HDL LD. 01 Português - Ref.: 128. Ref.:128 MS Instruções de Uso. Finalidade. Metodologia. Reagente. Princípio

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1 HDL LD Instruções de Uso Ref.:128 MS Finalidade. Sistema para determinação quantitativa e direta da lipoproteína de alta densidade do colesterol (HDL) em amostras de soro e plasma. [Somente para uso diagnóstico in vitro.] Princípio. O método é baseado em uma modificação dos métodos clássicos de co-precipitação utilizando quantidades otimizadas do ácido polivinil sulfônico (PVS) e polietilenoglicol metil eter (PEGME) associados ao uso de detergentes seletivos. Na primeira etapa da reação, LDL, VLDL e quilomicrons (CM), reagem com o PVS e PEGME e a reação resulta em inacessibilidade do LDL, VLDL e quilomicrons para as enzimas colesterol oxidase (CHOD) e colesterol esterase (CHER). Após a adição do reagente 2, as enzimas CHOD e CHER reagem especificamente com o HDL presente nas amostras, produzindo H2O2 que é detectado pela reação de Trinder. A intensidade da cor formada é diretamente proporcional à concentração de colesterol HDL na amostra. HDL + LDL + VLDL + CM PVS / PEGME HDL + CHOD + CHER 2H O + 4-AA + TODB Características do sistema. HDL+ (LDL + VLDL + CM) PVS/PEGME Ácido graxo + H O Quinoneimina + 5H O Devido à importância da medição exata do colesterol HDL, é desejável utilizar um método de referência. O método de referência que combina a ultracentrifugação com a precipitação química para separar HDL, dosando o colesterol com o método de Abell-Kendall é intensivo em tempo e operações e tem aplicação limitada no laboratório clínico. O sistema HDL LD é um método homogêneo líquido para medição direta do colesterol HDL e consiste em um processo simples, de fácil execução e apresenta características de precisão e exatidão que atendem os requisitos de desempenho propostos pelo Programa Nacional de 1 Educação em Colesterol (NCEP-EUA), em vigor desde A especificidade é conseguida pela ação seletiva do surfactante presente no Reagente 1 que resulta em inacessibilidade do LDL, VLDL e quilomicrons para as enzimas colesterol oxidase (CHOD) e colesterol esterase (CHER), que irão reagir especificamente com o colesterol HDL. Valores de triglicérides até 400 mg/dl, bilirrubina até 40 mg/dl, bilirrubina conjugada até 30 mg/dl, hemoglobina até 1000 mg/dl e ácido ascórbico até 10 mm não interferem significativamente na reação. 2 2 A flexibilidade do método torna-o facilmente aplicável em analisadores automáticos capazes de processar reação de ponto final com dois reagentes e medição em 600 nm. Metodologia. Reagente 1. - Surfactante seletivo 1 Reagente 1 - Armazenar entre 2-8 ºC. Pronto para uso. Contém Tampão MES ph 6,5 500 mm, TODB N,N-Bis (4-sulfobutil)-3-metilanina 50 mm, ácido polivinil sulfonico 50 g/l, polietilenoglicol metil ester 50 g/l, cloreto de magnésio 50 mm, conservante e surfactante Reagente 2 - Armazenar entre 2-8 ºC. Pronto para uso. Contém Tampão MES ph 6,5 500 mm, colesterol esterase 100 U/L, colesterol oxidase 100 U/L, 4-aminoantipirina 50 mm, peroxidase 100 U/L EDTA 10 mm, conservante e surfactante CAL Calibrador - Armazenar entre 2-8 ºC. Reagente liofilizado. Concentração no rótulo do frasco. Preparação contendo colesterol HDL humano e conservante1%. Após reconstituição é estável por 7 dias entre 2-8 ºC e 30 dias a -20 ºC. A calibração é válida apenas para um mesmo lote de reagentes e calibrador. Calibrador e reagentes de lotes diferentes não devem ser intercambiados. Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Os Reagentes 1 e 2, quando mantidos em bandeja refrigerada no equipamento são estáveis por 60 dias. Este período de estabilidade pode ser modificado em função das características e condições de manutenção do equipamento. Portanto, sugere-se que o controle da qualidade seja utilizado para monitorar o desempenho dos reagentes. Após abertos, os reagentes são estáveis até a data de validade indicada no rótulo, mas somente quando armazenados bem vedados em temperatura entre 2-8 ºC e não estejam submetidos a contaminações química ou microbiana. Precauções e cuidados especiais A calibração é válida apenas para um mesmo lote de reagentes e calibrador. Calibrador e reagentes de lotes diferentes não devem ser intercambiados. Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação dos reagentes, os quais não devem ser pipetados com a boca. 01 Português - Ref.: 128

2 O Calibrador contém derivados de sangue humano e apresentou resultados negativos para a presença de HBsAg e anticorpos HCV e HIV utilizando testes aprovados. Entretanto, nenhum teste conhecido pode assegurar que produtos derivados de sangue humano não transmitam doenças infecciosas. Portanto, recomenda-se manuseá-lo como sendo potencialmente infectante, seguindo as normas estabelecidas para biossegurança. Materiais necessários e não fornecidos 1. Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre 560 e 600 nm Incubador ou banho-maria a 37 ºC. Pipetas para medir amostras, controles, calibrador e reagentes. Cronômetro. Amostra Usar soro ou plasma (EDTA, citrato, heparina lítio). As amostras de soro ou plasma não devem permanecer entre 15 e 30 ºC por mais de 14 horas. Quando não for possível realizar as medições em até 14 horas após a coleta, as amostras podem ser armazenadas entre 2 e 8 ºC por 7 dias e por 30 dias a 20 ºC negativos. Quando houver necessidade de preservação por períodos mais longos, as amostras devem ser armazenadas em temperaturas 70 ºC negativos. Evitar congelamentos e descongelamentos repetidos. Amostras descongeladas devem ser bem misturadas antes da utilização. Não usar vórtex ou similar. Não usar amostras com sinais de contaminação microbiana. Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) para coleta, preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os erros ocorridos durante o procedimento analítico. Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las devem-se seguir as normas estabelecidas para biossegurança. Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental. Interferências Concentrações de bilirrubina não conjugada até 40 mg/dl, bilirrubina conjugada até 30 mg/dl, hemoglobina até 1000 mg/dl, ácido ascórbico até 10 mm e triglicérides até 400 mg/dl não interferem significativamente na reação. Preparo do calibrador. Adicionar 1,0 ml de água deionizada ou destilada (ver Observação no. 2), ao conteúdo do frasco do Calibrador. Deixar em repouso durante 5 minutos. Misturar por inversão suave evitando a formação de espuma. A fim de evitar congelamentos e descongelamentos repetidos, sugerimos separar o calibrador em alíquotas antes de congelar. Após descongelamento das alíquotas, estas devem ser bem homogeneizadas antes da utilização. Não utilizar vórtex ou similar. Uma vez descongelado, não congelar novamente. Calibração. O Calibrador é rastreável ao Standard Reference Material (SRM) 1951 do National Institute of Standards and Technology (NIST). Deverão ser utilizados dois pontos de calibração. Intervalos de calibração Quando o controle da qualidade indicar. Ao mudar de lote de reagente. Quando sejam utilizados novos frascos de reagentes pertencentes a um mesmo lote, nos casos em que a última calibração tenha sido realizada durante a utilização do frasco anterior. A calibração é válida apenas para um mesmo lote de reagentes e calibrador. Calibrador e reagentes de lotes diferentes não devem ser intercambiados. Parâmetros para realizaçâo do teste - Sistemas Automáticos * Os volumes de amostra e reagentes podem ser modificados proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste. Em caso de redução dos volumes é fundamental que se observe o volume mínimo necessário para a medição fotométrica. Parâmetros para sistemas automáticos Parâmetros Tipo de Reação λ de Onda Temperatura Calibração Modelo da Calibração Volume de Amostra* Volume de R1* Volume de R2* Leitura 1 (A1) Adição de R2 Leitura 2 (A2) Aplicação Ponto final 600 nm 37 ºC 2 pontos Ponto 1: Branco (água deionizada ou solução de cloreto de sódio 150 mmol/l (0,85%) Ponto 2: Calibrador Ref Linear 3 µ L 225 µ L 75 µ L Após 300 segundos de incubação a 37 ºC de R1 + amostra Após 300 segundos decorridos da adição de R1 + amostra Após 300 segundos de incubação a 37 ºC de R1 + amostra + R2 O calibrador reconstituído é estável 7 dias entre 2-8 ºC e 30 dias a 20 ºC negativos em recipiente hermeticamente fechado para evitar evaporação do solvente. 02 Português - Ref.: 128

3 Esquema da reação R1: 225 µ L Amostra: 3 µ L R2: 75 µ L Colesterol HDL (mg/dl) <40 60 Classificação ATP III - Crianças e Adolescentes 3 Baixo (desejável) 0 min 5 min 37 ºC 37 ºC 10 min Colesterol Total (mg/dl) - Idade: 2 a 19 anos < a 199 Limítrofe 200 Cálculos. A1 (600 nm) Ver item Intervalo Operacional A2 (600 nm) Colesterol LDL (mg/dl) - Idade: 2 a 19 anos < Limítrofe A = A2 - A1 Concentração de Colesterol HDL na amostra : Intervalo operacional. Controle interno da qualidade. A amostra - A branco A calibrador - A branco Valores desejáveis ou recomendados. Calibrador X (mg/dl) A reação é linear entre 1,06 e 184,8 mg/dl. Para concentrações superiores a 184,8 mg/dl, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/l (0,85%), realizar nova determinação e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. O laboratório deve manter um programa de controle interno da qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, critérios para especificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para monitorar a imprecisão da medição e desvios da calibração. Recomenda-se utilizar as preparações estabilizadas da Linha Qualitrol da Labtest para controle interno da qualidade em ensaios de química clínica. Os valores a seguir substituem os valores de referência e foram determinados a partir de dados epidemiológicos tratados estatisticamente, que relacionam as concentrações do colesterol com a prevalência de Doença Coronariana Isquêmica (DCI). Colesterol HDL (mg/dl) - Idade: <10 anos 40 4 Características de desempenho Estudos de comparação de métodos. A exatidão do método foi verificada por comparação com o método similar disponível no mercado, sendo obtidos os seguintes resultados: Número de amostras Média (mg/dl) Equação da regressão Coeficiente de correlação Método Comparativo Colesterol HDL (mg/dl) - Idade: 10 a 19 anos 35 HDL LD ,74 72,62 HDL LD = 1,048 * (Método comparativo) - 4,69 mg/dl 0,987 Utilizando a equação da regressão, o erro sistemático (bias) estimado é igual a - 3,72% para o nível de 55 mg/dl e - 0,41% para o nível de 90 mg/dl. Classificação ATP III - Adultos 2 Colesterol Total (mg/dl) < Colesterol LDL (mg/dl) < Limiar elevado Ótimo Limiar ótimo Limiar elevado Muito elevado Estudos de precisão. Os estudos de precisão foram realizados utilizando-se três amostras nativas. Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 N Média (mg/dl) DP CV (%) 80 29,0 0,3 1, ,0 0,41 0, ,6 0,84 0,9 03 Português - Ref.: 128

4 Reprodutibilidade - Imprecisão total Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 A imprecisão encontrada atende a especificação do NCEP-EUA que é 4,0%. O erro total (erro aleatório + erro sistemático) estimado é igual a 8,01% para o nível de 55 mg/dl e 4,03% para o nível de 90 mg/dl. Os resultados indicam que o método atende à especificação do NCEP- EUA para erro total ( 12,0%). Sensibilidade metodológica. Uma amostra não contendo colesterol HDL foi utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio, tendo sido encontrado um valor igual a 1,06 mg/dl, equivalente à média de 12 ensaios mais três desvios padrão. Efeitos da diluição da matriz. Uma amostra com concentração igual 184,8 mg/dl foi utilizada para avaliar a resposta do sistema nas diluições da matriz com solução de NaCl 150 mmol/l (0,85%). Usando fatores de diluição de 2 e 4, foi encontrada uma recuperação média de 102,08%, que corresponde a um erro sistemático médio igual a 2,08%. Significado clínico. Existem fortes evidências de que o colesterol é um fator de risco direto para Doença Coronariana Isquêmica (DCI). Estudos retrospectivos e prospectivos demonstram claramente uma interrelação curvilinear entre os níveis do colesterol sérico, mais especificamente o colesterol LDL e a prevalência de DCI. O HDL compõe uma das maiores classes de lipoproteínas plasmáticas. Elas são sintetizadas no fígado sob a forma de complexos de apolipoproteínas e fosfolipídeos, e são capazes de se ligar ao colesterol e transportá-lo das artérias para o fígado, onde o colesterol é convertido em bile e excretado para o intestino. Em 1977 foi demonstrado que o colesterol HDL tem efeito protetor contra a prevalência da DCI. Os estudos de Framingham mostraram de modo inequívoco que os níveis do colesterol HDL são inversamente proporcionais à prevalência da DCI. Esta relação inversa é claramente percebida na tabela de valores desejáveis ou recomendados. As concentrações do colesterol nas frações LDL e VLDL e na fração HDL dependem de metabolismos distintos e não se deve fazer qualquer tentativa de buscar correlação entre seus valores de concentração. Observações 1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos. 2. N Média (mg/dl) DP CV (%) 80 29,0 0,65 2, ,0 1,36 2, ,6 2,02 2,2 O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa potencial de erros analíticos. A água deionizada ou destilada utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes, usar nas medições e para uso no enxágüe final da vidraria, a água deve ter resistividade 1 megaohm.cm ou condutividade 1 microsiemens/cm e concentração de silicatos <0,1 mg/l. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. Referências 1. Bachorik PS, Ross JW. Clin Chem 1995;41: Executive Summary of the Third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA 2001;285: Leite PF, Martinez TLR, Halpern A, Cendoroglo MS, Novazzi JP, Fonseca FAH, Dias JCA. Risco cardiovascular: fatores metabólicos e nutricionais: diagnóstico e tratamento. São Paulo: Loyola, p Labtest: Dados de Arquivo. Apresentação Produto HDL LD *O número de testes em aplicações automáticas depende dos parâmetros de programação de cada equipamento Informações ao consumidor [Termos e Condições de Garantia] A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto dentro das especificações até a data de expiração indicada nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções sejam seguidos corretamente. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Serviço de Apoio ao Cliente (Ligação Gratuita) sac@labtest.com.br Revisão: Março, 2013 Ref.: Referência 128-1/80 Conteúdo 1 1 X 60 ml 2 1 X 20 ml 1 X 1,0 ml CAL Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reprodução sob prévia autorização 04 Português - Ref.: 128

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