T4 LIVRE. 01 Português - Ref.: 906. Ref.:906 MS Instruções de Uso

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1 T4 LIVRE Instruções de Uso Ref.:906 MS Finalidade. Sistema para a determinação quantitativa da tiroxina não ligada (T4 Livre) no soro e plasma. [Somente para uso diagnóstico in vitro.] Introdução. A tiroxina (T4) é um hormônio sintetizado a partir de resíduos de tirosina contidos na tireoglobulina, proteína produzida e armazenada na glândula tireóide. Sob a ação do hormônio tireotrópico (TSH) o T4 é liberado na corrente circulatória onde se liga a uma proteína carreadora específica, a TBG (Thyroxin Binding Globulin) e em menor grau à fração albumina. A maior parte do T4 se encontra em sua forma ligada, em equilíbrio com uma pequena fração livre (T4 Livre). A fração livre é a fração mais importante do ponto de vista metabólico, uma vez que é aquela capaz de ser convertida perifericamente em T3, que é o derivado hormonal metabolicamente mais ativo. Princípio. O T4 Livre presente na amostra compete com um análogo (T4 biotinilado) por um número limitado de anticorpos de coelho anti-t4. Os complexos anticorpo-t4 e anticorpo-t4 biotinilado são então capturados por anticorpos anti IgG de coelho que estão imobilizados na. Após a lavagem, é adicionado ao superfície dos Imunotubos meio o conjugado de estreptavidina-peroxidase, originando a formação de um complexo quaternário. Após remoção do excesso de reagentes a reação quimioluminescente é desencadeada pela adição de peróxido e luminol. A quantidade de luz emitida, medida em unidades relativas de luz (RLU), é inversamente proporcional à concentração de T4 Livre presente na amostra, cujo valor é obtido por meio de uma curva de calibração. Características do sistema. O T4 Livre - Labtest é um sistema semi-automático desenvolvido com uma abordagem inovadora que possibilita a utilização dos substratos quimioluminescentes luminol e peróxido em cinética rápida, com obtenção do sinal quimioluminescente em poucos segundos. Os níveis de sensibilidade são equivalentes aos de outros substratos quimioluminescentes que empregam a fosfatase alcalina como enzima. Os estudos realizados demonstram que o ensaio não sofre interferência significativa provocada por concentrações elevadas de hemoglobina, bilirrubina e de triglicérides. Metodologia. Quimioluminescência. Reagentes 1. - T4 Biotinilado. Armazenar entre 2-8 ºC. Pronto para uso. Contém T4 biotinilado em tampão 100 mmol/l ph 7,4; conservante, surfactante e estabilizadores. 2. ANTI T4 - Anti-T4. Armazenar entre 2-8 ºC. Pronto para uso. Contém anticorpo policlonal de coelho anti-t4 em tampão 100 mmol/l ph 7,4; conservante, surfactante e estabilizadores. 3. DIL REA - Diluente de Reação. Armazenar entre 2-8 ºC Conjugado Pronto para uso. Contém tampão 100 mmol/l ph 7,4; conservante, surfactante e estabilizadores. Concentrado 50X. Armazenar entre 2-8 ºC. Contém estreptavidina-peroxidase, conservante, surfactante e estabilizadores. Ver item Procedimento - Preparo de Reagentes Diluente 6. - Calibrador do Conjugado. Armazenar entre 2-8 ºC. Pronto para uso. Contém tampão 100 mmol/l ph 7,4; conservante, surfactante e estabilizadores. Low (Baixo). Armazenar entre 2-8 ºC. Preparação liofilizada de T4 em matriz proteica humana; conservante e estabilizadores. Ver item Procedimento - Preparo de Reagentes. A concentração de T4 está assinalada no rótulo do frasco. Após reconstituição, o calibrador é estável por 14 dias quando armazenado entre 2-8 ºC, bem vedado e protegido da luz, e por 90 dias quando armazenado a -15 ºC, bem vedado e protegido da luz. Ver item PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS, antes da manipulação dos calibradores. A concentração deste calibrador, presente no rótulo do produto, deverá ser inserida no protocolo do teste Calibrador High (Alto). Armazenar entre 2-8 ºC. Preparação liofilizada de T4 em matriz proteica humana; conservante e estabilizadores. Ver item Procedimento - Preparo de Reagentes. A concentração de T4 está assinalada no rótulo do frasco. Após reconstituição, o calibrador é estável por 14 dias quando armazenado entre 2-8 ºC, bem vedado e protegido da luz, e por 90 dias quando armazenado a -15 ºC, bem vedado e protegido da luz. Ver item P RECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS, antes da manipulação dos calibradores. A concentração deste calibrador, presente no rótulo do produto, deverá ser inserida no protocolo do teste Imunotubos. Armazenar entre 2-8 ºC. Pronto para uso. Tubos de poliestireno sensibilizados com anticorpos policlonais anti IgG de coelho. As embalagens plásticas contendo os tubos devem ser abertas somente quando estiverem em equilíbrio com a temperatura do ambiente (temperatura inferior a 30 ºC) onde será realizado o teste, para evitar a condensação de vapor de água nos tubos. O não cumprimento desta orientação acarretará em diminuição da estabilidade do reagente. Após a abertura das embalagens, os tubos são estáveis por 6 meses, quando armazenados entre 2-8 ºC e com o dessecante na embalagem plástica bem fechada. 01 Português - Ref.: 906

2 Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Após abertos, os reagentes devem ser manuseados de acordo com as boas práticas de laboratório para evitar contaminações de natureza química e microbiana, que podem provocar redução da estabilidade. Precauções e cuidados especiais Os calibradores são preparados a partir de derivados de sangue humano e foram testados para a presença de HBsAg, anticorpos anti-hcv e anti-hiv apresentando resultados negativos. Apesar de terem sido utilizados testes validados e aprovados, nenhum deles pode assegurar que produtos derivados do sangue humano estejam livres de agentes infecciosos. Portanto, os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação do produto, que não deve ser pipetado com a boca. Recomenda-se manuseá-lo como sendo potencialmente infectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes e não utilizar reagentes fora do prazo de validade. Não permitir a contaminação cruzada entre os componentes. Utilizar somente ponteiras descartáveis para pipetar cada amostra e cada reagente. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos. Resíduos de sabão, detergentes ou agentes oxidantes nos recipientes utilizados para o preparo do Conjugado de uso podem interferir na reação. Usar preferencialmente material plástico descartável. Caso se utilize recipientes de vidro, é recomendável que estes sejam lavados com ácido sulfúrico ou clorídrico 0,5 mol/l, enxaguados exaustivamente com água destilada ou deionizada e secos antes do uso. devem ser As embalagens plásticas contendo os Imunotubos abertas somente quando estiverem em equilíbrio com a temperatura do ambiente (temperatura inferior a 30 ºC) onde será realizado o teste, para evitar a condensação de vapor de água nos tubos. O não cumprimento desta orientação acarretará em diminuição da estabilidade do reagente. Após a abertura das embalagens, os Imunotubos são estáveis por 6 meses, quando armazenados com o dessecante na embalagem plástica bem fechada. Os Imunotubos deverão ser descartados após o uso. Não reutilizar para outros fins. Para descartar os reagentes e o material biológico, sugerimos aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental. Material necessário e não fornecido 1. Micropipetas e ponteiras descartáveis. 2. Banho-maria (37 1 ºC). 3. Recipientes para preparar as diluições. 4. Cronômetro. 5. Solução de Lavagem Concentrada (Ref. 908). 6. Soluções de Revelação (Ref. 909). 7. Estante para tubos 12 x 75 mm com sistema de fixação. 8. Microcomputador. 9. Luminômetro Lumiquest ou instrumento similar equipado com dois injetores e capacidade para acomodar tubos 12 x 75 mm. 10. Solução de Sanitização (Ref. 604). Amostra 1 Usar soro ou plasma (EDTA, Heparina, Citrato). Quando o sangue for obtido no anticoagulante citrato, efetuar correção pela diluição provocada na amostra. O analito é estável 7 dias entre 2-8 ºC e por até 30 dias em temperatura inferior a 15 ºC negativos quando armazenado em recipiente apropriado para congelamento. Assegurar que as amostras estejam descongeladas e homogeneizadas antes da sua utilização. Partículas em suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. Não usar amostras com sinais de contaminação ou amostras congeladas e descongeladas mais de uma vez. Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) para colheita, preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os erros ocorridos no procedimento analítico. Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las, devem-se seguir as normas de biossegurança. Interferências Concentrações de hemoglobina até 1000 mg/dl, bilirrubina até 30 mg/dl e triglicérides até 800 mg/dl, não produzem interferências significativas. Procedimento Cuidados especiais. As embalagens plásticas contendo os Imunotubos devem ser abertas somente quando estiverem em equilíbrio com a temperatura do ambiente (temperatura inferior a 30 ºC) onde será realizado o teste, para evitar a condensação de vapor de água nos tubos. O não cumprimento desta orientação acarretará em diminuição da estabilidade do reagente. Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso. Preparo dos reagentes Conjugado de uso. Para preparar o Conjugado de Uso, pipetar todo o conteúdo do frasco de Conjugado Concentrado, transferir para o frasco contendo o Diluente do Conjugado e homogeneizar. Se houver necessidade, centrifugar o material para certificar que todo o conteúdo do frasco de Conjugado Concentrado esteja no fundo do tubo. Após transferir todo o volume, lavar o frasco de Conjugado Concentrado com parte da mistura Conjugado Concentrado e Diluente de Conjugado. Homogeneizar suavemente por inversão. Uma vez preparado, o Conjugado de Uso é estável por 4 meses quando armazenado entre 2-8 ºC. Identificar o frasco e anotar a data de expiração. 02 Português - Ref.: 906

3 Se necessário, podem-se preparar volumes menores do Conjugado de Uso, transferindo-se para um frasco limpo e seco 1 (um) volume do Conjugado Concentrado e 50 volumes do Diluente do Conjugado. Uma vez preparado, o Conjugado de Uso é estável por 4 meses quando armazenado entre 2-8 ºC. Identificar o frasco e anotar a data de expiração. Para preservar seu desempenho, o Conjugado de Uso deve permanecer fora da geladeira somente o tempo necessário para a sua utilização. Reconstituição dos calibradores. Ver item 1 - Observações. Remover o selo de alumínio e retirar cuidadosamente a tampa de borracha. Utilizando uma pipeta volumétrica, adicionar ao frasco do calibrador o volume de água qualidade reagente indicado no rótulo. Recolocar a tampa de borracha, deixar em repouso durante 15 minutos e homogeneizar suavemente por inversão. Antes de utilizar, homogeneizar suavemente e retirar a quantidade necessária para uso. Tampar imediatamente e armazenar entre 2-8 ºC. Após a reconstituição, os calibradores são estáveis por 14 dias, quando armazenados entre 2-8 ºC. Para posterior utilização, o calibrador deve ser separado em alíquotas imediatamente após a reconstituição e armazenado em temperatura inferior a 15 ºC negativos por até 90 dias em recipiente hermeticamente fechado, protegido da luz. Para evitar evaporação do material durante o período de armazenamento é fundamental utilizar frascos adequados para congelamento (criotubos). As alíquotas do calibrador devem ser descongeladas somente uma vez. Os calibradores devem ser manuseados de acordo com as boas práticas de laboratório para evitar contaminações de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. Calibração. A calibração do sistema é realizada através da utilização de uma Master Curve de 6 pontos (concentração dos calibradores e respectivas RLUs) e ajustada, quando necessário, utilizando dois calibradores de ajuste (Calibrador Low - (Baixo) Ref e Calibrador High - (Alto) Ref ). A Master Curve é fornecida em um documento anexo juntamente com o produto T4 Livre e é específica para cada lote de reagentes. Ao inserir os dados da Master Curve durante a criação do protocolo do teste, inserir também as concentrações dos calibradores de ajuste indicadas nos rótulos dos mesmos. (Calibrador Low - (Baixo) Ref e Calibrador High - (Alto) Ref ). Quando um lote do produto é utilizado pela primeira vez, os dados da Master Curve deverão ser inseridos no programa do luminômetro e em seguida deverá ser realizado um ajuste da curva de calibração, ensaiando em duplicata os dois calibradores fornecidos dentro do kit (Calibrador Low - (Baixo) Ref e Calibrador High - (Alto) Ref ). Para definir a programação do aparelho e inserir corretamente os dados da Master Curve, consultar o manual do equipamento. Quando os reagentes são mantidos nas condições indicadas, a calibração permanece estável por 15 dias. A calibração do sistema deverá ser ajustada nas seguintes condições: 1. Quando um lote do produto é utilizado pela primeira vez; 2. A cada nova preparação do Conjugado de Uso; 3. A cada troca de lote das Soluções de Revelação (Ref. 909). 4. Quando o controle da qualidade indicar Procedimento de teste Importante 1. Os parâmetros de leitura dos testes, bem como os dados da Master curve, devem ser inseridos no luminômetro previamente à realização dos testes. Ver item Calibração e consulte o manual do equipamento para detalhes. 2. Não utilizar mais que 20 Imunotubos em cada corrida. 1. Separar o número de Imunotubos necessários aos testes, calibradores e controles, identificá-los e posicioná-los na estante para Imunotubos. 2. Adicionar 0,02 ml de amostra, calibradores e controles no fundo de cada tubo. 3. Adicionar 0,10 ml de T4 Biotinilado no fundo de cada tubo. 4. Adicionar 0,10 ml de Anti-T4 ANTI T4 no fundo de cada tubo. Homogeneizar. 5. Incubar 30 minutos em banho-maria a 37 ºC. 6. Retirar os tubos do banho-maria. 7. Adicionar 1,0 ml de Solução de Lavagem Concentrada (Ref. 908) pronta para uso. 8. Descartar o conteúdo dos tubos por inversão e com a estante ainda invertida, retirar o excesso de líquido, encostando a borda superior dos tubos sobre uma superfície absorvente (2-3 camadas de papel toalha). 9. Adicionar 0,10 ml de Diluente de Reação DIL REA no fundo de cada tubo. 10. Adicionar 0,10 ml de Conjugado de Uso diretamente ao conteúdo de cada tubo. Homogeneizar. 11. Incubar 30 minutos em banho-maria a 37 ºC. 12. Retirar os tubos do banho-maria. 03 Português - Ref.: 906

4 13. Repetir por seis vezes consecutivas as etapas 7 e Para a obtenção dos resultados, proceder da seguinte maneira: 1. Realizar o prime do Lumiquest (consultar as instruções de uso do produto Soluções de Revelação - Ref. 909 e o manual de operação do equipamento); 2. Selecionar o protocolo do teste que possui os dados da Master Curve; 3. Realizar a medição dos calibradores de ajuste, amostras e controles. Intervalo operacional. O intervalo operacional do teste é de 0,3 ng/dl a ~5,0 ng/dl. O limite superior do intervalo é definido pela concentração do último calibrador da curva de calibração. Amostras que apresentarem resultados menores que o limite da sensibilidade analítica devem ser reportadas como <0,3 ng/dl. Amostras com concentrações superiores ao calibrador 6 da Master curve devem ser reportadas como acima deste valor. Consultar a Master curve que acompanha o kit para a obtenção do valor do calibrador 6. Devido à situação de equilíbrio entre o T4 e suas proteínas ligadoras, a diluição de amostras contendo T4 Livre não fornece resultados confiáveis. Controle interno da qualidade. O laboratório deve manter um programa de controle interno da qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, normas, critérios para especificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro das atividades. A utilização dos controles em todos os conjuntos de testes é fundamental para monitorizar a imprecisão da medição e desvios da calibração. Sugere-se utilizar as preparações da Linha Qualitrol Q da Labtest (Ref. 907) para controle interno da qualidade em ensaios de quimioluminescência. 2 Intervalo de referência. O intervalo deve ser usado apenas como orientação. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de referência na população atendida. Soro ou plasma: 0,70-2,0 ng/dl Características de desempenho 3 Comparação de métodos. O método proposto foi comparado com produto disponível no mercado, que utiliza metodologia similar, sendo obtidos os seguintes resultados: Número de amostras Intervalo de concentrações Média das estimativas Equação da regressão Coeficiente de correlação Método Comparativo 0,43-2,90 1,36 Método Labtest 0,51-3,28 1,56 Método Labtest = 1,0478 x Método Comparativo + 0,1294 0,978 Utilizando a equação da regressão, o erro sistemático total (bias) estimado foi igual a 15,3% para uma amostra igual 1,17 ng/dl e 8,07% 4 para uma amostra igual 3,93 ng/dl, erro considerado aceitável e que não representa desvios de resultados entre a metodologia comparativa. Estudos de precisão. Os estudos de precisão foram realizados utilizando-se amostras nativas, em três níveis diferentes: Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 N Sensibilidade metodológica ou analítica. Limite de detecção 0,3 ng/dl. Representa a menor concentração de T4 Livre que pode ser diferenciada de zero. Equivale à concentração de T4 Livre situada dois desvios padrões acima do calibrador 1 (0 ng/dl). 5 Significado clínico. Média 0,61 1,17 3,93 Reprodutibilidade - Imprecisão total Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 N Média 0,61 1,17 3,93 O T4 ligado às proteínas carreadoras representa um reservatório de T4 necessário para manter constante a concentração plasmática do hormônio livre (T4 Livre). Perifericamente o T4 Livre é convertido em T3 que é o metabólito mais ativo. A estimulação da produção de T4 é feita pelo hormônio tireotrópico (TSH). A integração bioquímica da hipófise anterior, produtora do TSH e a tireóide, glândula alvo, é feita através do hormônio tripeptídico hipotalâmico, o TRH (Thyrotropin Releasing Hormone), o qual age diretamente sobre a hipófise estimulando a produção do TSH. Assim, níveis elevados de T4 inibem a produção hipotalâmica de TRH, diminuindo dessa maneira o estímulo para a produção do TSH hipofisário. Em contrapartida, a redução dos níveis plasmáticos de T4 tem como conseqüência uma elevação da produção do TSH através da diminuição do controle do hipotálamo. A compreensão dos mecanismos básicos acima conduz diretamente às interpretações clínicas dos achados laboratoriais encontradas nas diversas patologias. Assim, no hipotireoidismo primário, resultante de acometimento da glândula tireóide, os níveis de T4 (e também de T3) encontram-se diminuídos. No hipotireoidismo discreto ou em sua fase inicial, o T4 pode ainda se encontrar dentro do intervalo de referência, embora os níveis de TSH possam se encontrar elevados. DP 0,07 0,08 0,19 DP 0,09 0,08 0,20 CV (%) 3,30 3,53 3,74 CV (%) 10,61 7,17 6,19 04 Português - Ref.: 906

5 No hipotireoidismo secundário, o defeito metabólico encontra-se no nível central e ocorre devido a um distúrbio no eixo hipotalâmico-hipofisário, resultante de lesões no hipotálamo, na hipófise ou em ambos. Neste caso, os níveis de T4 encontram-se reduzidos. No hipertireoidismo primário, como aquele que ocorre na Doença de Grave, nódulos tireoidianos ou adenoma da tireóide, os níveis de T4 na maioria das vezes estará elevado. Observações 1. O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa potencial de erros analíticos. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes, usar nas medições e para uso no enxágue final da vidraria, a água deve ter resistividade 1 megaohm.cm ou condutividade 1 microsiemens/cm e concentração de silicatos <0,1 mg/l. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. Apresentação Produto T4 Livre Referência Conteúdo 1 X 5 ml ANTI T4 1 X 5 ml DIL REA 1 X 5 ml 1 X 0,1 ml 1 X 5 ml 1 X 1,0 ml 1 X 1,0 ml 2 X 25 un Referências 1. Arup Laboratories: National Reference Laboratory. Disponível em: <www.aruplab.com>, acesso em 07/ Tietz NW: Clinical Guide to Laboratory Tests, 3.ed. Philadelphia: Saunders Company, p Arquivos Labtest. 4. RiliBÄK (Richtlinien der Bundesärztekammer), publicado em 2009 no site do CLIA (www.westgard.com). (acesso em 07/2012). Edição: Janeiro, 2013 Ref.: Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reprodução sob prévia autorização 5. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE: Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, 4.ed. St. Louis: Sauders/Elsevier, p Português - Ref.: 906

6 06 Português - Ref.: 906

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