André Martins. Botucatu São Paulo

Transcrição

1 André Martins Caracterização do cassete cromossômico mec (SCCmec) e análise fenotípica e molecular de resistência a oxacilina em Estafilococos coagulase-negativa e Staphylococcus aureus. Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais, da Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, para obtenção do título de Doutor. Orientadora: Dr a. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha Botucatu São Paulo 2012

2 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Martins, André. Caracterização do cassete cromossômico mec (SCCmec) e análise fenotípica e molecular de resistência a oxacilina em estafilococos coagulasenegativa e Staphylococcus aureus / André Martins. Botucatu : [s.n.], 2012 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha Capes: Estafilococos aureos. 2. Antibióticos. Palavras-chave: Cassete cromossômico mec; meca; Oxacilina; Staphylococcus sp.

3 Ao meu pequeno Miguel, dono do sorriso mais lindo deste mundo, peço desculpa por todos os momentos ausentes, e lhe dedico esta tese como exemplo de esforço e dedicação; À minha esposa Alzira Fabiana, meu porto seguro, por todo o apoio, paciência e dedicação durante todos estes anos; Aos meus pais, Ivanir e José Osvaldo, pelo apoio e exemplo que me trouxeram até aqui. Dedicatória

4 Agradecimentos A Deus, causa de inspiração, sustentação e força durante todos estes anos; Á minha orientadora, Prof.ª Drª Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha, pelos ensinamentos, orientação, e principalmente pela confiança depositada no meu trabalho; À minha irmã, Ana Paula Martins, pelo apoio e força; às minhas tias Esterina Aparecida Martins e Edione Maria Martins pela ajuda na elaboração e correção do abstract e a Dona Loreni Terezinha de Christo pela ajuda e dedicação nestes últimos anos; Aos alunos de Pós Graduação Adilson de Oliveira, Carlos Henrique Camargo, Danilo Flávio Moraes Ribolli, Mariana Fávero Bonesso, Valéria Catanelli Pereira e ao Dr. Marcus Vinicius Pimenta Rodrigues, agradeço a ajuda na execução dos experimentos e a companhia durante todos estes anos; A todos os colegas do laboratório de bacteriologia, pelo bom companheirismo; À secretária do programa de pós-graduação em Doenças Tropicais, Solange Sako Cagliari, pela ajuda nos momentos difíceis e bom atendimento; A todos os funcionários da seção de pós-graduação da Faculdade de Medicina de Botucatu pela presteza no atendimento e ajuda quando necessário; A todos os funcionários do departamento de Microbiologia e Imunologia, pela presteza no atendimento; Ao Prof. Dr.Rogério Antônio de Oliveira pela paciência e dedicação na execução das análises estatísticas desta tese; Aos amigos Adriano Lima e Silva e Ulisses Benedito Colombo, pela ajuda, força e hospedagem e bons momentos vividos durante todos estes anos; e à amiga Martha Maria Passador pelo apoio e amizade; Aos amigos e funcionários do Instituto Adolfo Lutz de Santo André, Antonio Pereira da Silva Filho e Luis Fernando Armidoro Rafael, pela torcida, apoio e bons momentos de convivência; Aos amigos e funcionários do Instituto Adolfo Lutz de Marília, Laudelina Oliveira de Brito, Patricia de Fátima Florêncio Henschel, Roberto Costa Santos, Salete França Pôrto e Sérgio Schnoor Fogaça pela torcida e apoio; A todos os professores que contribuíram na minha formação; A todos que de uma forma ou de outra, estiveram comigo nestes últimos anos e que colaboraram para a conclusão deste trabalho.

5 "The greatest possibility of evil in selfmedication is the use of too small doses so that instead of clearing up the infection, the microbes are educated to resist penicillin and a host of penicillin-fast organisms is bred out." Sir Alexander Fleming

6 Sumário Lista de Figuras... Lista de Tabelas... Resumo... Abstract... i ii iii iv Capítulo 1: Caracterização do cassete cromossômico mec (SCCmec) e análise fenotípica e molecular de resistência a oxacilina em Estafilococos coagulasenegativa Resumo Abstract Introdução Objetivos Material e Métodos Amostras Identificação de Estafilococos Coagulase- Negativa Determinação de amostras de ECN resistentes à meticilina-oxacilina (MRCoNS) Técnica de difusão da droga em ágar com disco de oxacilina e cefoxitina Teste de triagem em Ágar Mueller Hinton com 4 µg/ml de oxacilina e 4% de NaCl Detecção do gene meca de resistência à meticilina em ECN Extração do Ácido Nucléico Amplificação do ácido nucléico (PCR)... 24

7 Visualização dos produtos amplificados Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) às drogas pelo método de E-test Determinação da produção de -lactamase Hiperprodução de -lactamase Procedência de amostras MRCoNS entre as enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP Determinação da sensibilidade intermediária de ECN à vancomicina Teste de triagem em Ágar BHI com 4 e 6 µg/ml de vancomicina Técnica de E-test macrométodo modificado Determinação do tipo de SCCmec (staphylococcal cassette chromosome mec) Determinação do Perfil Clonal das amostras de ECN Análise Estatística Resultados Amostras Identificação de Estafilococos Coagulase-Negativa Determinação de amostras de ECN resistentes à meticilina-oxacilina Técnica de difusão da droga em ágar com disco de oxacilina e cefoxitina Teste de triagem em Ágar Mueller Hinton com 4 µg/ml de oxacilina e 4% de NaCl Detecção do gene meca de resistência à meticilina em ECN Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) às drogas pelo método de E-test... 38

8 4.6. Determinação da produção de -lactamase Hiperprodução de -lactamase Distribuição de amostras MRCoNS entre as enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP Evolução da resistência à oxacilina no HC da FMB, UNESP no período de 2002 a Determinação da sensibilidade intermediária de ECN à vancomicina Tipagem de SCCmec para Estafilococos Coagulase Negativa Determinação do perfil clonal das amostras de Estafilococos Coagulase Negativa Análise Estatística Discussão Conclusões Referências Bibliográficas Capítulo 2: Caracterização molecular de Staphylococcus aureus resistentes à oxacilina isolados em um hospital universitário brasileiro Resumo Introdução Material e Métodos Amostras Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) às drogas pelo método de E-test Determinação do tipo de SCCmec para S.aureus Determinação do perfil clonal das amostras de S.aureus... 99

9 Resultados Determinação do tipo de SCCmec para S. aureus Determinação do perfil clonal das amostras de S.aureus Discussão Referências Molecular characterization of oxacillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from a Brazilian university hospital. 115 Abstract. 115 Introduction Matherial and Methods 118 Samples. 118 Determination of Minimal Inhibitory Concentration (MIC) to drugs by the E- test. Determination of the SCCmec type for S. aureus Determination of the Clonal Profile of S.aureus samples. Results.. Determination of the SCCmec type for S. aureus Determination of the Clonal Profile of S.aureus samples Discussion References 126 Comprovante de submissão do artigo Molecular characterization of oxacillinresistant Staphylococcus aureus isolated from a Brazilian university hospital à revista Chemotherapy Parecer de aprovação do comitê de ética em pesquisa

10 Lista de Figuras i Capítulo I Figura 1. Distribuição das espécies de ECN isoladas de hemoculturas Figura 2. Amostra de ECN com heterorresistência à oxacilina Figura 3. Resistência à oxacilina pelo teste de triagem com ágar Mueller Hinton acrescido de 4µg/mL de oxacilina e 4% de NaCl Figura 4. Presença do gene meca em amostras de Estafilococos Coagulase Negativas provenientes do HCFMB-UNESP Figura 5. Distribuição de Estafilococos coagulase-negativa de acordo com a espécie e resistência à oxacilina pela detecção do gene meca Figura 6. Resistência a antimicrobianos em amostras MRCoNS e MSCoNS Figura 7. Relação entre tipo de cassete cromosômico mec e CIM à vancomicina em amostras de Estafilococos Coagulase Negativas Figura 8. Produção de -lactamase por espécie de Estafilococos coagulase negativa Figura 9. Evolução da resistência à oxacilina em Estafilococos Coagulase Negativa (ECN) provenientes do HCFMB-UNESP no período de 2002 a Figura 10. Crescimento de amostra de S.epidernidis em ágar BHI acrescido de 6µg/mL de vancomicina Figura 11. Distribuição dos tipos de SCCmec em amostras de Estafilococos coagulase negativas Figura 12. Distribuição dos tipos de cassete SCCmec em amostras de Estafilococos Coagulase Negativas nos anos de 2002 a 2009 no HCFMB-UNESP. 55

11 Figura 13. Dendograma de amostras de S. epidermidis SCCmec tipo I analisadas i pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%) Figura 14. Dendograma de amostras de S. epidermidis SCCmec tipo III analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%) Figura 15. Dendograma de amostras de S. epidermidis SCCmec tipo IV analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%) Figura 16. Distribuição das amostras de S.epidermidis SCCmec I por clones identificados pela técnica de PFGE Figura 17. Distribuição das amostras de S.epidermidis SCCmec III por clones identificados pela técnica de PFGE Figura 18. Distribuição dos clones de amostras de S.epidermidis SCCmec I por complexo de enfermaria Figura 19. Distribuição dos clones de amostras de S.epidermidis SCCmec III por complexo de enfermaria Figura 20. Dendograma de amostras de S. haemolyticus SCCmec tipo I analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%)... 62

12 Capítulo II i Figura 1. Distribuição dos tipos de cassete SCCmec em amostras de S.aureus nos anos de 2002 a 2006 no HCFMB-UNESP Figura 2. Evolução da CIM 50% e 90% à vancomicina nos anos de 2002 a 2006 em amostras MRSA SCCmec III. A. Evolução da CIM 50% à vancomicina. B. Evolução da CIM 90% à vancomicina Figura 3. Dendograma de amostras de S. aureus SCCmec tipo III analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%) Figure 1. Distribution of SCCmec cassette types in de S.aureus samples from 2002 to 2006 at HCFMB-UNESP Figure 2. Evolution of 50% and 90% MIC to vancomycin in MRSA SCCmec III samples from 2002 to A. Evolution of 50% MIC to vancomycin. B. Evolution of 90% MIC to vancomycin. 133 Figure 3. Dendogram of type-iii SCCmec S. aureus samples analyzed by the PFGE method generated by Dice/UPGMA analysis (Bionumerics, Applied Maths) of PFGE profiles - SmaI (similarity 80%). 134

13 Lista de Tabelas ii Capítulo I Tabela 1. Taxas de sensibilidade e especificidade de métodos fenotípicos empregados na detecção da resistência à oxacilina em ECN Tabela 2: Oligonucleotídeos para a detecção do gene meca Tabela 3. Distribuição por especialidades das enfermarias do HCFMB-UNESP incluídas neste estudo Tabela 4. Oligonucleotídeos para a detecção do Cassete Cromossômico estafilocócico mec (SCCmec) em estafilococos coagulase negativa Tabela 5. Resistência à oxacilina avaliada pelo método de difusão com disco de oxacilina e cefoxitina Tabela 6. Determinação da sensibilidade à oxacilina em amostras de Estafilococos Coagulase Negativa por métodos fenotípicos e genotípicos Tabela 7. Resistência a drogas em amostras MRCoNS e MSCoNS detectadas pela técnica de E-test Tabela 8. Determinação da sensibilidade às drogas pelo método de E-test em amostras de ECN de acordo com a espécie Tabela 9. Concentração Inibitória Mínima 50% e 90% das diferentes drogas estudadas Tabela 10. Concentração Inibitória Mínima por espécie de ECN Tabela 11. Concentração Inibitória Mínima em amostras MRCoNS e MSCoNS 42 Tabela 12. Concentração Inibitória Mímina das diferentes drogas estudadas Tabela 13. Número de resistências em amostras MSCoNS e MRCoNS... 43

14 Tabela 14. Número de resistências em amostras MRCoNS e MSCoNS separadas ii por espécie de ECN Tabela 15. Evolução das CIM 50% e 90% à vancomicina em amostras MRCoNS e MSCoNS nos anos do estudo Tabela 16. Amostras positivas em testes fenotípicos para a detecção de resistência à oxacilina e negativas para a pesquisa de gene meca Tabela 17. Resistência à oxacilina em amostras de Estafilococos Coagulase Negativa isoladas de pacientes provenientes de diferentes enfermarias do HC da FMB Tabela 18. Evolução de resistência à oxacilina em amostras de Estafilococos Coagulase-Negativa isoladas de pacientes do HC-FMB UNESP no período de 2002 a Tabela 19. Amostras de Estafilococos Coagulase Negativas com CIM > 2µg/mL para a droga vancomicina ou crescimento em Agar BHI acreescido de 4µg/mL ou 6 µg/ml de vancomicina Tabela 20. Distribuição dos tipos de SCCmec em Estafilococos Coagulase- Negativa entre as enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP Tabela 21. Distribuição dos tipos de SCCmec por espécie de Estafilococos Coagulase Negativa Tabela 22. Associação entre tipo de cassete cromossômico mec e resistência aos antimicrobianos estudados Tabela 23. Relação entre Multirresistência e cassete cromossômico mec... 56

15 Tabela 24. Comparação da presença do gene meca com os métodos de difusão ii em ágar com disco de oxacilina, disco de cefoxitina, método de triagem (Ágar Mueller Hinton + 4 µg/ml de oxacilina + 4% NaCl) e E-test Capítulo II Tabela 1. Distribuição por especialidades das enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP incluídas neste estudo. 110 Tabela 2. Distribuição dos tipos de SCCmec em S. aureus entre os complexos de enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP Tabela 3. Associação entre tipo de cassete cromossômico mec e resistência aos antimicrobianos estudados Tabela 4. Relação entre multirresistência e tipo de cassete SCCmec Tabela 5. Distribuição dos clones de amostras de MRSA com SCCmec III por complexos de enfermarias Table 1. Distribuition by specialities wards of the Botucatu School of Medicine University Hospital (HCFMB) - UNESP included in this study. 130 Table 2. Distribution of SCCmec types in S.aureus in the ward complexes of the Botucatu School of Medicine University Hospital - UNESP Table 3. Association of SCCmec type with resistance to the studied antimicrobials 131 Table 4. Relation of multiresistance to SCCmec cassette type. 131 Table 5. Distribution of clones of MRSA samples with SCCmec III by Ward complexes

16 iii Resumo A oxacilina é uma das alternativas de escolha no tratamento das infecções causadas por Staphylococcus spp., contudo, a resistência a esta droga têm se tornado um grande problema nas últimas décadas. O objetivo deste estudo foi caracterizar a sensibilidade à oxacilina em amostras de ECN isoladas de pacientes do Hospital das Clínicas (HC) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) por diferentes métodos, determinar a concentração inibitória mínima a antimicrobianos, a triagem de amostras com sensibilidade intermediária à vancomicina e a caracterização do perfil clonal de amostras de MRSA e MRCoNS isoladas de hemoculturas. Um total de 160 amostras foram analisadas quanto a resistência à oxacilina por meio da técnica de difusão da droga em ágar com disco de oxacilina e cefoxitina, teste de triagem em Ágar Mueller- Hinton com 4 µg/ml de oxacilina e 4% de NaCl, E-test, detecção do gene meca, e determinação da sensibilidade intermediária a vancomicina em ágar BHI com 4 µg/ml e com 6 µg/ml de vancomicina, além da caracterização do perfil epidemiológico pela tipagem do cassete cromossômico mec (SCCmec) e análise clonal por PFGE de um total de 46 amostras MRSA isoladas no período de 2002 a 2006, 59 amostras de S. epidermidis e 07 amostras de S. haemolyticus isoladas no período de 2002 a Um total de 74,4% das amostras foram positivas para o gene meca. A sensibilidade do método de difusão com disco de oxacilina e da técnica de E-test foi de 99,1% e com especificidade de 90,1%. O disco de cefoxitina apresentou 100% de sensibilidade e a mesma especificidade descrita para o disco de oxacilina. O método de triagem apresentou 94,2% de sensibilidade e a melhor taxa de especificidade com 93,2%. Houve diferença entre as amostras MRCoNS e MSCoNS quando analisada a Concentração Inibitória Mínima (CIM), com maiores níveis de CIM no grupo

17 iii MRCoNS, além de maiores taxas de multirresistência. Nenhuma das amostras apresentou resistência ou heterorresistência à vancomicina, contudo, dez amostras cresceram no ágar BHI com 4 µg/ml de vancomicina e 01 amostra cresceu no ágar BHI com 6 µg/ml de vancomicina. Houve uma prevalência do cassete SCCmec III em amostras MRSA, com 78,3%. No grupo dos ECN, 32,8% das amostras foram tipadas como SCCmec I e 50% como SCCmec III. Houve baixa prevalência do SCCmec IV nos dois grupos estudados (10,9 e 6%). Observou-se um perfil clonal nas amostras MRSA SCCmec III tipadas pela técnica de PFGE, com quatro clones identificados, sendo um deles relacionados ao clone epidêmico brasileiro (BEC). As amostras de S. epidermidis SCCmec III tipadas apresentaram seis clones que se disseminaram em várias enfermarias e foram persistentes de 2002 a As altas taxas de resistência à oxacilina encontradas neste trabalho, bem como a disseminação de clones entre as várias enfermarias ressaltam a importância de boas práticas de controle de infecção hospitalar, bem como o uso racional da antibioticoterapia para prevenir a disseminação desses clones.

18 iv Abstract Oxacillin is one of the alternatives of choice in the treatment of infections caused by Staphylococcus spp. However, the resistance to this drug has become a major problem in recent decades. The aim of this study was to characterize the sensitivity to oxacillin in CNS samples isolated from patients in the School of Medicine University Hospital (HCFMB) - UNESP by different methods, to determine antimicrobial minimum inhibitory concentration, the screening of samples with intermediate sensitivity to vancomycin, and characterization of the clonal profile of MRSA and MRCoNS samples isolated from blood cultures. A total of 160 samples were analyzed for resistance to oxacillin, by the drug diffusion technique in agar with oxacillin and cefoxitin, a screening test on Mueller-Hinton agar with 4 µg/ml of oxacillin and 4% NaCl, E-test, meca gene detection, and determination of intermediate susceptibility to vancomycin in BHI agar with 4 µg/ml and 6 µg/ml of vancomycin, and characterizing the epidemiological profile by typing the cassette chromosome mec (SCCmec), and clonal analysis by PFGE a total of 46 MRSA samples isolated in the period from 2002 to 2006, 59 samples of S. epidermidis and 07 samples of S. haemolyticus isolated in the period from 2002 to A total of 74.4% of the samples were positive for meca. The sensitivity of the oxacillin disk diffusion and E-test technique was 99.1% and specificity 90.1%. The cefoxitin disk showed 100% of sensitivity and specificity reported for the same oxacillin disc. The screening method showed 94.2% of sensitivity and specificity with the best rate of 93.2%. There were differences between samples when analyzed MSCoNS MRCoNS and the minimum inhibitory concentration (MIC), with higher levels of MIC in the group MRCoNS, and higher rates of multidrug resistance. None of the samples showed resistance or heteroresistant to vancomycin, however, 10 samples

19 iv grew on BHI agar with 4 mg/ml of vancomycin and 01 sample grew on BHI agar with 6 mg/ml of vancomycin. There was a prevalence of cassette SCCmec III MRSA samples, with 78.3%. In the group of the CNS, 32.8% of samples were typed as SCCmec I and 50% SCCmec III. There was low prevalence of SCCmec IV in both groups (10.9 and 6%). There was a clonal profile in SCCmec III MRSA samples typed by PFGE technique, with four clones identified, one was related to the Brazilian epidemic clone (BEC). Samples of S. epidermidis SCCmec III had typed in six clones that have spread in various wards and were persistent from 2002 to The high rates of oxacillin resistance found in this work, as well as the spread of clones of the various wards highlight the importance of good hospital infection control, and the rational use of antibiotics to prevent the spread of these clones.

20 Capítulo I

21 1 Capítulo 1. Caracterização do cassete cromossômico mec (SCCmec) e análise fenotípica e molecular de resistência a oxacilina em Estafilococos coagulase-negativa Resumo Os estafilococos coagulase negativa são patógenos associados a infecções nosocomiais, principalmente bacteremia e sepse. A oxacilina é uma das alternativas de escolha no tratamento das infecções causadas por Staphylococcus spp., contudo, a resistência a esta droga têm se tornado um grande problema nas últimas décadas. O objetivo deste estudo foi caracterizar a sensibilidade à oxacilina em amostras de ECN isoladas de pacientes do Hospital das Clínicas (HC) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) por diferentes métodos, determinar a concentração inibitória mínima a antimicrobianos, a triagem de amostras com sensibilidade intermediária à vancomicina e a caracterização do perfil clonal de amostras de MRCoNS isoladas de hemoculturas. Um total de 160 amostras foram analisadas quanto a resistência à oxacilina por meio da técnica de difusão da droga em ágar com disco de oxacilina e cefoxitina, teste de triagem em Ágar Mueller-Hinton com 4 µg/ml de oxacilina e 4% de NaCl, E-test, detecção do gene meca, e determinação da sensibilidade intermediária a vancomicina em ágar BHI com 4 µg/ml e com 6 µg/ml de vancomicina, além da caracterização do perfil epidemiológico pela tipagem do cassete cromossômico mec (SCCmec) e análise clonal por PFGE de 59 amostras de S. epidermidis e 07 amostras de S. haemolyticus isoladas no período de 2002 a Um total de 74,4% das amostras foram positivas para o gene meca. A sensibilidade do método de difusão com disco de oxacilina e da técnica de E-test foi de 99,1% e com especificidade de 90,1%. O disco de cefoxitina apresentou 100% de sensibilidade e a mesma especificidade descrita para o disco de oxacilina. O método de triagem apresentou 94,2% de sensibilidade e a melhor taxa de especificidade

22 2 com 93,2%. Houve diferença entre as amostras MRCoNS e MSCoNS quando analisada a Concentração Inibitória Mínima (CIM), com maiores níveis de CIM para a oxacilina no grupo MRCoNS, além de maiores taxas de multirresistência. Nenhuma das amostras apresentou resistência ou heterorresistência à vancomicina, contudo, dez amostras cresceram no ágar BHI com 4 µg/ml de vancomicina e 01 amostra cresceu no ágar BHI com 6 µg/ml de vancomicina. Houve uma prevalência do cassete SCCmec III em amostras MRSA, com 78,3%. No grupo dos ECN, 32,8% das amostras foram tipadas como SCCmec I e 50% como SCCmec III. Houve baixa prevalência do SCCmec IV nos dois grupos estudados (10,9 e 6%). As amostras de S. epidermidis SCCmec III tipadas apresentaram seis clones que se disseminaram em várias enfermarias e foram persistentes de 2002 a As altas taxas de resistência à oxacilina encontradas neste trabalho, bem como a disseminação de clones entre as várias enfermarias ressaltam a importância de boas práticas de controle de infecção hospitalar, bem como o uso racional da antibioticoterapia para prevenir a disseminação desses clones.

23 Abstract 3 Oxacillin is one of the alternatives of choice in the treatment of infections caused by Staphylococcus spp. However, resistance to this drug has become a major problem in recent decades. The aim of this study was to characterize the sensitivity to oxacillin in CNS samples isolated from patients at the School of Medicine University Hospital (HCFMB) - UNESP by different methods, to determine antimicrobial minimum inhibitory concentration, the screening of samples with intermediate sensitivity to vancomycin and characterization of the clonal profile of MRCoNS samples isolated from blood cultures. A total of 160 samples were analyzed for resistance to oxacillin by the drug diffusion technique in agar with oxacillin and cefoxitin, a screening test on Mueller-Hinton agar with 4 µg/ml of oxacillin and 4% NaCl, E-test, meca gene detection, and determination of intermediate susceptibility to vancomycin in BHI agar with 4 µg/ml and 6 µg/ml of vancomycin, and characterizing the epidemiological profile by typing the cassette chromosome mec (SCCmec) and clonal analysis by PFGE a total of 59 samples of S. epidermidis and 07 samples of S. haemolyticus isolated in the period 2002 to A total of 74.4% of the samples were positive for meca. The sensitivity of the oxacillin disk diffusion and E-test technique was 99.1% and specificity 90.1%. The cefoxitin disk showed 100% sensitivity and specificity reported for the same oxacillin disc. The screening method showed 94.2% sensitivity and specificity with the best rate of 93.2%. There were differences between samples when analyzed MSCoNS MRCoNS and the minimum inhibitory concentration (MIC), with higher levels of MIC in the group MRCoNS, and higher rates of multidrug resistance. None of the samples showed resistance or heteroresistant to vancomycin, however, 10 samples grown on BHI agar with 4 mg/ml of vancomycin and 01 sample grown in BHI agar

24 4 with 6 mg/ml of vancomycin. In the group of the CNS, 32.8% of samples were typed as SCCmec I and 50% SCCmec III. There was low prevalence of SCCmec IV (6%). Samples of S. epidermidis SCCmec III had typed in six clones that have spread in various wards and were persistent from 2002 to The high rates of oxacillin resistance found in this study as well as the spread of clones of the various wards highlight the importance of good hospital infection control, and the rational use of antibiotics to prevent the spread of these clones.

25 1. Introdução 5 O gênero Staphylococcus é um dos principais patógenos humanos, estando associados a inúmeros processos infecciosos 1. Caracterizam-se morfologicamente como cocos Gram positivos, medindo de 0,5 a 1,5µm de diâmetro e se apresentam em arranjos irregulares com aspecto de cachos de uva. O gênero Staphylococcus encontrase classificado no filo Firmicutes, classe Bacilli, ordem Bacilliares, família Staphylococcaceae. Diferenciam-se dos gêneros Streptococcus e Enterococcus pela produção de catalase, e do gênero Micrococcus e Macrococcus pela taxa de crescimento, produção de ácido a partir da glicose em condições anaeróbicas, resistência a bacitracina e sensibilidade a furazolidona 1. As espécies de Staphylococcus são divididas conforme a capacidade de produção da enzima coagulase, sendo as espécies de Staphylococcus spp. não produtoras dessa enzima, conhecidas como Estafilococos coagulase-negativa (ECN). As principais espécies de ECN associadas a doenças em humanos são S.epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, S.warneri, S. hominis, S. simulans, S. lugdunensis, S. schleiferi, S. capitis, S. auricularis, S. pasteuri, S. caprae, S. cohnii, S. xylosus e S. saccharolyticus 1. Por muito tempo considerou-se os ECN como saprófitas, contudo, atualmente esses micro-organismos são considerados oportunistas 2. Embora já existissem relatos na literatura associando os ECN a processos patogênicos, somente a partir da segunda metade do século XX, vários autores descreveram a importância dos ECN no ambiente hospitalar. Um dos primeiros relatos de literatura associando ECN a processos patogênicos data do ano de 1946, onde Clemens Harry 3 cita um caso de meningite infantil associado a S. albus, espécie de ECN renomeada posteriormente como S.epidermidis. Dez anos mais tarde, Smith et al 4 associaram os ECN a septicemias

26 6 através da análise de dados coletados de pacientes. Alguns anos depois, Wilson & Stuart 5 descreveram positividade de 4,4% para ECN em amostras obtidas de pacientes com ferimentos superficiais. Atualmente, os ECN estão principalmente associados a infecções nosocomiais. Gales et al 6 relataram 14,7% de positividade para ECN em amostras provenientes de hemoculturas de diversos hospitais brasileiros. Em outro estudo multicêntrico, Marra et al 7 relatam os ECN como o segundo grupo bacteriano mais isolado em hemocultura, com taxa de 12,6%. Chen et al 8 descrevem os ECN como o grupo de bactérias gram positivas mais isolado em pacientes com doenças hematológicas, como leucemia aguda mielóide, leucemia aguda linfoblástica, linfoma não Hodgins e mieloma múltiplo, em um hospital universitário de Taiwan. Dentre as espécies de ECN patogênicas, a mais frequentemente encontrada em ambiente hospitalar é S. epidermidis 9. Segundo relatório publicado pelo Centers for Disease Control and Prevention 10 aproximadamente 22% das hemoculturas positivas de pacientes com suspeita de bacteremia nos EUA apresentaram crescimento de amostras de S. epidermidis. Cerca de 13% das infecções associadas a válvula cardíaca são causadas por S.epidermidis 11. Embora esta espécie possa ser um membro da microbiota normal do homem, possui uma série de fatores de virulência que o caracteriza como um patógeno, como a capacidade de formar biofilme, produção de exopolímeros que funcionam como um mecanismo de evasão da resposta imune inata, produção de toxinas e capacidade de invasão do tecido hospedeiro 11. Segundo o critério adotado pelo CDC, consideram-se os ECN como causadores de bacteremias apenas após o isolamento destes micro-organismos de no mínimo 02 hemoculturas em diferentes momentos 12.

27 S. haemolyticus é uma espécie de ECN comumente associada a infecções 7 nosocomiais. Além de estar associado ao ambiente hospitalar, causando bacteremia, este micro-organismo também pode ocasionar infecções de feridas e tecidos moles, infecções do trato urinário e endocardite 11, 13. Kawamura et al 14 em estudo multicêntrico realizado em hospitais japoneses descrevem S. haemolyticus como a terceira espécie de Staphylococcus spp. mais isolada em ambiente hospitalar. Kristóf et al 15 descrevem esta espécie como responsável por 6% de todas as bacteremias identificadas no Hospital da Universidade Semmelweis, Hungria. Os mesmos autores relatam altas taxas de elevada Concentração Inibitória Mínima a vários antimicrobianos, como oxacilina, clindamicina, gentamicina e ciprofloxacina. Outras espécies de ECN têm adquirido importância como agentes patogênicos nos últimos anos. S. hominis é descrito como importante patógeno associado a bacteremias e infecções nosocomiais, principalmente associado a infecções pulmonares 16. Cuevas et al 17 descrevem S. hominis como a segunda espécie de ECN mais prevalente em hospitais espanhóis no período de 1986 a Secchi et al 18 descrevem dados semelhantes em estudo realizado com amostras de hemocultura provenientes de um hospital da região sul do Brasil. Bouchami et al 19 descrevem S. hominis como a terceira espécie mais isolada em ambiente hospitalar dentro do grupo dos ECN. S. capitis é um importante patógeno, geralmente associado a processos infecciosos do trato urinário, bacteremia e infecções de pele 18, e S. saprophyticus também está presente no ambiente hospitalar, frequentemente associado a infecções do trato urinário 18. A meticilina e outras penicilinas semi-sintéticas, tais como a oxacilina e a meticilina resistentes à ação de penicilinases são empregadas no tratamento das infecções por Staphylococcus spp., tendo seu uso iniciado em A resistência à

28 8 oxacilina no grupo dos ECN se tornou um grande problema nos anos 70, quando amostras resistentes começaram a ser isoladas de infecções de válvulas prostéticas cardíacas e líquido cefalorraquidiano 16. Atualmente, as taxas de resistência à oxacilina por ECN são altas, o que se torna um grande problema no tratamento destas infecções, uma vez que a multirresistência é frequente, deixando poucas alternativas para o tratamento. Gales et al 6 descrevem 78,7% de amostras de estafilococos coagulase negativas resistentes à meticilina (MRCoNS) em estudo multicêntrico envolvendo três hospitais da região sul, sudeste e centro-oeste brasileiros e um laboratório clínico da região sul do Brasil. Em outro trabalho, Cuevas et al 17 relatam taxas semelhantes de resistência à ECN. As taxas de resistência à oxacilina aumentaram gradativamente de 32,5% em 1986 para 66,7% em Natoli et al 20 relataram 77% de amostras de ECN resistentes à oxacilina em estudo realizado com amostras de hemocultura provenientes das enfermarias de transplante hematológico e unidade de tratamento intensivo de um hospital italiano. Alguns estudos descrevem níveis maiores de resistência à oxacilina em ECN. Bouchami et al 19 relatam um total de 95,6% de amostras MRCoNS isoladas de hemoculturas de pacientes submetidos a transplante de medula óssea. Embora a grande maioria de amostras MRCoNS isoladas de infecções nosocomiais seja associada a S.epidermidis, outras espécies de ECN podem estar presentes. Palazzo et al 21 descrevem o isolamento de 06 amostras de S. hominis subsp. novobiossepticus provenientes de hemoculturas Destas, 05 apresentaram resistência à oxacilina. Kristóf et al 15 relatam um total de 97% de amostras de S.haemolyticus resistentes à oxacilina isoladas no período de 2001 a 2008 de hemoculturas no Hospital

29 9 Universitário Semmelweis, Hungria. Yu et al 22 descrevem resistência à oxacilina em 91% de amostras de S.haemolyticus isoladas em hospital chinês. Stuart et al 23 descrevem taxas de resistência à oxacilina em várias espécies de ECN, isoladas previamente em serviços de saúde e depositadas na coleção de culturas do Departamento de Microbiologia, London Health Sciences Centre, Canadá. Um total de 26,3% das amostras de S. cohnii subsp. cohnii, 38,7% de S. cohnii subsp. urealyticus, 65,7% de S.epidermidis, 79,8% de S.haemolyticus, 11,3 % de S. hominis subsp. hominis, 85,7 % de S. hominis subsp. novobiossepticus, 1,9 % de S. saprophyticus, 27,9% de S.simulans e 20,6 % S. warneri foram resistentes à oxacilina. A resistência à meticilina está associada com a diminuição da capacidade desta em aderir com a proteína ligadora de penicilina (PBP2a) e a síntese da parede celular não ser interrompida. Existem três mecanismos de resistência às penicilinas semisintéticas, grupo de drogas em que a oxacilina está incluída. O primeiro, está relacionado à hiperprodução de -lactamases, enzimas que clivam o anel -lactâmico da droga, inativando-a 24. O segundo mecanismo, conhecido como MOD-SA ocorre quando PBPs normais possuem afinidade reduzida à oxacilina 25. O terceiro mecanismo e o mais importante é a presença do gene meca. Este codifica a PBP alterada, conhecida como PBP 2a, impedindo a ligação desta com a oxacilina 26. O gene meca está inserido dentro de um elemento genético transponível, conhecido como cassete SCCmec. Este possui diversas variações em sua constituição, sendo divididos em onze tipos. A tipagem do cassete SCCmec é útil como ferramenta epidemiológica 27 uma vez que os diferentes tipos são mais prevalentes em ambiente hospitalar ou comunitário. Já foram descritos pelo menos 11 tipos de SCCmec 28, que diferem entre si em relação ao número de genes que carregam e em sua arquitetura gênica 29, 30. Alguns destes tipos são

30 10 carreadores de genes determinantes de resistência para múltiplos antibacterianos, além dos beta-lactâmicos, os macrolídeos, lincosaminas, estreptograminas, aminoglicosídeos e tetraciclina. Desta forma, quando uma célula bacteriana adquire estes SCCmec de uma única vez adquire um fenótipo de múltipla-resistência 30,31. Os tipos de SCCmec foram definidos através da combinação de duas partes: o complexo ccr e o complexo mec, com três genes ccr filogeneticamente distintos classificados como: ccra, ccrb e ccrc. Além disso, há cinco classes do complexo gene mec (classe A, B, C1, C2 e classe D) 28,32. Os diferentes tipos de SCCmec são classificados como: SCCmec tipo I (complexo gene mec classe B e ccra1b1), SCCmec tipo II (complexo gene mec classe A e ccra2b2), SCCmec tipo III (complexo gene mec classe A e ccra3b3), SCCmec tipo IV (complexo gene mec classe B e ccra2b2), e SCCmec tipo V (complexo gene mec classe C2 e ccrc), SCCmec tipo VI (complexo gene mec classe B e ccra4b4), SCCmec tipo VII (complexo gene mec classe C1 e ccrc) e SCCmec tipo VIII (complexo gene mec classe A e ccra4b4). A região restante do SCCmec é chamada de região J (Joining region), que é constituída por componentes não essenciais do cassete que podem carrear determinantes de resistência antimicrobiana adicionais 28, 33. Os três primeiros tipos foram detalhados por Ito et al 34. Os mesmos autores relatam e novamente descrevem em 2004 o mais recente tipo descoberto, denominado tipo V. Ma et al 35 descrevem o tipo IV, presente principalmente em amostras provenientes da comunidade. Os tipos I, II e III são responsáveis principalmente por infecções nosocomiais, e são significantemente maiores que os últimos tipos, IV e V. O cassete tipo I, foi descrito com o tamanho de bp, sendo o menor dos três. Este cassete não possui inserido nenhum transposon ou plasmídeo que confira resistência a

31 11 outras drogas além da meticilina, ou a metais pesados; e possui também um subtipo, conhecido como IA que difere do tipo I por possuir um plasmídeo integrado, pub O segundo cassete, denominado II, possui bp, contendo além dos genes meca e mecri, que conferem resistência à meticilina, o transposon Tn 554, responsável pela resistência deste tipo de amostra à eritromicina e estreptomicina. Este cassete possui um subtipo, denominado IIa, com tamanho de 40 Kb, um pouco menor que o tipo II 36. O cassete tipo III, o maior dos cinco tipos, possui o tamanho de bp e contém os genes meca, mecri, os transposons Tn 554 e ψtn 554, e o plasmídeo pt 181, sendo que o transposon ψtn 554 induz resistência ao cádmio e o plasmídeo IS431 mer é responsável pela resistência ao mercúrio. Além das informações descritas acima, os autores também citam diferenças nos tipos de genes ccr, descrevendo no tipo III de SCCmec um gene não presente nos outros tipos, denominado de ψccr; e sugerindo também que algumas das características de resistência presentes no tipo III possam ser utilizadas como marcadores seletivos. Este tipo de cassete apresenta dois subtipos, IIIa que não possui o plasmídeo pt181 e flanqueia com elemento IS 431 e IIIb, onde se ausentam cópias do plasmídeo pt181 e Tn O tipo IV de cassete SCCmec é responsável principalmente por infecções provenientes da comunidade. É um pequeno elemento que não carrega outros genes de resistência à exceção de meca; além de se dividir em múltiplos subtipos, o que sugere que o tipo IV de SCCmec é altamente transmissível 36. Os quatro subtipos do cassete tipo IV, IVa, IVb, IVc e IVd diferem por apresentarem sequências diferentes na extremidade esquerda do complexo ccr, conhecida como região L C 36.

32 O tipo V de SCCmec foi identificado por Ito et al 32 em um isolado australiano. 12 Estes mesmos autores descrevem o novo cassete, o qual possui o tamanho de bp sendo um pouco maior que o SCCmecIV, contudo com tamanho inferior aos outros tipos existentes. Assim como o tipo IV, possui apenas genes que codificam resistência à meticilina; contudo diferentemente dos outros elementos desta família, o tipo V possui um novo tipo de gene ccr, caracterizado como o tipo c, que se encontra individualmente, ao contrário dos outros elementos, que possuem um par destes genes. Outro novo elemento encontrado apenas no tipo V é um sistema de restrição e modificação, codificado pelos genes V22 e V23. Estudos recentes associam a presença deste tipo de cassete mec a infecções de origem comunitária 37, 38. Oliveira, Milheiriço e de Lencastre 39 caracterizaram o tipo VI de SCCmec, encontrado em amostras MRSA pertencentes ao clone pediátrico previamente tipados como SCCmec IV. Os autores descrevem diferenças no complexo ccrab, identificado como tipo 4 e a presença do complexo mec do tipo B, que não possui o gene meci. O tipo VII de SCCmec foi identificado por Higuchi et al 40, por meio de uma análise detalhada de amostras de S. aureus comunitárias isoladas em Taiwan. Possui tamanho de bp, com o complexo mec homólogo ao encontrado no tipo V, mas apresentando substituições, inserções e rearranjos, que o diferenciam. As principais características deste tipo de cassete são a presença do complexo ccrc, do transposon IS431 e de uma seqüência única presente do lado direito do cassete, denominada orf35. Zhang et al 27 descreveram um novo tipo de cassete SCCmec, denominado SCCmec VIII, encontrado em amostra MRSA de origem hospitalar. Este novo cassete posssui o tamanho de pares de base, sendo presentes os genes meca, mecr1,

33 13 meci do complexo mec e ccra4, ccrb4 do complexo ccr, além de possuir o transposon Tn554, que também presente no tipo II. Recentemente foram descritos os tipos IX, X e XI, que se caracterizam respectivamente pela presença dos complexos ccr 1(A1B1) 7(A1B6) e 8(A1B3) e complexo mec C2, C1 e E 41. Embora a resistência mediada pelo gene meca esteja presente em todas as células da população com resistência intrínseca, esta pode ser somente expressa por uma pequena percentagem delas, levando ao que se chama de resistência heterogênea. A expressão de resistência nas linhagens com resistência intrínseca tem sido categorizadas em quatro classes de expressão fenotípica, classes 1 a 4, com a classe 1 sendo a mais heterogênea e a 4 mais homogênea 42. A grande maioria das células (99,9 ou 99,99%) na cultura de linhagens com resistência heterôgenea de classe 1 apresenta concentração inibitória mínima (CIM) de 1,5 a 3 µg/ml, mas essa cultura também contém um baixo número de bactérias (10-7 a 10-8 ) que poderiam formar colônias mesmo na presença de 25 µg/ml ou mais de oxacilina. Nas culturas de linhagens de classe 2, a maioria das células (99,9%) apresentam CIM de 6 a 12 µg/ml, e nessas culturas a frequência de células altamente resistentes (capazes de crescer na presença de 25 µg/ml) é maior (10-5 ) do que as linhagens de classe As culturas de linhagens de classe 3 são compostas de bactérias (99 a 99,9%) que apresentam altos níveis de resistência à oxacilina (CIM = 50 a 200 µg/ml), mas geralmente possuem uma subpopulação (10-3 ) de células altamente resistentes, capazes de formar colônias mesmo na presença de 300 a 400 µg de oxacilina/ml. As culturas de classe 4 são compostas de células com resistência

34 14 homogênea, com todas as células apresentando altos níveis de resistência, com CIM de 400 a 1000 µg/ml 26. A resistência à oxacilina pode ser detectada por meio de inúmeros métodos fenotípicos e genotípicos, tais como difusão em discos com oxacilina e cefoxitina, diluição em caldo, E-test, aglutinação em látex e PCR, sendo os métodos genotípicos considerados padrão ouro para a detecção de resistência à oxacilina em estafilococos. Embora os métodos genotípicos possuam alta sensibilidade e especificidade quando comparados aos fenotípicos, não são acessíveis a todos os laboratórios de microbiologia. Os métodos de referência preconizados pelo CLSI para a detecção de resistência à oxacilina em S. aureus e ECN incluem a determinação da CIM pelo método de diluição da droga em ágar ou em caldo, o método de difusão com disco, o teste de triagem com ágar Mueller Hinton (MH) adicionado de 4% de NaCl e 4µg/ml de oxacilina e mais recentemente o teste de difusão com disco de cefoxitina 25, 43. O método de difusão com disco de oxacilina e cefoxitina é uma das técnicas mais empregadas em laboratórios de rotina para a detecção da resistência à meticilina, devido ao baixo custo e facilidade de execução, embora não seja tão sensível e específico quanto a detecção do gene meca. Diversos trabalhos relatam boas taxas de sensibilidade e especificidade para este método. A tabela 1 descreve vários trabalhos que analisaram as taxas de sensibilidade e especificidade dos testes fenotípicos empregados na detecção da resistência aos ECN.

35 15 Tabela 1. Taxas de sensibilidade e especificidade de métodos fenotípicos empregados na detecção da resistência à oxacilina em ECN. Autor Espécie N Teste fenotípico S E Swenson et al 44 ECN 310 Disco oxacilina Disco cefoxitina Jain et al 45 ECN 47 Disco oxacilina Disco cefoxitina 86, ,6 100 Perazzi et al 46 ECN 107 Disco oxacilina Disco cefoxitina John et al 47 S. epidermidis S. haemolyticus Disco cefoxitina 98, Ferreira et al 48 ECN 152 Triagem E-test ,4 Perez et al 49 Triagem Hedstierna- Johnsen et al 50 ECN 110 E-test Disco cefoxitina N:tamanho amostral S: sensibilidade E: especificidade O aumento de amostras resistentes à meticilina deixa poucas alternativas para o tratamento das infecções causadas por estes patógenos. O antimicrobiano mais utilizado no tratamento de infecções por MRCoNS é a vancomicina, contudo existem relatos de amostras apresentando resistência intermediária e resistência a esta, além do aumento de ECN com suscetibilidade diminuida a vancomicina. A detecção fenotípica da resistência a vancomicina é feita pelo método de triagem em ágar BHI acrescido de 6µg/mL de vancomicina 51 e pela técnica de E-test. Palazzo et al 52 descreveram 04 amostras de ECN (1 S. epidermidis, 1 S. haemolyticus e 2 S. capitis) resistentes à vancomicina isoladas de trabalhadores de uma escola particular e de um hospital localizado na região de Ribeirão Preto. A concentração inibitória mínima (CIM) que estas amostras apresentaram quando testadas pela técnica de E-test variou entre 16 µg/ml e 256 µg/ml. Martinez et al 53 relataram

36 16 uma amostra de S. cohnii isolada de uma criança de 05 anos com resistência à vancomicina, sendo que a CIM obtida pela técnica de E-test foi de 64µg/mL. A sensibilidade reduzida à vancomicina é um problema emergente, mais recentemente Olivares et al 54 relataram 73% de amostras de S.epidermidis com baixa suscetibilidade à vancomicina. A heterorresistência à vancomicina também tem sido relatada por D Melo 55, o que ressalta a importância da detecção adequada da resistência a esta droga. Recentemente, novas alternativas surgiram para o tratamento das infecções por Staphylococcus spp. resistentes à oxacilina. Drogas como a linezolida, daptomicina, quinupristina/daptopristina, teicoplanina, tigeciclicina têm sido empregadas com sucesso 16. Contudo, surgem relatos de amostras resistentes a algumas destas drogas. Creminter et al 56 descreveram o isolamento de 13 amostras de S. epidermidis, 02 de S.capitis e 01 de S. haemolyticus com susceptibilidade reduzida à teicoplanina. Uma das amostras de S. epidermidis também apresentou suscetibilidade reduzida à vancomicina. Todas as amostras de S. epidermidis com suscetibilidade reduzida a teicoplanina foram resistentes à meticilina. No Brasil, Nunes et at 57 descreveram três amostras com suscetibilidade reduzida à teicoplanina e positivas para o gene meca. A Linezolida é outra droga que tem sido empregada recentemente na terapia contra infecções por Staphylococcus spp. resistentes à oxacilina, com bons resultados, embora Potoski et al 58 descreveram um surto de amostras de S. epidermidis resistentes a linezolida, com 24 de 25 amostras isoladas com CIM > 256g/mL. Stuart et al 59 descreveram em estudo comparativo entre diversas espécies de ECN, um total de 25% das amostras de S. capitis resistentes à linezolida. Devido às altas taxas de resistência à oxacilina, principal alternativa terapêutica, e o surgimento de resistência a outros antimicrobianos, como a vancomicina, é de

37 17 grande importância compreender a epidemiologia das infecções provocadas por Staphylococcus spp. Nos últimos anos, as ferramentas moleculares têm sido empregadas em estudos epidemiológicos, com bons resultados. As três principais metodologias empregadas são o Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), o Multilocus Sequence Typing (MLST), e a técnica de spa typing, que possibilitam a identificação dos clones bacterianos circulantes em ambientes hospitalares e na comunidade. A PFGE é um método que emprega enzimas de restrição para clivar o DNA extraído. No caso do gênero Staphylococcus, a enzima empregada é a SmaI. Os fragmentos são separados em gel de agarose, com a direção do campo elétrico periodicamente alterado, formando um ângulo de 120º e permitindo que fragmentos de até 12mb sejam separados, ao contrário da eletroforese tradicional, que não é capaz de separar fragmentos maiores que 50kb 60. Geralmente esta técnica é empregada em estudos locais, como surtos hospitalares, o que permite identificar o tipo circulante. A técnica de PFGE foi descrita por Schartz & Cantor no ano de e primeiramente utilizada para fracionar todo o genoma da levedura Saccharomyces cerevisae, microorganismo modelo para estudos genéticos. Vários trabalhos utilizaram a PFGE para a identificação de clones circulantes em ambiente hospitalar e caracterização de surtos locais causados por Staphylococcus spp. resistentes à oxacilina. Vindel et al 62 relataram a presença de 13 diferentes genótipos presentes em 135 amostras provenientes de 145 hospitais espanhóis, o que indica uma possível disseminação entre unidades. Kosowska-Shick et al 63 descreveram três diferentes padrões clonais de S. epidermidis resistentes à linezolida, evidenciando diferentes origens para a resistência à linezolida neste hospital. A epidemiologia de S. hominis foi detalhada com o emprego desta técnica, tendo sido descrito vários padrões clonais, sugerindo que cada clone de S. hominis, é raramente disseminado 19.

38 A PFGE também permite a caracterização de amostras de ECN com 18 significância clínica ou contaminante, baseada na tipagem de mútliplas culturas oriundas de um mesmo paciente 64, além de auxiliar na caracterização de culturas de ECN provenientes de cateteres, uma vez que diferentes amostras de ECN podem estar presentes e serem fenotipicamente indistinguíveis 65. A MLST analisa a sequência de sete genes constitutivos (gmk, pta, dfp, gtr, muts, pyrr, e xpt), e os compara com sequências de cada alelo presente no lócus, previamente numeradas. A combinação dos alelos identificados em cada gene determina o perfil da amostra 66. É a metodologia mais adequada para a detecção de clones pandêmicos, uma vez que os genes investigados são constitutivos, com pouca taxa de mutação quando comparados a análise de todo o cromossomo 67. A técnica conhecida como spa typing investiga polimorfismos em um único lócus, com aplicação em estudos locais e detecção de clones pandêmicos 67. Com o aumento das taxas de resistência à oxacilina por ECN, e o reduzido número de alternativas terapêuticas, este estudo justifica-se frente a necessidade de estudar os níveis de resistência à oxacilina em amostras de ECN, bem como a caracterização epidemiológica destas amostras.

39 2. OBJETIVOS 19 OBJETIVO GERAL O objetivo geral deste trabalho foi determinar a sensibilidade à oxacilina em amostras de ECN isoladas de pacientes do Hospital das Clínicas (HC) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) por diferentes métodos indicados para otimizar o isolamento de MRCoNS, determinar a concentração inibitória mínima a antimicrobianos, a triagem de amostras com sensibilidade intermediária à vancomicina e a caracterização do perfil clonal de amostras MRCoNS isoladas de hemoculturas. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Identificar amostras de ECN isoladas de hemoculturas de pacientes do HC da FMB; Determinar a resistência à oxacilina em amostras de ECN pelo método de difusão da droga em ágar com disco de oxacilina e cefoxitina e pelo método de triagem; Detectar o gene meca nas amostras de ECN estudadas; Determinar a produção de -lactamase em amostras de ECN. Determinar a sensibilidade intermediária à vancomicina em amostras de ECN. Caracterizar o cassete SCCmec e a tipagem molecular por PFGE em MRCoNS isolados de hemoculturas.

40 3. Material e Métodos Amostras Foram estudadas 160 amostras de ECN previamente isoladas e estocadas na Coleção de Culturas do Departamento de Microbiologia e Imunologia. As amostras foram provenientes de hemoculturas de pacientes internados em diversas enfermarias do HC da FMB durante os anos de 2002 a O isolamento das amostras foi realizado conforme as normas descritas por Koneman et al Identificação de Estafilococos Coagulase Negativas Os isolados, obtidos a partir de espécimes clínicos foram semeados em ágar sangue e corados pelo método de Gram, objetivando-se sua pureza e a observação de sua morfologia e coloração especifica. Após a confirmação dessas características, as linhagens foram submetidas às provas de catalase e coagulase. O gênero Staphylococcus foi diferenciado de Micrococcus, com base na prova de oxidação e fermentação da glicose e pela resistência à bacitracina (0,04 U), indicada pela ausência de halo de inibição ou formação de halo de ate 9 mm e pela sensibilidade à furazolidona (100g) caracterizada por halos de inibição de 15 mm de diâmetro 68. Para a identificação dos ECN, foi utilizado o esquema simplificado proposto por Cunha et al 69, o qual estabelece a realização de testes de utilização de açúcares: xilose, sacarose, trealose, manitol, maltose, e frutose, caracterização de hemolisinas, urease, ornitina decarboxilase e resistência a novobiocina. Após a identificação pelo método simplificado, as amostras que não foram identificadas com S. epidermidis foram submetidas à identificação genotípica usando primers de sequências conservadas

41 21 adjacentes aos genes 16S e 23S. Este método descrito por Barry et al 70 e Couto et al 71 é conhecido como ITS-PCR (Internal Transcribed Spacer-PCR). A técnica foi realizada conforme descrito por Couto et al 71 usando os primers G1 (5'-GAAGTCGTAACAAGG) e L1 (5'-CAAGGCATCCACCGT). A amplificação foi constituída de uma etapa de desnaturação a 94 o C por quatro minutos e 25 ciclos de amplificação, sendo cada um desses com um minuto a 94 o C, dois minutos de rampa a 55 o C, sete minutos a 55 o C, dois minutos de rampa a 72 o C, dois minutos a 72 o C, seguidos por uma etapa de extensão adicional de sete minutos a 72 o C (Couto et al., 2001). Para controle dos resultados, foram utilizadas as seguintes linhagens de referência internacional: S. auricularis (ATCC 33753), S. capitis subsp. capitis (ATCC 27843), S. capitis subsp. urealyticus (ATCC 49325), S. caprae (ATCC 35538), S. cohnii (ATCC 49330), S. cohnii subsp. cohnii (ATCC 29974), S. epidermidis (ATCC 12228), S. epidermidis (ATCC 35983), S. haemolyticus (ATCC 29970), S. hominis (ATCC 27844), S. hominis subsp. novobiosepticus (ATCC ), S. lentus (ATCC ), S. lugdunensis (ATCC ), S. saprophyticus (ATCC 15305), S. schleiferi subsp. schleiferi (ATCC 43808), S. sciuri subsp. sciuri (ATCC 29062), S. simulans (ATCC 27851), S. xylosus (ATCC 29979), S. warneri (ATCC 10209) e S. aureus (ATCC 29062). Posteriormente à confirmação das espécies, as linhagens foram conservadas em caldo nutriente com glicerol a 20ºC e a 70ºC.

42 Determinação de amostras de ECN resistentes a meticilina-oxacilina (MRCoNS) Técnica de difusão da droga em ágar com disco de oxacilina e cefoxitina O teste de sensibilidade à oxacilina foi realizado pela técnica da difusão da droga em ágar a partir de discos impregnados conforme critérios recomendados pelo Clinical Laboratory Standards Institute - CLSI 43. Para o preparo dos inóculos foram utilizadas culturas em caldo BHI, previamente incubadas por 24 horas e posteriormente ajustadas com a turbidez da escala 0,5 de MacFarland. Os discos utilizados foram: Oxacilina (1 µg) e Cefoxitina (30 µg). Uma vez ajustada a densidade do inóculo, a semeadura foi feita por meio de swab estéril na superfície de ágar Mueller Hinton, e a seguir aplicados os discos impregnados com as drogas. As placas foram incubadas a temperatura de 35ºC por 24 horas sendo a atividade do antimicrobiano avaliada pelo diâmetro do halo de inibição e interpretação com base nas normas estabelecidas pelo CLSI 43. A linhagem padrão de S. aureus ATCC (sensível à oxacilina, gene meca negativo) e ATCC (resistente à oxacilina, gene meca positivo) foram utilizadas como controle em todos os experimentos Teste de triagem em Ágar Mueller Hinton com 4 µg/ml de oxacilina e 4% de NaCl Para verificação de resistência de ECN à oxacilina foi utilizado o meio de triagem preparado com ágar Mueller-Hinton adicionado de 4 µg/ml de oxacilina e 4% de NaCl 43. Para o preparo dos inóculos foram utilizadas culturas em caldo BHI

43 23 previamente incubadas por 24 horas e posteriormente ajustadas com a turbidez da escala 0,5 de MacFarland. Após o preparo do inóculo as linhagens foram semeadas na forma de spots sobre a superfície do ágar com o auxílio de swab estéril. As placas foram incubadas por 24h a uma temperatura de 35 C e a detecção de ECN resistentes à meticilina (MRCoNS) verificada por meio do crescimento de uma única colônia na superfície do ágar Detecção do gene meca de resistência à meticilina em ECN Extração do Ácido Nucléico O ácido nucléico total foi extraído a partir de linhagens de ECN cultivadas em ágar sangue e inoculadas individualmente em caldo Infusão de Cérebro e Coração (BHI) e incubadas a 37ºC por 24 h. A extração foi realizada com o Kit Illustra Blood Genomic Prep. Mini Spin Kit (GE Healthcare) que consiste na digestão inicial das células de estafilococos com lisozima (10 mg/ml) e proteinase K (20 mg/ml). A seguir 500 µl da solução de extração foram adicionadas à mistura e esta foi centrifugada a x g por 1 min. Em seguida o sobrenadante foi transferido para a coluna com filtro e centrifugado a x g por 1 min. O líquido coletado foi descartado e 500 µl de solução de extração foram adicionados novamente à coluna. Após a centrifugação e descarte do líquido coletado, 500 µl da solução de lavagem foi adicionada à coluna e esta submetida à centrifugação a x rpm por 3 min. A seguir, a coluna foi transferida para um tubo de 1,5 ml e 200 µl de água Milli Q aquecida a 70ºC foi utilizada para a eluição. As amostras foram centrifugadas a 5000 x g por 1 minuto, e a coluna de GFX desprezada. O DNA extraído foi guardado sob refrigeração à 4 C.

44 Amplificação do ácido nucléico (PCR) 24 As reações de PCR foram realizadas em tubos de microcentrífuga de 0,5 ml em volumes totais de 25 µl contendo 10 pmol de cada primer (Tabela 1), 2,0 U de Taq DNA polimerase, 100 µm de desoxiribonucleotídeos trifosfatados, 10 mm de Tris-HCl (ph 8,4), 0,75 mm de MgCl 2 e 3µL de ácido nucléico. A incubação foi realizada em termociclador apropriado, empregando os parâmetros descritos por Murakami et al 72 que consistiram de: 40 ciclos de desnaturação a 94ºC por trinta segundos, anelamento dos primers a 55,5ºC por trinta segundos e extensão a 72ºC por um minuto. Após completar os 40 ciclos, os tubos foram incubados a 72ºC por cinco minutos antes de resfriar a 4ºC. Em todas as reações realizadas foram utilizadas linhagens de referência internacional com controle positivo (S. aureus ATCC 33591) e negativo (S. aureus ATCC 25923) Visualização dos produtos amplificados A eficiência das amplificações foi monitorada pela eletroforese da reação em gel de agarose 2% preparado em tampão 1,0 X TBE e corado com Sybr Safe (Invitrogen). O tamanho dos produtos amplificados foi comparado com o marcador de peso molecular de 100 bp e posteriormente fotografados sob transiluminação UV. Tabela 2: Oligonucleotídeos para a detecção do gene meca. Função Nome Sequência de nucleotídeos 5 a 3 Produto amplificado Primer meca1 AAA ATC GAT GGT AAA GGT TGG 533 bp Primer meca2 AGT TCT GCA GTA CCG GAT TTG Fonte: Murakami et al 72

45 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) às drogas pelo método de E-test A sensibilidade in vitro das amostras de ECN foi testada para as seguintes drogas: oxacilina, netilmicina, eritromicina, sulfametaxazol-trimetropim e vancomicina. Para tanto, foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) dessas drogas, por meio da técnica de E-test. Este procedimento é um método quantitativo, que utiliza tira de plástico inerte, transparente, medindo 60 mm de comprimento por 5,5 mm de largura, na qual é incorporado um gradiente de concentração estabilizado do antimicrobiano a ser pesquisado. A concentração das diversas drogas no E-test varia de 0,016 a 256g/mL para a oxacilina, eritromicina, netilmicina e vancomicina; e 0,002 a 32g /ml para o trimetoprim-sulfametoxazol com proporção de 1/19, respectivamente. Os parâmetros técnicos envolvidos na realização do E-test foram: meio de cultura de Mueller-Hinton, inóculo com concentração final semelhante à turvação correspondente a escala 0,5 de McFarland; incubação das placas em aerobiose a 35ºC; leitura pela verificação na escala da parte anterior da fita do valor correspondente à intersecção da zona de elipse de inibição do crescimento bacteriano. As drogas foram consideradas sensíveis e resistentes de acordo com os breakpoints (µg/ml) indicados pelo CLSI (2011) (Netilmicina 8 sensível, 32 resistente; Vancomicina 4 sensível, 16 resistente; Oxacilina 0,25 sensível, 0,5 resistente; Eritromicina 0,5 sensível, 8 resistente; Trimetoprim-Sulfametoxazol 2/38 sensível, 4/76 resistente). Na descrição dos resultados as amostras que apresentaram níveis intermediários foram consideradas resistentes. Os resultados do estudo das CIMs das diversas drogas foram expressos por meio de: CIM 50% (Concentração de droga necessária para inibição de 50% da população bacteriana testada); CIM 90% (Concentração necessária para

46 26 inibição de 90% da população bacteriana); faixa de variação das CIMs e proporção de amostras sensíveis a cada droga, de acordo com definição do CLSI Determinação da produção de -lactamase A produção de -lactamase em amostras de ECN foi detectada por meio do uso de discos impregnados com Nitrocefina (Cefalosporina cromogênica-cefinase BBL). O disco foi umedecido com uma a duas gotas de água destilada estéril e depositado sobre as colônias de S. aureus previamente incubadas a 35 o C/24h na placa de ágar Mueller- Hinton com fita de E-test de oxacilina. A reação positiva foi evidenciada pelo desenvolvimento de uma coloração vermelha e a negativa pela não alteração de cor. Para as linhagens -lactamases negativas, a reação foi reexaminada após uma hora, conforme recomendações do fabricante. Para a correta análise dos resultados, os discos em testes foram sempre comparados com o disco não usado. Foram utilizadas linhagens de referência internacional com controle positivo (S. aureus ATCC e S. aureus ATCC 25923) e controle negativo (S. xylosus ATCC 29979) Hiperprodução de -lactamase Para verificar a hiperprodução de -lactamase as amostras de ECN foram testadas com um disco de amoxicilina (20g) e ácido clavulânico (10g). O breakpoint para sensibilidade foi a formação de um halo de inibição de 20 mm após 24h de incubação a 35ºC 43.

47 Procedência de amostras MRCoNS entre as enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP Neste estudo, as amostras das enfermarias do HCFMB-UNESP foram agrupadas em complexos de acordo com as especialidades. As 31 enfermarias que forneceram amostras para este estudo foram agrupadas em 07 complexos, descritos na tabela 3. Tabela 3. Distribuição por especialidades das enfermarias do HCFMB-UNESP incluídas neste estudo. Complexos de Enfermarias Enfermarias Cirúrgicas Clínica Médica Pronto Socorro Enfermarias Pediátricas Ginecologia e Obstetrícia Unidade de Tratamento Intensivo Outras Enfermarias Enfermarias Cirurgia Cirugia Cardíaca Cirugia Torácica Gastrocirugia Ortopedia Urologia Dermatologia Gastroclínica Clínica Médica Centro de Terapia Intensiva Cardiologia, Cardioclínica Hematologia Pneumologia Pronto Socorro Pronto Socorro - Unidade de Tratamento Intensivo Berçário Pediatria Unidade de Tratamento Intensivo Pediatrica Unidade de Tratamento Intensivo Neonatal Ginecologia Obstetrìcia Unidade de Tratamento Intensivo Unidade de Tratamento Intensivo Central Unidade de Tratamento Intensivo Coronariana Quimioterapia Oncologia Moléstias Infecciosas e Parasitárias Neurologia Diálise

48 3.9. Determinação da heteroresistência de ECN à vancomicina Teste de triagem em Ágar BHI com 4 e 6 µg/ml de vancomicina. Para verificação da heteroresistência de ECN à vancomicina foi utilizado o meio de triagem preparado com ágar BHI adicionado de 4 µg/ml e 6 µg/ml de oxacilina 51. Foram testadas as amostras que apresentaram CIM para a vancomicina pela técnica de E-test 2 µg/ml. Para o preparo dos inóculos foram utilizadas culturas em caldo BHI previamente incubadas por 24 horas e posteriormente ajustadas com a turbidez da escala 0,5 de MacFarland. Após o preparo do inóculo as linhagens foram semeadas na forma de spots sobre a superfície do ágar com o auxílio de swab estéril. As placas foram incubadas por 24h a uma temperatura de 35 C e o resultado positivo foi a detecção do crescimento de pelo mesmo uma colônia na superfície do ágar e a CIM obtida pela método de E-test (item 3.5) ter sido abaixo de 4 ou 6 µg/ml Técnica de E-teste macrométodo modificada. Para verificação da heteroresistência à vancomicina em ECN também foi utilizada a técnica de E-teste macrométodo modificada. Essa técnica foi utilizada para as amostras de ECN com CIM para a vancomicina igual ou superior a 2 µg/ml. Os parâmetros técnicos envolvidos na realização da técnica de macrométodo modificado foram: meio de cultura de BHI, inóculo com concentração final semelhante à turvação correspondente a escala 2 de McFarland; incubação das placas em aerobiose a 35ºC por 48 horas; leitura pela verificação do crescimento de colônias na elipse de inibição do crescimento bacteriano. A detecção de ECN heteroresistentes à vancomicina foi verificada por meio do crescimento de pelo mesmo uma colônia na elipse de inibição.

49 3.10. Determinação do tipo de SCCmec para estafilococos coagulase negativa 29 A determinação do tipo de SCCmec em ECN foi realizada utilizando o método de reação PCR Multiplex com 4 pares de primers descritos na Tabela 4 27, 76. Para a reação de amplificação foi utilizada a seguinte mistura: tampão de reação 1x, 1,25U taq polimerase, 200 μm de cada dntp, 10 pm dos primers CIF2 F2, CIF2 R2, 6 pm dos primers KDP F1 e KDP R1 e 5 pm dos primers RIF4 F3 e RIF4 R9 e 10 μl do DNA extraído. A amplificação foi realizada em termociclador PTC-100 TM, empregando os parâmetros descritos por Oliveira e de Lencastre 73 modificados por Mombach Pinheiro Machado et al 27, que consistiram de: 3 minutos a 92 o C, seguidos por 30 ciclos de 1 minuto a 92 o C, 1 minuto a 56 o C e 1,5 minutos a 72 C. A eficiência das amplificações foi monitorada pela eletroforese da reação em gel de agarose Ultrapure TM 2% preparado em tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 0,5X. Como padrão foi utilizado um marcador de peso molecular de 100 bp. O DNA foi corado com SYBR Safe e posteriormente fotografados sob transiluminação ultravioleta.

50 30 Tabela 4. Oligonucleotídeos para a detecção do Cassete Cromossômico estafilocócico mec (SCCmec) em estafilococos coagulase negativa. Primer Sequência de nucleotídeos 5 a 3 SCCmec/R* TPA** CIF2 F2 CIF2 R2 KDP F1 KDP R1 DCS F2 DCS R1 RIF4 F3 RIF4 R9 5 TTCGAGTTGCTGGATGAAGAAGG 3 5 ATTTACCACAAGGACTACCAGC 3 5 AATCATCTGCCATTGGTGATGC 3 5 CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG 3 5 CATCCTATGATAGCTTGGTC 3 5 CTAAATCATAGCCATGACCG 3 5 GTGATTGTTCGAGATATGTGG 3 5 CGCTTTATCTGTATCTATCGC 3 I, região J1 495 II, região J1 284 I, II, IV região J3 342 III região J3 414 Fonte: Oliveira & de Lencastre 76 ; Mombach Pinheiro Machado et al 27. SCCmec/R*: Tipo de SCCmec/ Região amplificada TPA**: Tamanho do produto amplificado Determinação do Perfil Clonal das amostras de ECN. A tipagem das amostras de S. epidermidis e S. haemolyticus por PFGE foi realizada segundo o protocolo modificado de McDougal et al 74. As amostras foram semeadas em caldo BHI e incubadas a 37 o C por 24 h. Em um microtubo previamente pesado, 400 µl da amostra foi centrifugada à rpm por 50 s. Depois de desprezado o sobrenadante, o microtubo foi novamente pesado e adicionados 300 l de solução TE (10 mm de Tris, 1mM EDTA [ph 8,0]) mais a diferença entre o peso final e inicial em ml. As amostras foram deixadas em banho-maria por 10 min a 37 C. Após agitação em vórtex, foram adicionados 5 l de lisostafina (1mg/ml em 20 mm de acetato de sódio [ph 4,5]) e 300 l de agarose low melt. As amostras foram distribuídas nos moldes para plugues, e após solidificarem foram colocadas em placa de 24 poços com 2 ml de solução EC (6 mm Tris-HCl, 1 M NaCl, 100 mm EDTA, 0,5 % Brij-58, 0,2 % deoxicolato de sódio, 0,5 % laurilsarcosil sódico) e incubadas à 37 C por pelo menos

51 31 4 h. O EC foi retirado e os plugues lavados com 2 ml de TE quatro vezes à temperatura ambiente por meia hora. Para a restrição do DNA genômico foi usada a enzima SmaI (Fast Digest SmaI, Fermentas Life Science, Canadá). A eletroforese foi executada em aparelho CHEF-DR III System (BioRad Laboratories, EUA) em gel de agarose a 1 % preparado com TBE 0,5 M (Pulsed Field Certified Agarose, BioRad Laboratories, EUA) sob as seguintes condições: intervalos de tempo de pulso de 5 a 40 s por 21 h; em rampa linear; 6 V/cm; ângulo de 120 ; 14 C; 0,5 M TBE como tampão de corrida. Foi utilizado Lambda Ladder PFG Marker (New England BioLabs) como marcador molecular. Os géis foram corados com GelRed ( X em água, Biotium, EUA) por 1 h, e fotografados sob transiluminação UV. Para análise de similaridade, cálculo dos coeficientes de correlação Dice e criação do dendograma pelo método UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic averages) foi utilizado o software BioNumerics (versão 6.1; Applied Maths, Bélgica). A tolerância da posição das bandas e a otimização foram ajustadas para 1.5 e 1 % respectivamente. Um coeficiente de similaridade de 80 % foi escolhido para determinação dos clusters Análise Estatística Para comparar os métodos de difusão da droga com disco de oxacilina e cefoxitina, o método de triagem (Mueller-Hinton acrescido de 4 µg/ml de oxacilina mais 4% de NaCl) e E-test com a técnica de PCR, considerada padrão ouro para a detecção de resistência intrínseca à oxacilina (detecção do gene meca), foram aplicados testes de avaliação de sensibilidade e especificidade 75 conforme descrição abaixo:

52 - Sensibilidade (S): proporção de amostras de ECN positivas pela técnica 32 de PCR (detecção do gene meca) e que apresentaram resistência à oxacilina pelos métodos fenotípicos testados, difusão da droga com disco de oxacilina e cefoxitina, triagem (Mueller-Hinton acrescido de 4 µg/ml de oxacilina mais 4% de NaCl) e E-test. - Especificidade (E): proporção de amostras de S. aureus negativas pela técnica de PCR (não detecção do gene meca) e que apresentaram sensibilidade à oxacilina pelos métodos fenotípicos, incluindo a difusão da droga com disco de oxacilina e cefoxitina, triagem (Mueller-Hinton acrescido de 4 µg/ml de oxacilina mais 4% de NaCl) e E-test. Para a comparação da prevalência de amostras MRCoNS e MSCoNS durante os anos do estudo, bem como a multirresistência entre amostras MRCoNS e MSCoNS e a multirresistência por tipo de cassete SCCmec foi empregado o teste de proporções. Para a análise da evolução das CIMs das amostras MRCoNS e MSCoNS à vancomicina, foi empregado a análise de variância.

53 4. Resultados Amostras Um total de 160 amostras provenientes de hemoculturas isoladas no período de 2002 a 2009 e armazenadas na coleção de cultura do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências de Botucatu foram analisadas neste estudo Identificação de Estafilococos Coagulase Negativas A figura 1 apresenta a distribuição das espécies entre as 160 amostras incluídas neste estudo. S. epidermidis foi a espécie mais encontrada, com 111 amostras, seguido por S. haemolyticus (n=16), S. hominis subsp. novobiossepticus (n=13), S. saprophyticus (n=9), S. capitis subsp.urealyticus (n=5), S. schleiferi subsp. schleiferi (n=3), S. xylosus, S. warneri e S. caprae, com uma amostra cada. 3,1% 1,9% 5,6% 0,6% 0,6% 0,6% 8,1% 10,0% 69,4% S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis subsp. novobiossepticus S. saprophyticus S. capitis subsp. urealyticus S. schleiferi subsp. schleiferi S. xylosus S. warneri S. caprae Figura 1. Distribuição das espécies de ECN isoladas de hemoculturas.

54 4.3. Determinação de amostras de ECN resistentes à meticilina-oxacilina Técnica de difusão da droga em ágar com disco de oxacilina e cefoxitina Todas as 160 amostras incluídas no estudo foram testadas pela técnica de difusão com disco de oxacilina e cefoxitina. Conforme os critérios do CLSI (2011) as amostras que apresentaram o diâmetro do halo de inibição menor ou igual a 17 mm para o disco de oxacilina (1 µg) foram consideradas resistentes, e as que apresentaram o diâmetro do halo de inibição igual ou maior a 18 mm foram consideradas sensíveis. Para o disco de cefoxitina (30 µg) as amostras com o diâmetro do halo menor ou igual a 24 mm foram consideradas resistentes, e sensíveis as que apresentaram o diâmetro do halo de inibição maior ou igual a 25 mm. Foram detectadas 118 amostras resistentes à oxacilina pelo disco de difusão com disco de oxacilina (Tabela 5, Figura 2) e 120 amostras pelo disco de cefoxitina (Tabela 5, Figura 2). Tabela 5. Resistência à oxacilina avaliada pelo método de difusão com disco de oxacilina e cefoxitina Oxacilina (1 µg) Cefoxitina (30 µg) N % N % MRCoNS , % MSCoNS 42 26, Total MRCoNS: Estafilococos coagulase negativas resistentes a oxacilina MSCoNS: Estafilococos coagulase negativas sensíveis a oxacilina N: número de amostras A figura 2 apresenta uma amostra de ECN com crescimento de colônias no interior do halo de inibição do disco de oxacilina e cefoxitina.

55 35 Figura 2. Amostra de ECN com heterorresistência à oxacilina Teste de triagem em Ágar Mueller Hinton com 4 µg/ml de oxacilina e 4% de NaCl Um total de 113 amostras de ECN (70,6%) foram resistentes à oxacilina pelo teste de triagem e 47 (29,4%) sensíveis à oxacilina (Figura 4). Como controle negativo, foi utilizado a cepa ATCC e como controle positivo, a cepa ATCC ,4% 70,6% MRCoNS MSCoNS Figura 3. Resistência à oxacilina pelo teste de triagem com ágar Mueller Hinton acrescido de 4µg/mL de oxacilina e 4% de NaCl.

56 4.4. Detecção do gene meca de resistência à meticilina em ECN 36 A detecção genotípica da resistência à oxacilina foi realizada por meio da detecção do gene meca pela técnica de PCR. Um total de 116 amostras foram positivas para o gene meca (Figura 4), sendo 116 positivas pelo método de difusão com disco de cefoxitina (100%), 115 pelo método de difusão com disco de oxacilina e pela técnica de E-test (99,1%) e 110 pelo método de triagem (94,8 %) (Tabela 6). A Figura 5 mostra a distribuição das espécies de ECN e a resistência à oxacilina pela detecção do gene meca, mostrando que a espécie S. haemolyticus foi a que apresentou maior positividade com 75% de amostras meca isoladas (n=16), seguido por S. epidermidis, com 70,7% de positividade para o gene meca (n=82) seguido por S. hominis subsp. novobiossepticus com 09 amostras meca positivas (7,8%), S. saprophyticus com 07 amostras (6%), e S. schleiferi e S. capitis subsp. urealyticus, com 03 amostras cada (2,6%). 25,6% 74,4% meca+ meca - Figura 4. Presença do gene meca em amostras de Estafilococos Coagulase Negativas provenientes do HCFMB-UNESP.

57 37 Tabela 6. Determinação da sensibilidade à oxacilina em amostras de Estafilococos Coagulase Negativas por métodos fenotípicos e genotípicos. PCR a meca+ (N=116) meca- (N=44) Métodos Fenotípicos Disco Difusão Oxacilina Cefoxitina Triagem b E-test S R S R S R S R N % N % N % N % N % N % N % N % 2 1, , , ,8 1 0, , ,9 4 9, ,1 4 9, ,2 3 6, ,9 4 9,1 a: Reação em Cadeia da Polimerase b: Ágar Mueller- Hinton com 4 µg/ml de oxacilina + 4% de NaCl Oxacilina S (1µg): 18 mm - sensível Oxacilina R (1µg): 17 mm resistente Cefoxitina S (30µg): 24 mm - resistente Cefoxitina R (30µg): 25 mm - sensível S: amostra sensível à oxacilina R: amostra resistente à oxacilina Nº de amostras Total MRCoNS Figura 5. Distribuição de Estafilococos coagulase-negativa de acordo com a espécie e resistência à oxacilina pela detecção do gene meca.

58 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) às drogas pelo método de E-test As amostras de ECN analisadas pela técnica de E-test apresentaram uma alta taxa de resistência à oxacilina, com 119 amostras resistentes (74,4%) (Tabela 6). Estas amostras também foram testadas para a eritromicina, com 104 amostras resistentes (65%), netilmicina, com apenas 16 amostras resistentes (10%) e trimetoprimsulfametoxazol, com 73 amostras resistentes (45,6%) (Tabela 7). A vancomicina também foi testada, apresentando um total de 154 amostras sensíveis e 07 amostras com CIM > 2µg/mL (4,3%), sendo 06 com CIM de 3 µg/ml e 01 com CIM de 4 µg/ml (Tabela 7). Quando separadas em MRCoNS e MSCoNS, houve uma grande diferença entre os dois grupos, com um maior predomínio de amostras resistentes às drogas entre as resistentes à oxacilina. A eritromicina apresentou maior taxa de resistência em amostras MRCoNS, com 90 amostras (77,6%), seguido pelo trimetoprimsulfametoxazol, com 66 amostras (56,9%), e netilmicina, com 15 amostras (12,9%) (Tabela 6). Quando analisadas as amostras MSCoNS, as taxas de resistência às drogas estudadas foram menores comparadas as amostras MRCoNS. A eritromicina apresentou 14 amostras resistentes (31,8%), seguido pelo trimetoprim-sulfametoxazol com 07 amostras (15,9%), netilmicina com apenas 01 amostra resistente (2,3%) e todas as amostras sensíveis a vancomicina (Tabela 7).

59 39 Tabela 7. Resistência a drogas em amostras MRCoNS e MSCoNS detectadas pela técnica de E-test MRCoNS a MSCoNS b Total N=116 N=44 N=160 N % N % N % Eritromicina 90 77, , Netilmicina 15 9,4 1 2, Oxacilina ,1 4 9, ,4 Trimetoprim- Sulfametoxazol 66 56,9 7 15, ,6 Vancomicina MRCoNS: Estafilococos coagulase negativas resistentes a oxacilina MSCoNS: Estafilococos coagulase negativas sensíveis a oxacilina N: número de amostras Houve diferença quanto à determinação da sensibilidade as diferentes drogas pelo método de E-test para as diferentes espécies de ECN estudadas, sendo observado entre as amostras de S. epidermidis um percentual de 74,8% de resistência à oxacilina, 64,9% de resistência à eritromicina, 45% de amostras resistentes ao trimetoprimsulfametoxazol e 12,6% de resistência à netilmicina (Tabela 8). A espécie S. haemolyticus apresentou 75% de amostras resistentes à oxacilina, 68,8% resistentes à eritromicina, 50% resistentes ao trimetoprim-sulfametoxazol e 6,3% resistentes à netilmicina (Tabela 8). A espécie S.hominis apresentou 76,9% de amostras resistentes à oxacilina, 84,6% de amostras resistentes à eritromicina, 53,8% de amostras resistentes ao trimetoprim-sulfametoxazol e todas as amostras sensíveis à netilmicina (Figura 7, Tabela 8). As amostras de S. saprophyticus identificadas neste estudo apresentaram taxa de resistência à oxacilina de 77,8%, eritromicina de 44,4%, trimetoprim-sulfametoxazol de 55,6% e nenhuma amostra resistente à netilmicina (Figura 7, Tabela 8). Todas as três amostras de S. schleiferi subsp. schleiferi foram resistentes à oxacilina, sendo uma resistente à eritromicina e uma ao trimetoprim-sulfametoxazol (Figura 7, Tabela 8). A

60 40 espécie de S. xylosus identificada neste estudo apresentou sensibilidade a todas as drogas, exceto à oxacilina, e a única amostra de S. warneri encontrada foi sensível a todas as drogas estudadas (Tabela 8). Tabela 8. Determinação da resistência às drogas pelo método de E-test em amostras de ECN de acordo com a espécie. S.epidermidis N=111 S.caprae N=1 S. capits subsp. urealuticus N=5 S. haemolyticus N=16 S. hominis subsp. novobiossepticus N=13 S. saprophyticus N=9 S.schleiferi subsp. schleiferi N=3 S. warneri N=1 S.xylosus N=1 N % N % N % N % N % N % N % N % N % Eritromicina 72 64, , ,6 4 44,4 1 33, Netilmicina 14 12, , , Oxacilina 82 74, ,9 7 77, Trimetoprim- Sulfametoxazol (1/19) ,8 5 55,6 1 33, Vancomicina 4 3, , N;número de amostras Para as amostras de ECN analisadas, os valores de CIM encontrados para a eritromicina foram de >256 µg/ml para CIM 50% e CIM 90% (Tabela 10); netilmicina com valores de 1 µg/ml para CIM 50% e 12 µg/ml para CIM 90% (Tabela 9), oxacilina com 3 µg/ml para CIM 50% e >256 µg/ml par CIM 90% (Tabela 9), trimetoprim-sulfametoxazol (1/19) com 1,5 µg/ml para CIM 50% e 8 µg/ml para CIM 90% (Tabela 9), e vancomicina com 1,5 µg/ml para CIM 50% e 2 µg/ml para CIM 90% (Tabela 9). A CIM 50% e 90% em amostras MRCoNS e MSCoNS foi maior para as amostras MRCoNS, com exceção da vancomicina, que apresentou CIM 50% e 90% iguais nos dois grupos (Tabela 11).

61 41 Tabela 9. Concentração Inibitória Mínima 50% e 90% das diferentes drogas estudadas. Concentração Inibitória Mínima Drogas CIM 50% (µg/ml) CIM 90% (µg/ml) Eritromicina >256 >256 Netilmicina 1 12 Oxacilina 3 >256 Trimetoprim- 1,5 8 Sulfametoxazol (1/19) Vancomicina 1,5 2 CIM: Concentração Inibitória Mínima A tabela 10 expressa os valores de CIM 50% e 90% de acordo para as espécies de ECN estudadas. As espécies S. epidermidis e S. hominis subsp. novobiossepticus apresentaram as maiores CIM 50% para a eritromicina. A espécie S. haemolyticus apresentou a maior CIM 50% para a oxacilina e maior CIM 90% para a vancomicina. A espécie S. saprophyticus apresentou a maior CIM 50% para o trimetoprimsulfametoxazol. Tabela 10. Concentração Inibitória Mínima por espécie de ECN. S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis subsp.. novobiossepticus S. saprophyticus S. capitis subsp. urealyticus Droga CIM 50% CIM 90% CIM 50% CIM 90% CIM 50% CIM 90% CIM 50% CIM 90% CIM 50% CIM 90% Eritromicina >256 > >256 >256 >256 0,25 >256 0,125 >256 Netilmicina ,5 16 0,38 1,5 0, Oxacilina 3 > > ,5 >256 2 >256 Trimetoprim- Sulfametoxazol (1/19) 1,5 >32 1 > >32 0,5 4 Vancomicina 2 2 1, ,5 1,5 1,5 1 1,5 CIM: Concentração Inibitória Mínima CIM 50% e 90%; valor expresso em µg/ml

62 Tabela 11. Concentração Inibitória Mínima em amostras MRCoNS e MSCoNS 42 CIM 50% (µg/ml) CIM 90% (µg/ml) Droga MRCoNS N=116 MSCoNS N=44 MRCoNS N=116 MSCoNS N=44 Eritromicina >256 0,25 > Netilmicina 1,5 0, Oxacilina 8 0,125 >256 0,38 Trimetoprim- Sulfametoxazol (1/19) 4 0,125 >32 12 Vancomicina 1,5 1,5 2 2 CIM: Concentração Inibitória Mínima MRCoNS: Estafilococos coagulase negativas resistentes a oxacilina MSCoNS: Estafilococos coagulase negativas sensíveis a oxacilina A tabela 12 apresenta a CIM das diferentes drogas estudadas por faixa (µg/ml). Tabela 12. Concentração Inibitória Mímina das diferentes drogas estudadas Nº de amostras por Faixa de CIM (µg/ml) 0,012 a 0,094 0,125 a 0,75 0,94 a 32 >32 a >256 CIM 50% CIM 90% Eritromicina >256 >256 Netilmicina Oxacilina >256 Trimetoprim- Sulfametoxazol (1/19) ,5 8 Vancomicina ,5 2 CIM: Concentração Inibitória Mínima Quando as amostras foram analisadas separadamente entre MRCoNS e MSCoNS, percebe-se um maior número de amostras multirresistentes no grupo das MRCoNS, com 39 amostras apresentando resistência a 01 droga além da oxacilina, 51 amostras apresentando resistência a 02 drogas e 10 amostras apresentando resistência a 03 das 04 drogas estudadas (Tabela 13; Figura 6). Nenhuma das amostras MSCoNS apresentou resistência a 03 drogas (Tabela 13; Figura 6). Quando esta análise foi realizada para cada espécie de ECN identificada neste trabalho, observou-se uma

63 43 tendência de maiores níveis de amostras multirresistentes entre o grupo dos MRCoNS (Tabela 14) Tabela 13. Número de resistências em amostras MSCoNS e MRCoNS MRCoNS MSCoNS Nº de N % N % P resistências 0R 16 13, ,6 0,07 1R 39 33, ,7 0,000 2R ,6 0,000 3R 10 8, ,002 Total MRCoNS: Estafilococos coagulase negativas resistentes a oxacilina MSCoNS: Estafilococos coagulase negativas sensíveis a oxacilina N: número de amostras p: nível de significância estatística Nº de amostras MRCoNS MSCoNS Total R 1R 2R 3R Figura 6. Resistência a antimicrobianos em amostras MRCoNS e MSCoNS.

64 44 Tabela 14. Número de resistências em amostras MRCoNS e MSCoNS separadas por espécie de ECN. S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis subsp. novobiossepticus S.saprophyticus S. capitis subsp. urealyticus S. schleiferi subsp. schleiferi R S R S R S R S R S R S Número de N=82 N=29 N=12 N=4 N=9 N=4 N=7 N=2 N=3 N=2 N=3 N=0 resistências 0R R R R R: Estafilococos coagulase negativas resistentes a oxacilina pela técnica de PCR. S: Estafilococos coagulase negativas sensíveis a oxacilina pela técnica de PCR. N: número de amostras A evolução da resistência à vancomicina de acordo com os anos demonstrou que não houve diminuição da sensibilidade nos anos estudados nos grupos MRCoNS e MSCoNS. A análise estatística das CIMs 50% e 90% nos grupos MRCoNS e MSCoNS não revelou diferença estatisticamente significativa, revelando valores estáveis de sensibilidade à vancomicina nos anos do estudo (Tabela 15). A figura 7 apresenta a distribuição da CIM por tipo de cassete SCCmec.

65 45 Tabela 15. Evolução das CIM 50% e 90% à vancomicina em amostras MRCoNS e MSCoNS nos anos estudados. CIM 50% CIM 90% MRCoNS MSCoNS MRCoNS MSCoNS ,5 1, ,5 2 1, , , , ,5 3 1, ,5 1,5 2 2 CIM: Concentração Inibitória Mínima MRCoNS: Estafilococos coagulase negativas resistentes a oxacilina MSCoNS: Estafilococos coagulase negativas sensíveis a oxacilina p: nível de significância estatística p=0,298 p=0,197 p=0,756 p=0, Nº de amostras SCCmec I SCCmec II SCCmec III SCCmec IV SCCmec NT 0 CIM 0,5 CIM 0,75 CIM 1 CIM 1,5 CIM 2 CIM 3 CIM 4 Figura 7. Relação entre tipo de cassete cromosômico mec e CIM à vancomicina em amostras de Estafilococos Coagulase Negativas.

66 4.6. Determinação da produção de -lactamase 46 Das 160 amostras de Staphylococcus spp. estudadas, 147 (91,9%) foram produtoras de -lactamase. A figura 10 mostra a produção de -lactamase por espécie de ECN. Do total de amostras produtoras de -lactamase, 103 (92,8%) foram identificadas como S.epidermidis, 14 (87,5%) como S.haemolyticus, 11 (84,6%) como S. hominis, 9 como S. saprophyticus, 4 como S. capitis, 3 como S. schleiferi, e 1 respectivamente como S. caprae, S. warneri e S. xylosus (Figura 8). % de amostras 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% -lactamase - -lactamase + Figura 8. Produção de -lactamase por espécie de Estafilococos coagulase negativa.

67 4.7. Hiperprodução de -lactamase 47 Do total de 160 amostras analisadas, 03 foram negativas para o gene meca e apresentaram resistência à oxacilina quando detectadas por todos os métodos fenotípicos utilizados. Contudo, essas amostras foram positivas para produção de lactamase e sensíveis ao disco de amoxacilina-ácido clavulânico, confirmando, portanto a resistência à oxacilina mediada pela hiperprodução de -lactamase (Tabela 16) Tabela 16. Amostras positivas em testes fenotípicos para a detecção de resistência à oxacilina e negativas para a pesquisa de gene meca. Amostra Espécie meca Triagem a oxacilina b Disco Disco cefoxitina c E-test d (µg/ml) AMC e -lactamase 1135/02 S.xylosus mm (R) 24mm (R) 1,5 39 (S) positivo 2512/09 S. caprae mm (R) 21mm (R) 0,75 27 (S) positivo 2536/09 S. epidermidis mm (R) 23mm (R) 1 31 (S) positivo a: Ágar Mueller- Hinton com 4µg/mL de oxacilina + 4% de NaCl b: 17 (resistente); 18 (sensivel) c: 24 (resistente); 25 (sensivel) d: "Breakpoint" 0,5µg/mL (resistente), 0,25µg/mL (sensível) e: Amoxacilina + Acido clavulânico 19mm (resistente), 20 mm (sensível) 4.8 Procedência de amostras MRCoNS entre as enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP Neste estudo, as amostras das enfermarias do HCFMB-UNESP foram agrupadas em complexos de acordo com as especialidades. As 31 enfermarias que forneceram amostras para este estudo foram agrupadas em 07 complexos. A tabela 17 mostra a distribuição de amostras MRCoNS pelos complexos de enfermarias. A análise estatística revelou que as enfermarias da Clínica Médica, Pronto Socorro e Unidades de Tratamento Intensivo apresentarm uma frequência maior de amostras MRCoNS do que MSCoNS.

68 48 Tabela 17. Resistência à oxacilina em amostras de Estafilococos Coagulase Negativa isoladas de pacientes provenientes de diferentes enfermarias do HC da FMB. MRCoNS MSCoNS Complexo de enfermarias N % N % p Enfermarias Cirúrgicas 08 72,7 3 27,3 0,227 Clínica Médica 23 74,2 8 25,8 0,011 Pronto Socorro 40 74, ,9 0,001 Enfermarias Pediátricas 09 69, ,8 0,267 Ginecologia e Obstetrícia 01 33, ,6 1,000 Unidades de Tratamento Intensivo ,000 Outras Enfermarias 17 60, ,3 0,345 Total , ,5 MRCoNS: Estafilococos coagulase negativas resistentes a oxacilina MSCoNS: Estafilococos coagulase negativas sensíveis a oxacilina N: número de amostras p: nível de significância estatística 4.9 Evolução da resistência à oxacilina no HC da FMB, UNESP no período de 2002 a De um total de 160 amostras de ECN isoladas no período de 2002 a 2009, selecionadas e analisadas neste estudo, verificou-se um aumento na taxa de resistência à oxacilina no ano de 2003 (85%), quando comparada a 2002 (50%), mantendo-se estável nos anos de 2004 (71,4%), 2005 (66,6%) com aumento no ano de 2006 (80%), seguido de uma queda na taxa de amostras resistentes à oxacilina no ano de 2007 (55%), com um novo aumento no ano de 2008 (95%) e nova queda no ano de 2009 (75%) (Tabela 18 e Figura 9).

69 49 Tabela 18. Evolução de resistência à oxacilina em amostras de Estafilococos Coagulase Negativas isoladas de pacientes do HC-FMB UNESP no período de 2002 a MRCoNS MSCoNS p N % N % , , ,4 6 28,6 0, ,6 7 33,3 0, , , , ,025 Total N;número de amostras MRCoNS; Estafilococos coagulase negativas resistentes a oxacilina pela técnica de PCR MSCoNS: Estafilococos coagulase negativas sensíveis a oxacilina pela técnica de PCR p: nível de significância estatística % de amostras 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% MSCoNS MRCoNS Figura 9. Evolução da resistência à oxacilina em Estafilococos Coagulase Negativa (ECN) provenientes do HCFMB-UNESP no período de 2002 a 2009.

70 4.10. Determinação da heteroresistência de ECN à vancomicina 50 Um total de 09 amostras apresentaram crescimento em ágar BHI acrescido de 4µg/mL de vancomicina (Tabela 19) e 01 amostra foi capaz de crescer em ágar BHI acrescido de 6 µg/ml de vancomicina. Destas, 05 foram identificadas como S.epidermidis, 03 como S.haemolyticus e 01 como S.capitis. A amostra que cresceu nas concentrações de 4 e 6 µg/ml foi identificada como S.epidermidis. Todas as amostras foram positivas para o gene meca. Um total de 06 amostras (5,2%) apresentaram CIM >2µg/mL para a vancomicina (Tabela 19). A figura 10 ilustra uma amostra com crescimento em ágar BHI acrescido de 6 µg/ml de vancomicina. Tabela 19. Amostras de ECN com CIM > 2µg/mL para a droga vancomicina ou crescimento em Agar BHI acrescido de 4 µg/ml ou 6 µg/ml de vancomicina. Disco Difusão E-test (µg/ml) Triagem Vancomicina Amostra Espécie Triagem a OXA CFO Oxacilina Vancomicina meca 4µg/mL 6 µg/ml H-264/03 H-32429/03 S.epidermidis S.epidermidis > H-31768/03 S. epidermidis > H-35702/03 S. epidermidis H-30973/05 S. epidermidis > H-1908/05 H-2823/06 S.haemolyticus S.epidermidis > H-1898/06 S. epidermidis > H-28/07 S. epidermidis , H-3544/07 S. epidermidis > H-113/08 S. haemolyticus > H-1200/08 S. epidermidis H-2123/08 H-793/09 S.epidermidis S. capitis subsp. urealyticus H-867/09 S.haemolyticus a: Agar Mueller-Hinton acrescido de 4 µg de oxacilina e 4% de NaCl OXA: disco de oxacilina CFO:disco de cefoxitina

71 51 Todas as amostras com CIM 2µg/mL analisadas não apresentaram sensibilidade intermediária à vancomicina quando submetidas à técnica de macrométodo modificada. A B Figura 10. Crescimento de amostra de S.epidernidis em ágar BHI acrescido de 6 µg/ml de vancomicina. A: amostra sensível à vancomicina. B: amostra heteroresistente à vancomicina.

72 Determinação do tipo de cassete SCCmec para Estafilococos Coagulase Negativas No presente estudo, 116 amostras foram positivas para o gene meca, sendo um total de 38 amostras tipadas como SCCmec I (32,8%), 03 amostras como SCCmec II (2,6%), 58 amostras como SCCmec III (50%), 07 amostras como SCCmec IV (6%) e 10 amostras (8,6%) não foram tipadas pelo protocolo utilizado (Figura 11). Houve uma maior prevalência em todos os complexos de enfermarias de amostras SCCmec III, seguidas por amostras SCCmec I, exceto nos complexos de Pronto Socorro e Ginecologia e Obstetrícia, onde amostras SCCmec I foram mais frequentemente isoladas (Tabela 20). Das amostras que cresceram no meio de triagem com vancomicina, com crescimento em ágar BHI suplementado com 4µg/mL de vancomicina, 06 foram tipadas como SCCmec I, sendo 03 provenientes do complexo de enfermarias de Unidades de Tratamento Intensivo e 03 do complexo de enfermarias de Pronto Socorro; 03 foram caracterizadas como SCCmec III, isoladas respectivamente dos complexos de enfermarias de Unidade de Tratamento Intensivo, Pronto Socorro e Clínica Médica e apenas uma foi tipada como SCCmec II, sendo isolada do complexo de enfermarias de Pronto Socorro.

73 53 6,0% 8,6% 32,8% 2,6% 50,0% SCCmec I SCCmec II SCCmec III SCCmec IV SCCmec não tipavel Figura 11. Distribuição dos tipos de SCCmec em amostras de Estafilococos coagulase negativas. Tabela 20. Distribuição dos tipos de cassete SCCmec em Estafilococos Coagulase Negativa entre os complexos de enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP. SCCmec SCCmec SCCmec SCCmec SCCmec Total Complexos de I II III IV NT Enfermarias N % N % N % N % N % N % Clínica Médica 07 30, ,9 01 4,3 01 4, Cirurgia 03 37, , Pronto Socorro 17 42,5 03 7, ,9 01 2, Enfermarias Infantis 01 11, , Ginecologia e Obstetrícia Unidades de Tratamento Intensivo 05 27, , , Outras Enfermarias 04 23, , , , SCCmec: cassete cromossômico mec SCCmec NT: cassete cromossômico mec não tipável N: número de amostras A tabela 21 descreve a proporção entre espécies de ECN e o tipo de SCCmec.

74 54 Tabela 21. Distribuição dos tipos de SCCmec por espécie de Estafilococos Coagulase Negativa. S. capitis S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis S. saprophyticus Total N % N % N % N % N % N % SCCmec I , ,4 1 14, ,8 SCCmec II ,4 1 8, ,6 SCCmec III , ,3 3 42, SCCmec IV ,1 1 8, ,3 7 6 SCCmec NT ,1 1 8,3 2 22,2 2 28,6 10 8,6 Total N: tamanho da amostra NT: não tipável A análise dos tipos de SCCmec por ano de isolamento mostrou que as amostras tipadas como SCCmec I apresentaram um diminuição no ano de 2003, com aumento nos anos de 2004, com diminuição no ano de 2005 a 2006 seguido por um aumento no ano de 2007 e com leve queda nos anos seguintes (Figura 12). Com relação às amostras tipadas como SCCmec II, houve a detecção de amostras apenas no ano de 2006 e 2008 (Figura 12). As amostras MRCoNS tipadas como SCCmec III apresentaram um grande aumento no ano de 2002 para 2003, seguido por uma queda no ano de 2004, aumento nos anos de 2005 e 2006, seguido por nova queda no ano de 2007, novo aumento no ano de 2008, mantendo-se constante no ano de 2009 (Figura 12). As amostras tipadas como SCCmec IV apresentaram um aumento na sua prevalência nos ano de 2004, não sendo detectada nos últimos anos (Figura 12). As amostras que não foram possíveis de serem tipadas pela técnica empregada (NT) apresentaram uma prevalência baixa, porém constante nos anos de 2002 a 2009 (Figura 12).

75 55 % de amostras 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% SCCmec NT SCCmec IV SCCmec III SCCmec II SCCmec I Figura 12. Distribuição dos tipos de cassete SCCmec em amostras de Estafilococos Coagulase Negativas nos anos de 2002 a 2009 no HCFMB-UNESP. Os níveis de resistência às drogas estudadas neste trabalho apresentaram diferenças conforme o tipo de SCCmec presente. Uma maior porcentagem de amostras resistentes à eritromicina e trimetoprim-sulfametoxazol foram associadas às amostras MRCoNS SCCmec I e III (Tabela 22). Com relação a netilmicina, as amostras MRCoNS tipadas como SCCmec III apresentaram os maiores níveis de resistência (Tabela 23). As amostras MRCoNS tipadas como SCCmec I e III apresentaram as maiores taxas de multirresistência neste estudo (Tabela 23).

76 56 Tabela 22. Associação entre tipo de cassete cromossômico mec e resistência aos antimicrobianos estudados. SCCmec I SCCmec II SCCmec III SCCmec IV SCCmec NT Total N=38 % N=3 % N=58 % N=7 % N=10 % N % Eritromicina , ,1 6 6,6 8 8, Netilmicina 2 12,5 1 6, ,8 1 6, Trimetoprim- Sulfametoxazol 13 19,7 1 1, ,6 4 6,1 6 9, Vancomicina SCCmec: cassete cromossômico mec SCCmec NT: cassete cromossômico mec não tipável N: número de amostras Tabela 23. Relação entre Multirresistência e cassete cromossômico mec. Nº de resistências SCCmec I SCCmec II SCCmec III SCCmec IV SCCmec NT 0R R R R Total p=0,001 p=0,300 p=0,000 p=0,666 p=0,055 SCCmec: cassete cromossômico mec SCCmec NT: cassete cromossômico mec não tipável p: nível de significância estatística Determinação do perfil clonal das amostras de Estafilococos coagulase negativas Do total de 116 amostras de ECN positivas para o gene meca, 18 amostras de S. epidermidis SCCmec I e 41 amostras de S.epidermidis SCCmec III foram tipadas pela técnica de PFGE. Para a determinação do perfil clonal das amostras MRCoNS foi utilizada a técnica de Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) com a enzima SmaI e determinado o coeficiente de similaridade de 80%. Foram detectados 03 clones circulantes de amostras SCCmecI (Figuras 13, 16 e 18). O clone identificado com a letra

77 57 A apresentou um total de 05 amostras isoladas nos anos de 2003, 2004, 2007, 2008 e 2009 provenientes dos complexos de enfermarias de Pronto Socorro, Unidades de Tratamento Intensivo, Enfermarias Cirúrgicas e Clínica Médica (Figuras 13, 16 e 18). O clone identificado com a letra B apresentou 03 amostras isoladas nos anos de 2002, 2004 e 2008 provenientes dos complexos de enfermarias de Ciurgia, Pronto Socorro e Outras enfermarias (Figuras 13, 16 e 18). O clone identificado com a letra C apresentou um total de 03 amostras isoladas nos anos de 2004 e 2008 provenientes dos complexos de enfermarias de Pronto Socorro, Enfermarias Cirúrgicas e Outras Enfermarias (Figuras 13, 16 e 18). Um total de 06 clones circulantes de amostras de S. epidermidis SCCmecIII foram detectados dentre as amostras analisadas. O clone A apresentou um total de 08 amostras, isoladas nos anos de 2003, 2005, 2006 e 2009, provenientes dos complexos de enfermarias de Unidades de Tratamento Intensivo, Outras enfermarias, Pronto Socorro e Clínica Médica (Figuras 14, 17 e 19). O clone identificado com a letra B agrupou duas amostras provenientes dos complexos de enfermarias de Clínica Médica e Pronto Socorro (Figuras 14, 17 e 19). O clone identificado com a letra C agrupou 07 amostras isoladas nos anos de 2002 e 2003 provenientes dos complexos de enfermarias de Enfermarias Pediátricas e Pronto Socorro (Figuras 14, 17 e 19). O clone identificado com a letra D agrupou 02 amostras isoladas nos anos de 2002 e 2003 provenientes dos complexos de enfermarias de Clínica Médica e Enfermarias Pediátricas (Figuras 14, 17 e 19). O clone identificado com a letra E possui 03 amostras isoladas nos anos de 2005 e 2007 provenientes dos complexos de enfermarias de Unidades de Tratamento Intensivo, Outras Enfermarias e Cirurgia (Figuras 14, 17 e 19). O clone identificado com a letra F possui 04 amostras isoladas nos anos de 2002, 2003 e 2008 provenientes dos complexos de enfermarias de Clínica Médica, Unidades de Tratamento Intensivo,

78 58 Pronto Socorro e Outras enfermarias (Figuras 14, 17 e 19). As amostras de S.epidermidis tipadas como SCCmec IV apresentaram perfil policlonal, não sendo encontrado nenhum clone prevalente (Figura 15). Figura 13. Dendograma de amostras de S. epidermidis SCCmec tipo I analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%)

79 59 Figura 14. Dendograma de amostras de S. epidermidis SCCmec tipo III analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%)

80 60 Figura 15. Dendograma de amostras de S. epidermidis SCCmec tipo IV analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%) 42% 26% 16% 16% Clone A Clone B Clone C Não clonais Figura 16. Distribuição das amostras de S.epidermidis SCCmec I por clones identificados pela técnica de PFGE.

81 61 32% 21% 8% 11% 18% 5% 5% Clone A Clone B Clone C Clone D Clone E Clone F Não Clonais Figura 17. Distribuição das amostras de S.epidermidis SCCmec III por clones identificados pela técnica de PFGE. 5 Nº de amostras Clone A Clone B Clone C 0 Clínica Médica Enfermarias Cirúrgicas Outras Enfermarias Pronto Socorro Unidades de Tratamento Intensivo Figura 18. Distribuição dos clones de amostras de S.epidermidis SCCmec I por complexo de enfermaria.

82 62 5 Nº de amostras Clone A Clone B Clone C Clone D Clone E Clone F 0 Clínica Médica Enfermarias Cirúrgicas Enfermarias Pediátricas Outras Enfermarias Pronto Socorro Unidades de Tratamento Intensivo Figura 19. Distribuição dos clones de amostras de S.epidermidis SCCmec III por complexo de enfermaria. Um total de 04 amostras de S. haemolyticus SCCmec I e 03 amostras SCCmec III foram analisadas pela técnica de PFGE, contudo todas apresentaram perfil policlonal (Figuras 20 e 21) Figura 20. Dendograma de amostras de S. haemolyticuss SCCmec tipo I analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%)

83 63 Figura 21. Dendograma de amostras de S. haemolyticus SCCmec tipo III analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%) Análise Estatística Foi calculado a sensibilidade e a especificidade dos resultados obtidos pelos métodos fenotípicos de detecção de resistência à oxacilina, utilizando a detecção do gene meca como padrão ouro (Tabela 24). O disco de cefoxitina apresentou mesma especificidade, porém com melhor taxa de sensibilidade dentre os métodos estudados, com 100%. A técnica de E-test e o disco de oxacilina apresentaram taxa de sensibilidade de 99,1% e a mesma especificidade do disco de oxacilina e cefoxitina. O método de triagem apresentou sensibilidade de 94,8% e a melhor taxa de especificidade, com 93,2%. (Tabela 24).

84 64 Tabela 24. Comparação da presença do gene meca com os métodos de difusão em ágar com disco de oxacilina, disco de cefoxitina, método de triagem (Ágar Mueller Hinton + 4 µg/ml de oxacilina + 4% NaCl) e E-test meca Metodos fenotípicos Positivo Negativo Sensibilidade Especificidade N=116 N=44 % % Disco Cefoxitina (30 µg) ,9 Disco Oxacilina (1µg) ,1 90,9 E-test ,1 90,9 Triagem a ,8 93,2 a : Ágar Mueller Hinton com 4µg/mL de oxacilina e 4% de NaCl p: nível de significância estatística

85 5. Discussão 65 As espécies do gênero Staphylococcus são uma das principais causas de processos infecciosos, sendo os Estafilococos Coagulase-Negativa importantes patógenos associados à bacteremias e infecções nosocomiais. Por muito tempo, os ECN foram considerados contaminantes, contudo nas últimas décadas ficou estabelecido seu papel como patógeno oportunista humano. A oxacilina é a principal opção de tratamento as infecções por ECN, contudo, houve um significativo aumento das taxas de resistência nos últimos anos, o que restringe as opções de escolha terapêutica. No presente estudo, S. epidermidis foi a espécie de ECN mais isolada, com um total de 69,4% das amostras, seguido por S. haemolyticus com 10% e S. hominis, com 8,1%. Diversas pesquisas relatam S. epidermidis como uma das espécies mais prevalentes entre os micro-organismos causadores de bacteremia. Nos EUA, esta espécie foi responsável por 22% das hemoculturas positivas de pacientes com suspeita de bacteremia no ano de No Canadá, S. epidermidis foi a terceira espécie mais prevalente em bacteremias, com 11,7% de amostras 76. Dados recentes do Brasil, relatados pelo Centro de Vigilância Epidemiológica do Estado de São Paulo 77, mostram que S. epidermidis e outras espécies de ECN foram os micro-organismos mais isolados de hemoculturas no ano de 2010, com um total de 30%. A alta prevalência de S. epidermidis pode estar associada ao fato deste micro-organismo ser um importante membro da microbiota normal da pele. Outros trabalhos também relatam a alta prevalência de S. epidermidis como causador de bacteremia entre os ECN. Koksal, Yasar & Samasti 78 descrevem esta espécie como a mais isolada em um hospital de Istambul, Turquia, dentre as espécies de ECN, com um total de 43,5% das amostras. Gatermann, Koschinski & Friedrich 79

86 66 descreveram prevalência de 67,4% de amostras de S.epidermidis isoladas em um hospital alemão, semelhantes às taxas encontradas neste estudo. Os mesmos autores relataram S. haemolyticus e S.hominis como a segunda e terceira espécie de ECN mais frequentemente isolada, com taxas de 11,9% e 7,5% respectivamente, semelhantes às descritas neste trabalho. Embora neste trabalho S.hominis tenha sido a terceira espécie mais isolada, Cuevas et al 17 descreveram S. hominis como a segunda espécie de ECN mais frequente em ambiente hospitalar. Kristóf et al 15 também encontraram S. epidermidis e S. haemolyticus como as duas espécies de ECN mais isoladas em ambiente hospitalar. O mesmo autor relata altas taxas de resistência à oxacilina em S. haemolyticus, com um total de 97% de amostras resistentes. A resistência à oxacilina em amostras de ECN isoladas em ambiente hospitalar tornou-se um grande problema, devido às poucas opções terapêuticas para tratamento. Neste estudo, 116 amostras (74,4%) foram positivas para o gene meca, e desta forma, resistentes à meticilina. Taxas semelhantes foram descritas por outros autores no Brasil. Gales et al 6 encontraram um total de 78,7% de amostras de estafilococos coagulase negativas resistentes à meticilina em estudo multicêntrico com hospitais da região sul, sudeste e centro-oeste, semelhantes as taxas descritas neste estudo. Outros autores descrevem níveis maiores de resistência à oxacilina. Rigatti et al 80 relataram 90% de amostras de ECN positivas para o gene meca em estudo realizado em um hospital da região Sul do Brasil. Taxas semelhantes de resistência à oxacilina foram descritas em outros países, como na Espanha, com 66,8% de amostras MRCoNS identificadas em estudo multicêntrico com 145 hospitais 17. Na Itália, em estudo realizado com amostras de hemocultura provenientes das enfermarias de transplante hematológico e unidade de tratamento intensivo foram encontradas um total de 77% de amostras de ECN

87 67 resistentes à oxacilina 21. Existem relatos de taxas maiores de resistência à oxacilina em outros países do que as encontradas neste estudo. Na Tunísia, foi descrito um total de 95% de amostras MRCoNS provenientes de hemoculturas de pacientes submetidos a transplante de medula óssea, sendo a espécie mais isolada S. epidermidis, com 74,4% das amostras resistentes à oxacilina, S. haemolyticus, com 23,3% das amostras e S. hominis com apenas 2,3% 81. Neste trabalho, a espécie de ECN que apresentou maiores níveis de resistência à oxacilina foi S. haemolyticus, com 75% das amostras, seguido por S. epidermidiss, com 70,7% e S. hominis com 69,2%. Altas taxas de resistência à oxacilina têm sido relatadas em S. haemolyticus, ressaltando a importância da correta identificação das espécies de ECN. Em estudo realizado em hospital chinês com um total de 113 amostras de S. haemolyticus, foi descrito um total de 90,2% de amostras resistentes à oxacilina 23. Taxas maiores de amostras de S. haemolyticus resistentes à oxacilina foram descritas na Hungria, com um total de 97% de amostras positivas para o gene meca 15. As altas taxas de resistência à oxacilina em S. haemolyticus devem servir de alerta para o aumento das boas práticas de controle de infecção hospitalar, bem como o uso racional de antibioticoterapia, uma vez que diversos estudos relatam esta espécie como a segunda mais isolada no grupo dos ECN. Devido aos altos níveis de resistência à oxacilina em ECN, faz-se necessária a correta identificação da resistência nestas amostras. A detecção fenotípica da resistência à meticilina apresenta baixo custo e facilidade de execução da técnica, sendo amplamente empregada em laboratórios de rotina. O CLSI 43 recomenda o disco de cefoxitina para a detecção fenotípica da resistência à meticilina em ECN, sendo considerado um ótimo indutor da expressão do gene meca 82. No presente estudo, os métodos fenotípicos obtiveram boas taxas de sensibilidade e especificidade, o que

88 68 ressalta o papel destas metodologias para a rápida detecção da resistência à oxacilina. O disco de cefoxitina apresentou 100% de sensibilidade e 90,9% de especificidade, o que vem de encontro com os dados da literatura, que descrevem boas taxas de sensibilidade para esta técnica. Perazzi et al 46 descrevem a mesma taxa de sensibilidade e melhores taxas de especificidade, com 100%. John et al 47 descrevem sensibilidade de 94,6% e especificidade de 93,5% para o disco de cefoxitina. Este estudo também ressalta que a sensibilidade e especificidade do disco de cefoxitina podem variar conforme a espécie, sendo menos sensível para espécies como S. simulans e S. warneri, e menos específico para S. cohnii subsp. urealyticus. Contudo, Jain, Agarwal & Verma 45 descrevem baixa sensibilidade para o disco de cefoxitina, com taxa de 80% e especificidade de 100%, superior a encontrada neste estudo. O mesmo autor descreve sensibilidade de 86,6% para o disco de oxacilina e especificidade de 70,6% Neste estudo, o disco de oxacilina apresentou sensibilidade de 99,1%, próxima a sensibilidade descrita para o disco de cefoxitina, e especificidade de 90,1%, a mesma descrita para o disco de cefoxitina. Perez et al 83 descrevem sensibilidade de 100% e especificidade de 92,1%, taxas um pouco superiores às encontradas neste estudo. Outros autores descrevem níveis de sensibilidade e especificidade menores, variando entre 86% a 88% e 70 a 86%, respectivamente 45, 46. Existem também relatos de discrepâncias entre os resultados de testes fenotípicos que utilizam oxacilina e cefoxitina, o que ressalta a importância do emprego dos dois discos na detecção de amostras de Staphylococcus spp. resistentes à oxacilina. Hung et al 84 descrevem um total de 27 amostras discrepantes entre o disco de oxacilina e o teste com Concentração Inibitória Mínima utilizando a cefoxitina acrescida em ágar Mueller Hinton. O método de triagem em ágar Mueller Hinton acrescido de 4 µg/ml de oxacilina e 4% de NaCl é outra alternativa fenotípica para a detecção da resistência à oxacilina

89 69 em ECN. No presente estudo, o método de triagem apresentou sensibilidade de 94,8%, inferior a encontrada em relatos de literatura, e a melhor taxa de especificidade, com 93,2%. Ferreira et al 48 encontraram boas taxas de sensibilidade e especificidade em amostras de ECN. Após 48 horas de incubação, a técnica obteve taxas de sensibilidade e especificidade de 100%. Perez et al 49 descreveram sensibilidade semelhante para o método de triagem, com sensibilidade de 100% e especificidade de 94,7%. A técnica de E-test é uma alternativa ao ensaio de microdiluição para determinação da Concentração Inibitória Mínima, com maior facilidade de execução. Neste trabalho, a técnica de E-test apresentou sensibilidade para a detecção de resistência à oxacilina de 99,1%, a mesma para o disco de oxacilina e próxima à sensibilidade descrita para o disco de cefoxitina, e especificidade de 90,1%. Ressaltamos o fato de que 06 amostras apresentaram heterorresistência, com a presença de pequenas colônias na elipse de inibição ou subpopulações, o que deve ser levado em conta na hora da leitura, uma vez que a desconsideração destas colônias pode levar a um resultado falso negativo. Um total de 76,6% das amostras de ECN apresentaram resistência à oxacilina pela técnica de E-test, resultados inferiores aos descritos por Shorman et al 85, que relataram um percentual de 86,2% de resistência à oxacilina. Hederstierna-Johnsen et al 49 descreveram 100% de sensibilidade para a detecção da resistência à oxacilina pela técnica de E-test, contudo, a taxa de especificidade foi de 80%, inferior a encontrada neste trabalho. Tveten et al 86 relataram a mesma taxa de sensibilidade, com especificidade de 95,4%, superior a descrita neste estudo. Baixas taxas de especificidade podem estar relacionadas com a presença de outros mecanismos de resistência não mediados pelo gene meca, como a hiperprodução de -lactamase e a resistência modificada, chamada de MOD-SA, mediada pela alteração de PBPs intrínsecas, com afinidade para a oxacilina alterada 25. Neste trabalho,

90 70 91,9% das amostras foram produtoras de -lactamase, e 03 amostras apresentaram resistência à oxacilina por todas as técnicas fenotípicas empregadas e foram negativas para a pesquisa do gene meca, contudo, apresentaram hiperprodução de -lactamase. As Concentrações Inibitórias Mínimas à oxacilina das três amostras foram próximas ao breakpoint, ressaltando a associação da hiperprodução de -lactamase com a resistência borderline e importância da detecção correta da resistência fenotípica à oxacilina. Do mesmo modo, foram descritos altos níveis de resistência aos antimicrobianos testados, o que pode ser verificado quando analisadas as CIM 50% e 90%. A eritromicina foi a droga que apresentou a maior CIM 50%, com valores 256 µg/ml em 88 amostras. Gherardi et al 87 relataram um total de 62,7% de amostras resistentes à eritromicina, taxas um pouco superiores às encontradas neste estudo. Gattermann et al 88 descreveram um total de 62,5% das amostras de S. epidermidis, 89,8% das amostras de S.haemolyticus e 51,4% das amostras de S.hominis resistentes à eritromicina. O trimetoprim-sulfametoxazol também apresentou um alto percentual de amostras resistentes e maior CIM 50% e 90% em amostras MRCoNS quando comparado com amostras MSCoNS, o que ressalta a associação entre resistência à oxacilina e amostras multirresistentes. Neste trabalho, apenas 12,6% das amostras apresentaram resistência à netilmicina, o que pode indicar esta droga, bem como o grupo dos aminoglicosídios, como uma boa alternativa terapêutica. Dados semelhantes foram descritos por Emaneini et al 89, que descreveram apenas 21,2% de resistência em amostras de Staphylococcus spp. Outros autores relataram níveis um pouco maiores de resistência à netilmicina, contudo, muito inferiores quando comparados com a resistência à oxacilina em ECN, o que ressalta mais uma vez a importância desta droga como alternativa terapêutica 90.

91 Os resultados desse estudo mostraram diferença entre as taxas de resistência aos 71 antimicrobianos testados em amostras MRCoNS e MSCoNS, com uma maior prevalência de resistência a duas e três drogas no grupo ds MRCoNS. Giusti 90 relataram CIM 50% e 90% maior para diversas drogas em amostras MRCoNS, quando comparadas com amostras MSCoNS. A multirresistência em amostras de MRCoNS está relacionada com a presença de transposons e plasmídios inseridos no interior do cassete cromossômico mec, além de plasmídios que podem ser transferidos entre espécies de ECN ou até mesmo entre ECN e S.aureus 91. A distribuição de amostras MRCoNS pelo HCFMB-UNESP apresentou uma maior concentração nos complexos de enfermarias de Pronto Socorro, o que pode estar relacionado com as condições em que os pacientes chegam a estas enfermarias. A resistência à oxacilina no HCFMB-UNESP apresentou um pequeno aumento no ano de 2003, mantendo-se estável nos anos de 2004 a 2006, com queda no ano de 2007, um novo aumento no ano de 2008 e uma discreta queda no ano de 2009, contudo, com um percentual alto de amostras MRCoNS, o que ressalta a importância da vigilância de resistência à oxacilina em Unidades de Tratamento Intensivo. O gene meca, principal mecanismo de resistência à oxacilina, está presente dentro de um elemento genético móvel chamado cassete cromossômico mec. Além de carrear resistência à oxacilina, o cassete SCCmec pode conter genes de resistência a outras drogas, como tetraciclina e eritromicina, e metais pesados, como o mercúrio e cádmio 92. Os SCCmec se dividem em onze tipos e diversos subtipos, cada um com características epidemiológicas exclusivas 41, o que caracteriza a tipagem do cassete SCCmec como uma ferramenta epidemiológica de grande utilidade 27. Neste estudo, as espécies de ECN estudadas também apresentaram um alto percentual de amostras

92 72 tipadas com o SCCmec I e SCCmec III, associado a amostras de origem hospitalar. Dados semelhantes foram descritos em estudo realizado na região Sul do Brasil 27. O cassete SCCmec IV, relacionado com amostras de origem comunitária apresentou uma baixa prevalência, porém desde o ano de 2003 é detectado o SCCmec IV, o que confirma a presença desse cassete no ambiente hospitalar como relatado por Valsesia et al 93 que relataram a substituição dos tipos de SCCmec I, II e III, associados a ambiente nosocomial pelos tipos IV e V. Outros autores descreveram uma maior prevalência de amostras SCCmec IV. Bouchami et al 81 relataram um maior predomínio de amostras de ECN tipadas como SCCmec IV provenientes de pacientes internados na enfermaria de oncohematologia, fato que pode estar relacionado ao estado imunológico destes pacientes. Garza-Gonzalez et al 94 relataram níveis semelhantes de prevalência de ECN com SCCmec dos tipos III e IV. A espécie S. epidermidis apresentou um percentual de 53,7% amostras resistentes à oxacilina tipadas como SCCmec III, sendo que a espécie S. capitis apresentou 100% das amostras resistentes à oxacilina tipadas como SCCmec III. A espécie S. haemolyticus apresentou o maior percentual de amostras resistentes à oxacilina caracterizadas como SCCmec I, com um total de 50%. A espécie S. saprophyticus, geralmente associada a infecções do trato urinário comunitárias apresentou o maior percentual de amostras tipadas como SCCmec IV, com um total de 14,3% das amostras desta espécie resistentes à oxacilina. A maior quantidade de amostras meca positivas e que não foram tipadas pela técnica empregada foram encontrados nas espécies S. hominis e S. saprophyticus, fato que pode estar relacionado a presença de outros tipos de SCCmec. Bouchami et al 19

93 73 estudaram 33 amostras de S. hominis isolados de pacientes neutropênicos com um total de 20% de amostras tipadas como SCCmec VI e 14 % tipadas como SCCmec VIII. Houve uma forte associação entre multirresistência e a presença dos SCCmec dos tipos I e III, o que pode ser explicado pelo fato destes dois tipos de cassete SCCmec estarem associados a amostras de origem hospitalar. Potel et al 95 também associaram o cassete SCCmec III e um alto percentual de resistência à eritromicina e ao trimetoprimsulfametoxazol. Embora o cassete SCCmec IV não esteja associado a amostras multirresistentes, neste trabalho das 07 amostras tipadas como SCCmec IV, 06 apresentaram resistência a eritromicina e 04 ao trimetoprim-sulfametoxazol, o que indica a presença de amostras SCCmec IV multirresistentes. Quando analisada a prevalência dos tipos de cassete SCCmec em amostras MRCoNS no período estudado, percebe-se um aumento do número amostras tipadas como SCCmec I nos últimos anos, com uma leve queda no anos de As amostras tipadas como SCCmec III apresentaram picos de maior prevalência nos anos de 2003, 2006 e 2008, apresentando queda no ano de Embora o ano de 2009 registre uma queda na prevalência de amostras SCCmec I e III, este fato pode estar associado a diminuição do número de amostras MRCoNS isoladas e não a uma substituição por outro tipo de SCCmec. O tratamento das amostras de ECN resistentes à oxacilina normalmente é feito com a vancomicina, um antimicrobiano da classe dos glicopeptídios que tem sido empregado nas últimas três décadas com sucesso no combate destas infecções 96. Contudo, na última década houve um aumento do número de amostras MRCoNS resistentes à vancomicina ou com suscetibilidade diminuída, o que é motivo de

94 74 preocupação uma vez que esta é a droga de escolha para o tratamento de amostras de Staphylococcus spp. resistentes à meticilina. Neste trabalho, foram detectadas 09 amostras que foram capazes de crescer em ágar BHI suplementado com 4µg/mL de vancomicina, e 01 amostra (0,6%) de S.epidermidis que cresceu em ágar BHI suplementado com 4 e 6µg/mL de vancomicina. A técnica de E-test detectou 03 amostras de S.epidermidis e 02 de S haemolyticus com CIM de 3 µg/ml e 01 amostra com CIM de 4µg/mL, fato que indica o declínio da suscetibilidade de amostras de ECN a vancomicina no HCFMB-UNESP. Diversos trabalhos descrevem o declínio da suscetibilidade à vancomicina em amostras de ECN. Garret et al 97 descreveram o primeiro relato de uma amostra de S.epidermidis com suscetibilidade reduzida à vancomicina. Poucos anos depois, surgiram novos relatos de amostras de ECN resistentes e heterorresistentes à vancomicina. Nunes et al 57 relataram o declínio da suscetibilidade à vancomicina em um hospital brasileiro, com taxas de 6,1% de amostras com heterorresistência à vancomicina, dados semelhantes aos encontrados neste estudo. Natoli et al 20 encontraram 11 amostras de S.epidermidis e 02 amostras de S. haemolyticus com heterorresistência a vancomicina. Embora neste trabalho apenas 6,3% das amostras apresentaram heteroresistência a vancomicina, existem relatos de altas taxas de amostras de Staphylococcus spp. heterorresistentes.olivares et al 54 descreveram 61% de amostras de ECN com suscetibilidade reduzida à vancomicina, fato que é preocupante pela limitação de alternativas terapêuticas para o tratamento destas infecções. Neste estudo apenas 01 amostra de S. capitis apresentou suscetibilidade reduzida à vancomicina, contudo D mello et al 55 relataram 09 amostras de S. capitis isoladas de

95 75 hemoculturas com suscetibilidade reduzida à vancomicina. A única amostra identificada neste trabalho como S. warneri apresentou heteroresistência à vancomicina, contudo Center et al 98 relataram um alto percentual de amostras de S. warneri isoladas de neonatos com suscetibilidade reduzida à vancomicina. Um total de 03 amostras de S. haemolyticus apresentaram heteroresistência à vancomicina neste trabalho, sendo duas tipadas como SCCmec I e 01 como SCCmec II. Reyna-Figueroa et al 99 encontraram 01 amostra de S. haemolyticus isolada de amostra de líquido cefelorraquidiano de um recém-nascido em hospital mexicano. Pallazzo et al 52 também relataram o isolamento de uma amostra de S. haemolyticus resistente à vancomicina isolada da comunidade. Creminter et al 100 descreveram uma amostra de S. haemolyticus heterorresistente à teicoplamina, outro antibiótico da classe dos glicopeptídios. Devido ao aumento do número de amostras de Staphylococcus spp. resistentes à oxacilina e o surgimento de amostras heterorresistentes e resistentes à vancomicina, fazse necessário estudar a disseminação destas amostras no ambiente hospitalar. Para estudos deste tipo, a técnica de PFGE é empregada com grande êxito. Neste trabalho, um total de 18 amostras de S. epidermidis SCCmec I e 41 amostras SCCmec III foram tipadas pela técnica de PFGE. Três clones de amostras SCCmec I foram detectados, o maior deles sendo detectado durante os anos de 2003 a 2009, fato que caracteriza a disseminação clonal destas amostras. Houve a detecção de seis clones de amostras SCCmec III; disseminados por diversas enfermarias e circulantes por vários anos. No clone identificado com a letra A, nota-se a presença de 05 amostras com 100% de similaridade, o que significa que a mesma amostra circulou durante os anos de 2003 a 2009 por várias enfermarias. Muldrew et al 101 relatam a disseminação clonal de S.epidermidis por uma enfermaria oncológica. Klingenberg et al 102 também descrevem a persistência de clones de S.epidermidis em enfermaria pediátrica por um longo período.

96 76 Os mesmos autores também relatam a presença de um clone de S.haemolyticus disseminado por esta enfermaria, o que não foi encontrado neste estudo. As amostras de S. epidermidis SCCmec IV tipadas apresentaram perfil policlonal, o que pode estar relacionado com a origem comunitária destes isolados. Valsesia et al 93 descrevem alta prevalência de amostras MRSA SCCmec IV em hospital suíço, com baixa clonalidade, o que também pode ser explicado pela origem comunitária. Todas as amostras de S. haemolyticus apresentaram perfis distintos, embora todas possuíssem cassete cromossômico mec associado a ambiente hospitalar. Dados semelhantes são descritos por Kristóf et al 15, que descrevem alta variabilidade genética em amostras de S. haemolyticus. Contudo, Yu et al 24 relatam disseminação clonal de S.haemolyticus por diversas enfermarias de um hospital chinês. Os resultados obtidos neste estudo confirmam a importância da detecção da resistência à oxacilina como marcador importante na escolha da terapêutica antimicrobiana, com multirresistência em amostras MRCoNS e maior sensibilidade aos outros antimicrobianos em amostras MSCoNS. A disseminação clonal de amostras MRCoNS pelo HCFMB-UNESP também ressalta a importância das boas práticas de controle de infecção hospitalar.

97 6. Conclusões 77 Houve uma maior prevalência de S.epidermidis dentre as espécies de ECN isoladas de hemoculturas provenientes das enfermarias do HCFMB-UNESP. Foi encontrado um alto percentual de amostras de Estafilococos coagulase negativas resistentes à oxacilina (74,4%), o que enfatiza o emprego racional de antibioticoterapia. O disco de cefoxitina, o disco de oxacilina e a técnica de E-test apresentaram taxas similares de sensibilidade e foram superiores ao método de triagem para a detecção da resistência à oxacilina no grupo dos Estafilococos Coagulase Negativa A maioria das amostras MRCoNS apresentou altos níveis de CIM à oxacilina e multirresistência Embora não tenha sido detectada resistência à vancomicina, nota-se uma diminuição da sensibilidade a esta droga Houve uma prevalência de amostras de MRCoNS SCCmec I e III neste trabalho Observou-se uma disseminação de amostras MRCoNS pelas enfermarias do HCFMB-UNESP, bem como a persistência de clones circulantes durante os anos do estudo

98 7. Referências Bibiolgráficas Referências Bibiolgráficas 1. Koneman EW; Winn WC. Diagnóstico Microbiológico: texto e atlas colorido. Rio de Janeiro, Ed Guanabara-Koogan, ª Ed 1760p. 2. Kloos WE, Bannerman TL Staphylococcus and Micrococcus. In Murray PR, Baron Ej, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH. Manual of Clinical Microbiology, Washington DC, ASM press, 1995, p Clemens H. Staphylococcus albus hemolyticus meningitis in an infant. The Journal of Pediatrics. 1945; 27(3): Smith IM, Beals PD, Kingsburry KR, Hasenclever HF. Observations on Staphylococcus albus septicemia in mice and men. AMA Arch Intern Med. 1958; 102: Wilson TS, Stuart RD. ST. Staphylococcus albus in wound infection and septicemia. Can Med Assoc J ;93: Gales AC, Sader HS, Ribeiro J, Zoccoli C, Barth A, Pignatari AC. Antimicrobial Susceptibility of Gram-Positive Bacteria Isolated in Brazilian Hospitals Participating in the SENTRY Program ( ). Clin Infect Dis 2009; 13: Marra AR, Camargo LF, Pignatari AC, Sukiennik T, Behar PR, Medeiros EA, et al. Nosocomial bloodstream infections in Brazilian hospitals: analysis of 2,563 cases from a prospective nationwide surveillance study. J Clin Microbiol. 2011; 49:

99 8. Chen CY, Tsay W, Tang JL, Tien HF, Chen YC, Chang SC, Hsueh PR. 79 Epidemiology of bloodstream infections in patients with haematological malignancies with and without neutropenia. Epidemiol Infect. 2010; 138(7): McCann MT, Gilmore BF, Gorman SP. Staphylococcus epidermidis devicerelated infections: pathogenesis and clinical management. J Pharm Pharmacol. 2008; 60: Service, PH, & Services H. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October Am J Infect Control. 2004; Otto M. Staphylococcus epidermidis - the 'accidental' pathogen. Nat Rev Microbiol. 2009; 7: Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Critérios Diagnósticos NNIS (From: Horan TC, Gaynes RP. Surveillance of nosocomialinfections. In:Hospital Epidemiology and Infection Control, 3rd ed., Mayhall CG, editor. Philadelphia:Lippincott Williams & Wilkins, 2004: ) Brasília, Pai R, Johnson LB, Kamalakannan D, Sharma M, Saravolatz LD. Staphylococcus haemolyticus Mitral Valve Endocarditis Presenting With Multiple Brain Abscesses. Infect Dis Clin Pract, 2008; 16: Kawamura Y, Hou XG, Sultana F, Hirose, K Miyake M, Shu SE, Ezaki T. Distribution of Staphylococcus Species among Human Clinical Specimens and Emended Description of Staphylococcus caprae. J Clin Microbiol 1998; 36: Kristóf K, Kocsis E, Szabó D, Kardos S, Cser V. Significance of methicillin teicoplanin resistant Staphylococcus haemolyticus in bloodstream infections in

100 patients of the Semmelweis University hospitals in Hungary. Eur J Clin 80 Microbiol Infect Dis, John JF, Harvin AM. History and evolution of antibiotic resistance in coagulase-negative staphylococci: Susceptibility profiles of new antistaphylococcal agents. Ther Clin Risk Manag. 2007; 3: Cuevas O, Cercenado E, Goyanes MJ, Vindel A, Trincado P, Boquete T, Marín M, Bouza E; Grupo Español para el Estudio de Estafilococo. Staphylococcus spp. en España: situación actual y evolución de la resistencia a antimicrobianos, Enferm Infecc Microbiol Clin 2008; 26: Secchi C, Lúcia A, Antunes S, Reus L, Perez R, Cantarelli V V, Alves P. Identification and Detection of Methicillin Resistance in Non-Epidermidis Coagulase-Negative Staphylococci. Brazilian J Infect Dis, 2008; 12: Bouchami O, Hassen A B., Lencastre H D, Miragaia M. Molecular Epidemiology of Methicillin-Resistant Staphylococcus hominis (MRSHo): Low Clonality and Reservoirs of SCCmec Structural Elements. Epidemiology. 2011; 6: Natoli S, Fontana C, Favaro M, Bergamini A, Testore GP, Minelli S, Bossa MC, et al. Characterization of coagulase-negative staphylococcal isolates from blood with reduced susceptibility to glycopeptides and therapeutic options. BMC Infect Dis. 2009; 9: Palazzo IC, d'azevedo PA, Secchi C, Pignatari AC, Darini AL. Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus strains causing nosocomial bloodstream infection in Brazil. J Antimicrob Chemother. 2008; 62:

101 22. Yu M, Chen Y, Yu Y, Chen C, Li L. (2010). Antimicrobial resistance and 81 molecular characterization of Staphylococcus haemolyticus in a Chinese hospital. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2010; Stuart JI, John MA, Milburn S, Diagre D, Wilson B, Hussain Z. Susceptibility patterns of coagulase-negative staphylococci to several newer antimicrobial agents in comparison with vancomycin and oxacillin. Int J Antimicrob Agents. 2011; 37: McDougal LK, Thornsberry C. The role of beta-lactamase in staphylococcal resistance to penicillinase-resistant penicillins and cephalosporins. J Clin Microbiol. 1986; 23: Tomasz A, Drugeon HB, Lencastre HM, Jabes D, Mcdougal L, Bille J. New mechanism for methicilin resistance in Staphylococcus aureus: clinical isolates that lack the PBP2a gene and contain normal penicillin-binding proteins with modified penicillin-binding capacity. Antimicrob Agents Chemother. 1989; 33: Zhang K, McClure JA, Elsayed S, Conly JM. Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillinresistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53: Mombach Pinheiro Machado AB, Reiter KC, Paiva RM, Barth AL. Distribution of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) types I, II, III and IV in coagulase-negative staphylococci from patients attending a tertiary hospital in southern Brazil. J Med Microbiol. 2007; 56:

102 28. International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette 82 Chromosome Elements (IWG-SCC). Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec): Guidelines for Reporting Novel SCCmec Elements. Antimicrob. Agents Chemother. 2009; Hiramatsu K, Chui L, Kuroda M, Ito T. The emergence and evolution of methicilin resistant Staphylococcus aureus. Trends Microbiol. 2001; 9: McCulloch JA (2006). Avaliação da funcionalidade do locus acessory gene regulator (agr) em cepas de Staphylococcus aureus brasileiras com suscetibilidade reduzida aos glicopeptídeos. Faculdade de Ciências Farmacêuticas, São Paulo. 31. Ito T, Okuma K, Ma XX, Yuzawa H, Hiramatsu K. Insights on antibiotic resistance of Staphylococcus aureus from its whole genome: genomic island SCC. Drug Resist Updat. 2003; 6: Ito T, Ma XX, Takeuchi F, Okuma K, Yuzawa H, Hiramatsu K. Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase, ccrc. Antimicrob Agents Chemother. 2004; 48: Hanssen AM, Ericson Sollid JU. SCCmec in staphylococci: genes on the move. FEMS Immunol Med Microbiol (1): Ito T, Katayama Y, Asada K, Mori N, Tsutsumimoto K, Tiensasitorn C, Hiramatsu K. Structural comparison of three types of staphylococcal cassette chromosome mec integrated in the chromosome in methicillin- resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 2001; 45: Ma XX, Ito T, Tiensasitorn C, Jamklang M, Chongtrakool P, Boyle-vavra S, Daum RS, et al. Novel Type of Staphylococcal Cassette Chromosome mec

103 Identified in Community-Acquired Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus 83 Strains. Antimicrob Agents Chemother. 2002; 46: Shore A, Rossney AS, Keane CT, Enright MC, Coleman DC. Seven novel variants of the staphylococcal chromosomal cassette mec in methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from Ireland. Antimicrob Agents Chemother. 2005; 49: O'Brien FG, Zaini Z, Coombs GW, Pearson JC, Christiansen K, Grubb WB. Macrolide, lincosamide and streptogramin B resistance in a dominant clone of Australian community methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother. 2005; 56: Ho PL, Wang TK, Ching P, Mak GC, Lai E, Yam WC, Seto WH. Epidemiology and genetic diversity of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains in residential care homes for elderly persons in Hong Kong. Infect Control Hosp Epidemiol. 2007; 28: Oliveira DC, Milheiriço C, de Lencastre H. Redefining a structural variant of staphylococcal cassette chromosome mec, SCCmec type VI. Antimicrob Agents Chemother. 2006; 50: Higuchi W, Takano T, Teng LJ, Yamamoto T. Structure and specific detection of staphylococcal cassette chromosome mec type VII. Biochem Biophys Res Commun. 2008; 377: International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements (IWG-SCC). em

104 42. Tomasz A, Nachman S, Leaf H. Stable classes of Phenotipic expression in 84 methicilin resistant clinical isolates of Staphylococci. Antimicrob Agents Chemother. 1991; 35: CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI approved standard M100-S15. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA: Swenson JM, Tenover FC. Cefoxitin disk Study Group. Results of disk diffusion testing with cefoxitin correlate with presence of meca in Staphylococcus spp. J. Clin Microbiol 2005;43: Jain A, Agarwal A, Verma RK. Cefoxitin disc diffusion test for detection of meticillin-resistant staphylococci. J Med Microbiol. 2008; 57: Perazzi B, Rodrı M, Malimovka A, Garcı SD, Orgambide M, Vay CA. Accuracy of Cefoxitin Disk Testing for Characterization of Oxacillin Resistance Mediated by Penicillin-Binding Protein 2a in Coagulase-Negative Staphylococci. J Clin Microbiol. 2006; 44: John M, Burden J, Stuart JI, Reyes RC, Lannigan R, Milburn S, Diagre D, et al. Comparison of three phenotypic techniques for detection of methicillin resistance in Staphylococcus spp. reveals a species-dependent performance. J Antimicrob Chemoth. 2009; 63: Ferreira RBR, Iorio NLP, Malvar KL, Nunes APF, Fonseca LS, Bastos CCR, Santos RN. Coagulase-Negative Staphylococci: Comparison of Phenotypic and Genotypic Oxacillin Susceptibility Tests and Evaluation of the Agar Screening Test by Using Different Concentrations of Oxacillin. J. Clin. Microbiol. 2003; 41:

105 49. Perez LRR, Antunes LLS, Barth AL, D Azevedo PA. Variations of agar screen 85 tests for detection of methicillin resistance in staphylococci: focus on cefoxitin. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007; 26: Hederstierna-Johnsen T, Schønheyder HC, Paulsen K. Detection of methicillin resistance in coagulase-negative staphylococci by cefoxitin disc diffusion and oxacillin Etest. A study of consecutive bacteraemia isolates. APMIS. 2005; 113: Morbidity & Mortality Weekly Report. Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus- New York, MMWR.2004; 53: Palazzo IC, Araujo ML, Darini AL. First report of vancomycin-resistant staphylococci isolated from healthy carriers in Brazil. J Clin Microbiol. 2005; 43: Martinez P, Mattar S. Posible aislamiento clínico de Staphylococcus cohnii resistente a vancomicina. Infectio. 2006, 10(3) Olivares MF, Orozco RH, Gutierrez SH, Eseverri SH, Vidigal FFR, Marcos MR. Actividad de daptomicina, ciprofloxacino, clindamicina y cotrimoxazol frente a diferentes cepas de Staphylococcus coagulasa negativo con sensibilidad conservada y disminuida para vancomicina. Rev Esp Quimioter 2010; 23: D'mello D, Daley AJ, Rahman MS, Qu Y, Garland S, Pearce C, Deighton MA. Vancomycin heteroresistance in bloodstream isolates of Staphylococcus capitis. J Clin Microbiol. 2008; 46: Cremniter J, Slassi A, Quincampoix J C, Sivadon-Tardy V, Bauer T, Porcher R, Lortat-Jacob A, et al. Decreased susceptibility to teicoplanin and vancomycin in coagulase-negative Staphylococci isolated from orthopedic-device-associated infections. J Clin Microbiol. 2010; 48:

106 57. Nunes AP, Schuenck F, Callegario RP, Bastos C, Magnanini R. Heterogeneous 86 Resistance to Vancomycin and Teicoplanin Among Staphylococcus spp. Isolated from Bacteremia. Clin Infect Dis 2007; 11: Potoski BA, Adams J, Clarke L, Shutt K, Linden PK, Baxter C, Pasculle AW, Capitano B, Peleg AY, Szabo D, Paterson DL. Epidemiological profile of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci. Clin Infect Dis. 2006; 43: Stuart JI, John MA, Milburn S, Diagre D, Wilson B, Hussain Z. Susceptibility patterns of coagulase-negative staphylococci to several newer antimicrobial agents in comparison with vancomycin and oxacillin. Int J Antimicrob Agents, 2011; 37: Herschleb J, Ananiev G, Schwartz DC. Pulsed-field gel electrophoresis. Nat Protoc. 2007; 2: Schwartz DC, Cantor CR. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell. 1984; 37: Vindel A, Cuevas O, Cercenado E, Marcos C, Bautista V, Castellares C, Trincado P, Boquete T, Pérez-Vázquez M, Marín M, Bouza E. Methicillinresistant Staphylococcus aureus in Spain: molecular epidemiology and utility of different typing methods. J Clin Microbiol. 2009; 47: Kosowska-Shick, K, Julian K G, Mcghee P L, Appelbaum P C, Whitener C J. Molecular and epidemiologic characteristics of linezolid-resistant coagulasenegative staphylococci at a tertiary care hospital. Diag Microbiol Infect Dis. 2010; 68: Seybold U, Reichardt C, Halvosa J S, Blumberg H M. Clonal Diversity in Episodes with Multiple Coagulase-Negative Staphylococcus

107 Bloodstream Isolates Suggesting Frequent Contamination. Infection. 2009; 3: Casey A L, Worthington T, Lambert P A, Elliott T S. Evaluation of routine microbiological techniques for establishing the diagnosis of catheter-related bloodstream infection caused by coagulase-negative staphylococci. J. Med. Microbiol. 2007; 56: Aanensen DM, Spratt BG. The multilocus sequence typing network: mlst.net. Nucleic Acids Res ; 33: W Miragaia M, Thomas JC, Couto I, Enright MC, de Lencastre H. Inferring a population structure for Staphylococcus epidermidis from multilocus sequence typing data. J Bacteriol. 2007; 189: Malachowa N, Sabat A, Gniadkowski M, Krzyszton-Russjan J, Empel J, Miedzobrodzki J, Kosowska-Shick K, Appelbaum PC, Hryniewicz W. Comparison of multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis with pulsed-field gel electrophoresis, spa typing, and multilocus sequence typing for clonal characterization of Staphylococcus aureus isolates. J Clin Microbiol. 2005; 43: Baker JS. Comparison of various methods for differentiation of staphylococci and micrococci. J Clin Microbiol 1984; 19: Cunha MLRS, Sinzato YK, Silveira LV. Comparison of methods for the identification of coagulase-negative staphylococci. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2004; 99: Barry T, Colleran G, Glennon M, Dunican LK, Gannon F. The 16s/23s ribosomal spacer region as a target for DNA probes to identify eubacteria. PCR Methods Appl. 1991; 1:51-6.

108 71. Couto I, Pereira S, Miragaia M, Sanches IS, de Lencastre H. Identification of 88 clinical staphylococcal isolates from humans by internal transcribed spacer PCR. J Clin Microbiol 2001; 39: Murakami et al Murakami K, Minamide K, Wada K, Nakamura E, Teraoka, H, Watanabe S. Identification of methicillin-resistant strains of staphylococci by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 1991; 29: Oliveira DC, de Lencastre H. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob.Agents Chemother. 2002; 46: Mcdougal LK, Steward CD, Killgore GE, Chaitram JM, Mcallister SK, Tenover FC. Pulsed-Field Gel Electrophoresis Typing of Oxacillin-Resistant Staphylococcus aureus Isolates from the United States: Establishing a National Database. J Clin Microbiol. 2003; 41: Fletcher RH, Fletcher SW, Wagner EH, Diagnóstico. In: Fletcher, R.H., Fletcher, SW, Wagner, EH, eds., Epidemiologia Clínica, Porto Alegre: Artes Médicas, 3, 1991, p Zhanel GG, Adam HJ, Low DE, Blondeau J, Decorby M, Karlowsky JA, Weshnoweski B, Vashisht R, Wierzbowski A, Hoban DJ; Canadian Antimicrobial Resistance Alliance (CARA). Antimicrobial susceptibility of 15,644 pathogens from Canadian hospitals: results of the CANWARD study. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011; 69: Assis DB, Madalosso D, Ferreira SA, Yassuda YY. Análise dos dados do Sistema de Vigilância de Infecção Hospitalar do Estado de São Paulo Ano 2010

109 78. Koksal FA, Yasar H, Samasti M. Antibiotic resistance patterns of coagulase- 89 negative staphylococcus strains isolated from blood cultures of septicemic patients in Turkey. Microbiol Research. 2009; 164: Gatermann SG, Koschinski T, Friedrich S. Distribution and expression of macrolide resistance genes in coagulase-negative staphylococci. Clin Microbiol Infect. 2007; 13: Rigatti F, Tizotti MK, Hörner R, Domingues VO, Martini R, Mayer LE, Khun FT, et al. Bacteremias por Staphylococcus coagulase negativos oxacilina resistentes em um hospital escola na cidade de Santa Maria, Estado do Rio Grande do Sul Oxacillin-resistant coagulase-negative Staphylococci bacteremia at a teaching hospital. Rev Soc Bras Med Trop. 2010; 43: Bouchami O, Achour W, Mekni MA, Rolo J, Hassen AB. Antibiotic resistance and molecular characterization of clinical isolates of methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci isolated from bacteremic patients in oncohematology. Folia Microbiol. 2011; 56: McKinney TK, Sharma VK, Craig WA, Archer GL. Transcription of the gene mediating methicillin resistance in Staphylococcus aureus (meca) is corepressed but not coinduced by cognate meca and beta-lactamase regulators. J Bacteriol. 2001; 183: Perez LRR, d Azevedo PA. Evaluation of the accuracy of various phenotypic tests to detect oxacillin resistance in coagulase-negative staphylococci. Brazilian J Infect Dis. 2008; 12: Hung K, Yan J, Lu Y, Chen H. Evaluation of discrepancies between oxacillin and cefoxitin susceptibility in coagulase-negative staphylococci. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2011;

110 85. Shorman MA, Atoom AMNM, Abuharfeil NM ; Al-Majal AM. Identification of 90 Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Methicillin Resistant Coagulase-Negative Staphylococcus (CoNS) in Clinical Settings. American Journal of Infectious Diseases. 2008; 4: Tveten Y, Jenkins A, Digranes A, Melby KK, Allum AG, Kristiansen BE. Comparison of PCR detection of meca with agar dilution and E-test for clinical isolates of coagulase negative staphylococci. Clin Microbiol Infect. 2004; 10: Gherardi G, Florio LD, Lorino G, Fico L, Dicuonzo G. Macrolide resistance genotypes and phenotypes among erythromycin-resistant clinical isolates of Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci, FEMS Immunol Med Microbiol. 2009; Gatermann SG, Koschinski T, Friedrich S (2007) Distribution and expression of macrolide resistance in coagulase-negative staphylococci. Clin Microbiol Infect 13: Emaneini M, Taherikalani M, Eslampour M, Sedaghat H, Aligholi M, Jabalameli F, Shasavan S, et al. Phenotypic and Genotypic Evaluation of Aminoglycoside Resistance in Clinical Isolates of Staphylococci in Tehran, Iran. Microb Drug Resist. 2009; Giusti MD, Pacifico L, Panero A, Boccia A, Chiesa C. Phenotypic detection of nosocomial meca-positive coagulase-negative staphylococci from neonates.. J Antimicrob Chemother. 1999; Huebner J, Goldmann DA. Coagulase-negative staphylococci: role as pathogens. Annu Rev Med. 1999; 50:

111 92. Martins A, Cunha M de L. Methicillin resistance in Staphylococcus aureus and 91 coagulase-negative staphylococci: epidemiological and molecular aspects. Microbiol Immunol. 2007; 51: Valsesia G, Rossi M, Bertschy S, Pfyffer GE. Emergence of SCCmec Type IV and SCCmec Type V Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Containing the Panton-Valentine Leukocidin Genes in a Large Academic Teaching Hospital in Central Switzerland: External Invaders or Persisting Circulators? J Clin Microbiol. 2010; 48: Garza-González E, López D, Pezina C, Muruet W, Bocanegra-García V, Muñoz I, Ramírez C, et al. Diversity of staphylococcal cassette chromosome mec structures in coagulase-negative staphylococci and relationship to drug resistance. J Med Microbiol. 2010; 59: Potel C, Alvarez M, Alvarez P, Otero I, Fluiters E. Evolution, antimicrobial susceptibility, and assignment to international clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated over a 9-year period in two Spanish hospitals. Clin Microbiol Infect. 2007; 13: Schilling A, Neuner E, Rehm SJ. Vancomycin: A 50-something-year-old antibiotic we still don t understand. Clev Clin J Med, 2011; 78: Garrett DO, Jochimsen E, Murfitt K, Hill B, McAllister S, Nelson P, Spera RV, Sall RK, Tenover FC, Johnston J, Zimmer B, Jarvis WR. The emergence of decreased susceptibility to vancomycin in Staphylococcus epidermidis. Infect Control Hosp Epidemiol. 1999; 20: Center KJ, Reboli AC, Hubler R, Rodgers GL, Long SS. Decreased vancomycin susceptibility of coagulase-negative staphylococci in a neonatal intensive care

112 unit: evidence of spread of Staphylococcus warneri. J Clin Microbiol. 2003; 41: Reyna-Figueroa J, Ramírez-Landin A, Villeda-Gabriel G, Ortiz-Ibarra FJ. Staphylococcus haemolyticus with reduced susceptibility to vancomycin isolated from a patient with neonatal meningitis in a Mexican medical facility.gac Med Mex. 2007; 143: Cremniter J, Slassi A, Quincampoix JC, Sivadon-Tardy V, Bauer T, Porcher R, Lortat-Jacob A, et al. Decreased susceptibility to teicoplanin and vancomycin in coagulase-negative Staphylococci isolated from orthopedic-device-associated infections. J Clin Microbiol. 2010; 48: Muldrew KL, Tang Y, Li H, Stratton CW. Clonal Dissemination of Staphylococcus epidermidis in an Oncology Ward. J Clin Microbiol. 2008; 46: Klingenberg C, Ronnestad A, Anderson AS, et al. Persistent strains of coagulase-negative staphylococci in a neonatal intensive care unit: virulence factors and invasiveness. Clin Microbiol Infect. 2007; 13:

113 CapítuloII

114 94 Capítulo 2: Caracterização molecular de Staphylococcus aureus resistentes à oxacilina isolados em um hospital universitário brasileiro. Este capítulo foi escrito no formato de artigo científico, seguindo as normas da revista científica Chemotherapy. Caracterização molecular de Staphylococcus aureus resistentes à oxacilina isolados em um hospital universitário brasileiro. André Martins ab ; Danilo Flávio Moraes Ribolli a, Valéria Catanelli Pereira a, Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha a. a: Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, UNESP Universidade Estadual Paulista, São Paulo, Brasil b: Departamento de Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem, Faculdade de Medicina de Botucatu Endereço para correspondência: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha. Departamento de Microbiologia e Imunologia. Instituto de Biociências, UNESP Universidade Estadual Paulista. Caixa Postal 510, CEP , São Paulo, Brasil. Telefone: , Fax: cunhamlr@ibb.unesp.br

115 Resumo 95 Introdução: O gene meca é o principal mecanismo de resistência à oxacilina em Staphylococcus aureus. Está inserido dentro de um elemento genético móvel, conhecido como cassete cromossômico mec (SCCmec), sendo que cada tipo apresenta características epidemiológicas distintas, além de diferentes perfis de resistência a antimicrobianos. O objetivo deste trabalho foi realizar a tipagem do SCCmec em amostras de S. aureus e caracterizar o perfil clonal destas amostras. Materiais e métodos: um total de 46 amostras positivas para o gene meca isoladas entre 2002 e 2006 foram caracterizadas quanto à resistência a antimicrobianos pela técnica de E-test, tipagem do cassete SCCmec através da técnica de PCR multiplex e a determinação do perfil clonal pela técnica de Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Resultados: Quarenta e uma amostras (89,1%) foram tipadas como SCCmec III e cinco (10,9%) como SCCmec IV. Foram detectados quatro clones circulantes, um deles com amostras relacionadas ao clone epidêmico brasileiro (BEC), e detectado em todos os anos do estudo. Conclusões: detecção de uma maior quantidade de amostras SCCmec III, associadas a altos níveis de multirresistência, bem como a disseminação clonal de amostras MRSA pelas enfermarias do HCFMB-UNESP. Introdução Staphylococcus aureus é um dos principais patógenos humanos, está associado a inúmeros processos patológicos, como intoxicações alimentares, pneumonias, bacteremias, impetigo, foliculite e osteomielite (1). Atualmente, é responsável por uma grande parte das infecções encontradas em ambiente hospitalar. No Brasil, cerca de 20% das bacteremias são causadas por S. aureus (2). Do mesmo modo, taxas semelhantes são

116 96 descritas em vários países europeus, o que ressalta a importância de estudos que levem em consideração a ação deste micro-organismo como agente de infecção hospitalar (3,4). A oxacilina é utilizada como marcador de resistência em S. aureus, com cerca de 30 a 50% das amostras de S. aureus de origem hospitalar resistentes a esta droga, deixando poucas alternativas para o tratamento (5,6,7). O principal mecanismo de resistência à oxacilina é a presença do gene meca, contido no interior do cassete cromossômico mec (SCCmec), um elemento genético móvel que é composto por genes de incisão e excisão (complexo ccr), além de genes que conferem resistência a antimicrobianos e metais pesados (8). Atualmente, são conhecidos onze diferentes tipos de cassete SCCmec (9), que diferem entre si em relação ao número de genes que carregam, sua arquitetura gênica e podem estar associados a amostras de origem hospitalar ou comunitária, o que faz da tipagem de SCCmec uma importante ferramenta epidemiológica (10). Alguns destes tipos são carreadores de genes de resistência determinantes para múltiplos antibacterianos, além dos beta-lactâmicos, os macrolídeos, lincosaminas, estreptograminas, aminoglicosídeos e tetraciclina, desta forma, quando uma célula bacteriana adquire estes SCCmec de uma única vez adquire um fenótipo de múltipla-resistência (11). O antimicrobiano mais utilizado no tratamento de infecções por MRSA (Staphylococcus resistentes a Meticilina) é a vancomicina, contudo existem relatos de amostras apresentando resistência intermediária e resistência a esta, além do aumento de ECN com suscetibilidade diminuída a vancomicina. Devido às poucas opções terapêuticas para o tratamento de amostras MRSA e o surgimento de amostras MRSA resistentes a vancomicina, faz-se necessário estudos epidemiológicos para a melhor

117 97 caracterização destes micro-organismos em ambiente hospitalar e comunitário. Com o auxílio de técnicas de epidemiologia molecular foram identificados 05 grandes clones pandêmicos de amostras MRSA. O clone epidêmico brasileiro (BEC) é o mais frequente no Brasil, América do Sul e em alguns países europeus, como Portugal. Ele é responsável por 70% dos isolamentos de amostras MRSA em ambiente hospitalar (12). Em outros países, o clone brasileiro também está difundido, como no caso da República Tcheca e Índia (13,14). Cada um destes clones possui características próprias, como resistência a antimicrobianos e fatores de viruência. Uma vez que a resistência a oxacilina têm se tornado um grande problema no ambiente hospitalar, deixando poucas alternativas terapêuticas, e é conhecida a característica de disseminação clonal de amostras MRSA, com a presença de clones pandêmicos disseminados, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular de amostras MRSA isoladas no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu. Material e Métodos Amostras Foram estudadas 46 amostras de S.aureus positivas para o gene meca (MRSA) provenientes de hemoculturas de pacientes internados em diversas enfermarias do HC da FMB durante os anos de 2002 a 2006 O isolamento das linhagens foi realizado conforme as normas descritas por Koneman et al (15). Neste estudo, as amostras das enfermarias do HCFMB-UNESP foram agrupadas em complexos de acordo com as especialidades. As 31 enfermarias das quais foram isoladas as amostras para este estudo foram agrupadas em 07 complexos, descritos na tabela 1.

118 98 de E-test Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) às drogas pelo método A sensibilidade in vitro das amostras estudadas foi testada para as seguintes drogas: oxacilina, netilmicina, eritromicina, sulfametaxazol-trimetropim e vancomicina. Para tanto, foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) dessas drogas, por meio do E-test. Este procedimento é um método quantitativo, que utiliza tira de plástico inerte, transparente, medindo 60 mm de comprimento por 5,5 mm de largura, na qual é incorporado um gradiente de concentração estabilizado do antimicrobiano a ser pesquisado. Os parâmetros técnicos envolvidos na realização do E-test foram: meio de cultura de Mueller-Hinton, inóculo com concentração final semelhante à turvação correspondente a escala 0,5 de McFarland; incubação das placas em aerobiose a 35ºC; leitura pela verificação na escala da parte anterior da fita do valor correspondente à intersecção da zona de elipse de inibição do crescimento bacteriano. As drogas foram consideradas sensíveis e resistentes de acordo com os breakpoints (µg/ml) indicados pelo CLSI (16) Determinação do tipo de SCCmec para S. aureus A determinação do tipo de SCCmec foi realizada utilizando-se o método de reação de PCR Multiplex, conforme descrito por Milheiriço et al (17). Para a reação de amplificação foi utilizada a seguinte mistura: tampão de reação da taq 1x, 200 μm de cada dntp, 200 nm dos primers kdp F1 e kdp R1, 400 nm dos primers CIF2 F2, CIF2 R2, RIF5 F10, RIF5 R13, SCCmec III J1F, SCCmec III J1R, SCCmec V J1 F, and

119 99 SCCmec V J1 R, 800 nm dos primers meci P2, meci P3, dcs F2, dcs R1, meca P4, meca P7, ccrb2f2, ccrb2 R2, ccrc F2, and ccrc R2 1,25U de taq polimerase e 5 ng de DNA. A amplificação foi realizada em termociclador PTC-100 TM, que consistiu de quatro minutos a 94 o C, seguidos por 30 ciclos de 30 segundos a 94 o C, 30 segundos a 53 o C e um minuto a 72 o C. O programa finalizou com uma extensão adicional de quatro minutos a 72 C. A eficiência das amplificações foi monitorada pela eletroforese da reação em gel de agarose Ultrapure TM 2% preparado em tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 0,5X. Como padrão foi utilizado um marcador de peso molecular de 100 bp. O DNA foi corado com SYBR Safe e posteriormente fotografado sob transiluminação ultravioleta. Determinação do Perfil Clonal das amostras de S.aureus A tipagem das amostras de S. aureus por PFGE foi realizada segundo o protocolo modificado de McDougal et al (18). Do total de 46 amostras de S.aureus positivas para o gene meca, 23 foram selecionadas baseando-se no perfil de similaridade encontrado na técnica de determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) com a fita de E-test. As amostras foram separadas em grupos conforme os valores obtidos de CIM para todas os antimicrobianos testados e apenas 01 representante de cada grupo foi selecionado. Posteriormente, as amostras foram semeadas em caldo BHI e incubadas a 37 o C por 24h. Em um microtubo previamente pesado, 400µl da amostra foi centrifugada à rpm por 50s. Depois de desprezado o sobrenadante, o microtubo foi novamente pesado e adicionados 300l de solução TE (10 mm de Tris, 1mM EDTA [ph 8,0]) mais a diferença entre o peso final e inicial em ml. As amostras foram deixadas em banhomaria por 10min à 37 C. Após agitação em vórtex, foram adicionados 5l de lisostafina

120 100 (1mg/ml em 20mM de acetato de sódio [ph 4,5]) e 300l de agarose low melting. As amostras foram distribuídas nos moldes para plugues, e após solidificarem foram colocadas em placa de 24 poços com 2ml de solução EC (6mM Tris-HCl, 1M NaCl, 100mM EDTA, 0,5% Brij-58, 0,2% deoxicolato de sódio, 0,5% laurilsarcosil sódico) e incubadas à 37 C por pelo menos 4h. O EC foi retirado e os plugues lavados com 2ml de TE quatro vezes à temperatura ambiente por meia hora. Para a restrição do DNA genômico foi usada a enzima SmaI (Fast Digest SmaI, Fermentas Life Science, Canadá). A eletroforese foi execuada em aparelho CHEF-DR III System (BioRad Laboratories, EUA) em gel de agarose a 1% preparado com TBE 0,5M (Pulsed Field Certified Agarose, BioRad Laboratories, EUA) sob as seguintes condições: intervalos de tempo de pulso de 5 a 40s por 21h; em rampa linear; 6V/cm; ângulo de 120 ; 14 C; 0,5M TBE como tampão de corrida. Foi utilizado Lambda Ladder PFG Marker (New England BioLabs) como marcador molecular. Os géis foram corados com GelRed (10.000X em água, Biotium, EUA) por 1h, e fotografados sob transiluminação UV. Para análise de similaridade, cálculo dos coeficientes de correlação Dice e criação do dendograma pelo método UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic averages) foi utilizado o software BioNumerics (versão 6.1; Applied Maths, Bélgica). A tolerância da posição das bandas e a otimização foram ajustadas para 1.5 e 1% respectivamente. Um coeficiente de similaridade de 80% foi escolhido para determinação dos clusters.

121 Resultados 101 Determinação do tipo de SCCmec para S. aureus Do total de 46 amostras de S. aureus isoladas de hemoculturas e positivas para o gene meca isoladas no período de 2002 a 2006, a maior prevalência foi associada ao SCCmec III, com 41 amostras tipadas (89,1%), seguido por 05 amostras tipadas como SCCmec IV (10,9%). Das 41 amostras identificadas como SCCmec III, uma maior quantidade de amostras foi identificada no complexo de enfermarias Clínica Médica, com 14 amostras isoladas (Tabela 2). O SCCmec IV foi identificado em 02 amostras provenientes do complexo de enfermarias Pronto Socorro e 01 amostra cada isolada respectivamente dos complexos de Enfermarias Cirúrgicas, Clínica Médica e Unidades de Tratamento Intensivo (Tabela 2). Os níveis de resistência às drogas estudadas neste trabalho apresentaram diferenças conforme o tipo de SCCmec presente. Uma maior porcentagem de amostras resistentes a eritromicina, netilmicina e trimetoprim-sulfametoxazol foram associadas às amostras MRSA SCCmec III (Tabela 3). Houve uma associação entre multirresistência e a presença do cassete SCCmec III, com 38 amostras (92,7%) apresentando resistência a três das quatro drogas avaliadas. (Tabela 4). Do total de 05 amostras tipadas como SCCmec IV, 04 apresentaram sensibilidade a todas as drogas avaliadas e apenas 01 amostra foi resistente a eritromicina ( Tabela 4). Houve uma prevalência das amostras MRSA SCCmec III em todos os anos do estudo, contudo, as amostras SCCmec IV não foram detectadas apenas no ano de 2005 (Figura 1). Quando a sensibilidade à vancomicina foi separada por tipo de cassete SCCmec, as amostras tipadas como SCCmec IV apresentaram CIM 50% de 2 µg/ml e CIM 90% de 3 µg/ml, pouco superiores às amostras SCCmec III, que obtiveram CIM 50% de 1,5

122 102 µg/ml e CIM 90% de 2 µg/ml. Não houve diminuição da sensibilidade à vancomicina em amostras SCCmec III e IV durante os anos do estudo. As amostras SCCmec III apresentaram uma leve queda na CIM 50% à vancomicina do ano de 2002 para 2003, com um discreto aumento no ano de 2004, mantendo-se estável durante os anos de 2005 e 2006 (Figura 2). As amostras SCCmec IV apresentaram diminuição da CIM de 2002 para 2003, mantendo-se estável nos anos posteriores Determinação do Perfil Clonal das amostras de S.aureus Pela análise das amostras tipadas como SCCmec III, observa-se a presença de 04 clones, separados de acordo com o coeficiente de similaridade > ou + a 80%, sendo identificados com uma letra. Houve um predomínio do clone A, com um total de 05 amostras incluídas. Quando analisadas todas as amostras, um total de 16 amostras de S.aureus são incluídas neste clone, isoladas dos complexos de Clínica Médica, Cirurgia, Pronto Socorro e Outras Enfermarias (Tabela 5 e Figura 3). Houve um maior predomínio das amostras deste clone nos complexos de Cirurgia e Outras Enfermarias. A cepa padrão HU 25 CEB, pertencente ao clone brasileiro de circulação pandêmica (BEC) também está presente no clone A, desta forma, sugerindo uma relação entre estas amostras e o clone epidêmico brasileiro. Houve a presença de amostras isoladas nos anos de 2002 a 2006 neste clone (Figura 3). O clone identificado como B apresentou 02 amostras isoladas dos complexos de Clínica Médica e Pronto Socorro provenientes dos anos de 2002 e 2004 (Tabela 5 e Figura 3). O clone C apresentou 03 amostras incluídas pela técnica de PFGE (Figura 3). Quando analisado o perfil de CIM pela técnica de E-test, um total de 06 amostras foram incluídas neste clone, provenientes dos anos de 2002, 2004, 2005 e 2006 e isoladas nos complexos de Unidades de

123 103 Tratamento Intensivo, Pronto Socorro e Outras Enfermarias, com maior prevalência nos complexos de Clínica Médica e Pronto Socorro (Tabela 5 e Figura 3). O clone D apresentou apenas 02 amostras isoladas no ano de 2006 nos complexos de Clínica Médica e Outras Enfermarias (Tabela 5 e Figura 3). As amostras com perfil policlonal totalizaram 20 amostras. As amostras tipadas como SCCmec IV apresentaram baixa clonalidade, com agrupamento de apenas duas amostras isoladas nos anos de 2002 e 2004 e provenientes dos complexos de Clínica Médica e Unidades de Tratamento Intensivo. Discussão Neste trabalho, houve um predomínio do cassete SCCmec III em S.aureus, o que indica a origem hospitalar destas amostras, fato que ressalta a importância de uma antibioticoterapia adequada, uma vez que é sabido a associação entre amostras de Staphylococcus spp. de origem hospitalar e multirresistência. A eritromicina foi a droga que apresentou maiores níveis de resistência em amostras MRSA SCCmec III, seguido pelo trimetoprim-sulfametoxazol. Houve uma forte associação entre amostras SCCmec III e multirresistência, o que pode ser explicado pela origem hospitalar destas amostras. A droga de escolha no tratamento de infecções por MRSA e S.aureus multirresistentes é a vancomicina, contudo, existem relatos de amostras resistentes à vancomicina ou com suscetibilidade intermediária, bem como trabalhos descrevendo a diminuição da suscetibilidade desta droga em ambiente hospitalar. (19,20). A diminuição da sensibilidade à vancomicina não foi detectada neste trabalho, com as CIM 50% e 90% de amostras MRSA SCCmec III se apresentando estáveis no decorrer dos anos deste

124 104 estudo. Contudo, existem relatos de associação entre o SCCmec III e a presença de amostras com suscetibilidade intermediária a vancomicina (21). Com relação à evolução da prevalência dos tipos de cassete SCCmec em amostras MRSA no período estudado, percebe-se um aumento do número de amostras SCCmec III nos anos de 2002 a 2005, seguido por uma queda no ano de As amostras tipadas como SCCmec IV apresentaram uma prevalência baixa e estável nos anos de 2002 a 2004, sendo novamente detectadas apenas no ano de Devido ao aumento do número de amostras de Staphylococcus spp. resistentes à oxacilina e o surgimento de amostras heterorresistentes e resistentes à vancomicina, fazse necessário estudar a disseminação destas amostras no ambiente hospitalar. Para estudos deste tipo, a técnica de PFGE é empregada com grande êxito. Neste trabalho, um total de 23 amostras de S.aureus foram tipadas utilizando-se esta técnica. Assim, observou-se a presença de quatro clones, com circulação de amostras entre diferentes enfermarias e prevalência durante os anos. O clone identificado com a letra A apresentou o maior número de amostras SCCmec III, sendo isoladas nos anos de 2002 a 2006 e provenientes dos complexos de enfermarias de Cirurgia, Clínica Médica, Outras Enfermarias Pronto Socorro e Unidades de Tratamento Intensivo. A cepa HU 25, pertencente ao BEC mostrou uma similaridade acima de 80% com esse clone, desta forma, todas as amostras pertencentes ao clone A são relacionadas ao BEC. O clone brasileiro é predominante em hospitais de todas as regiões do Brasil, América do Sul e em alguns países europeus, como Portugal, sendo responsáveis por 70% dos isolamentos de amostras MRSA em ambiente hospitalar (12). Alta prevalência de amostras similares ao BEC foram detectadas em um hospital da região Nordeste do Brasil (22). Em outros países, o clone brasileiro também está difundido, como no caso

125 105 da República Tcheca, onde nos anos de , o isolamento deste representou 80% das amostras MRSA encontradas (13). O clone brasileiro foi descrito também na Índia, em dois hospitais na região de Bengalore, juntamente com o clone húngaro, que também possui o cassete SCCmec III (14). Neste trabalho, as amostras pertencentes ao clone A foram identificadas em todos os anos do estudo, o que pode ser explicado pela predominância deste clone desde a década de 90 em diversos hospitais brasileiros (13,23) As amostras caracterizadas como SCCmec IV apresentaram perfil policlonal, contudo, a técnica de PFGE permitiu a identificação de um clone que se disseminou nos anos de 2002 e 2004, com amostras isoladas nas enfermarias de Cardiologia e Unidade de Tratamento Intensivo. Este clone não apresentou similaridade com as cepas USA 800 e HAR 24, pertencente ao clone pediátrico e ao clone EMRSA-15 respectivamente, que são caracterizados pela presença do cassete SCCmec IV. Embora neste estudo não tenha sido encontrado uma predominância de amostras SCCmec IV, existem relatos da substituição do BEC pelo clone EMRSA-15 em Portugal (24). Alto percentual de amostras MRSA SCCmec IV (46%) foi descrito em um hospital universitário suíço, com o predomínio de quatro clones majoritários, o que pode ser explicado pela substituição na transmissão nosocomial de clones hospitalares por pediátricos ou na maciça prevalência de amostras de origem comunitária (25). No Brasil, foi descrito o isolamento de 03 amostras geneticamente relacionadas com o clone USA 800 em hospital da região nordeste brasileira, o que pode indicar a entrada deste clone de origem comunitária no ambiente hospitalar. (22). Os resultados obtidos neste trabalho confirmam a importância da caracterização epidemiológica de amostras MRSA, uma vez que altos níveis de multirresistência

126 106 associado a amostras de origem hospitalar foram encontrados, bem como a disseminação clonal de amostras MRSA pelas enfermarias do HCFMB-UNESP. Referências 1. Kloos WE, Bannerman TL Staphylococcus and Micrococcus. In Murray PR, Baron Ej, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH. Manual of Clinical Microbiology, Washington DC, ASM press, 1995, p Gales AC, Sader HS, Ribeiro J, Zoccoli C, Barth A, Pignatari AC. Antimicrobial Susceptibility of Gram-Positive Bacteria Isolated in Brazilian Hospitals Participating in the SENTRY Program ( ). Clin Infect Dis 2009; 13: Johnson AP. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: the European landscape. J Antimicrob Chemother May;66 Suppl 4:iv43-iv48 4. Goosens H. European Status of Resistance in Nosocomial Infections. Chemotherapy 2005; 51: Vindel A, Cuevas O, Cercenado E, Marcos C, Bautista V, Castellares C, Trincado P, Boquete T, Pérez-Vázquez M, Marín M, Bouza E. Methicillinresistant Staphylococcus aureus in Spain: molecular epidemiology and utility of different typing methods. J Clin Microbiol. 2009; 47: Martins A, Pereira VC, Cunha Mde L. Oxacillin resistance of Staphylococcus aureus isolated from the university hospital of Botucatu Medical School in Brazil. Chemotherapy 2010; 56: Zhanel GG, Adam HJ, Low DE, Blondeau J, Decorby M, Karlowsky JA, Weshnoweski B, Vashisht R, Wierzbowski A, Hoban DJ; Canadian

127 107 Antimicrobial Resistance Alliance (CARA). Antimicrobial susceptibility of 15,644 pathogens from Canadian hospitals: results of the CANWARD study. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011; 69: Martins A, Cunha M de L. Methicillin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci: epidemiological and molecular aspects. Microbiol Immunol. 2007; 51: International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements (IWG-SCC). Accessado em Mombach Pinheiro Machado AB, Reiter KC, Paiva RM, Barth AL. Distribution of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) types I, II, III and IV in coagulase-negative staphylococci from patients attending a tertiary hospital in southern Brazil. J Med Microbiol. 2007; 56: Ito T, Okuma K, Ma XX, Yuzawa H, Hiramatsu K. Insights on antibiotic resistance of Staphylococcus aureus from its whole genome: genomic island SCC. Drug Resist Updat. 2003; 6: Oliveira DC, Tomasz A, de Lencastre H. Secrets of success of a human pathogen: molecular evolution of pandemic clones of meticillin- resistant Staphylococcus aureus.lancet Infect Dis. 2002; 2: Melter O, Aires de Sousa M, Urbaskova P, et al. Update on the major clonal types of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the Czech Republic. J Clin Microbiol 2003; 41: Arakere G, Nadig S, Swedberg G, Macaden R, Amarnath SK, Raghunath D. Genotyping of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains from two hospitals in Bangalore, South India. J Clin Microbiol. 2005; 43:

128 15. Koneman EW; Winn WC. Diagnóstico Microbiológico: texto e atlas colorido. 108 Rio de Janeiro, Ed Guanabara-Koogan, ª Ed 1760p. 16. CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI approved standard M100-S15. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA: Milheiriço C, Oliveira DC, de Lencastre H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 2007; 51: Mcdougal LK, Steward CD, Killgore GE, Chaitram JM, Mcallister SK, Tenover FC. Pulsed-Field Gel Electrophoresis Typing of Oxacillin-Resistant Staphylococcus aureus Isolates from the United States: Establishing a National Database. J Clin Microbiol. 2003; 41: Steinkraus G, White R, Friedrich L. Vancomycin MIC creep in nonvancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (VISA), vancomycinsusceptible clinical methicillin-resistant S. aureus (MRSA) blood isolates from J Antimicrob Chemother. 2007; 60: Dhawan B, Gadepalli R, Rao C, Kapil A, Sreenivas V. Decreased susceptibility to vancomycin in meticillin-resistant Staphylococcus aureus: a 5 year study in an Indian tertiary hospital.j Med Microbiol. 2010; 59: Hsueh PR, Lee SY, Perng CL, Chang TY, Lu JJ.Clonal dissemination of meticillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in a Taiwanese hospital. Int J Antimicrob Agents. 2010; 36: Sousa-Junior FC, Silva-Carvalho MC, Fernandes MJ, Vieira MF, Pellegrino FL, Figueiredo AM, de Melo MC, Milan EP. Genotyping of methicillin-resistant

129 109 Staphylococcus aureus isolates obtained in the Northeast region of Brazil. Braz J Med Biol Res. 2009; 42: Reinert C, Mcculloch JA, Watanabe S, Ito T, Hiramatsu K, Mamizuka EM. Type IV SCCmec Found in Decade Old Brazilian MRSA Isolates. Emerging Infect Dis. 2008; 12: Amorim ML, Faria NA, Oliveira DC, Vasconcelos C, Cabeda JC, Mendes AC, Calado E, Castro AP, Ramos MH, Amorim JM, de Lencastre H.. Changes in the clonal nature and antibiotic resistance profiles of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates associated with spread of the EMRSA-15 clone in a tertiary care Portuguese hospital. J. Clin.Microbiol. 2007, 45: Valsesia G, Rossi M, Bertschy S, Pfyffer GE. Emergence of SCCmec Type IV and SCCmec Type V Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Containing the Panton-Valentine Leukocidin Genes in a Large Academic Teaching Hospital in Central Switzerland: External Invaders or Persisting Circulators? J Clin Microbiol. 2010; 48:720-7.

130 110 Tabela 1. Distribuição por especialidades das enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP incluídas neste estudo. Complexos de Enfermarias Enfermarias Cirúrgicas Clínica Médica Pronto Socorro Enfermarias Pediátricas Ginecologia e Obstetrícia Unidade de Tratamento Intensivo Outras Enfermarias Enfermarias Cirurgia Cirugia Cardíaca Cirugia Torácica Gastrocirugia Ortopedia Urologia Dermatologia Gastroclínica Clínica Médica Centro de Terapia Intensiva Cardiologia, Cardioclínica Hematologia Pneumologia Pronto Socorro Pronto Socorro - Unidade de Tratamento Intensivo Berçário Pediatria Unidade de Tratamento Intensivo Pediatrica Unidade de Tratamento Intensivo Neonatal Ginecologia Obstetrìcia Unidade de Tratamento Intensivo Unidade de Tratamento Intensivo Central Unidade de Tratamento Intensivo Coronariana Quimioterapia Oncologia Moléstias Infecciosas e Parasitárias Neurologia Diálise

131 111 Tabela 2. Distribuição dos tipos de SCCmec em S. aureus entre os complexos de enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP. SCCmec III SCCmec IV Total Complexo de Enfermarias (N) % (N) % (N) % Enfermarias Cirúrgicas 8 88,9 1 11, Clínica Médica 14 93,3 1 6, Pronto Socorro 7 77,8 2 22, Enfermarias Pediátricas Unidades de Tratamento Intensivo 2 66,6 1 33, Outras Enfermarias SCCmec: cassete cromossômico mec N: número de amostras Tabela 3. Associação entre tipo de cassete cromossômico mec e resistência aos antimicrobianos estudados. SCCmec III SCCmec IV Total Droga N=41 % N=5 % N % Eritromicina 40 97, Netilmicina 38 92, Trimetoprim- Sulfametoxazol 39 95, Vancomicina Tabela 4. Relação entre multirresistência e tipo de cassete SCCmec. Nº de resistências SCCmec III SCCmec IV N % N % 0R 01 2, R 01 2, R 01 2, R 38 92,7 0 0 Total SCCmec: cassete cromossômico MEC N: tamanho amostral

132 112 Tabela 5. Distribuição dos clones de amostras de MRSA com SCCmec III por complexos de enfermarias. Cirurgia Clínica Médica Complexos de Enfermarias Outras Enfermarias Pronto Socorro UTIs N % N % N % N % N % 10 Clone A , Clone B , Clone C ,6 1 12, Clone D ,3 1 12, Total UTIs: Unidades de Tratamento Intensivo Figura 1. Distribuição dos tipos de cassete SCCmec em amostras de S.aureus nos anos de 2002 a 2006 no HCFMB-UNESP.

133 113 Figura 2. Evolução da CIM 50% e 90% à vancomicina nos anos de 2002 a 2006 em amostras MRSA SCCmec III. A. Evolução da CIM 50% à vancomicina. B. Evolução da CIM 90% à vancomicina

134 114 Figura 3. Dendograma de amostras de S. aureus SCCmec tipo III analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%).

135 Molecular characterization of oxacillin-resistant Staphylococcus aureus 115 isolated from a Brazilian university hospital André Martins ab ; Danilo Flávio Moraes Ribolli a, Valéria Catanelli Pereira a, Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha a. a: Department of Microbiology and Immunology, Biosciences Institute, UNESP Univ Estadual Paulista, São Paulo, Brazil. b: Department of Tropical Diseases and Imaging Diagnosis, Botucatu School of Medicine, UNESP Univ Estadual Paulista, São Paulo, Brazil. Corresponding address: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha. Departamento de Microbiologia e Imunologia. Instituto de Biociências, UNESP Universidade Estadual Paulista. Caixa Postal 510, CEP , São Paulo, Brasil. Telephone: Fax: cunhamlr@ibb.unesp.br Abstract Introduction: The meca gene is the main oxacillin-resistance mechanism in Staphylococcus aureus. It is inserted into a movable genetic element known as cassette chromosome mec (SCCmec), and each type represents different epidemiological characteristics, in addition to different antimicrobial resistance profiles. This study aimed at typing SCCmec in S. aureus samples and at characterizing the clonal profile of such samples. Materials and methods: a total number of 46 positive samples for the

136 116 meca gene isolated from 2002 to 2006 were characterized for antimicrobial resistance by the E-test method, SCCmec typing by the multiplex PCR method and clonal profile determination by the Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) method. Results: Fortyone samples (89.1%) were typed as SCCmec III, and five (10.9%) as SCCmec IV. Four circulating clones were detected, one of them with samples related to the Brazilian epidemic clone (BEC), and detected in all studied years. Conclusions: A larger number of SCCmec III was detected. They were associated with high multi-resistance levels as well as with the clonal dissemination of MRSA samples in the wards of the Botucatu School of Medicine University Hospital (HCFMB) - UNESP. Introduction Staphylococcus aureus is one the main human pathogens. It is associated with numerous pathological processes, such as food poisoning, pneumonia, bacteremia, impetigo, folliculitis and osteomyelitis (1). Presently, it is largely responsible for infections found in hospitals. In Brazil, approximately 20% of bacteremias are caused by S. aureus (2). Similar rates are described for several European countries, which points out the importance of studies on the action of such microorganism as a nosocomial infection agent (3,4). Oxacillin is used as a resistance marker in S. aureus, and approximately 30 to 50% of hospital S. aureus isolates are oxacillin resistant, which leaves few treatment alternatives (5,6,7). The main oxacillin-resistance mechanism is the presence of the meca gene, which is contained in a cassette chromosome mec (SCCmec), a movable genetic element that consists of incision and excision genes (ccr complex), in addition to genes

137 117 that provide resistance to antimicrobials and heavy metals (8). Presently, eleven different SCCmec types are known (9). They differ from each other in relation to the number of genes that they carry and their gene architecture. Also, they may be associated with hospital or community samples, which makes SCCmec typing an important epidemiological tool (10). Some of these types carry resistance genes that are determinant for multiple antibacterials, in addition to beta-lactams, macrolides, lincosamines, streptogramins, aminoglycosides and tetracycline. Hence, when a bacterial cell acquires such SCCmec, it, at once, acquires a multiple-resistance phenotype (11). The antimicrobial most frequently used for treating MRSA (methicillin-resistant staphylococcus) infections is vancomycin; however, samples presenting resistance and intermediate resistance to vancomycin have been reported in addition to an increased number of CNS with decreased susceptibility to it. Due to the few therapeutic options for treating vancomycin-resistant MRSA samples, epidemiological studies are necessary in order to better characterize these microorganisms in hospital and community environments. Five large pandemic clones of MRSA samples have been identified by means of epidemiological techniques. The Brazilian epidemic clone (BEC) is the most frequent in Brazil, South America and some European countries, such as Portugal. It is responsible for 70% of the MRSA sample isolates in hospitals (12). The Brazilian clone has also disseminated in other countries, such as the Czech Republic and India (13,14). Each one of these clones has its own characteristics, such as antimicrobial resistance and virulence factors. Since oxacillin resistance has become a large problem in hospitals, thus leaving few therapeutic alternatives, and considering that the clonal dissemination characteristic of MRSA samples is known through the presence of disseminated pandemic clones, this

138 118 study aimed at preforming the molecular characterization of MRSA samples isolated from the Botucatu School of Medicine University Hospital Material and Methods Samples Forty-six samples of S.aureus from blood cultures of patients hospitalized at different wards of HCFMB UNESP from 2002 to 2006 and positive for the meca gene (MRSA) were studied. Lineage isolation was performed according to the standards described by Koneman et al (15). In this study, the samples from the HCFMB-UNESP wards were grouped in complexes according to specialties. The 31 wards from which the samples were isolated for this study were grouped into 07 complexes and described in table 1. Determination of Minimal Inhibitory Concentration (MIC) to drugs by the E-test The samples in-vitro sensitivity was tested for the following drugs: oxacillin, netilmicin, erythromycin, sulfamethoxazole-trimethoprim and vancomycin. To that end, the minimal inhibitory concentration (MIC) to these drugs was determined by the E-test. Such procedure is a quantitative method that uses an inert, transparent plastic band measuring 60 mm in length and 5.5 mm in width, to which a stabilized concentration of the antimicrobial to be studied is incorporated. The technical parameters involved in the performance of the E-test were: Mueller-Hinton culture medium, inoculum with final concentration similar to the turbidity corresponding to McFarland s 0.5 scale; aerobiosis plates at 35ºC; reading by evaluating the scale on the anterior part of the tape corresponding to the intersection of the bacterial growth inhibition ellipsis zone. The

139 119 drugs were considered to be sensitive and resistant according to the breakpoints (µg/ml) indicated by CLSI (16). Determination of the SCCmec type for S. aureus SCCmec type was determined by using the Multiplex PCR method as described by Milheiriço et al (17). For amplified reaction, the following mixture was used: taq reaction buffer 1x, 200 μm of each dntp, 200 nm of primers kdp F1 and kdp R1, 400 nm of primers CIF2 F2, CIF2 R2, RIF5 F10, RIF5 R13, SCCmec III J1F, SCCmec III J1R, SCCmec V J1 F, and SCCmec V J1 R, 800 nm of primers meci P2, meci P3, dcs F2, dcs R1, meca P4, meca P7, ccrb2f2, ccrb2 R2, ccrc F2, and ccrc R2 1,25U of taq polymerase and 5 ng of DNA. Amplification was performed by a PTC-100 TM thermal cycler and consisted of four minutes at 94 o C, followed by second cycles at 94 o C, 30 seconds at 53 o C and one minute at 72 o C. The program was completed with an additional extension of four minutes at 72 C. The efficiency of amplifications was monitored by electrophoresis of the reaction in 2% Ultrapure TM agarose gel prepared in 0.5X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer. A marker with molecular weight of 100bp was used as a standard. DNA was stained by SYBR Safe and later photographed under ultraviolet transllumination. Determination of the Clonal Profile of S.aureus samples Typing of S. aureus samples by PFGE was performed according to the modified protocol by McDougal et al (18). Of the total 46 S.aureus samples positive for the meca gene, 23 were selected based on the similarity profile found in the technique for

140 120 Minimal Inhibitory Concentration (MIC) determination with an E-test strip. The samples were separated into groups according to the MIC values obtained for all the antimicrobials tested and only one representative of each group was selected. Later, the samples were seeded in BHI broth and incubated at 37 o C for 24h. 400µl of the sample was centrifuged in a previously weighed microtube at 12,000 rpm for 50s. After discarding the supernatant, the microtube was again weighed, and 300l of TE solution (10 mm of Tris, 1mM EDTA [ph 8.0]) plus the difference between final weight and initial weight in ml were added. The samples were left in a water bath for 10min at 37 C. After vortex agitation, 5l of lysostaphin (1mg/ml in 20mM of sodium acetate [ph 4.5]) and 300l low-melting agarose were added. The samples were distributed in plug casts, and after solidifying, they were placed on 24-well plates with 2ml of EC solution (6mM Tris-HCl, 1M NaCl, 100mM EDTA, 0.5% Brij-58, 0.2% sodium deoxycholate, 0.5% sodium laurilsarkosyl) and incubated at 37 C for at least 4h. EC Was removed and the plugs were washed with 2ml of TE four times at ambient temperature for half an hour. Enzyme SmaI (Fast Digest SmaI, Fermentas Life Science, Canada) was used for genomic DNA restriction. Electrophoresis was performed by equipment CHEF-DR III System (BioRad Laboratories, EUA) in 1% agarose gel prepared with 0.5M TBE (Pulsed Field Certified Agarose, BioRad Laboratories, USA) under the following conditions: pulse time interval from 5 to 40s for 21h; on a linear ramp; 6V/cm; 120 angle; 14 C; 0.5M TBE as the running buffer. Lambda Ladder PFG Marker (New England BioLabs) was used as a molecular marker. Gels were stained by GelRed (10,000X in water, Biotium, USA) for 1h, and photographed under UV transllumination UV. For similarity analysis, estimation of the Dice correlation coefficient and dendogram creation by the UPGMA method (unweighted pair group method using

141 121 arithmetic averages), the BioNumerics software (version 6.1; Applied Maths, Belgium) was used. The tolerance of band position and optimization were adjusted tor 1.5 and 1%, respectively. A similarity coefficient of 80% was chosen for cluster determination. Results Determination of SCCmec type for S. aureus Of the total of 46 S. aureus samples and positive for the meca gene isolated from blood cultures from 2002 to 2006, the highest prevalence was associated with SCCmec III, with 41 typed samples (89.1%), followed by 05 samples typed as SCCmec IV (10.9%). Of the 41 samples identified as SCCmec III, a larger number of samples were identified in the complex of Internal Medicine wards, with 14 isolated samples (Table 2). SCCmec was identified in 02 samples from the complex of Emergency wards and 01 sample each was respectively isolated from the complexes of Surgery, Internal Medicine and Intensive Care Unit wards (Table 2). The levels of resistance to the drugs evaluated in this study showed differences according to the SCCmec type present. A higher percentage of resistant samples to erythromycin, netilmicin and trimethoprim-sulfamethoxazole were associated with the MRSA SCCmec III samples (Table 3). There was association between multi-resistance and the presence of the SCCmec III cassette, with 38 samples (92.7%) showing resistance to three of the four evaluated drugs (Table 4). Of the total of 05 samples typed as SCCmec IV, 04 showed sensitivity to the evaluated drugs, and only 01 sample was erythromycin resistant (Table 4). There was prevalence of MRSA SCCmec III samples in all studied years; however, SCCmec IV samples were not detected only in 2005 (Figure 1).

142 122 As regards sensitivity to vancomycin, it was separated by SCCmec cassette type. The samples typed as SCCmec IV showed 50% MIC of 2 µg/ml and 90% MIC of 3 µg/ml, which were higher than those of SCCmec III samples, as they showed 50% MIC of 1.5 µg/ml and 90% MIC of 2 µg/ml. There was no decrease in vancomycin sensitivity in SCCmec III and IV samples in the studied years. SCCmec III samples showed a slight reduction in 50% MIC to vancomycin in 2002 to 2003, with a slight increase in 2004, and remained stable in 2005 and 2006 (Figure 2). The SCCmec IV samples showed MIC decrease from 2002 to 2003 and remained stable in the later years. Determination of the Clonal Profile of S.aureus samples From the analysis of the samples typed as SCCmec III, the presence of 04 clones was observed. They were separated according to the similarity coefficient > or + to 80%, identified with a letter. There was predominance of clone A, with a total of 05 samples included. When all the samples were analyzed, a total number of 16 S.aureus samples were included in this clone, isolated from the Internal Medicine, Surgery, Emergency complexes and Other Wards (Table 5 and Figure 3). There was greater predominance of samples of this clone in the Surgery and Other Wards complexes. The standard strain HU 25 CEB, belonging to the Brazilian clone of pandemic circulation (BEC) was also present in clone A, thus suggesting a relation between these samples and the epidemic Brazilian clone. Samples isolated from 2002 to 2006 were present in this clone (Figure 3). The clone identified as B showed 02 samples isolated from the Internal Medicine and Emergency complexes from 2002 and 2004 (Table 5 and Figure 3). Clone C showed 03 samples included by the PFGE technique (Figure 3). When the MIC profile was analyzed by the E-test method, a total of 06 samples were

143 123 included in this clone from 2002, 2004, 2005 and 2006 and isolated in the Intensive care Unit, Emergency and Other Wards complexes, with higher prevalence in the Internal medicine and Emergency complexes (Table 5 and Figure 3). Clone D showed only 02 samples isolated in 2006 in the Internal medicine and Other Wards complexes (Table 5 and Figure 3). The samples with a polyclonal profile totaled 20 samples. The samples typed as SCCmec IV showed low clonality, with the grouping of only two samples isolated in 2002 and 2004 from the Internal Medicine and Intensive Care Units complexes. Discussion In this study, there was predominance of the SCCmec III cassette in S.aureus, which shows the hospital origin of these samples, a fact that emphasizes the importance of appropriate antibiotic therapy once the association between Staphylococcus spp. samples of hospital origin and multi-resistance is known. Erythromycin was the drug that showed the highest resistance levels in MRSA SCCmec III samples, followed by sulfamethoxazole-trimethoprim. There was strong association between SCCmec III samples and multi-resistance, which can be explained by the hospital origin of such samples. The drug of choice in the treatment of infections with multi-resistant MRSA and S.aureus is vancomycin; however, vancomycin-resistant samples or those with intermediate susceptibility have been reported. There are also studies describing this drug s decreased susceptibility in hospitals (19,20). Reduced vancomycin sensitivity was not observed in this study with 50% and 90% MIC of MRSA SCCmec III samples showing to be stable during the studied years. However, the association between

144 124 SCCmec III and the presence of samples with intermediate vancomycin resistance has been reported (21). As regards the evolution of the prevalence of SCCmec cassette types in MRSA samples in the studied period, an increase in the number of it SCCmec III was observed from 2002 to 2005, which was followed by a decrease in The samples typed as SCCmec IV showed low and stable prevalence from 2002 to 2004, and they were again detected only in Due to the increase in the number of oxacillin-resistant Staphylococcus spp. samples and the emergence of and heteroresistant vancomycin-resistant samples, it is necessary to study the dissemination of such samples in hospitals. For this type of study, the PFGE method is successfully used. In this study, a total number of 23 S.aureus samples were typed by using that method. Hence, the presence of four clones was observed, with the circulation of samples in various wards and prevalence during the studied years. The clone identified with letter A showed the largest number of SCCmec III samples, which were isolated from 2002 to 2006 from the following wards complexes: Surgery, Internal Medicine, Other Wards, Emergency and Intensive Care Units. The HU 25 strain, which belongs to BEC, showed similarity of over 80% to that clone. Hence, all the samples belonging to clone A are BEC-related. The Brazilian clone is predominant in hospitals in all Brazilian regions, South America and Some European countries, such as Portugal, which are responsible for 70% of the isolation of MRSA samples from hospitals (12). A high prevalence of BEC-like samples was detected in a hospital in the Northeastern region of Brazil (22). The Brazilian clone is also disseminated in other countries, such as the Czech Republic, where its isolation represented 80% of the MRSA samples found from

145 to 1997 (13). The Brazilian clone was also described in India, in two hospitals in the Bengalore region, conjointly with the Hungarian clone, which also has the SCCmec III cassette (14). In this study, the samples belonging to clone A were identified in all studied years, which can be explained by that clone s predominance since the 1990s in various Brazilian hospitals (22,23) The samples characterized as SCCmec IV showed a polyclonal profile; however, the PFGE method enabled the identification of a clone that disseminated in 2002 and 2004, with samples isolated from the Cardiology and Intensive Care wards. This clone did not show similarity to strains USA 800 or HAR 24, belonging to the pediatric clone and the EMRSA-15 clone, respectively, which are characterized by the presence of the SCCmec IV cassette. Although a predominance of SCCmec IV samples was not found in this study, the replacement of BEC by the EMRSA-15 in Portugal has been reported (24). A high percentage of MRSA SCCmec IV samples (46%) was described in a Swiss university hospital, with the predominance of four major clones, which can be explained by the replacement in the nosocomial transmission of hospital clones by pediatric clones or by the massive prevalence of samples of community origin (25). In Brazil, the isolation of three samples that were genetically related to clone USA 800 was described in the northeastern region, which may indicate the introduction of this communityoriginated clone into hospital environments (22). The results obtained in this study confirmed the importance of the epidemiological characterization of MRSA samples, since high mult-resistance levels associated with samples of hospital origin were found in addition to the clonal dissemination of MRSA samples in the wards of HCFMB-UNESP.

146 References Kloos WE, Bannerman TL Staphylococcus and Micrococcus. In Murray PR, Baron Ej, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH. Manual of Clinical Microbiology, Washington DC, ASM press, 1995, p Gales AC, Sader HS, Ribeiro J, Zoccoli C, Barth A, Pignatari AC. Antimicrobial Susceptibility of Gram-Positive Bacteria Isolated in Brazilian Hospitals Participating in the SENTRY Program ( ). Clin Infect Dis 2009; 13: Johnson AP. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: the European landscape. J Antimicrob Chemother May;66 Suppl 4:iv43-iv48 4. Goosens H. European Status of Resistance in Nosocomial Infections. Chemotherapy 2005; 51: Vindel A, Cuevas O, Cercenado E, Marcos C, Bautista V, Castellares C, Trincado P, Boquete T, Pérez-Vázquez M, Marín M, Bouza E. Methicillinresistant Staphylococcus aureus in Spain: molecular epidemiology and utility of different typing methods. J Clin Microbiol. 2009; 47: Martins A, Pereira VC, Cunha Mde L. Oxacillin resistance of Staphylococcus aureus isolated from the university hospital of Botucatu Medical School in Brazil. Chemotherapy 2010; 56: Zhanel GG, Adam HJ, Low DE, Blondeau J, Decorby M, Karlowsky JA, Weshnoweski B, Vashisht R, Wierzbowski A, Hoban DJ; Canadian Antimicrobial Resistance Alliance (CARA). Antimicrobial susceptibility of 15,644 pathogens from Canadian hospitals: results of the CANWARD study. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011; 69:

147 8. Martins A, Cunha M de L. Methicillin resistance in Staphylococcus aureus and 127 coagulase-negative staphylococci: epidemiological and molecular aspects. Microbiol Immunol. 2007; 51: International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements (IWG-SCC). Accessado em Mombach Pinheiro Machado AB, Reiter KC, Paiva RM, Barth AL. Distribution of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) types I, II, III and IV in coagulase-negative staphylococci from patients attending a tertiary hospital in southern Brazil. J Med Microbiol. 2007; 56: Ito T, Okuma K, Ma XX, Yuzawa H, Hiramatsu K. Insights on antibiotic resistance of Staphylococcus aureus from its whole genome: genomic island SCC. Drug Resist Updat. 2003; 6: Oliveira DC, Tomasz A, de Lencastre H. Secrets of success of a human pathogen: molecular evolution of pandemic clones of meticillin- resistant Staphylococcus aureus.lancet Infect Dis. 2002; 2: Melter O, Aires de Sousa M, Urbaskova P, et al. Update on the major clonal types of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the Czech Republic. J Clin Microbiol 2003; 41: Arakere G, Nadig S, Swedberg G, Macaden R, Amarnath SK, Raghunath D. Genotyping of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains from two hospitals in Bangalore, South India. J Clin Microbiol. 2005; 43: Koneman EW; Winn WC. Diagnóstico Microbiológico: texto e atlas colorido. Rio de Janeiro, Ed Guanabara-Koogan, ª Ed 1760p.

148 16. CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI 128 approved standard M100-S15. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA: Milheiriço C, Oliveira DC, de Lencastre H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 2007; 51: Mcdougal LK, Steward CD, Killgore GE, Chaitram JM, Mcallister SK, Tenover FC. Pulsed-Field Gel Electrophoresis Typing of Oxacillin-Resistant Staphylococcus aureus Isolates from the United States: Establishing a National Database. J Clin Microbiol. 2003; 41: Steinkraus G, White R, Friedrich L. Vancomycin MIC creep in nonvancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (VISA), vancomycinsusceptible clinical methicillin-resistant S. aureus (MRSA) blood isolates from J Antimicrob Chemother. 2007; 60: Dhawan B, Gadepalli R, Rao C, Kapil A, Sreenivas V. Decreased susceptibility to vancomycin in meticillin-resistant Staphylococcus aureus: a 5 year study in an Indian tertiary hospital.j Med Microbiol. 2010; 59: Hsueh PR, Lee SY, Perng CL, Chang TY, Lu JJ.Clonal dissemination of meticillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in a Taiwanese hospital. Int J Antimicrob Agents. 2010; 36: Sousa-Junior FC, Silva-Carvalho MC, Fernandes MJ, Vieira MF, Pellegrino FL, Figueiredo AM, de Melo MC, Milan EP. Genotyping of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates obtained in the Northeast region of Brazil. Braz J Med Biol Res. 2009; 42:

149 23. Reinert C, Mcculloch JA, Watanabe S, Ito T, Hiramatsu K, Mamizuka EM. 129 Type IV SCCmec Found in Decade Old Brazilian MRSA Isolates. Emerging Infect Dis. 2008; 12: Amorim ML, Faria NA, Oliveira DC, Vasconcelos C, Cabeda JC, Mendes AC, Calado E, Castro AP, Ramos MH, Amorim JM, de Lencastre H.. Changes in the clonal nature and antibiotic resistance profiles of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates associated with spread of the EMRSA-15 clone in a tertiary care Portuguese hospital. J. Clin.Microbiol. 2007, 45: Valsesia G, Rossi M, Bertschy S, Pfyffer GE. Emergence of SCCmec Type IV and SCCmec Type V Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Containing the Panton-Valentine Leukocidin Genes in a Large Academic Teaching Hospital in Central Switzerland: External Invaders or Persisting Circulators? J Clin Microbiol. 2010; 48:720-7.

150 130 Table 1. Distribuition by specialities wards of the Botucatu School of Medicine University Hospital (HCFMB) - UNESP included in this study. Ward Complex Emergency Room Gynecology and Obstetrics Intensive Care Unit Internal Medicine Other Wards Pediatric Wards Surgery Wards Wards Emergency Room Emergency Room Intensive Care Unit Gynecology Obstetrics Intensive Care Unit Intensive Care Unit Central Coronary Intensive Care Unit. Dermatology Gastric Clinic Internal Medicine Intensive Care Unit Cardiology Cardiology Clinic Hematology Pulmonology Chemotherapy Oncology Infectious and Parasitic Diseases Neurology Dialysis Nursery Pediatrics Pediatric Intensive Care Unit Neonatal Intensive Care Unit Surgery Cardiac Surgery Thoracic Surgery Gastric Surgery Orthopedic Urologic Surgery

151 Table 2. Distribution of SCCmec types in S.aureus in the ward complexes of the 131 Botucatu School of Medicine University Hospital - UNESP. SCCmec III SCCmec IV Total Ward Complex (N) % (N) % (N) % Surgery Internal Medicine Emergency Pediatric Intensive Care Units Other Wards SCCmec: Staphylococcal cassette chromosome mec N: number of samples Table 3. Association of SCCmec type with resistance to the studied antimicrobials. SCCmec III SCCmec IV Total Droga N=41 % N=5 % N % Erythromycin Netilmicin Sulfamethoxazole- Trimethoprim Vancomycin Table 4. Relation of multiresistance to SCCmec cassette type. No. of resistances SCCmec III SCCmec IV N % N % 0R R R R Total SCCmec: Staphylococcal cassette chromosome mec N: sample size

152 132 Table 5. Distribution of clones of MRSA samples with SCCmec III by Ward complexes. Surgery Ward Complexes Internal Medicine Other Wards Emergency ICUs N % N % N % N % N % Clone A Clone B Clone C Clone D Total ICUs: Intensive Care Units Figure 1. Distribution of SCCmec cassette types in de S.aureus samples from 2002 to 2006 at HCFMB-UNESP.

153 133 Figure 2. Evolution of 50% and 90% MIC to vancomycin in MRSA SCCmec III samples from 2002 to A. Evolution of 50% MIC to vancomycin. B. Evolution of 90% MIC to vancomycin.

154 134 Figure 3. Dendogram of type-iii SCCmec S. aureus samples analyzed by the PFGE method generated by Dice/UPGMA analysis (Bionumerics, Applied Maths) of PFGE profiles - SmaI (similarity 80%).