GLICOSE HK Liquiform. 01 Português - Ref.: 137. Ref.:137 MS Instruções de Uso. Finalidade. Princípio. Metodologia. Reagentes

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1 GLICOSE HK Liquiform Instruções de Uso Ref.:137 MS Finalidade. Sistema enzimático para determinação da glicose por fotometria ultravioleta de ponto final, em amostras de sangue, urina, líquor e líquidos ascítico, pleural e sinovial. [Somente para uso diagnóstico in vitro.] Princípio. A adenosina trifosfato promove a fosforilação da glicose em uma reação catalisada pela hexoquinase (HK), de acordo com a seguinte reação: Glicose + ATP HK Características do sistema. Glicose-6-fosfato + ADP A glicose-6-fosfato produzida na reação anterior é oxidada a 6-fosfogluconato na presença da nicotinamida adenina dinucleótide (NAD), em reação catalisada especificamente pela glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PDH). Ocorre a produção de um mol de NADH para cada mol de glicose-6-fosfato que é oxidado. A absorbância resultante, medida em 340 nm, é diretamente proporcional à concentração da glicose na amostra. Glicose-6-fosfato + NAD G-6-PDH 6-Fosfogluconato + NADH A hexoquinase é uma enzima que catalisa a transferência do fosfato do ATP não somente para a glicose, mas também para a D-frutose, D-manose, D-glucosamina, 2 deoxi-d-glicose. Como a G-6-PDH tem elevada especificidade para a glicose-6-fosfato, outras hexoses ou esteres de pentose que são fosforilados não participam da reação. Assim, o ensaio é extremamente específico para a glicose. A especificidade da reação, proporcionada pela G-6-PDH, possibilita a determinação da glicose urinária com um grau elevado de exatidão, o que não é conseguido quando se empregam sistemas utilizando outras enzimas como reagentes. Os dados da repetitividade e da reprodutibilidade demonstram de modo inequívoco que o sistema Glicose HK Liquiform possui uma robustez extremamente desejável e valiosa para um sistema analítico. As substâncias utilizadas na reação se encontram distribuídas adequadamente em dois reagentes, para conferir maior estabilidade na forma líquida original e manutenção das condições ótimas da reação permitindo a utilização direta dos reagentes em sistemas automáticos. A utilização de metodologia birreagente reduz significativamente as interferências presentes na amostra, conferindo maior exatidão aos resultados. O sistema permite ainda preparar o volume de Reagente de Trabalho necessário para realizar um ensaio para determinação de concentração de glicose. O sistema é facilmente aplicável a analisadores automáticos e semiautomáticos capazes de medir com exatidão a absorbância em 340 nm. Metodologia. Reagentes 1. - Bondar e Mead modificado. 1 Reagente 1 - Armazenar entre 2-8 ºC. Contém tampão ph 7,8, ATP 1,0 mmol/l, NAD 1,0 mmol/l, cloreto de magnésio 10 mmol/l e azida sódica 7,7 mmol/l Reagente 2 - Armazenar entre 2-8 ºC. Hexoquinase 1000 U/L, G-6-PDH 6000 U/L e azida sódica 15 mmol/l Padrão 100 mg/dl - Armazenar entre 2-30 ºC. Após o manuseio armazenar bem vedado para evitar evaporação. O estabilizador do padrão pode precipitar em baixas temperaturas, o que não interfere em seu desempenho. Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Durante o manuseio os reagentes estão sujeitos a contaminações de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. Rastreabilidade do sistema. A calibração do sistema é rastreável ao Standard Reference Material 917 do National Institute of Standards and Technology. Precauções e cuidados especiais Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação do reagente. Os reagentes de Glicose HK Liquiform contêm azida sódica, que é toxica. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato com os olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e cobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água para descartar o reagente. Não utilizar o Reagente de Trabalho quando a sua absorbância medida a 340 nm contra a água for maior que 0,350. A metodologia monoreagente pode ser aplicada utilizando um Reagente de Trabalho estável por 60 dias sob refrigeração, obtendo-se desempenho adequado mesmo em situações de baixas demandas do teste. 01 Português - Ref.: 137

2 Materiais necessários e não fornecidos Banho-maria mantido à temperatura constante (37 ºC). Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância em 340 nm. Pipetas para medir amostras e reagente. Cronômetro. Influências pré-analíticas. Nas 24 horas que sucedem à ingestão aguda de álcool, ocorre significativa redução da glicemia. As reduções podem também ser significativas nos indivíduos submetidos a jejum prolongado ou em obesos tratados com dietas com baixo valor calórico. Pacientes diabéticos em uso continuado de clorpropamida (Diabinese) podem desenvolver hipoglicemias importantes que são muito difíceis de corrigir. Amostra Usar plasma, soro ou urina tomando as precauções a seguir. A amostra de sangue deve ser obtida após jejum de no mínimo 8 horas ou de acordo com recomendação médica. Realizar a colheita do sangue utilizando um anticoagulante contendo um inibidor da glicólise. O uso do anticoagulante Glistab (Labtest Ref. 29) permite a colheita de uma só amostra para as dosagens de creatinina, glicose e uréia. As amostras de sangue não contendo antiglicolítico devem ser centrifugadas imediatamente após a colheita e o plasma ou soro separados das células ou coágulo. Nas amostras de sangue tratadas com antiglicolítico a concentração da glicose permanece estável até 8 horas. No plasma, soro e outros líquidos separados das células, a glicose permanece estável 3 dias entre 2-8 ºC, 6 se não ocorrer contaminação microbiana. A presença de ácido ascórbico na amostra não interfere nos resultados, o que ocorre em sistemas que utilizam a metodologia Trinder. Em outros líquidos biológicos (líquor e líquidos ascítico, pleural e sinovial), adicionar anticoagulante contendo antiglicolítico na mesma proporção usada para a amostra de sangue e centrifugar antes da dosagem. As amostras de urina devem ser armazenadas entre 2-8 ºC para evitar interferências por contaminação microbiana. Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de material biológico humano não transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseálas, deve-se seguir as normas estabelecidas para biossegurança. Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental. Interferências Para metodologia birreagente, valores de bilirrubina até 20 mg/dl, hemoglobina até 200 mg/dl e triglicérides até 1000 mg/dl não produzem interferências significativas. Para metodologia monorreagente, valores de bilirrubina até 10 mg/dl, hemoglobina até 50 mg/dl e triglicérides até 350 mg/dl não produzem interferências significativas. Valores de bilirrubina até 20 mg/dl, hemoglobina até 200 mg/dl e triglicérides até 1000 mg/dl produzem interferências que podem ser minimizadas utilizando o branco da amostra. Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em uma amostra hemolisada, pode-se proceder do seguinte modo: Diluir 0,05 ml da amostra em 2,0 ml de NaCl 150 mmol/l (0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm, acertando o zero com água deionizada ou destilada. Hemoglobina (mg/dl) Absorbância405 x 601 Hemoglobina (mg/dl) Absorbância x 467 Branco da amostra: este procedimento é aplicável quando houver ação de interferentes. Misturar 1,0 ml de NaCl 150 mmol/l (0,85%) com 0,01 ml da amostra. Medir a absorbância em 340 nm, acertando o zero com água deionizada ou destilada. Diminuir a absorbância assim obtida da absorbância do teste e calcular a concentração. Preparo do reagente de trabalho. O conjunto de um frasco de Reagente 1 e um frasco de Reagente 2 permite preparar o Reagente de Trabalho. Transferir o conteúdo de um frasco de Reagente 2 para um frasco de Reagente 1 e homogeneizar por inversão. Anotar a data de expiração. Estável 60 dias entre 2-8 ºC quando não houver contaminação química ou bacteriana. Identificar o frasco do Reagente de Trabalho, para evitar confusão com outros frascos do Reagente 1. Para preservar seu desempenho, o reagente deve permanecer fora da geladeira somente o tempo necessário para se obter o volume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta. Opcionalmente pode-se preparar menor volume do Reagente de Trabalho utilizando-se da proporção 4 volumes do Reagente 1 e 1 (um) volume do Reagente 2. Ex.: para preparar 1 ml do Reagente de Trabalho misturar 0,8 ml do R1 com 0,2 ml do R2. Procedimento Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir: Amostra Padrão Reagente de trabalho Branco 1,0 ml Misturar e incubar em banho maria a 37 ºC durante 5 minutos. O nível da água no banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio. Determinar as absorbâncias do teste e padrão em 340 nm, acertando o zero com o branco. A absorbância é estável por 60 minutos. O procedimento sugerido para a medição é adequado para fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual ou menor que 1,0 ml. Deve ser feita uma verificação da necessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado. 415 Teste 0,01 ml 1,0 ml Padrão 0,01 ml 1,0 ml 02 Português - Ref.: 137

3 Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste e o procedimento de cálculos se mantém inalterado. Em caso de redução dos volumes é fundamental que se observe o volume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes da amostra menores que 0,01 ml são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a imprecisão da medição. Cálculos. Ver linearidade. Absorbância doteste Glicose (mg/dl) = x 100 Absorbância do Padrão Exemplo A Teste = 0,322 A Padrão = 0,357 0,322 Glicose (mg/dl) = x 100 = 90 0,357 O resultado também pode ser obtido utilizando o fator de calibração. Fator de calibração = 100 Absorbância do Padrão Glicose (mg/dl) = Absorbância do Teste x Fator Exemplo 100 Fator = = 2 0,357 Glicose (mg/dl) = 0,322 x 2 = 90 urina (mg/24 horas) = Calibração. mg/dl x volume (em ml) 100 O padrão rastreável ao Standart Reference Material (SRM) 917 no National Institute of Standards and Technology (NIST). Calibrações manuais Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentes ou quando o controle interno da qualidade indicar. Sistemas automáticos Branco de reagente: água ou solução de cloreto de sódio 150 mmol/l (0,85%); Padrões: usar calibradores protéicos. A concentração de Glicose no Calibra H é rastreável ao SRM 917 do NIST. Linearidade A reação é linear até 700 mg/dl. Para valores maiores, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/l (0,85%), realizar nova determinação e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. Sugerimos a verificação da linearidade metodológica e fotométrica, no mínimo semestralmente, utilizando amostras com valores até 700 mg/dl. Controle interno da qualidade. O laboratório deve manter um programa de controle interno da qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, critérios para especificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para avaliar a imprecisão e desvios da calibração. Sugere-se que as especificações para o coeficiente de variação e o erro total sejam 8.9 baseadas nos componentes da variação biológica. (VB). Sugere-se utilizar os produtos da linha Qualitrol H- Labtest para controle interno da qualidade em ensaios de química clínica. Intervalo de referência. Os intervalos devem ser usados apenas como orientação. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, na população atendida, seus próprios intervalos de referência. Plasma (jejum de 8 horas) 11 Os critérios de diagnóstico de pré diabetes e diabetes podem ser obtidos em: American Diabetes Association. Diabetes Care 2012; (suppl): 1 S64-S71. Líquor. 2/3 da glicemia quando a medição é realizada em amostras colhidas simultaneamente. Em indivíduos sadios, a pequena quantidade de líquido presente nas cavidades articular, pleural e peritoneal é originada de ultrafiltrado do plasma. Portanto, pode-se considerar que, praticamente, a glicose ali presente está na mesma concentração do plasma. Urina. menor que 20 mg/dl ou até 250 mg/24 horas. Conversão. Unidades Convencionais (mg/dl) x 0,0556 = Unidades SI (mmol/l). CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO 12 Exatidão. Idade Prematuro 0 a 1 dia > 1 dia Crianças e Adultos Em duas amostras com concentrações de glicose iguais a 51 e 103 mg/dl foram adicionadas quantidades diferentes do analito, obtendo-se no método de ponto final recuperações entre 98 e 99%. O erro sistemático proporcional médio obtido em um valor de 120 mg/dl é igual a 1,8 mg/dl ou 1,5%. Especificidade. mg/dl 20 a a a a 99 O método proposto foi comparado com um método similar apresentando os resultados abaixo: Número de amostras Intervalo de concentrações (mg/dl) Equação da regressão Coeficiente de correlação Método Comparativo Método Labtest Método Labtest (mg/dl) = 0,9965 x Comparativo + 0,8167 0, Português - Ref.: 137

4 Utilizando a equação da regressão, o erro sistemático total (constante e proporcional) verificado nos níveis de decisão de 45,120 e 1 mg/dl foram iguais a 0,66; 0,40 e 0,19 mg/dl ou 1,47; 0,33 e 0,11%, respectivamente. O erro sistemático total obtido é menor que o erro sistemático total da especificação desejável baseada nos componentes da Variação Biológica que é ± 2,2%. Como as amostras foram selecionadas aleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacientes hospitalizados, pode-se inferir que o método tem uma especificidade metodológica adequada. Estudos de precisão. Os estudos de precisão foram realizados utilizando amostras com concentrações médias iguais a 46, 123 e 184 mg/dl. Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 N Média DP 0,46 1,01 1,45 CV (%) 1,00 0,83 0,79 Valores diminuídos de glicose ocorrem nas hipoglicemias que podem ser devidas a várias causas. Quando a ocorrência de sintomas de hipoglicemia é relacionada à alimentação, duas formas de hipoglicemia podem ser definidas: hipoglicemia do jejum e pós-prandial. As causas mais comuns de hipoglicemia do jejum são: hiperinsulinismo endógeno (insulinoma e sulfonilurea), hiperinsulinismo exógeno (factício), tumores extrapancreáticos, síndrome auto imune ( formação expontânea de anticorpos para receptores da insulina), insuficiência supra-renal e ou hipofisária, doença hepática grave e alcoolismo. A hipoglicemia pós-prandial, dependendo da história clínica e da resposta ao teste oral de tolerância à glicose, é classificada em hipoglicemia alimentar, do diabético tipo II, do paciente com intolerância à glicose, funcional ou reativa. Para uma revisão dos critérios diagnósticos e classificação do diabetes mellitus consultar American Diabetes Association. Diabetes Care 2012;(suppl): 1 S64-S71 ou: (acesso em 16/04/2012). A redução da concentração de glicose nos líquidos corporais encontra-se usualmente relacionada a processos inflamatórios ou infecciosos. Reprodutibilidade - Imprecisão total Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 N Média DP 1,04 1,47 2,46 CV (%) 1,85 1,19 1,34 A determinação da concentração de glicose no líquor representa um dos parâmetros para a distinção entre meningite bacteriana e virótica tendo, porém, sensibilidade inferior à avaliação da celularidade no mesmo material. Observações O erro total (erro aleatório + erro sistemático) estimado em concentrações iguais a 45, 120 e 1 mg/dl são iguais a 4,53%, 2,30% e 2,32%, respectivamente. Os resultados indicam que o método atende a especificação desejável para o erro total ( ± 6,9%) baseada nos componentes desejável da Variação Biológica. Sensibilidade metodológica. Uma amostra protéica não contendo glicose foi utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendo sido encontrado um valor igual a 0,62 mg/dl, equivalente à media de concentrações obtidas mais dois desvios padrão. Utilizando-se a absorbância do padrão como parâmetro, o limite de detecção fotométrica é 0,28 mg/dl correspondendo a uma absorbância igual a 0,001. Efeitos da diluição da matriz. Duas amostras com valores iguais a 821 e 834 mg/dl foram utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições da matriz com NaCl 150 mmol/l (0,85%). Utilizando fatores de diluição que variaram de 2 a 8 foi encontrada recuperação média de 100,1%. O erro total obtido é menor que o erro sistemático total da especificação desejável baseada nos componentes da Variação Biológica que é ± 6,9%. Significado clínico. Valores elevados de glicose ocorrem nos vários tipos de diabetes primários, nos estados de intolerância à glicose e no diabetes secundário a várias doenças (hipertireoidismo, hiperpituitarismo, hiperadrenocorticismo, etc.). 1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos. 2. O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa potencial de erros analíticos. A água deionizada ou destilada utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes, usar nas medições e para uso no enxágüe final da vidraria, a água deve ter resistividade 1 megaohm.cm ou condutividade 1 microsiemens/cm e concentração de silicatos <0,1 mg/l. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. Referências 1. Bergmeyer HU. Methods of Enzimatic Analisys, 3ed, vol 6, Deerfield Beach: Verlag Chemie,1984; Bjorkem I, Blomstrand R, Falk O, Ohman G. Clin Chim Acta 1976;72: Bondar RJL, Mead D. Clin Chem 1974;20: Inmetro - Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark eds, Rio de Janeiro, Português - Ref.: 137

5 5. Kaplan LA, Pesce AJ. Methods in Clinical Chemistry, St. Louis: The C.V. Mosby Co., 1987; BURTIS CA, Ashwood ER, Bruns DE. Tietz, Textbook of Clinical Chemistry and molecular diagnostics, 4th edition St Luis, Missouri: Elsevier Saunders Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;27: Biological Variation Database specifications - Westgard QC. Disponível em: < h t t p : / / w w w. w e s t g a r d. c o m / b i o d a t a b a s e 1. h t m > (acesso em 28/10/2011). 9. Basques JC. Especificações de Qualidade Analítica. Labtest Diagnóstica Burtis CA,Ashwood ER. Textbook of Clinical Chemistry, 2ª. Edição, Philadelphia:W.B. Saunders, 1986: American Diabetes Association: Point: Impaired Fasting Glucose: The Case for the New American Diabetes Association Criterion. Diabetes Care May 2006 vol. 29 no Labtest: Datos de Archivo. Apresentação Produto Referência Conteúdo Glicose HK Liquiform 137-2/100 O número de testes em aplicações automáticas depende dos parâmetros de programação. Estão disponíveis as aplicações para sistemas automáticos. Informações ao consumidor [Termos e Condições de Garantia] 2 X ml 2 X 20 ml 1 X 5 ml A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto dentro das especificações até a data de expiração indicada nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções sejam seguidos corretamente. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Serviço de Apoio ao Cliente (Ligação Gratuita) sac@labtest.com.br 1 2 Edição: Novembro, 2012 Ref.: Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reprodução sob prévia autorização 05 Português - Ref.: 137

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