PSA TOTAL. 01 Português - Ref.: 901. Ref.:901 MS Instruções de Uso. Metodologia. Quimioluminescência em tubos.

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1 PSA TOTAL Instruções de Uso Ref.:901 MS Finalidade. Sistema para a determinação quantitativa do antígeno prostático específico total ( Prostatic Specific Antigen - PSA) em soro. [Somente para uso diagnóstico in vitro.] Introduçâo. O antígeno específico da próstata (PSA) é uma glicoproteína de 237 aminoácidos membro da família das calicreínas humanas. Produzida principalmente pelas células epiteliais da próstata, esta serina protease age liquefazendo o fluido seminal através de um mecanismo de atividade enzimática similar à quimiotripsina. Existem ainda outras fontes de PSA, como o leite materno e as glândulas salivares, mamárias, periuretrais e anais. O PSA está presente no soro sob duas formas diferentes, PSA não complexado (PSA livre, ou PSAL) e PSA complexado. O PSA complexado está predominantemente ligado à -1-antiquimiotripsina (PSA-ACT), enquanto um pequeno percentual se liga à -2-macroglobulina (PSA-A2M). Estes inibidores de proteases séricas estão presentes no 6 soro em concentração de 10 a 10 vezes maiores que a concentração de PSA circulante, garantindo que a maior parte do PSA sérico esteja sob a forma inativa, complexado a outras proteínas. O PSA-ACT é imunoreativo, porém inativo enzimaticamente, enquanto o PSA-A2M mantém fraca atividade proteásica, embora não seja imunoreativa. O PSAL é enzimaticamente inativo e está presente no soro não ligado a quaisquer proteínas. Princípio. O PSA presente na amostra se liga especificamente a anticorpos policlonais anti PSA imobilizados na superfície de imunotubos (IT). Após lavagem, são adicionados anticorpos policlonais marcados com biotina e conjugado de estreptavidina-peroxidase, originando a formação de um complexo quaternário. Após remoção do excesso de reagentes a reação quimioluminescente é desencadeada pela adição de peróxido e luminol. A quantidade de luz emitida, medida em unidades relativas de luz (RLU), está relacionada à concentração de PSA total presente na amostra, cujo valor é obtido através da curva de calibração. Características do sistema. O PSA - Labtest é um sistema semi-automático desenvolvido com uma abordagem inovadora que possibilita a utilização dos substratos quimioluminescentes luminol e peróxido em cinética rápida, com obtenção do sinal quimioluminescente em poucos segundos. Os níveis de sensibilidade são equivalentes aos de outros substratos quimioluminescentes que empregam a fosfatase alcalina como enzima. Os estudos realizados demonstram que o ensaio não sofre interferência significativa provocada por concentrações elevadas de hemoglobina, bilirrubina e de triglicérides, além de não apresentar o efeito hook (redução da resposta por excesso de antígeno). A estabilidade dos reagentes reduz a freqüência das calibrações, possibilitando adaptação a pequenas rotinas, com a realização de testes individuais sem aumento de custos. Metodologia. Quimioluminescência em tubos. Reagentes 1. - Diluente 2. - Biotinilado. Armazenar entre 2-8 ºC. de Amostra. Armazenar entre 2-8 ºC. Contém tampão 100 mmol/l ph 7,4; conservante, surfactante e estabilizadores. Pronto para uso Conjugado Contém anticorpo policlonal anti-psa biotinilado 0,5 g/ml em tampão 100 mmol/l ph 7,4; conservante; surfactante e estabilizadores. Pronto para uso. Concentrado 50X. Armazenar entre 2-8 ºC. Contém estreptavidina-peroxidase 50 g/ml, conservante, surfactante e estabilizadores. Ver item Procedimento - Preparo de Reagentes Diluente 5. - Calibrador do Conjugado. Armazenar entre 2-8 ºC. Contém tampão 100 mmol/l ph 7,4; conservante, surfactante e estabilizadores. Pronto para uso. Low (Baixo). Armazenar entre 2-8 ºC. Preparação liofilizada do antígeno prostático específico (PSA) contendo tampão 150 mmol/l ph 7,4 conservante e estabilizadores. Ver item Procedimento - Preparo de Reagentes. A concentração de PSA Total está assinalada no rótulo do frasco. Após reconstituição, o calibrador é estável por 30 dias quando armazenado entre 2-8 ºC, bem vedado e protegido da luz. A concentração deste calibrador, presente no rótulo do produto, deverá ser inserida no protocolo do teste Calibrador High (Alto). Armazenar entre 2-8 ºC. Preparação liofilizada do antígeno prostático específico (PSA) contendo tampão 150 mmol/l ph 7,4 conservante e estabilizadores. Ver item Procedimento - Preparo de Reagentes. A concentração de PSA Total está assinalada no rótulo do frasco. Após reconstituição, o calibrador é estável por 30 dias quando armazenado entre 2-8 ºC, bem vedado e protegido da luz. A concentração deste calibrador, presente no rótulo do produto, deverá ser inserida no protocolo do teste Imunotubos. Armazenar entre 2-8 ºC. Tubos de poliestireno sensibilizados com anticorpos policlonais anti PSA. Pronto para uso. As embalagens plásticas contendo os tubos devem ser abertas somente quando estiverem à temperatura ambiente (15-30 ºC), para evitar a condensação de vapor de água nos tubos. O não cumprimento desta orientação acarretará em diminuição da estabilidade do reagente. Após a abertura das embalagens, os tubos são estáveis por 6 meses, quando armazenados com o dessecante na embalagem plástica bem fechada. 01 Português - Ref.: 901

2 Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Após abertos, os reagentes devem ser manuseados de acordo com as boas práticas de laboratório para evitar contaminações de natureza química e microbiana, que podem provocar redução da estabilidade. Precauções e cuidados especiais Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação dos reagentes, os quais não devem ser pipetados com a boca. Não misturar reagentes de lotes diferentes e não utilizar reagentes fora do prazo de validade. Não permitir a contaminação cruzada entre os componentes. Utilizar somente ponteiras descartáveis para pipetar cada amostra e cada reagente. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos. Resíduos de sabão, detergentes ou agentes oxidantes nos recipientes utilizados para o preparo do Conjugado de uso podem interferir na reação. Usar preferencialmente material plástico descartável. Caso se utilize recipientes de vidro, é recomendável que estes sejam lavados com ácido sulfúrico ou clorídrico 0,5 mol/l, enxaguados exaustivamente com água destilada ou deionizada e secos antes do uso. As embalagens plásticas contendo os imunotubos (IT) devem ser abertas somente quando estiverem à temperatura ambiente (15-30 ºC), para evitar a condensação de vapor de água nos tubos. O não cumprimento desta orientação acarretará em diminuição da estabilidade do reagente. Após a abertura das embalagens, os imunotubos são estáveis por 6 meses, quando armazenados com o dessecante na embalagem plástica bem fechada. Os imunotubos (IT) deverão ser descartados após o uso. Não reutilizar para outros fins. Para descartar os reagentes e o material biológico, sugerimos aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental. Material necessário e não fornecido 1. Micropipetas e ponteiras descartáveis. 2. Banho-maria (37 1 ºC). 3. Recipientes para preparar as diluições. 4. Cronômetro. 5. Solução de Lavagem Concentrada (Ref. 908). 6. Soluções de Revelação (Ref. 909). 7. Estante para tubos 12 x 75 mm com sistema de fixação. 8. Microcomputador. 9. Luminômetro Lumiquest ou instrumento similar equipado com dois injetores e capacidade para acomodar tubos 12x75 mm. 10. Solução de Sanitização (Ref. 604). Amostra 1,2 Usar somente soro. O analito é estável 4 dias entre 2-8 ºC e por até 8 meses em temperatura inferior a 20 ºC negativos quando armazenado em recipiente apropriado para congelamento. Assegurar que as amostras estejam descongeladas e homogeneizadas antes da sua utilização. Partículas em suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. Não usar amostras com sinais de contaminação ou amostras congeladas e descongeladas mais de uma vez. Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) para colheita, preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os erros ocorridos no procedimento analítico. Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las, devem-se seguir as normas de biossegurança. Interferências Concentrações de hemoglobina até 1000 mg/dl, bilirrubina até 30 mg/dl e triglicérides até 1000 mg/dl, não produzem interferências significativas. Procedimento Cuidados especiais. As embalagens contendo os imunotubos devem ser abertas somente quando estiverem à temperatura ambiente (15-30 ºC), para evitar a condensação de vapor de água nos tubos. O não cumprimento desta orientação acarretará em diminuição da estabilidade do reagente. Os reagentes líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do uso. Preparo dos reagentes Conjugado de uso. Transferir o volume total do Conjugado Concentrado para o frasco contendo o Diluente do Conjugado Homogeneizar suavemente por inversão. Identificar o frasco e anotar a data de expiração. Opcionalmente podem-se preparar menores volumes do Conjugado de Uso transferindo para um frasco limpo e seco 1 (um) volume do Conjugado Concentrado e 50 volumes do Diluente do Conjugado Identificar o frasco e anotar a data de expiração. Uma vez preparado, o Conjugado de Uso é estável por 4 meses quando armazenado entre 2-8 ºC. Identificar o frasco e anotar a data de expiração. Para preservar seu desempenho, o reagente deve permanecer fora da geladeira somente o tempo necessário para a sua utilização. 02 Português - Ref.: 901

3 Reconstituição dos calibradores. Ver item 1 - Observações Remover o selo de alumínio e retirar cuidadosamente a tampa de borracha. Utilizando uma pipeta volumétrica, adicionar ao frasco do calibrador o volume de água qualidade reagente indicado no rótulo. Recolocar a tampa de borracha, deixar em repouso durante 15 minutos e homogeneizar suavemente por inversão. Antes de utilizar, homogeneizar suavemente e retirar a quantidade necessária para uso. Tampar imediatamente e armazenar entre 2-8 ºC. Após a reconstituição, o calibrador permanece estável por 30 dias se armazenado entre 2-8 ºC, bem vedado e protegido da luz. Para preservar o desempenho, manter o calibrador fora da temperatura de armazenamento somente pelo tempo mínimo necessário para se obter o volume a ser utilizado. Para armazenamento por período superior a 30 dias sugerimos, após reconstituição, separar o calibrador em alíquotas e armazenar em temperatura inferior a 20 ºC negativos por até 6 meses em recipiente hermeticamente fechado, protegido da luz. Para evitar evaporação do material durante o período de armazenamento é fundamental utilizar frascos adequados para congelamento (criotubos). As alíquotas do calibrador devem ser descongeladas somente uma vez. Os calibradores devem ser manuseados de acordo com as boas práticas de laboratório para evitar contaminações de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. Calibração. Os calibradores são rastreáveis ao Material de Referência NIBSC código 96/670 (WHO International Standard - Prostate Specific Antigen 90:10). A calibração do sistema é realizada através da utilização de uma Master Curve de 6 pontos (concentração dos calibradores e respectivas RLUs) e ajustada, quando necessário, utilizando dois calibradores de ajuste (Calibrador Low - (Baixo) Ref e Calibrador High - (Alto) Ref ). A Master Curve é fornecida em um documento anexo juntamente com o produto PSA total e é específica para cada lote de reagentes. Ao inserir os dados da Master Curve durante a criação do protocolo do teste, inserir também as concentrações dos calibradores de ajuste indicadas nos rótulos dos mesmos. (Calibrador Low - (Baixo) Ref e Calibrador High - (Alto) Ref ). Quando um lote do produto é utilizado pela primeira vez, os dados da Master Curve deverão ser inseridos no programa do luminômetro e em seguida deverá ser realizado um ajuste da curva de calibração, ensaiando em duplicata os dois calibradores fornecidos dentro do kit (Calibrador Low - (Baixo) Ref e Calibrador High - (Alto) Ref ). Para definir a programação do aparelho e inserir corretamente os dados da Master Curve, consultar o manual do equipamento. A calibração do sistema deverá ser ajustada nas seguintes condições: 1. Quando um lote do produto é utilizado pela primeira vez; 2. A cada nova preparação do Conjugado de Uso; 3. A cada troca de lote das Soluções de Revelação (Ref. 909). 4. Quando o controle da qualidade indicar. Procedimento de teste IMPORTANTE 1. Os parâmetros de leitura dos testes bem como os dados da Master curve devem ser inseridos no luminômetro previamente à realização dos testes. Ver item Calibração e consulte o manual do equipamento para detalhes. 2. Não utilizar mais que 20 imunotubos em cada corrida. 1. Separar o número de imunotubos (IT) necessários aos testes, identificá-los e posicioná-los na estante para imunotubos. 2. Adicionar 0,20 ml de Diluente de Amostra no fundo de cada tubo. 3. Adicionar 0,05 ml da amostra (soro, controles ou calibradores) diretamente ao conteúdo de cada tubo. Homogeneizar. 4. Incubar 30 minutos em banho-maria a 37 ºC. 5. Retirar os tubos do banho-maria. 6. Adicionar 1,0 ml de Solução de Lavagem Concentrada Ref. 908 pronta para uso. 7. Descartar o conteúdo dos tubos por inversão e com a estante ainda invertida, retirar o excesso de líquido, encostando a borda superior dos tubos sobre uma superfície absorvente (2-3 camadas de papel toalha). 8. Adicionar 0,15 ml de Biotinilado no fundo de cada tubo. 9. Adicionar 0,10 ml de Conjugado de Uso diretamente ao conteúdo de cada tubo. Homogeneizar. 10. Incubar 30 minutos em banho-maria a 37 ºC. 11. Retirar os tubos do banho-maria. 12. Repetir por seis vezes consecutivas as etapas 6 e 7. Quando os reagentes são mantidos nas condições indicadas, a calibração permanece estável por 90 dias. 03 Português - Ref.: 901

4 13. Para a obtenção dos resultados, proceder da seguinte maneira: 1. Realizar o prime do equipamento utilizando as Soluções de Revelação (consultar as instruções de uso do produto Soluções de Revelação - Ref. 909 e o manual de operação do equipamento); 2. Selecionar o protocolo do teste que possui os dados da Master Curve; 3. Realizar a medição dos calibradores de ajuste (se necessário), amostras e controles. Intervalo operacional. O intervalo operacional do teste é de 0,05 ng/ml até ng/ml. Amostras que apresentarem resultados menores que o limite da sensibilidade analítica devem ser reportadas como <0,05 ng/ml. Amostras com concentrações superiores a ng/ml podem ser diluídas com solução salina 0,85%. Após a diluição, multiplicar o valor encontrado pelo fator de diluição utilizado. Controle interno da qualidade. O laboratório deve manter um programa de controle interno da qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, normas, critérios para especificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro das atividades. A utilização dos controles em todos os conjuntos de testes é fundamental para monitorizar a imprecisão da medição e desvios da calibração. Sugere-se utilizar as preparações da Linha Qualitrol Q da Labtest para controle interno da qualidade em ensaios de quimioluminescência. 3 Intervalo de referência. A determinação do PSA no soro humano, em combinação com o exame de toque retal (DRE), forma a base para os programas modernos de triagem de câncer de próstata (CaP). Tal abordagem foi inicialmente adotada no final dos anos 80, onde um estudo de larga escala realizado por Catalona et al avaliou o resultado de biópsias da próstata realizados em pacientes que apresentaram alguma alteração nos exames de DRE, Ultrasom transretal (TRUS) e concentração sérica de PSA superior a 4,0 ng/ml. O resultado deste estudo demonstrou que 43% dos cânceres não teriam sido diagnosticados caso os pacientes tivessem sido submetidos somente ao exame de TRUS. Por este motivo, no início dos anos 90 foi publicada a recomendação de realizar a biópsia da próstata em casos de DRE anormal ou em exames sorológicos que apresentassem PSA em concentrações superiores a 4,0 ng/ml. No entanto, inúmeros estudos recentes relatam a ocorrência de câncer de próstata em homens que apresentam concentrações séricas de PSA inferiores a 4,0 ng/ml. Em 1993, um estudo demonstrou a ocorrência de câncer de próstata em 15,2% dos casos onde a concentração sérica de PSA foi inferior a 4,0 ng/ml. Por este motivo, a partir de 1995 surge o consenso urológico moderno de recomendar a realização de biópsia da próstata em pacientes que apresentem concentração sérica de PSA superior a 2,5 ng/ml. Características do desempenho 4 Efeitos da diluição da matriz. Uma amostra com valor igual a 89,7 ng/ml foi utilizada para avaliar a resposta do sistema nas diluições da matriz com NaCl 150 mmol/l (0,85%). Usando fatores de diluição que variaram de 2 a 16 foram encontradas recuperações médias de 105,8%. Comparação de métodos. O método proposto foi comparado com método similar, sendo obtidos os seguintes resultados: Número de amostras Intervalo de concentrações Média das estimativas Equação da regressão Coeficiente de correlação Método Comparativo Utilizando a equação da regressão, o erro sistemático total (bias) estimado foi igual a 15,3% para um nível de decisão igual 2,5 ng/ml e 12% para um nível de decisão igual 10 ng/ml, erro considerado aceitável 5 e que não representa desvios de resultados entre a metodologia comparativa. Estudos de precisão. Os estudos de precisão foram realizados utilizando-se amostras nativas, em três níveis diferentes: Sensibilidade metodológica ou analítica. Limite de detecção: 0,05 ng/ml. Equivale à concentração de PSA que está distante dois desvios padrões do calibrador 1 (0 ng/ml) e representa a menor concentração de PSA que pode ser diferenciada de zero. 6,7 Significado clínico. Nos últimos 20 anos, o PSA sérico tem sido o marcador tumoral mais comumente utilizado para triagem, estadiamento e prognóstico de CaP. No entanto, a triagem de pacientes para biópsia da próstata utilizando como parâmetro somente a análise do PSA sérico é inconclusiva, principalmente nos homens com mais de 50 anos, pois concentrações elevadas de PSA são também observadas nos casos de hipertrofia benigna da próstata (BPH), neoplasia intraepitelial prostática, isquemia prostática, prostatites aguda ou crônica ou após manipulação da próstata. 41 0,05-33,3 6,30 Método Labtest = 1,110 x Método Comparativo + 0,109 0,993 Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio Amostra 1 Amostra 2 N Média 2,50 10,0 Reprodutibilidade - Imprecisão total Amostra 1 Amostra 2 N Média 2,50 10,0 DP 0,20 0,69 DP 0,18 0,79 Método Labtest 41 0,05-39,12 7,10 CV (%) 4,43 9,37 CV (%) 3,10 8,24 04 Português - Ref.: 901

5 Neste contexto, a determinação sérica de PSAL tem sido sugerida como teste adjunto ao teste de determinação do PSA total (PSA complexado + PSAL), com o objetivo de diminuir o número de biópsias prostáticas desnecessárias e aumentar o percentual de acerto de diagnóstico diferencial entre CaP e BPH, visto que homens que desenvolvem o CaP apresentam percentual de PSAL menor do que os homens que possuem BPH. Ressalta-se, no entanto, que a determinação isolada de PSAL, na ausência da determinação de PSA total não são relevantes. O aumento da confiabilidade do diagnóstico será obtido somente quando o percentual que determina a concentração de PSAL em relação à concentração de PSA total for obtido (PSAL%). A probabilidade de existir CaP aumenta à medida que o PSAL% diminui. Quando os valores de PSA total excedem 10 ng/ml, o cálculo do PSAL% não contribui para diferenciar casos de CaP e doenças benignas, mas no intervalo de 2,5 a 10 ng/ml de PSA total, o cálculo do PSAL% é usado para aumentar a especificidade do diagnóstico. Observações 1. O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa potencial de erros analíticos. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes, usar nas medições e para uso no enxágue final da vidraria, a água deve ter resistividade 1 megaohm.cm ou condutividade 1 microsiemens/cm e concentração de silicatos <0,1 mg/l. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. Referências 1. Pettersson, K., Piironen, T., Seppala, M., Liukkonen, L., Christensson, A., Matikainen, M.T., Suonpaa, M., Lovgren, T. and Lilja, H. (1995) Free and complexed prostate-specific antigen (PSA): in vitro stability, epitope map and development of immunofluorometric assays for specific and sensitive detection of free PSA and PSA-1- antichymotrypsin complex. Clin. Chem. 41, Ajani Kumari G, Malati T. (2004) Stability of total and free prostate specific antigen in serum samples at different storage conditions. Ind. J. Clin. Bioch. 19, (2) Catalona WJ, Loeb S (2010) Prostate cancer screening and determining the appropriate prostate-specific antigen cutoff values. J Natl Compr Canc Netw. 8(2): ). 4. Arquivos Labtest. 7. Okegawa T. (2000) Comparisons of the various combinations of free, complexed and total prostate-specific antigen for the detection of prostate cancer. Eur Urol, 38: Apresentação Produto PSA Total Informações ao consumidor [Termos e Condições de Garantia] A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto dentro das especificações até a data de expiração indicada nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções sejam seguidos corretamente. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Serviço de Apoio ao Cliente (Ligação Gratuita) sac@labtest.com.br Edição: Julho, 2012 Ref.: Referência CAL LOW CAL S A M P B I O T H I G H Conteúdo 5 0 x I T CAL LOW CAL S A M P B I O T 5 0 x H I G H I T 1 X 10 ml 1 X 7,5 ml 1 X 0,1 ml 1 X 5 ml 2 X 25 un 1 X 20 ml 1 X 15 ml 1 X 0,2 ml 1 X 10 ml 4 X 25 un Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reprodução sob prévia autorização 5. Ricós V. (1999) Current databases on biological variation: pros, cons and progress. Scand J Clin Lab Invest; 59: Stephan C. (2000) Molecular forms of prostate-specific antigen and human Kallikrein 2 as promising tools for early diagnosis of prostate cancer. Cancer Epidemiol biomarkers Prev, 9: Português - Ref.: 901

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