André Martins. Botucatu São Paulo
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1 André Martins Caracterização do cassete cromossômico mec (SCCmec) e análise fenotípica e molecular de resistência a oxacilina em Estafilococos coagulase-negativa e Staphylococcus aureus. Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais, da Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, para obtenção do título de Doutor. Orientadora: Dr a. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha Botucatu São Paulo 2012
2 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Martins, André. Caracterização do cassete cromossômico mec (SCCmec) e análise fenotípica e molecular de resistência a oxacilina em estafilococos coagulasenegativa e Staphylococcus aureus / André Martins. Botucatu : [s.n.], 2012 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha Capes: Estafilococos aureos. 2. Antibióticos. Palavras-chave: Cassete cromossômico mec; meca; Oxacilina; Staphylococcus sp.
3 Ao meu pequeno Miguel, dono do sorriso mais lindo deste mundo, peço desculpa por todos os momentos ausentes, e lhe dedico esta tese como exemplo de esforço e dedicação; À minha esposa Alzira Fabiana, meu porto seguro, por todo o apoio, paciência e dedicação durante todos estes anos; Aos meus pais, Ivanir e José Osvaldo, pelo apoio e exemplo que me trouxeram até aqui. Dedicatória
4 Agradecimentos A Deus, causa de inspiração, sustentação e força durante todos estes anos; Á minha orientadora, Prof.ª Drª Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha, pelos ensinamentos, orientação, e principalmente pela confiança depositada no meu trabalho; À minha irmã, Ana Paula Martins, pelo apoio e força; às minhas tias Esterina Aparecida Martins e Edione Maria Martins pela ajuda na elaboração e correção do abstract e a Dona Loreni Terezinha de Christo pela ajuda e dedicação nestes últimos anos; Aos alunos de Pós Graduação Adilson de Oliveira, Carlos Henrique Camargo, Danilo Flávio Moraes Ribolli, Mariana Fávero Bonesso, Valéria Catanelli Pereira e ao Dr. Marcus Vinicius Pimenta Rodrigues, agradeço a ajuda na execução dos experimentos e a companhia durante todos estes anos; A todos os colegas do laboratório de bacteriologia, pelo bom companheirismo; À secretária do programa de pós-graduação em Doenças Tropicais, Solange Sako Cagliari, pela ajuda nos momentos difíceis e bom atendimento; A todos os funcionários da seção de pós-graduação da Faculdade de Medicina de Botucatu pela presteza no atendimento e ajuda quando necessário; A todos os funcionários do departamento de Microbiologia e Imunologia, pela presteza no atendimento; Ao Prof. Dr.Rogério Antônio de Oliveira pela paciência e dedicação na execução das análises estatísticas desta tese; Aos amigos Adriano Lima e Silva e Ulisses Benedito Colombo, pela ajuda, força e hospedagem e bons momentos vividos durante todos estes anos; e à amiga Martha Maria Passador pelo apoio e amizade; Aos amigos e funcionários do Instituto Adolfo Lutz de Santo André, Antonio Pereira da Silva Filho e Luis Fernando Armidoro Rafael, pela torcida, apoio e bons momentos de convivência; Aos amigos e funcionários do Instituto Adolfo Lutz de Marília, Laudelina Oliveira de Brito, Patricia de Fátima Florêncio Henschel, Roberto Costa Santos, Salete França Pôrto e Sérgio Schnoor Fogaça pela torcida e apoio; A todos os professores que contribuíram na minha formação; A todos que de uma forma ou de outra, estiveram comigo nestes últimos anos e que colaboraram para a conclusão deste trabalho.
5 "The greatest possibility of evil in selfmedication is the use of too small doses so that instead of clearing up the infection, the microbes are educated to resist penicillin and a host of penicillin-fast organisms is bred out." Sir Alexander Fleming
6 Sumário Lista de Figuras... Lista de Tabelas... Resumo... Abstract... i ii iii iv Capítulo 1: Caracterização do cassete cromossômico mec (SCCmec) e análise fenotípica e molecular de resistência a oxacilina em Estafilococos coagulasenegativa Resumo Abstract Introdução Objetivos Material e Métodos Amostras Identificação de Estafilococos Coagulase- Negativa Determinação de amostras de ECN resistentes à meticilina-oxacilina (MRCoNS) Técnica de difusão da droga em ágar com disco de oxacilina e cefoxitina Teste de triagem em Ágar Mueller Hinton com 4 µg/ml de oxacilina e 4% de NaCl Detecção do gene meca de resistência à meticilina em ECN Extração do Ácido Nucléico Amplificação do ácido nucléico (PCR)... 24
7 Visualização dos produtos amplificados Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) às drogas pelo método de E-test Determinação da produção de -lactamase Hiperprodução de -lactamase Procedência de amostras MRCoNS entre as enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP Determinação da sensibilidade intermediária de ECN à vancomicina Teste de triagem em Ágar BHI com 4 e 6 µg/ml de vancomicina Técnica de E-test macrométodo modificado Determinação do tipo de SCCmec (staphylococcal cassette chromosome mec) Determinação do Perfil Clonal das amostras de ECN Análise Estatística Resultados Amostras Identificação de Estafilococos Coagulase-Negativa Determinação de amostras de ECN resistentes à meticilina-oxacilina Técnica de difusão da droga em ágar com disco de oxacilina e cefoxitina Teste de triagem em Ágar Mueller Hinton com 4 µg/ml de oxacilina e 4% de NaCl Detecção do gene meca de resistência à meticilina em ECN Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) às drogas pelo método de E-test... 38
8 4.6. Determinação da produção de -lactamase Hiperprodução de -lactamase Distribuição de amostras MRCoNS entre as enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP Evolução da resistência à oxacilina no HC da FMB, UNESP no período de 2002 a Determinação da sensibilidade intermediária de ECN à vancomicina Tipagem de SCCmec para Estafilococos Coagulase Negativa Determinação do perfil clonal das amostras de Estafilococos Coagulase Negativa Análise Estatística Discussão Conclusões Referências Bibliográficas Capítulo 2: Caracterização molecular de Staphylococcus aureus resistentes à oxacilina isolados em um hospital universitário brasileiro Resumo Introdução Material e Métodos Amostras Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) às drogas pelo método de E-test Determinação do tipo de SCCmec para S.aureus Determinação do perfil clonal das amostras de S.aureus... 99
9 Resultados Determinação do tipo de SCCmec para S. aureus Determinação do perfil clonal das amostras de S.aureus Discussão Referências Molecular characterization of oxacillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from a Brazilian university hospital. 115 Abstract. 115 Introduction Matherial and Methods 118 Samples. 118 Determination of Minimal Inhibitory Concentration (MIC) to drugs by the E- test. Determination of the SCCmec type for S. aureus Determination of the Clonal Profile of S.aureus samples. Results.. Determination of the SCCmec type for S. aureus Determination of the Clonal Profile of S.aureus samples Discussion References 126 Comprovante de submissão do artigo Molecular characterization of oxacillinresistant Staphylococcus aureus isolated from a Brazilian university hospital à revista Chemotherapy Parecer de aprovação do comitê de ética em pesquisa
10 Lista de Figuras i Capítulo I Figura 1. Distribuição das espécies de ECN isoladas de hemoculturas Figura 2. Amostra de ECN com heterorresistência à oxacilina Figura 3. Resistência à oxacilina pelo teste de triagem com ágar Mueller Hinton acrescido de 4µg/mL de oxacilina e 4% de NaCl Figura 4. Presença do gene meca em amostras de Estafilococos Coagulase Negativas provenientes do HCFMB-UNESP Figura 5. Distribuição de Estafilococos coagulase-negativa de acordo com a espécie e resistência à oxacilina pela detecção do gene meca Figura 6. Resistência a antimicrobianos em amostras MRCoNS e MSCoNS Figura 7. Relação entre tipo de cassete cromosômico mec e CIM à vancomicina em amostras de Estafilococos Coagulase Negativas Figura 8. Produção de -lactamase por espécie de Estafilococos coagulase negativa Figura 9. Evolução da resistência à oxacilina em Estafilococos Coagulase Negativa (ECN) provenientes do HCFMB-UNESP no período de 2002 a Figura 10. Crescimento de amostra de S.epidernidis em ágar BHI acrescido de 6µg/mL de vancomicina Figura 11. Distribuição dos tipos de SCCmec em amostras de Estafilococos coagulase negativas Figura 12. Distribuição dos tipos de cassete SCCmec em amostras de Estafilococos Coagulase Negativas nos anos de 2002 a 2009 no HCFMB-UNESP. 55
11 Figura 13. Dendograma de amostras de S. epidermidis SCCmec tipo I analisadas i pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%) Figura 14. Dendograma de amostras de S. epidermidis SCCmec tipo III analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%) Figura 15. Dendograma de amostras de S. epidermidis SCCmec tipo IV analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%) Figura 16. Distribuição das amostras de S.epidermidis SCCmec I por clones identificados pela técnica de PFGE Figura 17. Distribuição das amostras de S.epidermidis SCCmec III por clones identificados pela técnica de PFGE Figura 18. Distribuição dos clones de amostras de S.epidermidis SCCmec I por complexo de enfermaria Figura 19. Distribuição dos clones de amostras de S.epidermidis SCCmec III por complexo de enfermaria Figura 20. Dendograma de amostras de S. haemolyticus SCCmec tipo I analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%)... 62
12 Capítulo II i Figura 1. Distribuição dos tipos de cassete SCCmec em amostras de S.aureus nos anos de 2002 a 2006 no HCFMB-UNESP Figura 2. Evolução da CIM 50% e 90% à vancomicina nos anos de 2002 a 2006 em amostras MRSA SCCmec III. A. Evolução da CIM 50% à vancomicina. B. Evolução da CIM 90% à vancomicina Figura 3. Dendograma de amostras de S. aureus SCCmec tipo III analisadas pela técnica de PFGE gerado pela análise Dice/UPGMA (Bionumerics, Applied Maths) dos perfis PFGE SmaI (similaridade 80%) Figure 1. Distribution of SCCmec cassette types in de S.aureus samples from 2002 to 2006 at HCFMB-UNESP Figure 2. Evolution of 50% and 90% MIC to vancomycin in MRSA SCCmec III samples from 2002 to A. Evolution of 50% MIC to vancomycin. B. Evolution of 90% MIC to vancomycin. 133 Figure 3. Dendogram of type-iii SCCmec S. aureus samples analyzed by the PFGE method generated by Dice/UPGMA analysis (Bionumerics, Applied Maths) of PFGE profiles - SmaI (similarity 80%). 134
13 Lista de Tabelas ii Capítulo I Tabela 1. Taxas de sensibilidade e especificidade de métodos fenotípicos empregados na detecção da resistência à oxacilina em ECN Tabela 2: Oligonucleotídeos para a detecção do gene meca Tabela 3. Distribuição por especialidades das enfermarias do HCFMB-UNESP incluídas neste estudo Tabela 4. Oligonucleotídeos para a detecção do Cassete Cromossômico estafilocócico mec (SCCmec) em estafilococos coagulase negativa Tabela 5. Resistência à oxacilina avaliada pelo método de difusão com disco de oxacilina e cefoxitina Tabela 6. Determinação da sensibilidade à oxacilina em amostras de Estafilococos Coagulase Negativa por métodos fenotípicos e genotípicos Tabela 7. Resistência a drogas em amostras MRCoNS e MSCoNS detectadas pela técnica de E-test Tabela 8. Determinação da sensibilidade às drogas pelo método de E-test em amostras de ECN de acordo com a espécie Tabela 9. Concentração Inibitória Mínima 50% e 90% das diferentes drogas estudadas Tabela 10. Concentração Inibitória Mínima por espécie de ECN Tabela 11. Concentração Inibitória Mínima em amostras MRCoNS e MSCoNS 42 Tabela 12. Concentração Inibitória Mímina das diferentes drogas estudadas Tabela 13. Número de resistências em amostras MSCoNS e MRCoNS... 43
14 Tabela 14. Número de resistências em amostras MRCoNS e MSCoNS separadas ii por espécie de ECN Tabela 15. Evolução das CIM 50% e 90% à vancomicina em amostras MRCoNS e MSCoNS nos anos do estudo Tabela 16. Amostras positivas em testes fenotípicos para a detecção de resistência à oxacilina e negativas para a pesquisa de gene meca Tabela 17. Resistência à oxacilina em amostras de Estafilococos Coagulase Negativa isoladas de pacientes provenientes de diferentes enfermarias do HC da FMB Tabela 18. Evolução de resistência à oxacilina em amostras de Estafilococos Coagulase-Negativa isoladas de pacientes do HC-FMB UNESP no período de 2002 a Tabela 19. Amostras de Estafilococos Coagulase Negativas com CIM > 2µg/mL para a droga vancomicina ou crescimento em Agar BHI acreescido de 4µg/mL ou 6 µg/ml de vancomicina Tabela 20. Distribuição dos tipos de SCCmec em Estafilococos Coagulase- Negativa entre as enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP Tabela 21. Distribuição dos tipos de SCCmec por espécie de Estafilococos Coagulase Negativa Tabela 22. Associação entre tipo de cassete cromossômico mec e resistência aos antimicrobianos estudados Tabela 23. Relação entre Multirresistência e cassete cromossômico mec... 56
15 Tabela 24. Comparação da presença do gene meca com os métodos de difusão ii em ágar com disco de oxacilina, disco de cefoxitina, método de triagem (Ágar Mueller Hinton + 4 µg/ml de oxacilina + 4% NaCl) e E-test Capítulo II Tabela 1. Distribuição por especialidades das enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP incluídas neste estudo. 110 Tabela 2. Distribuição dos tipos de SCCmec em S. aureus entre os complexos de enfermarias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP Tabela 3. Associação entre tipo de cassete cromossômico mec e resistência aos antimicrobianos estudados Tabela 4. Relação entre multirresistência e tipo de cassete SCCmec Tabela 5. Distribuição dos clones de amostras de MRSA com SCCmec III por complexos de enfermarias Table 1. Distribuition by specialities wards of the Botucatu School of Medicine University Hospital (HCFMB) - UNESP included in this study. 130 Table 2. Distribution of SCCmec types in S.aureus in the ward complexes of the Botucatu School of Medicine University Hospital - UNESP Table 3. Association of SCCmec type with resistance to the studied antimicrobials 131 Table 4. Relation of multiresistance to SCCmec cassette type. 131 Table 5. Distribution of clones of MRSA samples with SCCmec III by Ward complexes
16 iii Resumo A oxacilina é uma das alternativas de escolha no tratamento das infecções causadas por Staphylococcus spp., contudo, a resistência a esta droga têm se tornado um grande problema nas últimas décadas. O objetivo deste estudo foi caracterizar a sensibilidade à oxacilina em amostras de ECN isoladas de pacientes do Hospital das Clínicas (HC) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) por diferentes métodos, determinar a concentração inibitória mínima a antimicrobianos, a triagem de amostras com sensibilidade intermediária à vancomicina e a caracterização do perfil clonal de amostras de MRSA e MRCoNS isoladas de hemoculturas. Um total de 160 amostras foram analisadas quanto a resistência à oxacilina por meio da técnica de difusão da droga em ágar com disco de oxacilina e cefoxitina, teste de triagem em Ágar Mueller- Hinton com 4 µg/ml de oxacilina e 4% de NaCl, E-test, detecção do gene meca, e determinação da sensibilidade intermediária a vancomicina em ágar BHI com 4 µg/ml e com 6 µg/ml de vancomicina, além da caracterização do perfil epidemiológico pela tipagem do cassete cromossômico mec (SCCmec) e análise clonal por PFGE de um total de 46 amostras MRSA isoladas no período de 2002 a 2006, 59 amostras de S. epidermidis e 07 amostras de S. haemolyticus isoladas no período de 2002 a Um total de 74,4% das amostras foram positivas para o gene meca. A sensibilidade do método de difusão com disco de oxacilina e da técnica de E-test foi de 99,1% e com especificidade de 90,1%. O disco de cefoxitina apresentou 100% de sensibilidade e a mesma especificidade descrita para o disco de oxacilina. O método de triagem apresentou 94,2% de sensibilidade e a melhor taxa de especificidade com 93,2%. Houve diferença entre as amostras MRCoNS e MSCoNS quando analisada a Concentração Inibitória Mínima (CIM), com maiores níveis de CIM no grupo
17 iii MRCoNS, além de maiores taxas de multirresistência. Nenhuma das amostras apresentou resistência ou heterorresistência à vancomicina, contudo, dez amostras cresceram no ágar BHI com 4 µg/ml de vancomicina e 01 amostra cresceu no ágar BHI com 6 µg/ml de vancomicina. Houve uma prevalência do cassete SCCmec III em amostras MRSA, com 78,3%. No grupo dos ECN, 32,8% das amostras foram tipadas como SCCmec I e 50% como SCCmec III. Houve baixa prevalência do SCCmec IV nos dois grupos estudados (10,9 e 6%). Observou-se um perfil clonal nas amostras MRSA SCCmec III tipadas pela técnica de PFGE, com quatro clones identificados, sendo um deles relacionados ao clone epidêmico brasileiro (BEC). As amostras de S. epidermidis SCCmec III tipadas apresentaram seis clones que se disseminaram em várias enfermarias e foram persistentes de 2002 a As altas taxas de resistência à oxacilina encontradas neste trabalho, bem como a disseminação de clones entre as várias enfermarias ressaltam a importância de boas práticas de controle de infecção hospitalar, bem como o uso racional da antibioticoterapia para prevenir a disseminação desses clones.
18 iv Abstract Oxacillin is one of the alternatives of choice in the treatment of infections caused by Staphylococcus spp. However, the resistance to this drug has become a major problem in recent decades. The aim of this study was to characterize the sensitivity to oxacillin in CNS samples isolated from patients in the School of Medicine University Hospital (HCFMB) - UNESP by different methods, to determine antimicrobial minimum inhibitory concentration, the screening of samples with intermediate sensitivity to vancomycin, and characterization of the clonal profile of MRSA and MRCoNS samples isolated from blood cultures. A total of 160 samples were analyzed for resistance to oxacillin, by the drug diffusion technique in agar with oxacillin and cefoxitin, a screening test on Mueller-Hinton agar with 4 µg/ml of oxacillin and 4% NaCl, E-test, meca gene detection, and determination of intermediate susceptibility to vancomycin in BHI agar with 4 µg/ml and 6 µg/ml of vancomycin, and characterizing the epidemiological profile by typing the cassette chromosome mec (SCCmec), and clonal analysis by PFGE a total of 46 MRSA samples isolated in the period from 2002 to 2006, 59 samples of S. epidermidis and 07 samples of S. haemolyticus isolated in the period from 2002 to A total of 74.4% of the samples were positive for meca. The sensitivity of the oxacillin disk diffusion and E-test technique was 99.1% and specificity 90.1%. The cefoxitin disk showed 100% of sensitivity and specificity reported for the same oxacillin disc. The screening method showed 94.2% of sensitivity and specificity with the best rate of 93.2%. There were differences between samples when analyzed MSCoNS MRCoNS and the minimum inhibitory concentration (MIC), with higher levels of MIC in the group MRCoNS, and higher rates of multidrug resistance. None of the samples showed resistance or heteroresistant to vancomycin, however, 10 samples
19 iv grew on BHI agar with 4 mg/ml of vancomycin and 01 sample grew on BHI agar with 6 mg/ml of vancomycin. There was a prevalence of cassette SCCmec III MRSA samples, with 78.3%. In the group of the CNS, 32.8% of samples were typed as SCCmec I and 50% SCCmec III. There was low prevalence of SCCmec IV in both groups (10.9 and 6%). There was a clonal profile in SCCmec III MRSA samples typed by PFGE technique, with four clones identified, one was related to the Brazilian epidemic clone (BEC). Samples of S. epidermidis SCCmec III had typed in six clones that have spread in various wards and were persistent from 2002 to The high rates of oxacillin resistance found in this work, as well as the spread of clones of the various wards highlight the importance of good hospital infection control, and the rational use of antibiotics to prevent the spread of these clones.
20 Capítulo I
21 1 Capítulo 1. Caracterização do cassete cromossômico mec (SCCmec) e análise fenotípica e molecular de resistência a oxacilina em Estafilococos coagulase-negativa Resumo Os estafilococos coagulase negativa são patógenos associados a infecções nosocomiais, principalmente bacteremia e sepse. A oxacilina é uma das alternativas de escolha no tratamento das infecções causadas por Staphylococcus spp., contudo, a resistência a esta droga têm se tornado um grande problema nas últimas décadas. O objetivo deste estudo foi caracterizar a sensibilidade à oxacilina em amostras de ECN isoladas de pacientes do Hospital das Clínicas (HC) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) por diferentes métodos, determinar a concentração inibitória mínima a antimicrobianos, a triagem de amostras com sensibilidade intermediária à vancomicina e a caracterização do perfil clonal de amostras de MRCoNS isoladas de hemoculturas. Um total de 160 amostras foram analisadas quanto a resistência à oxacilina por meio da técnica de difusão da droga em ágar com disco de oxacilina e cefoxitina, teste de triagem em Ágar Mueller-Hinton com 4 µg/ml de oxacilina e 4% de NaCl, E-test, detecção do gene meca, e determinação da sensibilidade intermediária a vancomicina em ágar BHI com 4 µg/ml e com 6 µg/ml de vancomicina, além da caracterização do perfil epidemiológico pela tipagem do cassete cromossômico mec (SCCmec) e análise clonal por PFGE de 59 amostras de S. epidermidis e 07 amostras de S. haemolyticus isoladas no período de 2002 a Um total de 74,4% das amostras foram positivas para o gene meca. A sensibilidade do método de difusão com disco de oxacilina e da técnica de E-test foi de 99,1% e com especificidade de 90,1%. O disco de cefoxitina apresentou 100% de sensibilidade e a mesma especificidade descrita para o disco de oxacilina. O método de triagem apresentou 94,2% de sensibilidade e a melhor taxa de especificidade
22 2 com 93,2%. Houve diferença entre as amostras MRCoNS e MSCoNS quando analisada a Concentração Inibitória Mínima (CIM), com maiores níveis de CIM para a oxacilina no grupo MRCoNS, além de maiores taxas de multirresistência. Nenhuma das amostras apresentou resistência ou heterorresistência à vancomicina, contudo, dez amostras cresceram no ágar BHI com 4 µg/ml de vancomicina e 01 amostra cresceu no ágar BHI com 6 µg/ml de vancomicina. Houve uma prevalência do cassete SCCmec III em amostras MRSA, com 78,3%. No grupo dos ECN, 32,8% das amostras foram tipadas como SCCmec I e 50% como SCCmec III. Houve baixa prevalência do SCCmec IV nos dois grupos estudados (10,9 e 6%). As amostras de S. epidermidis SCCmec III tipadas apresentaram seis clones que se disseminaram em várias enfermarias e foram persistentes de 2002 a As altas taxas de resistência à oxacilina encontradas neste trabalho, bem como a disseminação de clones entre as várias enfermarias ressaltam a importância de boas práticas de controle de infecção hospitalar, bem como o uso racional da antibioticoterapia para prevenir a disseminação desses clones.
23 Abstract 3 Oxacillin is one of the alternatives of choice in the treatment of infections caused by Staphylococcus spp. However, resistance to this drug has become a major problem in recent decades. The aim of this study was to characterize the sensitivity to oxacillin in CNS samples isolated from patients at the School of Medicine University Hospital (HCFMB) - UNESP by different methods, to determine antimicrobial minimum inhibitory concentration, the screening of samples with intermediate sensitivity to vancomycin and characterization of the clonal profile of MRCoNS samples isolated from blood cultures. A total of 160 samples were analyzed for resistance to oxacillin by the drug diffusion technique in agar with oxacillin and cefoxitin, a screening test on Mueller-Hinton agar with 4 µg/ml of oxacillin and 4% NaCl, E-test, meca gene detection, and determination of intermediate susceptibility to vancomycin in BHI agar with 4 µg/ml and 6 µg/ml of vancomycin, and characterizing the epidemiological profile by typing the cassette chromosome mec (SCCmec) and clonal analysis by PFGE a total of 59 samples of S. epidermidis and 07 samples of S. haemolyticus isolated in the period 2002 to A total of 74.4% of the samples were positive for meca. The sensitivity of the oxacillin disk diffusion and E-test technique was 99.1% and specificity 90.1%. The cefoxitin disk showed 100% sensitivity and specificity reported for the same oxacillin disc. The screening method showed 94.2% sensitivity and specificity with the best rate of 93.2%. There were differences between samples when analyzed MSCoNS MRCoNS and the minimum inhibitory concentration (MIC), with higher levels of MIC in the group MRCoNS, and higher rates of multidrug resistance. None of the samples showed resistance or heteroresistant to vancomycin, however, 10 samples grown on BHI agar with 4 mg/ml of vancomycin and 01 sample grown in BHI agar
24 4 with 6 mg/ml of vancomycin. In the group of the CNS, 32.8% of samples were typed as SCCmec I and 50% SCCmec III. There was low prevalence of SCCmec IV (6%). Samples of S. epidermidis SCCmec III had typed in six clones that have spread in various wards and were persistent from 2002 to The high rates of oxacillin resistance found in this study as well as the spread of clones of the various wards highlight the importance of good hospital infection control, and the rational use of antibiotics to prevent the spread of these clones.
25 1. Introdução 5 O gênero Staphylococcus é um dos principais patógenos humanos, estando associados a inúmeros processos infecciosos 1. Caracterizam-se morfologicamente como cocos Gram positivos, medindo de 0,5 a 1,5µm de diâmetro e se apresentam em arranjos irregulares com aspecto de cachos de uva. O gênero Staphylococcus encontrase classificado no filo Firmicutes, classe Bacilli, ordem Bacilliares, família Staphylococcaceae. Diferenciam-se dos gêneros Streptococcus e Enterococcus pela produção de catalase, e do gênero Micrococcus e Macrococcus pela taxa de crescimento, produção de ácido a partir da glicose em condições anaeróbicas, resistência a bacitracina e sensibilidade a furazolidona 1. As espécies de Staphylococcus são divididas conforme a capacidade de produção da enzima coagulase, sendo as espécies de Staphylococcus spp. não produtoras dessa enzima, conhecidas como Estafilococos coagulase-negativa (ECN). As principais espécies de ECN associadas a doenças em humanos são S.epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, S.warneri, S. hominis, S. simulans, S. lugdunensis, S. schleiferi, S. capitis, S. auricularis, S. pasteuri, S. caprae, S. cohnii, S. xylosus e S. saccharolyticus 1. Por muito tempo considerou-se os ECN como saprófitas, contudo, atualmente esses micro-organismos são considerados oportunistas 2. Embora já existissem relatos na literatura associando os ECN a processos patogênicos, somente a partir da segunda metade do século XX, vários autores descreveram a importância dos ECN no ambiente hospitalar. Um dos primeiros relatos de literatura associando ECN a processos patogênicos data do ano de 1946, onde Clemens Harry 3 cita um caso de meningite infantil associado a S. albus, espécie de ECN renomeada posteriormente como S.epidermidis. Dez anos mais tarde, Smith et al 4 associaram os ECN a septicemias
26 6 através da análise de dados coletados de pacientes. Alguns anos depois, Wilson & Stuart 5 descreveram positividade de 4,4% para ECN em amostras obtidas de pacientes com ferimentos superficiais. Atualmente, os ECN estão principalmente associados a infecções nosocomiais. Gales et al 6 relataram 14,7% de positividade para ECN em amostras provenientes de hemoculturas de diversos hospitais brasileiros. Em outro estudo multicêntrico, Marra et al 7 relatam os ECN como o segundo grupo bacteriano mais isolado em hemocultura, com taxa de 12,6%. Chen et al 8 descrevem os ECN como o grupo de bactérias gram positivas mais isolado em pacientes com doenças hematológicas, como leucemia aguda mielóide, leucemia aguda linfoblástica, linfoma não Hodgins e mieloma múltiplo, em um hospital universitário de Taiwan. Dentre as espécies de ECN patogênicas, a mais frequentemente encontrada em ambiente hospitalar é S. epidermidis 9. Segundo relatório publicado pelo Centers for Disease Control and Prevention 10 aproximadamente 22% das hemoculturas positivas de pacientes com suspeita de bacteremia nos EUA apresentaram crescimento de amostras de S. epidermidis. Cerca de 13% das infecções associadas a válvula cardíaca são causadas por S.epidermidis 11. Embora esta espécie possa ser um membro da microbiota normal do homem, possui uma série de fatores de virulência que o caracteriza como um patógeno, como a capacidade de formar biofilme, produção de exopolímeros que funcionam como um mecanismo de evasão da resposta imune inata, produção de toxinas e capacidade de invasão do tecido hospedeiro 11. Segundo o critério adotado pelo CDC, consideram-se os ECN como causadores de bacteremias apenas após o isolamento destes micro-organismos de no mínimo 02 hemoculturas em diferentes momentos 12.
27 S. haemolyticus é uma espécie de ECN comumente associada a infecções 7 nosocomiais. Além de estar associado ao ambiente hospitalar, causando bacteremia, este micro-organismo também pode ocasionar infecções de feridas e tecidos moles, infecções do trato urinário e endocardite 11, 13. Kawamura et al 14 em estudo multicêntrico realizado em hospitais japoneses descrevem S. haemolyticus como a terceira espécie de Staphylococcus spp. mais isolada em ambiente hospitalar. Kristóf et al 15 descrevem esta espécie como responsável por 6% de todas as bacteremias identificadas no Hospital da Universidade Semmelweis, Hungria. Os mesmos autores relatam altas taxas de elevada Concentração Inibitória Mínima a vários antimicrobianos, como oxacilina, clindamicina, gentamicina e ciprofloxacina. Outras espécies de ECN têm adquirido importância como agentes patogênicos nos últimos anos. S. hominis é descrito como importante patógeno associado a bacteremias e infecções nosocomiais, principalmente associado a infecções pulmonares 16. Cuevas et al 17 descrevem S. hominis como a segunda espécie de ECN mais prevalente em hospitais espanhóis no período de 1986 a Secchi et al 18 descrevem dados semelhantes em estudo realizado com amostras de hemocultura provenientes de um hospital da região sul do Brasil. Bouchami et al 19 descrevem S. hominis como a terceira espécie mais isolada em ambiente hospitalar dentro do grupo dos ECN. S. capitis é um importante patógeno, geralmente associado a processos infecciosos do trato urinário, bacteremia e infecções de pele 18, e S. saprophyticus também está presente no ambiente hospitalar, frequentemente associado a infecções do trato urinário 18. A meticilina e outras penicilinas semi-sintéticas, tais como a oxacilina e a meticilina resistentes à ação de penicilinases são empregadas no tratamento das infecções por Staphylococcus spp., tendo seu uso iniciado em A resistência à
28 8 oxacilina no grupo dos ECN se tornou um grande problema nos anos 70, quando amostras resistentes começaram a ser isoladas de infecções de válvulas prostéticas cardíacas e líquido cefalorraquidiano 16. Atualmente, as taxas de resistência à oxacilina por ECN são altas, o que se torna um grande problema no tratamento destas infecções, uma vez que a multirresistência é frequente, deixando poucas alternativas para o tratamento. Gales et al 6 descrevem 78,7% de amostras de estafilococos coagulase negativas resistentes à meticilina (MRCoNS) em estudo multicêntrico envolvendo três hospitais da região sul, sudeste e centro-oeste brasileiros e um laboratório clínico da região sul do Brasil. Em outro trabalho, Cuevas et al 17 relatam taxas semelhantes de resistência à ECN. As taxas de resistência à oxacilina aumentaram gradativamente de 32,5% em 1986 para 66,7% em Natoli et al 20 relataram 77% de amostras de ECN resistentes à oxacilina em estudo realizado com amostras de hemocultura provenientes das enfermarias de transplante hematológico e unidade de tratamento intensivo de um hospital italiano. Alguns estudos descrevem níveis maiores de resistência à oxacilina em ECN. Bouchami et al 19 relatam um total de 95,6% de amostras MRCoNS isoladas de hemoculturas de pacientes submetidos a transplante de medula óssea. Embora a grande maioria de amostras MRCoNS isoladas de infecções nosocomiais seja associada a S.epidermidis, outras espécies de ECN podem estar presentes. Palazzo et al 21 descrevem o isolamento de 06 amostras de S. hominis subsp. novobiossepticus provenientes de hemoculturas Destas, 05 apresentaram resistência à oxacilina. Kristóf et al 15 relatam um total de 97% de amostras de S.haemolyticus resistentes à oxacilina isoladas no período de 2001 a 2008 de hemoculturas no Hospital
29 9 Universitário Semmelweis, Hungria. Yu et al 22 descrevem resistência à oxacilina em 91% de amostras de S.haemolyticus isoladas em hospital chinês. Stuart et al 23 descrevem taxas de resistência à oxacilina em várias espécies de ECN, isoladas previamente em serviços de saúde e depositadas na coleção de culturas do Departamento de Microbiologia, London Health Sciences Centre, Canadá. Um total de 26,3% das amostras de S. cohnii subsp. cohnii, 38,7% de S. cohnii subsp. urealyticus, 65,7% de S.epidermidis, 79,8% de S.haemolyticus, 11,3 % de S. hominis subsp. hominis, 85,7 % de S. hominis subsp. novobiossepticus, 1,9 % de S. saprophyticus, 27,9% de S.simulans e 20,6 % S. warneri foram resistentes à oxacilina. A resistência à meticilina está associada com a diminuição da capacidade desta em aderir com a proteína ligadora de penicilina (PBP2a) e a síntese da parede celular não ser interrompida. Existem três mecanismos de resistência às penicilinas semisintéticas, grupo de drogas em que a oxacilina está incluída. O primeiro, está relacionado à hiperprodução de -lactamases, enzimas que clivam o anel -lactâmico da droga, inativando-a 24. O segundo mecanismo, conhecido como MOD-SA ocorre quando PBPs normais possuem afinidade reduzida à oxacilina 25. O terceiro mecanismo e o mais importante é a presença do gene meca. Este codifica a PBP alterada, conhecida como PBP 2a, impedindo a ligação desta com a oxacilina 26. O gene meca está inserido dentro de um elemento genético transponível, conhecido como cassete SCCmec. Este possui diversas variações em sua constituição, sendo divididos em onze tipos. A tipagem do cassete SCCmec é útil como ferramenta epidemiológica 27 uma vez que os diferentes tipos são mais prevalentes em ambiente hospitalar ou comunitário. Já foram descritos pelo menos 11 tipos de SCCmec 28, que diferem entre si em relação ao número de genes que carregam e em sua arquitetura gênica 29, 30. Alguns destes tipos são
30 10 carreadores de genes determinantes de resistência para múltiplos antibacterianos, além dos beta-lactâmicos, os macrolídeos, lincosaminas, estreptograminas, aminoglicosídeos e tetraciclina. Desta forma, quando uma célula bacteriana adquire estes SCCmec de uma única vez adquire um fenótipo de múltipla-resistência 30,31. Os tipos de SCCmec foram definidos através da combinação de duas partes: o complexo ccr e o complexo mec, com três genes ccr filogeneticamente distintos classificados como: ccra, ccrb e ccrc. Além disso, há cinco classes do complexo gene mec (classe A, B, C1, C2 e classe D) 28,32. Os diferentes tipos de SCCmec são classificados como: SCCmec tipo I (complexo gene mec classe B e ccra1b1), SCCmec tipo II (complexo gene mec classe A e ccra2b2), SCCmec tipo III (complexo gene mec classe A e ccra3b3), SCCmec tipo IV (complexo gene mec classe B e ccra2b2), e SCCmec tipo V (complexo gene mec classe C2 e ccrc), SCCmec tipo VI (complexo gene mec classe B e ccra4b4), SCCmec tipo VII (complexo gene mec classe C1 e ccrc) e SCCmec tipo VIII (complexo gene mec classe A e ccra4b4). A região restante do SCCmec é chamada de região J (Joining region), que é constituída por componentes não essenciais do cassete que podem carrear determinantes de resistência antimicrobiana adicionais 28, 33. Os três primeiros tipos foram detalhados por Ito et al 34. Os mesmos autores relatam e novamente descrevem em 2004 o mais recente tipo descoberto, denominado tipo V. Ma et al 35 descrevem o tipo IV, presente principalmente em amostras provenientes da comunidade. Os tipos I, II e III são responsáveis principalmente por infecções nosocomiais, e são significantemente maiores que os últimos tipos, IV e V. O cassete tipo I, foi descrito com o tamanho de bp, sendo o menor dos três. Este cassete não possui inserido nenhum transposon ou plasmídeo que confira resistência a
31 11 outras drogas além da meticilina, ou a metais pesados; e possui também um subtipo, conhecido como IA que difere do tipo I por possuir um plasmídeo integrado, pub O segundo cassete, denominado II, possui bp, contendo além dos genes meca e mecri, que conferem resistência à meticilina, o transposon Tn 554, responsável pela resistência deste tipo de amostra à eritromicina e estreptomicina. Este cassete possui um subtipo, denominado IIa, com tamanho de 40 Kb, um pouco menor que o tipo II 36. O cassete tipo III, o maior dos cinco tipos, possui o tamanho de bp e contém os genes meca, mecri, os transposons Tn 554 e ψtn 554, e o plasmídeo pt 181, sendo que o transposon ψtn 554 induz resistência ao cádmio e o plasmídeo IS431 mer é responsável pela resistência ao mercúrio. Além das informações descritas acima, os autores também citam diferenças nos tipos de genes ccr, descrevendo no tipo III de SCCmec um gene não presente nos outros tipos, denominado de ψccr; e sugerindo também que algumas das características de resistência presentes no tipo III possam ser utilizadas como marcadores seletivos. Este tipo de cassete apresenta dois subtipos, IIIa que não possui o plasmídeo pt181 e flanqueia com elemento IS 431 e IIIb, onde se ausentam cópias do plasmídeo pt181 e Tn O tipo IV de cassete SCCmec é responsável principalmente por infecções provenientes da comunidade. É um pequeno elemento que não carrega outros genes de resistência à exceção de meca; além de se dividir em múltiplos subtipos, o que sugere que o tipo IV de SCCmec é altamente transmissível 36. Os quatro subtipos do cassete tipo IV, IVa, IVb, IVc e IVd diferem por apresentarem sequências diferentes na extremidade esquerda do complexo ccr, conhecida como região L C 36.
32 O tipo V de SCCmec foi identificado por Ito et al 32 em um isolado australiano. 12 Estes mesmos autores descrevem o novo cassete, o qual possui o tamanho de bp sendo um pouco maior que o SCCmecIV, contudo com tamanho inferior aos outros tipos existentes. Assim como o tipo IV, possui apenas genes que codificam resistência à meticilina; contudo diferentemente dos outros elementos desta família, o tipo V possui um novo tipo de gene ccr, caracterizado como o tipo c, que se encontra individualmente, ao contrário dos outros elementos, que possuem um par destes genes. Outro novo elemento encontrado apenas no tipo V é um sistema de restrição e modificação, codificado pelos genes V22 e V23. Estudos recentes associam a presença deste tipo de cassete mec a infecções de origem comunitária 37, 38. Oliveira, Milheiriço e de Lencastre 39 caracterizaram o tipo VI de SCCmec, encontrado em amostras MRSA pertencentes ao clone pediátrico previamente tipados como SCCmec IV. Os autores descrevem diferenças no complexo ccrab, identificado como tipo 4 e a presença do complexo mec do tipo B, que não possui o gene meci. O tipo VII de SCCmec foi identificado por Higuchi et al 40, por meio de uma análise detalhada de amostras de S. aureus comunitárias isoladas em Taiwan. Possui tamanho de bp, com o complexo mec homólogo ao encontrado no tipo V, mas apresentando substituições, inserções e rearranjos, que o diferenciam. As principais características deste tipo de cassete são a presença do complexo ccrc, do transposon IS431 e de uma seqüência única presente do lado direito do cassete, denominada orf35. Zhang et al 27 descreveram um novo tipo de cassete SCCmec, denominado SCCmec VIII, encontrado em amostra MRSA de origem hospitalar. Este novo cassete posssui o tamanho de pares de base, sendo presentes os genes meca, mecr1,
33 13 meci do complexo mec e ccra4, ccrb4 do complexo ccr, além de possuir o transposon Tn554, que também presente no tipo II. Recentemente foram descritos os tipos IX, X e XI, que se caracterizam respectivamente pela presença dos complexos ccr 1(A1B1) 7(A1B6) e 8(A1B3) e complexo mec C2, C1 e E 41. Embora a resistência mediada pelo gene meca esteja presente em todas as células da população com resistência intrínseca, esta pode ser somente expressa por uma pequena percentagem delas, levando ao que se chama de resistência heterogênea. A expressão de resistência nas linhagens com resistência intrínseca tem sido categorizadas em quatro classes de expressão fenotípica, classes 1 a 4, com a classe 1 sendo a mais heterogênea e a 4 mais homogênea 42. A grande maioria das células (99,9 ou 99,99%) na cultura de linhagens com resistência heterôgenea de classe 1 apresenta concentração inibitória mínima (CIM) de 1,5 a 3 µg/ml, mas essa cultura também contém um baixo número de bactérias (10-7 a 10-8 ) que poderiam formar colônias mesmo na presença de 25 µg/ml ou mais de oxacilina. Nas culturas de linhagens de classe 2, a maioria das células (99,9%) apresentam CIM de 6 a 12 µg/ml, e nessas culturas a frequência de células altamente resistentes (capazes de crescer na presença de 25 µg/ml) é maior (10-5 ) do que as linhagens de classe As culturas de linhagens de classe 3 são compostas de bactérias (99 a 99,9%) que apresentam altos níveis de resistência à oxacilina (CIM = 50 a 200 µg/ml), mas geralmente possuem uma subpopulação (10-3 ) de células altamente resistentes, capazes de formar colônias mesmo na presença de 300 a 400 µg de oxacilina/ml. As culturas de classe 4 são compostas de células com resistência
34 14 homogênea, com todas as células apresentando altos níveis de resistência, com CIM de 400 a 1000 µg/ml 26. A resistência à oxacilina pode ser detectada por meio de inúmeros métodos fenotípicos e genotípicos, tais como difusão em discos com oxacilina e cefoxitina, diluição em caldo, E-test, aglutinação em látex e PCR, sendo os métodos genotípicos considerados padrão ouro para a detecção de resistência à oxacilina em estafilococos. Embora os métodos genotípicos possuam alta sensibilidade e especificidade quando comparados aos fenotípicos, não são acessíveis a todos os laboratórios de microbiologia. Os métodos de referência preconizados pelo CLSI para a detecção de resistência à oxacilina em S. aureus e ECN incluem a determinação da CIM pelo método de diluição da droga em ágar ou em caldo, o método de difusão com disco, o teste de triagem com ágar Mueller Hinton (MH) adicionado de 4% de NaCl e 4µg/ml de oxacilina e mais recentemente o teste de difusão com disco de cefoxitina 25, 43. O método de difusão com disco de oxacilina e cefoxitina é uma das técnicas mais empregadas em laboratórios de rotina para a detecção da resistência à meticilina, devido ao baixo custo e facilidade de execução, embora não seja tão sensível e específico quanto a detecção do gene meca. Diversos trabalhos relatam boas taxas de sensibilidade e especificidade para este método. A tabela 1 descreve vários trabalhos que analisaram as taxas de sensibilidade e especificidade dos testes fenotípicos empregados na detecção da resistência aos ECN.
35 15 Tabela 1. Taxas de sensibilidade e especificidade de métodos fenotípicos empregados na detecção da resistência à oxacilina em ECN. Autor Espécie N Teste fenotípico S E Swenson et al 44 ECN 310 Disco oxacilina Disco cefoxitina Jain et al 45 ECN 47 Disco oxacilina Disco cefoxitina 86, ,6 100 Perazzi et al 46 ECN 107 Disco oxacilina Disco cefoxitina John et al 47 S. epidermidis S. haemolyticus Disco cefoxitina 98, Ferreira et al 48 ECN 152 Triagem E-test ,4 Perez et al 49 Triagem Hedstierna- Johnsen et al 50 ECN 110 E-test Disco cefoxitina N:tamanho amostral S: sensibilidade E: especificidade O aumento de amostras resistentes à meticilina deixa poucas alternativas para o tratamento das infecções causadas por estes patógenos. O antimicrobiano mais utilizado no tratamento de infecções por MRCoNS é a vancomicina, contudo existem relatos de amostras apresentando resistência intermediária e resistência a esta, além do aumento de ECN com suscetibilidade diminuida a vancomicina. A detecção fenotípica da resistência a vancomicina é feita pelo método de triagem em ágar BHI acrescido de 6µg/mL de vancomicina 51 e pela técnica de E-test. Palazzo et al 52 descreveram 04 amostras de ECN (1 S. epidermidis, 1 S. haemolyticus e 2 S. capitis) resistentes à vancomicina isoladas de trabalhadores de uma escola particular e de um hospital localizado na região de Ribeirão Preto. A concentração inibitória mínima (CIM) que estas amostras apresentaram quando testadas pela técnica de E-test variou entre 16 µg/ml e 256 µg/ml. Martinez et al 53 relataram
36 16 uma amostra de S. cohnii isolada de uma criança de 05 anos com resistência à vancomicina, sendo que a CIM obtida pela técnica de E-test foi de 64µg/mL. A sensibilidade reduzida à vancomicina é um problema emergente, mais recentemente Olivares et al 54 relataram 73% de amostras de S.epidermidis com baixa suscetibilidade à vancomicina. A heterorresistência à vancomicina também tem sido relatada por D Melo 55, o que ressalta a importância da detecção adequada da resistência a esta droga. Recentemente, novas alternativas surgiram para o tratamento das infecções por Staphylococcus spp. resistentes à oxacilina. Drogas como a linezolida, daptomicina, quinupristina/daptopristina, teicoplanina, tigeciclicina têm sido empregadas com sucesso 16. Contudo, surgem relatos de amostras resistentes a algumas destas drogas. Creminter et al 56 descreveram o isolamento de 13 amostras de S. epidermidis, 02 de S.capitis e 01 de S. haemolyticus com susceptibilidade reduzida à teicoplanina. Uma das amostras de S. epidermidis também apresentou suscetibilidade reduzida à vancomicina. Todas as amostras de S. epidermidis com suscetibilidade reduzida a teicoplanina foram resistentes à meticilina. No Brasil, Nunes et at 57 descreveram três amostras com suscetibilidade reduzida à teicoplanina e positivas para o gene meca. A Linezolida é outra droga que tem sido empregada recentemente na terapia contra infecções por Staphylococcus spp. resistentes à oxacilina, com bons resultados, embora Potoski et al 58 descreveram um surto de amostras de S. epidermidis resistentes a linezolida, com 24 de 25 amostras isoladas com CIM > 256g/mL. Stuart et al 59 descreveram em estudo comparativo entre diversas espécies de ECN, um total de 25% das amostras de S. capitis resistentes à linezolida. Devido às altas taxas de resistência à oxacilina, principal alternativa terapêutica, e o surgimento de resistência a outros antimicrobianos, como a vancomicina, é de
37 17 grande importância compreender a epidemiologia das infecções provocadas por Staphylococcus spp. Nos últimos anos, as ferramentas moleculares têm sido empregadas em estudos epidemiológicos, com bons resultados. As três principais metodologias empregadas são o Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), o Multilocus Sequence Typing (MLST), e a técnica de spa typing, que possibilitam a identificação dos clones bacterianos circulantes em ambientes hospitalares e na comunidade. A PFGE é um método que emprega enzimas de restrição para clivar o DNA extraído. No caso do gênero Staphylococcus, a enzima empregada é a SmaI. Os fragmentos são separados em gel de agarose, com a direção do campo elétrico periodicamente alterado, formando um ângulo de 120º e permitindo que fragmentos de até 12mb sejam separados, ao contrário da eletroforese tradicional, que não é capaz de separar fragmentos maiores que 50kb 60. Geralmente esta técnica é empregada em estudos locais, como surtos hospitalares, o que permite identificar o tipo circulante. A técnica de PFGE foi descrita por Schartz & Cantor no ano de e primeiramente utilizada para fracionar todo o genoma da levedura Saccharomyces cerevisae, microorganismo modelo para estudos genéticos. Vários trabalhos utilizaram a PFGE para a identificação de clones circulantes em ambiente hospitalar e caracterização de surtos locais causados por Staphylococcus spp. resistentes à oxacilina. Vindel et al 62 relataram a presença de 13 diferentes genótipos presentes em 135 amostras provenientes de 145 hospitais espanhóis, o que indica uma possível disseminação entre unidades. Kosowska-Shick et al 63 descreveram três diferentes padrões clonais de S. epidermidis resistentes à linezolida, evidenciando diferentes origens para a resistência à linezolida neste hospital. A epidemiologia de S. hominis foi detalhada com o emprego desta técnica, tendo sido descrito vários padrões clonais, sugerindo que cada clone de S. hominis, é raramente disseminado 19.
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