TSH. 01 Português - Ref.: 903. Ref.:903 MS Instruções de Uso. Finalidade. Sistema para a determinação quantitativa do hormônio

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1 TSH Instruções de Uso Finalidade. Sistema para a determinação quantitativa do hormônio tireotrópico ( Thyroid Stimulating Hormone - TSH) em soro. [Somente para uso diagnóstico in vitro.] Princípio. O TSH presente na amostra se liga especificamente a anticorpos monoclonais anti-tsh imobilizados na superfície de imunotubos (IT). Após lavagem são adicionados anticorpo monoclonal marcado com biotina e conjugado de estreptavidina-peroxidase, originando a formação de um complexo quaternário. Após remoção do excesso de reagentes a reação quimioluminescente é desencadeada pela adição de peróxido e luminol. A quantidade de luz emitida, medida em unidades relativas de luz (RLU), é proporcional à concentração de TSH na amostra. Características do sistema. O TSH - Labtest é um sistema semiautomático desenvolvido com uma abordagem inovadora que possibilita a utilização dos substratos quimioluminescentes luminol e peróxido em cinética rápida, com obtenção de resultados em poucos segundos de reação. Os níveis de sensibilidade são equivalentes aos de outros substratos quimioluminescentes que empregam a fosfatase alcalina como enzima. Os estudos realizados demonstram que o ensaio não sofre interferência significativa provocada por concentrações elevadas de hemoglobina, bilirrubina, triglicérides e dos hormônios LH, FSH e hcg, além de não apresentar o efeito hook. A elevada estabilidade dos reagentes reduz a freqüência das calibrações, possibilitando adaptação a pequenas rotinas, com a realização de testes individuais sem aumento de custos. Metodologia. Quimioluminescência em tubos. Reagentes 1. - Diluente 2. - Biotinilado - Armazenar entre 2-8 ºC. de Amostra - Armazenar entre 2-8 ºC. Pronto para uso. Contém tampão 100 mmol/l ph 7,4, conservante, surfactante e estabilizadores Conjugado Pronto para uso. Contém anticorpo monoclonal anti-tsh biotinilado em tampão 100 mmol/l ph 7,4, conservante, surfactante e estabilizadores. Concentrado 50X - Armazenar entre 2-8 ºC. Contém estreptavidina-peroxidase, conservante, surfactante e estabilizadores. Ver item Procedimento - Preparo de Reagentes Diluente 5. - Calibrador Ref.:903 MS do Conjugado - Armazenar entre 2-8 ºC. Contém tampão 100 mmol/l ph 7,4, conservante, surfactante e estabilizadores. Ver item Procedimento - Preparo de Reagentes. Low (Baixo) - Armazenar entre 2-8 ºC. Preparação liofilizada do hormônio tireotrópico (TSH) contendo tampão 100 mmol/l ph 8,1, conservante e estabilizadores. Ver no rótulo do frasco o valor assinalado para a concentração do TSH. Ver item Procedimento - Preparo de Reagentes - Reconstituição dos calibradores. A concentração deste calibrador, presente no rótulo do produto, deverá ser inserida no protocolo do teste Calibrador High (Alto) - Armazenar entre 2-8 ºC. Preparação liofilizada do hormônio tireotrópico (TSH) contendo tampão 100 mmol/l ph 8,1, conservante e estabilizadores. Ver no rótulo do frasco o valor assinalado para a concentração do TSH. Ver item Procedimento - Preparo de Reagentes - Reconstituição dos calibradores. A concentração deste calibrador, presente no rótulo do produto, deverá ser inserida no protocolo do teste Imunotubos - Armazenar entre 2-8 ºC. Pronto para uso. Tubos de poliestireno sensibilizados com anticorpos monoclonais anti-tsh. As embalagens plásticas contendo os tubos devem ser abertas somente quando estiverem em equilíbrio com a temperatura do ambiente (temperatura inferior a 30 ºC) onde será realizado o teste, para evitar a condensação de vapor de água nos tubos. O não cumprimento desta orientação acarretará em diminuição da estabilidade do reagente. Após a abertura das embalagens, os tubos são estáveis por 6 meses, quando armazenados entre 2 e 8 ºC e com o dessecante na embalagem plástica bem fechada. Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Após abertos, os reagentes devem ser manuseados de acordo com as boas práticas de laboratório para evitar contaminações de natureza química e microbiana, que podem provocar redução da estabilidade. Precauções e cuidados especiais Os calibradores são preparados a partir de derivados de sangue humano e foram testados pela presença de HBsAg e anticorpos anti-hcv e anti- HIV, apresentando resultados negativos. Apesar de terem sido utilizados testes validados e aprovados, nenhum deles pode assegurar que produtos derivados do sangue humano estejam livres de agentes infecciosos. Portanto, os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação do produto, que não deve ser pipetado com a boca. Recomenda-se manuseá-lo como sendo potencialmente infectante. 01 Português - Ref.: 903

2 Não misturar reagentes de lotes diferentes e não utilizar reagentes fora do prazo de validade. Não permitir a contaminação cruzada entre os componentes. Utilizar somente ponteiras descartáveis para pipetar cada amostra e cada reagente. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos. Resíduos de sabão, detergentes ou agentes oxidantes nos recipientes utilizados para o preparo do Conjugado de uso podem interferir na reação. Usar preferencialmente material plástico descartável. As embalagens plásticas contendo os imunotubos (IT) devem ser abertas somente quando estiverem à temperatura ambiente (temperatura inferior a 30 ºC) onde será realizado o teste, para evitar a condensação de vapor de água nos tubos. O não cumprimento desta orientação acarretará em diminuição da estabilidade do reagente. Após a abertura das embalagens, os tubos são estáveis por 6 meses, quando armazenados com o dessecante na embalagem plástica bem fechada. Os imunotubos deverão ser descartados após o uso. Não reutilizar para outros fins. Para descartar os reagentes e o material biológico, sugerimos aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental. Material necessário e não fornecido 1. Micropipetas e ponteiras descartáveis. 2. Banho-maria (37 1 ºC). 3. Recipientes para preparar as diluições. 4. Cronômetro. 5. Solução de Lavagem Concentrada (Ref. 908). 6. Soluções de Revelação (Ref. 909). 7. Estante para tubos 12 x 75 mm com sistema de fixação. 8. Microcomputador. 9. Luminômetro Lumiquest ou instrumento similar equipado com dois injetores e capacidade para acomodar tubos 12x75 mm. 10. Solução de Sanitização (Ref. 604) Amostra 4 Usar somente soro. O analito é estável 5 dias entre 2 e 8 ºC e por até 1 mês em temperatura inferior a 20 ºC negativos armazenado em recipiente apropriado para congelamento. Assegurar que as amostras estejam descongeladas e homogeneizadas antes da sua utilização. Partículas em suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. Não usar amostras com sinais de contaminação ou amostras congeladas e descongeladas mais de uma vez. Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) para colheita, preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os erros ocorridos no procedimento analítico. Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las, devem-se seguir as normas de biossegurança. Interferências Concentrações de hemoglobina até 750 mg/dl, bilirrubina até 20 mg/dl, triglicérides até 1000 mg/dl, hcg até mui/ml, LH até mui/ml e FSH até mui/ml, não produzem interferências significativas. Limitações do sistema 1. O sistema TSH Labtest possui inibidores de anticorpos anticamundongos (HAMA). Entretanto, amostras contendo quantidades elevadas de HAMA podem produzir resultados falsamente diminuídos. 2. Como ocorre nos imunoensaios em geral, interferências não descritas de medicações ou outras substâncias endógenas podem afetar os resultados. Procedimento Cuidados especiais. As embalagens contendo os imunotubos devem ser abertas somente quando estiverem à temperatura ambiente (temperatura inferior a 30 ºC) onde será realizado o teste, para evitar a condensação de vapor de água nos tubos. O não cumprimento desta orientação acarretará em diminuição da estabilidade do reagente. Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso. Preparo dos reagentes Conjugado de uso. Para preparar o Conjugado de Uso, pipetar todo o conteúdo do frasco de Conjugado Concentrado, transferir para o frasco contendo o Diluente do Conjugado e homogeneizar. Se houver necessidade, centrifugar o material para certificar que todo o conteúdo do frasco de Conjugado Concentrado esteja no fundo do tubo. Após transferir todo o volume, lavar o frasco de Conjugado Concentrado com parte da mistura Conjugado Concentrado e Diluente do Conjugado. Homogeneizar suavemente por inversão. Uma vez preparado, o Conjugado de Uso é estável por 4 meses quando armazenado entre 2 e 8 ºC. Identificar o frasco e anotar a data de expiração. Se necessário, pode-se preparar volumes menores do Conjugado de Uso, transferindo-se para um frasco limpo e seco 1 (um) volume do Conjugado Concentrado e 50 volumes do Diluente do Conjugado. Identificar o frasco e anotar a data de expiração. Para preservar seu desempenho, o Conjugado de Uso deve permanecer fora da geladeira somente o tempo necessário para a sua utilização. 02 Português - Ref.: 903

3 Reconstituição dos calibradores Ver item 1 - Observações. Remover o selo de alumínio e retirar cuidadosamente a tampa de borracha. Utilizando uma pipeta volumétrica, adicionar ao frasco do calibrador o volume de água deionizada indicado no rótulo. Recolocar a tampa de borracha, deixar em repouso durante 10 minutos e homogeneizar suavemente por inversão. Antes de utilizar, homogeneizar suavemente e retirar a quantidade necessária para uso. Tampar imediatamente e armazenar entre 2 e 8 ºC. Após a reconstituição, os calibradores permanecem estáveis por 21 dias se armazenado entre 2 e 8 ºC, bem vedado e protegido da luz. Para preservar o desempenho, manter o calibrador fora da temperatura de armazenamento somente pelo tempo mínimo necessário para se obter o volume a ser utilizado. Para armazenamento por período superior a 21 dias sugerimos, após reconstituição, separar o calibrador em alíquotas e armazenar em temperatura inferior a 15 ºC negativos por até 90 dias em recipiente hermeticamente fechado, protegido da luz. Para evitar evaporação do material durante o período de armazenamento é fundamental utilizar frascos adequados para congelamento (criotubos). As alíquotas do calibrador devem ser descongeladas somente uma vez. Os calibradores devem ser manuseados de acordo com as boas práticas de laboratório para evitar contaminações de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. Calibração. A calibração do sistema é realizada através da utilização de uma Master Curve de 6 pontos (concentração dos calibradores e respectivas RLUs) e ajustada, quando necessário, utilizando dois calibradores de ajuste (Calibrador Low - (Baixo) Ref e Calibrador High - (Alto) Ref ). A Master Curve é fornecida em um documento anexo juntamente com o produto TSH e é específica para cada lote de reagentes. Ao inserir os dados da Master Curve durante a criação do protocolo do teste, inserir também as concentrações dos calibradores de ajuste indicadas nos rótulos dos mesmos. (Calibrador Low - (Baixo) Ref e Calibrador High - (Alto) Ref ). Quando um lote do produto é utilizado pela primeira vez, os dados da Master Curve deverão ser inseridos no programa do luminômetro e em seguida deverá ser realizado um ajuste da curva de calibração, ensaiando em duplicata os dois calibradores fornecidos dentro do kit (Calibrador Low - (Baixo) Ref e Calibrador High - (Alto) Ref ). Para definir a programação do equipamento e inserir corretamente os dados da Master Curve, consultar o manual do equipamento. Quando os reagentes são mantidos nas condições indicadas, a calibração permanece estável por 90 dias. A calibração do sistema deverá ser ajustada nas seguintes condições: 1. Quando um lote do produto é utilizado pela primeira vez; 2. A cada nova preparação do Conjugado de Uso, se for o caso. 3. Quando o controle da qualidade indicar. Procedimento de Teste Importante 1. Os parâmetros de leitura dos testes bem como os dados da Master curve devem ser inseridos no luminômetro previamente à realização dos testes. Ver item Calibração e consulte o manual do equipamento para detalhes. 2. Não utilizar mais que 20 imunotubos em cada corrida. 1. Separar o número de imunotubos (IT) necessários aos testes, identificá-los e posicioná-los na estante para imunotubos. 2. Adicionar 0,15 ml de Diluente de Amostra no fundo de cada tubo. 3. Adicionar 0,10 ml da amostra (soro, controles ou calibradores) diretamente ao conteúdo de cada imunotubo. Homogeneizar. 4. Incubar 30 minutos em banho maria a 37 ºC. 5. Retirar os imunotubos do banho-maria. 6. Adicionar 1,0 ml de Solução de Lavagem Concentrada (Ref. 908) pronta para uso. 7. Descartar o conteúdo dos tubos por inversão e com a estante ainda invertida, retirar o excesso de líquido, encostando a borda superior dos tubos sobre uma superfície absorvente (2-3 camadas de papel toalha). 8. Adicionar 0,15 ml de Biotinilado no fundo de cada tubo. 9. Adicionar 0,10 ml de Conjugado de Uso diretamente ao conteúdo de cada tubo. Homogeneizar. 10. Incubar 30 minutos em banho-maria a 37 ºC. 11. Retirar os tubos do banho-maria. 12. Repetir por seis vezes consecutivas as etapas 6 e Para a obtenção dos resultados, proceder da seguinte maneira: 1. Realizar o prime do equipamento utilizando as Soluções de Revelação (consultar as instruções de uso do produto Soluções de Revelação - Ref. 909 e o manual de operação do equipamento); 2. Selecionar o protocolo do teste que possui os dados da Master Curve; 3. Realizar a medição dos calibradores de ajuste (se necessário), amostras e controles. Intervalo operacional. O intervalo operacional do teste é de 0,05 UI/mL até aproximadamente 25 UI/mL. O limite superior do intervalo é definido pela concentração do último calibrador da curva de calibração. A concentração deste último calibrador pode sofrer pequenas variações de lote a lote. 03 Português - Ref.: 903

4 Amostras que apresentarem resultados menores que o limite da sensibilidade analítica devem ser reportadas como <0,05 UI/mL. Amostras com concentrações superiores ao valor do último calibrador devem ser diluídas com solução salina 0,85%. Após a diluição, multiplicar o valor encontrado pelo fator de diluição utilizado. Controle interno da qualidade. O laboratório deve manter um programa de controle interno da qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, normas, critérios para especificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro das atividades. A utilização dos controles em todos os conjuntos de testes é fundamental para monitorizar a imprecisão da medição e desvios da calibração. Sugere-se que as especificações para o coeficiente de variação e o erro 1,2,3 total sejam baseadas nos componentes da variação biológica (VB). Sugere-se utilizar as preparações da Linha Qualitrol Q da Labtest para controle interno da qualidade em ensaios de quimioluminescência. Intervalo de referência 4 O intervalo deve ser usado apenas como orientação. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de referência na população atendida. Idade recém-nascidos até 4 dia TSH ( Ul/mL) 1, a 20 semanas 1,7-9,1 21 semanas até 20 anos 0,7-6,4 21 a 54 anos 0,4-4,2 55 a 87 anos 0,5-8,9 Gravidez 1º. Trimestre 0,3-4,5 2º. Trimestre 3º. Trimestre 0,5-4,6 0,8-5,2 Número de amostras Intervalo de concentrações ( UI/mL) Média das estimativas ( UI/mL) Equação da regressão Coeficiente de correlação Método Comparativo Utilizando a equação da regressão, o erro sistemático total (bias) estimado foi igual a 2,74% para um nível de decisão igual a 4,49 UI/mL e 0,58% para um nível de decisão igual a 19,81 UI/mL. Esses erros são menores que o erro sistemático analítico da especificação desejável baseada nos componentes da variação biológica que é 7,82%. Estudos de precisão. Os estudos de precisão foram realizados utilizando-se amostras nativas, com concentrações iguais a 4,49 UI/mL e 21,23 UI/mL. 48 0,59-19,81 5,25 Método Labtest 48 0,59-19,53 5,38 Método Labtest = 1,000 x Método Comparativo + 0,123 0,994 Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio Amostra 1 Amostra 2 N Média ( UI/mL) 4,49 21,23 Reprodutibilidade - Imprecisão total Amostra 1 Amostra 2 N Média ( UI/mL) 4,49 21,23 DP 0,21 0,87 DP 0,26 1,53 CV (%) 4,58 4,10 CV (%) 5,79 7,19 Características do desempenho 5 Efeitos da diluição da matriz. Duas amostras com valores iguais a 13,9 e 20,7 UI/mL foram utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições da matriz com NaCl 150 mmol/l (0,85%). Usando fatores de diluição que variaram de 2 a 8 foram encontradas recuperações entre 98,6 e 99,4%. Comparação de métodos. O método proposto foi comparado com produto disponível no mercado, que utiliza metodologia similar, sendo obtidos os seguintes resultados: A imprecisão encontrada atende a especificação desejável para imprecisão total baseada nos componentes da VB que é 9,65%. O erro total (erro aleatório + erro sistemático) estimado é igual a 12,3% para o nível de decisão 4,49 UI/L e 12,4% para o nível de decisão 21,23 UI/L. Os resultados indicam que o método atende à especificação desejável para erro total ( 23,74%) baseada nos componentes da VB. Sensibilidade metodológica ou analítica. Limite de detecção: 0,05 UI/mL. A sensibilidade analítica corresponde ao limite de detecção inferior. Representa a concentração mais baixa de TSH passível de ser distinguida de zero. É calculada como a concentração de TSH situada dois desvios padrão acima do calibrador zero. 04 Português - Ref.: 903

5 4 Significado clínico. O TSH é uma glicoproteína com peso molecular igual a 30 KDa e composta por duas subunidades polipeptídicas, ambas essenciais para sua ação metabólica. A subunidade β é específica para o TSH e a subunidade é compartilhada com outros hormônios como o LH, FSH e hcg. Atuando através do mecanismo do AMP cíclico, o TSH age estimulando a produção dos hormônios T3 (triiodotironina) e T4 (tiroxina) pela glândula tireóide. A integração bioquímica da hipófise anterior, produtora do TSH e a tireóide, glândula alvo, é feita através do hormônio tripeptídico hipotalâmico, o TRH ( Thyrotropin Releasing Hormone), o qual age diretamente sobre a hipófise estimulando a produção do TSH. Assim, níveis elevados de T4 inibem a produção hipotalâmica de TRH, diminuindo dessa maneira o estímulo para a produção do TSH hipofisário. Em contrapartida, a redução dos níveis plasmáticos de T4 tem como conseqüência uma elevação da produção do TSH através da diminuição do controle do hipotálamo. A compreensão dos mecanismos básicos acima conduz diretamente às interpretações clínicas dos achados laboratoriais encontrados nas diversas patologias. 2. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e medicamentosas de interferência nos resultados e na metodologia sugere-se consultar Young ª DS. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3 edição, Washington: AACC Press, Referências 1. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. Disponível em: < Variacion_biologica_%7C_Comision_de_Calidad_Analitica_%7C_Co mite_cientifico/> (acesso em 04/2014). 2. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica. Labtest Diagnóstica Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;27: Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE: Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, 4.ed. St. Louis: Sauders/Elsevier, p Assim, no hipotireoidismo primário, resultante de acometimento da glândula tireóide, os níveis de T3 e T4 encontram-se diminuídos, o que leva a um aumento do TSH. Mesmo no hipotireoidismo discreto ou em sua fase inicial, quando os hormônios tireoidianos podem ainda se encontrar no intervalo de referência, os níveis de TSH já se encontram elevados. No hipotireoidismo secundário, o defeito metabólico encontra-se no nível central e ocorre devido a um distúrbio no eixo hipotalâmico-hipofisário, resultante de lesões no hipotálamo, na hipófise ou em ambos. Neste caso, os níveis de T3 e T4 encontram-se reduzidos, mas os níveis de TSH encontram-se diminuídos ou no intervalo de referência, ou seja, os níveis de TSH estão abaixo do esperado para os níveis de T4. No hipertireoidismo primário, como aquele que ocorre na Doença de Graves, nódulos tireoidianos ou adenoma da tireóide, os níveis de TSH estão quase sempre diminuídos ou mesmo indetectáveis, excetuando-se algumas situações metabólicas raras. Na maioria dos casos o T4 (principalmente o T4 livre) estará elevado. Observações 5. Labtest: Dados de arquivo. Apresentação Produto Referência TSH Conteúdo 1 2 X 7,5 ml X 7,5 ml 1 X 0,1 ml 1 X 5 ml 1 X 1 ml 1 X 1 ml X 25 un 1. O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa potencial de erros analíticos. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes, usar nas medições e para uso no enxágue final da vidraria, a água deve ter resistividade 1 megaohm.cm ou condutividade 1 microsiemens/cm e concentração de silicatos <0,1 mg/l. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. Edição: Maio, 2012 Ref.: Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reprodução sob prévia autorização 05 Português - Ref.: 903

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