras, as sementes de malícia foram inibidas com mais intensidade. É importante relatar que ao final dos ensaios as espécies receptoras, plantas invasoras de pastagens, morreram. Os gráficos abaixo exibem de forma clara os resultados obtidos Hexânico Acetato MeOH 1 MeOH 2 Gráfico 1: Efeitos dos extratos brutos na concentração de 1% (m/v) sobre a germinação das sementes de mata-pasto. Dados expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (água destilada).

27 Hexânico Acetato meoh 1 MeOH 2 Gráfico 2: Efeitos dos extratos brutos na concentração de 1% (m/v) sobre a germinação das sementes de malícia. Dados expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (água destilada) Hexânico Acetato MeOH 1 MeOH 2 Gráfico 3: Efeitos dos extratos brutos na concentração de 1% (m/v) sobre o desenvolvimento da radícula das sementes de mata-pasto. Dados expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (água destilada).

28 Hexânico Acetato MeOH 1 MeOH 2 Gráfico 4: Efeitos dos extratos brutos na concentração de 1% (m/v) sobre o desenvolvimento da radícula das sementes de malícia. Dados expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (água destilada) Hexânico Acetato MeOH 1 MeOH 2 Gráfico 5: Efeitos dos extratos brutos na concentração de 1% (m/v) sobre o desenvolvimento do hipocótilo das sementes de mata-pasto. Dados expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (água destilada).

29 Hexânico Acetato MeOH 1 MeOH 2 Gráfico 6: Efeitos dos extratos brutos na concentração de 1% (m/v) sobre o desenvolvimento do hipocótilo das sementes de malícia. Dados expressos em percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (água destilada).

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36 7. CONCLUSÃO. A partir das folhas e galhos jovens da espécie Virola michelii foram isolados 17 fungos endofíticos: Pestalotiopsis guepinii, Coelomyceto, Paecylomyces variotii, Colletotrichum gloeosporioides e os demais fungos estão em fase de identificação. Dos endofíticos isolados escolheu-se o fungo identificado como Pestalotiopsis guepinii que foi cultivado em grande escala utilizando meios de cultura diferentes. Do filtrado obtido pela incubação do P. guepinii no meio Czapek s, que foi submetido à partição líquido-líquido com acetato de etila, obteve-se o extrato da fase acetato. A partir do processo de extração do meio sólido (arroz) que foi seco e moído obteve-se os extratos hexânico, acetato de etila e os extratos Metanólicos 1 e 2. Do estudo químico do extrato hexânico foram isoladas duas substâncias: o ergosterol (S1) e o peróxido de ergosterol (S2), assim como um triglicerídeo que se encontra em fase de identificação estrutural. Também encontram-se em fase de determinação estrutural um triglicerídeo isolado no extrato acetato de etila, a substância S3 isolada na fração C14 hexano/acetato 20% obtida da fase hexânica do extrato metanólico-1. Os extratos hexânico, acetato de etila e metanólicos 1 e 2 (MeOH-1 e MeOH-2) foram submetidos aos bioensaios de alelopatia utilizando como plantas invasoras de pastagens a Mimosa pudica (malicia) e a Senna Obtusifolia (matapasto). Nos testes realizados, os extratos mais polares mostraram-se mais ativos nos ensaios visando à inibição do desenvolvimento da radícula, do hipocótilo e germinação. Frente à espécie malícia os extratos MeOH-1 e MeOH-2 inibiram, respectivamente, o desenvolvimento da radícula (49% e 48%), do hipocótilo (55% e 51%) e da germinação de sementes (94% e 80%). Já frente à espécie matapasto os extratos MeOH-1 e MeOH-2 inibiram o desenvolvimento da radícula (51% e 38%), do hipocótilo (48% e 43%) e da germinação (100% e 67%). A partir desses dados conclui-se que das espécies receptoras, no conjunto de dados, a malícia apresentou maior sensibilidade aos efeitos inibitórios dos

37 extratos. Entretanto, na germinação de sementes da espécie mata-pasto, o extrato MeOH1 apresentou 100% de inibição. Um fato importante que deve ser relatado é a morte das espécies receptoras, as plantas invasoras de pastagens, ao final dos bioensaios e este resultado encontra-se em investigação.

38 8. TRABALHOS BUBLICADOS. Lima, M. N.; Ferreira,I. C. S.; Souza Filho, A.P. S.; Arruda, M. S. P., Guilhon, G. M.S.P.; Muller, A.H.; Santos, A.S.; Rodrigues-Filho, E.; Marinho, A. M. R. e Santos, L.S.. Potencial alelopático dos extratos do endofítico Pestalotiopsis guepinii associado à espécie Virola michelii. 28 a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química-SBQ Poços de Caldas-MG. Cavalcante, F.O.R.; Lima, M. N. ; Borges, F. C.; Monteiro, M. N. P.; Ferreira,I. C. S ; Santos, A.S.; Rodrigues-Filho, E.; Marinho, A. M. R.; Guilhon, G. M.S.P.; Santos, L.S. Isolamento e dentificação de fungos endofíticos associados à Virola michelii. XLV Congresso Brasileiro de Química. Belém-PA. Setembro (aceito para apresentação).

39 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. GOTTLIEB, O.R.; Yoshida, M., Química Nova, 7, 250 (1984) 2. BORGES, F. C.; Estudo Fitoquímico, Alelopático e Farmacológico de Constituintes Químicos das Folhas de Virola michelii e Virola surinamensis. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós -Graduação em Química- UFPA, Belém-PA, PETRINI, O.; Sieber, T. N.; Toti, O. Ecology, metabolite production, and substrate utilization in endophytic fungi. Natural toxis, 1: , MELO, I.S.; AZEVEDO, J.L. Controle Biológico. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, V.3, p MARINHO, A. M. do R.; Investigação e Propriedades Biológicas dos Extratos do Fungo Penicillium janthinellum aos Frutos de Melia azedarach(meliaceae). São Carlos. Programa de Pós -Graduação em Química - UFSCar, Dissertação de Mestrado. 6. TRABULSI, L.R. Microbiologia. 3ª ed. São Paulo. Atheneu Editora, p AZEVEDO, J.L.; Microorganismos Endofíticos. In: MELO, I.S.; AZEVEDO, J.L., ed. Ecologia Microbiana. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, P CARVALHO, J.C.T.; SANTOS, L.S.; CORRÊA, M.J.C.; CAMPOS, L.M.O.; BASTOS, J.K. e SARTI, S.J., Anti-inflammatory activity of flavone and some of its derivates from Virola michellii Heckel. Journal of Ethnopharmacology 64(2), (1999). 9. SANTOS, L.S.; CORRÊA, M.J.C.; CAMPOS, L.M.O. e ANDRADE, M.A. Contituents from the leaves of Virola michellii. Fitoterapia, 67 (6), (1996) 10. MOLISCH, H. Der einfluss einer Pflanze auf die andere Allelopathie. Jena, Fischer (1937). 11. RIZVI, S.J.H.; HAQUE, H.; SINGH, U.K.; RIZVI, V. A discipline called allelopathy. In: RIZVI, S.J.H.; RIZVI, H (Eds.). Allelopathy: Basic and applied aspects. London, Chapman & Hall,.1(1992). 12. RICE, E.L., Allelopathy. 2nd ed, New York, Academic Press (1984). 13. WALLER, G.R., Introduction. In: MARCIAS, F.A.; GALINDO, J.C.G.; MOLINILLO, J.M.G.; Cutler, H.G. (Eds.) Recent advances in allelopathy. Cadiz, Serv. Pub. Univ. Cadiz. 1, sem paginação(1999).

40 14. WALLER, G.R.; Feug, M.C.; Fujii, Y., Biochemical analysis of allelopathic compounds: plant, microorganisms, and soil secondary metabolites. In: INDERJIT; DAKSHINI, K.M.M. & FOY, C.L (Eds.). Principles and practices in plant ecology. Boca Raton, CRC Press, 75 (1999). 15. BREITMAEIR, E., Carbon-13 NMR Spectroscopy. New York, Jonh Wiley e Sons, BARROS, F.A., Dissertação de Mestrado. DQ-UFSCar, YUE, J.; CHEN, S.; LIN, Z; SUN, H. Sterol from the Fungos Lactarium Volumes. Phytochemistry. 2001, 56, MARINHO, A. M. R., Dissertação de Mestrado Investigação Química e Propriedades Biológicas dos Extratos do Fungo Penicillium janthinellum Associado como Endofítico aos Frutos de Mellia azedarach (Meliaceae), pp.160. DQ-UFSCar,2002.

41 PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das atividades do aluno e justificativa do pedido de renovação, se for o caso. A bolsista desenvolveu seu trabalho com seriedade e dedicação, cumprindo o cronograma previsto no Plano de Trabalho e, como descrito neste Relatório Final, obteve resultados significativos, isolando e identificando duas substâncias produzidas por fungos. Vale ressaltar que esta linha de pesquisa (Metabólitos Secundários de Fungos Endofíticos) está sendo implantada em nosso grupo de pesquisa. Os resultados deste estudo foram divulgados na 28º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. Poços de Caldas (MG), com apresentação de um trabalho, e um outro trabalho foi aceito para apresentação no XLV Congresso Brasileiro de Química, a ser realizado em setembro/2005, em Belém-PA. Portanto, somos de parecer FAVORÁVEL à aprovação deste relatório. DATA : 26 / 08 / 2005 ASSINATURA DO ORIENTADOR Prof. Dr. Lourivaldo da Silva Santos ASSINATURA DO ALUNO Isabel Cristina Ferreira Serrão