HbA1c. 01 Português - Ref.: 301. Ref.:301 MS Instruções de Uso. Hemoglobina A1c. Finalidade. Princípio. Precauções e cuidados especiais
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- Ana Luiza Paixão da Conceição
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1 HbA1c Instruções de Uso Ref.:01 MS Hemoglobina A1c Turbiquest Finalidade. Sistema para determinação quantitativa da Hemoglobina A1c (HbA1c) em amostras de sangue total. [Somente para uso diagnóstico in vitro.] Princípio. Todas as hemoglobinas presentes na amostra se ligam à superfície das partículas de látex (Reagente 1). A adição de anticorpo monoclonal de camundongo anti-hba1c humana (Reagente 2) promove a formação do complexo látex-hba1c-anticorpo anti-hba1c. Um segundo anticorpo presente no Reagente 2 (anticorpo policlonal anti-igg de camundongo) produz aglutinação deste complexo. A intensidade da aglutinação, medida em absorbância, é proporcional à quantidade de HbA1c presente na amostra. O valor de HbA1c é obtido através de curva de calibração. Características do sistema. O produto HbA1c Labtest é um método imunoturbidimétrico facilmente aplicável a analisadores automáticos bioquímicos capazes de medir absorbâncias em 60 nm (600 a 660 nm). A medição é realizada diretamente, sem a necessidade da determinação da hemoglobina total utilizando somente um canal do analisador automático. Além disso, os resultados são obtidos através de curva de calibração, dispensando a realização de cálculos adicionais. Todas estas características agregam maior praticidade e segurança para o usuário, além de propiciar maior agilidade e rapidez ao processo analítico. O sistema HbA1c é capaz de fornecer resultados com reprodutibilidade e exatidão, já que a fração pré-hba1c (fração lábil ou instável) não é detectada pelo método e, portanto, não interfere na determinação da HbA1c. Além disso, uremia, hiperbilirrubinemia (até 50 mg/dl), hipertrigliceridemia (até 00 mg/dl) e a presença de ácido ascórbico (até 50 mg/dl), hemoglobina carbamilada (até 7,5 mmol/l) e hemoglobina acetilada (até 5,0 mmol/l) na amostra não produzem interferências significativas. O método é certificado pelo National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP) para Pointe Scientific, Inc., com rastreabilidade ao método de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) utilizado no estudo Diabetes and Complications Trial (DCCT). Metodologia. Reagentes Imunoturbidimetria. Reagente 1 - Armazenar entre 2-8 ºC. Contém partículas de poliestireno 0,1%, preservativo. 2. 2A - Reagente 2A - Armazenar entre 2-8 ºC. Contém tampão 80 mmol/l, ph 7,; preservativo.. 2B - Reagente 2B - Armazenar entre 2-8 ºC. Contém tampão mmol/l, ph 7,1; anticorpo monoclonal de camundongo anti-hba1c humana; anticorpo policlonal anti-igg de camundongo e azida sódica 14,6 mmol/l Reagente Hemolisante - Armazenar entre 2-8 ºC. Contém azida sódica 7, mmol/l. Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão sujeitos a contaminações de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação dos reagentes, os quais não devem ser pipetados com a boca. Os reagentes 2B e Hemolisante contêm azida sódica que é tóxica. Devese tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com os olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e cobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água para descartar o reagente. Material necessário e não fornecido 1. Analisador capaz de medir com exatidão a absorbância entre 600 e 660 nm. 2. Precauções e cuidados especiais Calibradores Calibra HbA1c e controles Glicotrol da Labtest. Amostra Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) que estabeleça procedimentos adequados para colheita, preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os erros ocorridos durante o procedimento analítico. Usar somente sangue total colhido com EDTA. O analito é estável por 7 dias entre 2-8 ºC e por pelo menos 1 ano em temperatura igual ou inferior a 70 ºC negativos. Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las, deve-se seguir as normas estabelecidas para biossegurança. 01 Português - Ref.: 01
2 Para descartar os reagentes e o material biológico, sugerimos aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental. Concentrações de bilirrubina até 50 mg/dl, ácido ascórbico até 50 mg/dl, triglicérides até 00 mg/dl, hemoglobina carbamilada até 7,5 mmol/l e hemoglobina acetilada até 5,0 mmol/l não produzem interferências significativas. Resultados inconsistentes podem ser obtidos em pacientes que apresentam as seguintes condições: uso de opiáceos, envenenamento por chumbo, alcoolismo e ingestão de grandes quantidades de ácido acetilsalicílico. A uremia não interfere na determinação imunométrica da HbA1c. A fração pré-hba1c (fração lábil ou instável) não é detectada e, portanto, não interfere na determinação imunométrica da HbA1c. Valores elevados de hemoglobina fetal na amostra produzem interferência negativa. Hemoglobina A2 e hemoglobina S não são detectadas por ensaios imunométricos podendo aumentar a inexatidão dos resultados. A influência de outras variantes da hemoglobina não foi avaliada. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e medicamentosas de interferência nos resultados e na metodologia sugere-se consultar Preparo dos reagentes. O Reagente Hemolisante e o Reagente 1 estão prontos para uso. O reagente 1 após aberto é estável 0 dias se armazenado entre 2-8 ºC, quando não houver contaminação química ou microbiana. O conjunto de um frasco de Reagente 2A e um frasco de Reagente 2B permite preparar o Reagente 2. Transferir o conteúdo de um frasco do Reagente 2B para um frasco do Reagente 2A e homogeneizar gentilmente por inversão. Identificar o frasco do Reagente 2 e anotar a data de expiração. O Reagente 2 é estável 0 dias se armazenado entre 2-8 ºC, quando não houver contaminação química ou microbiana. Para preservar o desempenho, o reagente somente deve permanecer fora da temperatura de armazenamento o tempo necessário para se obter o volume a ser utilizado. Armazenar bem vedado. Ver observações 1 e 2. Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos. Preparo da amostra. Preparar um hemolisado para cada amostra. O mesmo procedimento deverá ser aplicado para Calibradores e es. 1. Interferências Procedimento Em um tubo pipetar 0,5 ml do Reagente Hemolisante e 0,010 ml da amostra de sangue total bem homogeneizada; 2.. Agitar fortemente por 10 segundos e esperar 5 minutos ou até que a lise completa seja evidente (ausência de turvação); O hemolisado pode ser armazenado até 10 dias entre 2-8 ºC. * Os volumes de amostra e reagentes podem ser modificados proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste e o procedimento de cálculos se mantém inalterado. Em caso de redução dos volumes é fundamental que se observe o volume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Calibração Parâmetros para Analisadores Automáticos Nome do Teste Tipo de Reação Direção da Reação Comprimento de Onda Temperatura Volume de Amostra* Volume de Reagente 1* Volume de Reagente 2* Tempo de Incubação 1 Tempo de Incubação 2 Calibração Modelo da Calibração Intervalo Operacional Valores Esperados Rastreabilidade do sistema. HbA1c Ponto Final Crescente 60 nm (600 a 660 nm) 7 ºC 4 µ L 150 µ L 50 µ L 00 segundos 00 segundos 5 pontos Ponto 0: água deionizada Ponto 1 ao 4: produto Calibra HbA1c Ref.: 02 Polinomial 2,0 a 16,0% 4,0 a 6,0% O método é certificado pelo National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP) para Pointe Scientific, Inc., com rastreabilidade ao método de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) utilizado no estudo Diabetes and Complications Trial (DCCT). Calibração de 5 pontos Ponto 0: Água deionizada ou NaCl 150 mmol/l. Ponto 1 ao 4: utilizar o produto Calibra HbA1c Labtest (Ref.: 02). Intervalo de calibrações Quando o controle interno da qualidade indicar; Quando utilizar novo lote de reagentes; Semanalmente, caso os reagentes estejam em uso há mais de 07 dias. Linearidade O intervalo operacional de medição é de 2,0% a 16,0%. Resultado superior a 16,0% deve ser reportado como maior que 16,0%. Sugerimos a verificação da linearidade metodológica e fotométrica no mínimo semestralmente utilizando amostras com valores até 16,0%. 02 Português - Ref.: 01
3 e interno da qualidade. O laboratório deve manter um programa de controle da qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, critérios para especificações da qualidade e limites de controle, ações corretivas e registro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para avaliar a imprecisão e/ou desvios da calibração. Sugere-se procurar atender como limites 6 máximos de controle as especificações propostas por NGSP para 5 coeficiente de variação <5% e erro total 0,85 pontos percentuais. Valores esperados. 4,0% a 6,0%. Características do desempenho Estudos de recuperação. Comparação de métodos. Para indivíduos não diabéticos. Valores entre Para indivíduos diabéticos em controle glicêmico Criança (faixa pré-puberal) Criança (faixa puberal) Adulto Idoso Os valores para indivíduos diabéticos foram determinados a partir dos resultados de estudos clínicos prospectivos e randomizados e se correlacionam com risco significativamente menor de desenvolvimento,4 de complicações do Diabetes Mellitus. Em duas amostras com concentrações de HbA1c iguais a 5,4% e 8,1% foram adicionadas quantidades diferentes do analito, obtendo-se recuperações entre 100,8 e 104,5%. Utilizando o erro médio de 2,6%, o erro sistemático proporcional foi igual a 0,156% e 0,260% em concentrações de 6,0% e 10,0% respectivamente. A estimativa atende a especificação do NGSP que recomenda a aceitação de resultados com intervalo de ± 1,0 ponto percentual. Os resultados do método HbA1c foram comparados com os resultados do método HPLC, rastreável ao método de referência do Diabetes and Complications Trial (DCCT). Foram realizadas medições, com os dois métodos, de 40 amostras com valores situados entre 4,9% e 1,%. As seguintes estatísticas foram estimadas: Estatística *Ponto percentual. 8 Comparação com método de referência NGSP (HPLC) Interseção* -0,401 Inclinação Coeficiente de correlação Média das diferenças* DP das diferenças (y-xmx) Intervalo de confiança* <8,0% <8,5% <7,0% <8,0% 1,02 0,989-0,14 0,11-0,75 a 0,47 Utilizando a equação da regressão, o erro sistemático (bias) foi igual a -0,9% e -0,081% em concentrações de 6,0% e 10,0% respectivamente. Como os resultados dos estudos comparativos indicam erros sistemáticos menores que ± 1,0 ponto percentual e o intervalo de confiança está incluído no limite aceitável de -1,00 a +1,00 - incluindo o valor zero no intervalo de confiança estimado - o método HbA1c é substancialmente equivalente ao método HPLC. Estudos de precisão. Os estudos de precisão foram realizados segundo as recomendações do NGSP utilizando uma amostra com valor entre 4,0-6,0% e outra amostra com valor maior que 9,0%. Repetitividade - imprecisão intra-ensaio Amostra 1 Amostra 2 A especificação do NGSP para Coeficiente de Variação ( 4,0%) é atendida tanto para a amostra com valor normal quanto para a amostra com valor maior que 9,0%. Sensibilidade metodológica. N Utilizando-se a absorbância mínima detectável como parâmetro, o limite de detecção fotométrica no Labmax 240 é 0,025% correspondendo a uma diferença de absorbância igual a 0,001. A estimativa indica que o método é capaz de detectar diferenças entre amostras no mínimo iguais a 0,025 pontos percentuais. Significado clínico. Média 5,2% 11,% Reprodutibilidade - imprecisão total Amostra 1 Amostra 2 N Média 5,2% 11,% DP 0,07 0,18 DP 0,18 0,28 CV (%) 1,40 1,57 CV (%),56 2,50 A hemoglobina humana do adulto é habitualmente constituída de HbA (97%), HbA2 (2,5%) e HbF (0,5%). A análise cromatográfica da HbA identifica uma gama de hemoglobinas que migram mais rapidamente do que a HbAo: HbA1a, HbA1b e HbA1c, que 2 foram inicialmente denominadas hemoglobinas rápidas. Posteriormente, observou-se que estas hemoglobinas rápidas estão ligadas a alguns açucares, sendo coletivamente chamadas hemoglobinas glicadas ou HbA1. A HbA1c é a principal fração e corresponde a 80% da HbA1. A HbA1c é formada pela ligação não enzimática da glicose com a porção N-terminal valina (glicação) em cada cadeia beta da HbA, formando uma base de Schiff instável (pré-hba1c, HbA1c lábil ou instável) que sofre um rearranjo irreversível (rearranjo de 2 Amadori), formando uma cetoamina estável. A formação de hemoglobina glicada é contínua e irreversível, e seu nível sanguíneo depende da sobrevida da hemácia (cerca de 1 dias) e da concentração de glicose no sangue, já que a hemácia é livremente permeável à glicose. A HbA1c corresponde a cerca de 4% a 6% da HbA total em indivíduos não diabéticos, podendo chegar a % em indivíduos diabéticos mal controlados. 0 Português - Ref.: 01
4 A quantidade de HbA1c é diretamente proporcional à concentração média de glicose no sangue durante as seis a oito semanas precedentes e fornece um critério adicional para a avaliação do controle glicêmico. A dosagem de HbA1c parece ser capaz de prognosticar o risco do desenvolvimento e progressão das complicações crônicas do diabetes. Assim, a HbA1c deve ser medida rotineiramente em todos os pacientes com diabetes mellitus para avaliar o grau de controle glicêmico. Conforme o Posicionamento Oficial - 04 do Grupo Interdisciplinar de 4 Padronização da Hemoglobina Glicada, a determinação da HbA1c deve ser realizada pelo menos duas vezes ao ano para todos os pacientes diabéticos e quatro vezes por ano (a cada três meses) para pacientes que se submeteram a alteração do esquema terapêutico ou que não estejam 4 atingindo os objetivos recomendados com o tratamento vigente. Os níveis de HbA1c não retornam aos valores esperados imediatamente após a redução e estabilização da concentração sanguínea de glicose. O tempo necessário é de aproximadamente oito a dez semanas. 2. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, Philadelphia: Saunders Company 1994; DCCT Research Group. Diabetes and Complications Trial (DCCT). N Eng J Med 199; 29: Grupo Interdisciplinar de Padronização da Hemoglobina Glicada - A1c (Menu: Comissões). 5. Guidelines and Recommendations for Laboratory Analysis in the Diagnosis and Management of Diabetes Mellitus. Sacks DB, Bruns, DE, Goldstein DE, Maclaren NK, McDonald JM, Parrott M. Clin Chem 02:48: Summary of NGSP Certification Categories. Disponível em: < (acesso em 01/08). 7. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;27: Labtest: Dados de Arquivo. Pacientes com doença hemolítica ou outras condições que reduzem a sobrevida das hemácias (estados hemorrágicos) podem apresentar resultados falsamente diminuídos de HbA1c. Anemia por deficiência de ferro, vitamina B12 ou ácido fólico pode levar a resultados falsamente aumentados de HbA1c por aumentar a sobrevida das hemácias. A determinação da HbA1c não tem valor nos pacientes que apresentam hemoglobinopatias homozigóticas devido a ausência de HbA. Nestas situações sugere-se realizar a determinação da frutosamina para avaliação do controle glicêmico. O teste não deve ser utilizado para o diagnóstico do diabetes mellitus. O 2 diagnóstico definitivo deve se basear nos valores da glicemia. Apresentação Produto HbA1c Referência 01-1/ / 1 2A 2B 1 2A 2B Conteúdo 1 X 0 ml 1 X 9,5 ml 1 X 0,5 ml 1 X 125 ml 1 X 15 ml 1 X 4,75 ml 1 X 0,25 ml 1 X 6 ml Observações 1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos. 2. O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa potencial de erros analíticos. A água deionizada ou destilada utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes, usar nas medições e para uso no enxágüe final da vidraria, deve ter resistividade 1 megaohm.cm ou condutividade 1 microsiemens/cm e concentração de silicatos <0,1 mg/l. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre produção de água alcalina com liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. Referências 1. American Diabetes Association. Diabetes Care 04 27(suppl 1):S5- S10. Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos e semiautomáticos. O número de testes em aplicações automáticas depende dos parâmetros de programação. Informações ao consumidor [Termos e Condições de Garantia] A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto, dentro das especificações, até a data de expiração indicada nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções sejam seguidos corretamente. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Serviço de Apoio ao Cliente (Ligação Gratuita) sac@labtest.com.br Revisão: Abril, 10 Ref.: Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reprodução sob prévia autorização 04 Português - Ref.: 01
5 05 Português - Ref.: 01
6 Símbolos utilizados com produtos diagnósticos in vitro Símbolos usados con productos diagnósticos in vitro Symbols used with ivd devices Conteúdo suficiente para < n > testes Contenido suficiente para < n > tests Contains sufficient for < n > tests Risco biológico Riesgo biológico Biological risk Data limite de utilização (aaaa-mm-dd ou mm/aaaa) Estable hasta (aaaa-mm-dd o mm/aaaa) Use by (yyyy-mm-dd or mm/yyyy) Marca CE Marcado CE CE Mark Calibrator Material Tóxico Tóxico Poison Calibrator Material Reagente Reactivo Reagent Limite de temperatura (conservar a) Temperatura limite (conservar a) Temperature limitation (store at) Fabricado por Elaborado por Manufactured by Representante Autorizado na Comunidade Europeia Representante autorizado en la Comunidad Europea Authorized Representative in the European Community Número do lote Denominación de lote Batch code Consultar instruções de uso Consultar instrucciones de uso Consult instructions for use e Número do catálogo Número de catálogo Catalog Number e negativo negativo Negative control Adições ou alterações significativas Cambios o suplementos significativos Significant additions or changes e positivo positivo Positive control Produto diagnóstico in vitro Dispositivo de diagnóstico in vitro In vitro diagnostic device e Liofilizado Liofilizado Lyophilized Corrosivo Corrosivo Corrosive Período após abertura Período post-abertura Period after-opening Ref.: Português - Ref.: 01
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