TÉCNICAS ESTATÍSTICAS APLICADAS A VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ESTUDO DE CASO: VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO MODIFICADO PARA DETERMINAÇÃO DE CAFEÍNA EM ERVA MATE
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- William Caldas Henriques
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1 METROSUL IV IV Congresso Latino-Americano de Metrologia A METROLOGIA E A COMPETITIVIDADE NO MERCADO GLOBALIZADO 09 a 12 de Novembro, 2004, Foz do Iguaçu, Paraná BRASIL Rede Paranaense de Metrologia e Ensaios TÉCNICAS ESTATÍSTICAS APLICADAS A VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ESTUDO DE CASO: VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO MODIFICADO PARA DETERMINAÇÃO DE CAFEÍNA EM ERVA MATE José Laurentino Ferreira 1, Adilson dos Anjos 2 1 Instituto de Tecnologia do Paraná TECPAR, Curitiba PR, Brasil 2 Universidade Federal do Paraná UFPR, Curitiba PR, Brasil Resumo: Este trabalho apresenta uma proposta de procedimento de análise estatística para validações de metodologias na área de química, um requisito essencial à garantia da confiabilidade analítica. Apresenta um estudo de caso Validação de uma metodologia modificada para determinação de cafeína em erva mate por cromatografia líquida. Foram utilizadas as análises estatísticas: i) Análise de regressão, para determinação da faixa linear e da faixa de trabalho da metodologia; ii) Análise de variância ANOVA, para a avaliação da repetitividade e da precisão intermediária; iii) Técnicas de Taguchi, para a otimização e estabelecimento das condições de robustez da metodologia. A seletividade/especificidade do método foi verificada pela comparação de espectro de ultravioleta entre a resposta de cafeína do padrão de referência e a resposta de cafeína na amostra; A exatidão/tendência foi avaliada por um ensaio de recuperação após contaminação da amostra. Dois sistemas de cromatografia líquida de alta pressão foram utilizados: Merck Hitachi e Waters. Os resultados da precisão do método indicaram uma repetitividade (CV) de 1,10%, e uma precisão intermediária (CV) de 1,08%, em relação aos dois sistemas de cromatografia utilizados. O ensaio de exatidão demonstrou uma recuperação do método de 94,3%. Palavras chave: validação, erva-mate, análise estatística. 1. INTRODUÇÃO A validação é um importante requisito na prática da análise química. A norma NBR ISO/IEC Requisitos Gerais para Competência de laboratórios de Ensaio e Calibração [11], aborda essa problemática, estabelecendo os requisitos necessários que os laboratórios devem atender para demonstrar que tem implementado um sistema da qualidade, que são tecnicamente competentes e que são capazes de produzir resultados tecnicamente válidos. Um desses requisitos é a validação de métodos, justificado pela norma NBR ISO/IEC no item como: Com o objetivo de confirmar que os métodos são apropriados para o uso pretendido, o laboratório deve validar os métodos não normalizados, métodos criados/desenvolvidos pelo próprio laboratório, métodos normalizados usados fora do escopo para os quais foram concebidos, ampliações e modificações de métodos normalizados. A validação deve ser suficientemente abrangente para atender as necessidades de uma determinada aplicação ou área de aplicação(...). O objetivo deste trabalho foi definir um procedimento de análise estatística para a validação de métodos químicos. Um método modificado para determinação de cafeína em erva mate por cromatografia líquida foi utilizado. O método original é específico para cafeína em café [7], por essa razão era necessário uma validação devido à mudança de escopo. O guia do INMETRO: DOQ-CGCRE-008 Orientações sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos [8] foi o documento norteador deste estudo, embora muitos outros trabalhos contribuíram para sua efetivação. 2. PARÂMETROS DA VALIDAÇÃO Validação é a confirmação por exame e fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um determinado uso pretendido são atendidos [11]. As fases de validação de métodos aqui verificadas compreendem: seletividade, faixa linear e faixa de trabalho, exatidão, precisão, e robustez. Não discutiremos aqui, as definições dos parâmetros de validação por não se tratar do objetivo deste trabalho. Detalhes e discussões sobre tais definições podem ser encontradas nas referências [1], [3], [4], [5], [6], [10], [12] e [13].
2 3. ANÁLISE ESTATÍSTICA 3.1. Planejamento Robusto pelo método de Taguchi Com um planejamento apropriado de uma metodologia, o processo pode ser feito de modo que se torne insensível a variações ou seja: robusto. Assim se tornando uma chave à melhoria da confiabilidade analítica. O japonês Genichi Taguchi desenvolveu suas próprias idéias sobre como planejar, realizar e analisar experimentos, utilizando as técnicas de experimentos fatoriais fracionados desenvolvidas por Fischer. Os experimentos sugeridos por Taguchi são, geralmente, fatoriais fracionados, que estão dispostos em matrizes denominadas arranjos ortogonais [9]. Num arranjo ortogonal representado como L 8 (2 7 ), tabela 1, a matriz é referida simplesmente como uma L 8, (2 7 ) significa que são 7 fatores em dois níveis. As colunas verticais são chamadas de colunas da matriz ortogonal e correspondem aos fatores, a coluna X corresponde ao resultado analítico da combinação ensaiada. Os níveis 1 e 2 em cada coluna indicam os níveis dos fatores. Cada coluna tem igual número de níveis 1 e 2. Tabela 1. Arranjo ortogonal - L 8 (2 7 ) FATORES nº A B C D E F G Χ s t u v w x y z A média de cada nível dos fatores é obtida pela razão entre a soma dos dados experimentais do nível particular e o número de vezes que o nível daquele fator aparece na matriz ortogonal. O efeito de cada fator é a diferença entre os níveis 1 e 2 do fator, por exemplo para o fator D, temos a equação 1. EfeitoD D 1 / 2 s + u + w + y t + v + x + z = (1) 4 4 Um critério de significância para os efeitos é estabelecido. Os efeitos cujo valor não ultrapassem este valor são considerados não significativos Análise de Regressão O propósito usual na análise de regressão é o desenvolvimento de um modelo estatístico que possa ser utilizado para prever os valores de uma variável dependente ou variável de resposta, com base nos valores de, pelo menos uma variável independente ou explicativa. O modelo de regressão linear simples pode ser representado pela equação 2. Y i = b 0 + b 1 x i + ε i (2) Onde b 0 = Intersecção de Y para a amostra b 1 = inclinação para a amostra ε i ~ N (0,σ 2 ) = erro aleatório em Y para a observação i Antes de utilizarmos a função calibração estabelecida pela teoria dos mínimos quadrados, é preciso verificar se os pressupostos da análise de regressão são satisfeitos: homocedasticidade que estabelece a igualdade de variâncias, a normalidade da regressão, a independência dos erros e a linearidade. A discussão que trata dos detalhes da verificação dos pressupostos da regressão pode ser encontrada nas literaturas [2] e [8] Coeficiente de Determinação r 2 O coeficiente de determinação é igual à soma dos quadrados devido à regressão, dividida pela soma total dos quadrados [8]. r 2 = SQ Re g STQ r 2 é usado como parâmetro de eficiência da regressão, sendo que o valor desejado é o mais próximo possível de 1. O coeficiente de determinação mede a proporção da variação, que é explicada pela variável independente do modelo de regressão. Um r 2 de 0,981 significa que 98,1% da variação da variável de resposta podem ser explicados pela variabilidade da variável explicativa. Somente 1,9% da variabilidade da amostra em relação á variável de resposta podem ser explicados por fatores diferentes daquele que é levado em conta no modelo de regressão linear [8] Análise de variância ANOVA Em um experimento, é de interesse avaliar simultaneamente duas ou mais amostras, testando se (3)
3 existe diferenças significativas entre elas. Sabe-se porém, que além do efeito do tratamento utilizado e avaliado, podem existir efeitos desconhecidos, que nem sempre podem ser controlados, provocando uma variação ao acaso nos dados obtidos do experimento. A análise de variância consiste em decompor a variação total das observações do experimento em partes que podem ser atribuídas a causas conhecidas e em partes a causas desconhecidas, o erro ou resíduo. O erro ou resíduo pode ocorrer em função do material que se está trabalhando ou em função do ambiente em que o experimento é conduzido. Outra fonte de erro pode ser a maneira como o experimento é conduzido pelo experimentador. Para que a análise de variância seja considerada válida, algumas pressuposições devem ser obedecidas: homocedasticidade, normalidade e independência dos erros [8]. Estas pressuposições são análogas aos pressupostos de regressão e correlação, uma vez que também é um modelo linear, com algumas diferenças específicas à análise Teste de Hipóteses Sob o pressuposto de que os grupos ou os níveis do fator em estudo representam populações cujas medidas de resultado são retiradas aleatória e independentemente, seguem uma distribuição normal e tem variâncias equivalentes, a hipótese nula equação 4, de nenhuma diferença nas médias aritméticas das populações. H 0 : µ 1 = µ 2 =... = µ I (4) pode ser testada em relação à alternativa de que nem todas as médias aritméticas das populações dos grupos são iguais, equação 5. H 1 : µ i µ j para pelo menos um par (i,j) (5) Teste F É utilizado para comparar variâncias. Ele é, em geral, o quociente entre os quadrados médios de tratamentos e o resíduo. O teste F depende das esperanças dos quadrados médios dos efeitos 1. Para testar a hipótese nula H 0 em relação à alternativa H 1, calculamos a estatística de teste F, do seguinte modo: MQE F = MQD Onde: (6) MQE = média dos quadrados entre grupos MQD = média dos quadrados dentro dos grupos Para um dado nível de significância, α, pode-se rejeitar a hipótese nula, H 0, se Fcal>Ftab, ou seja, existe diferença significativa entre pelo menos uma média de tratamentos. Se Fcal Ftab, aceitamos a hipótese de nulidade H 0, ou seja, não existe diferença significativa entre tratamentos ao nível α de significância escolhido. 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Metodologia Química Para a análise química (determinação do teor de cafeína em erva-mate) foi utilizada a metodologia ISO Coffee Determination of caffeine content Method using high-performance liquid chromatography [7]. Cafeína é extraída de uma porção de 0,5 gramas de amostra em solução aquosa à 90 o C na presença de 4g de óxido de magnésio por 20 minutos. Após filtração uma alíquota é purificada em uma coluna de purificação de sílica modificada com grupos fenil. Após a purificação a alíquota é aferida para um volume conhecido e o teor de cafeína na amostra determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), com detecção por UV à 272nm. Foram utilizados dois sistemas de cromatografia líquida de alta eficiência, um da marca Merck Hitachi e outro da marca Waters. Merck: O sistema de HPLC consiste de uma bomba quaternária de alta pressão, um injetor automático, e um detetor de arranjos de diodo DAD. Waters: O sistema de HPLC consiste de uma bomba quaternária de alta pressão, um injetor manual de volume fixo e um detetor UV-Visível. Para ambos os detectores o comprimento de onda λ foi ajustado para leitura à 272nm. O detetor DAD do Merck foi programado também para leitura em varredura numa faixa de 190 à 310nm. A coluna cromatográfica utilizada foi uma Lichrospher100 RP- 18e - 5µm. O volume de injeção para ambos os equipamentos foi de 20µL. Para o ensaio de otimização e robustez do método foram testadas duas configurações de fases. Fase Móvel A: 75%Água; 10%Metanol e 15% Acetonitrila fase móvel menos polar. Fase Móvel B: 85%Água; 10%Metanol e 5% Acetonitrila fase móvel mais polar Metodologia Estatística As análises utilizadas nesta validação foram: Análise de regressão Regressão linear pelo método dos mínimos quadrados para a determinação da faixa linear e de trabalho da metodologia. Para a verificação da precisão do método foi utilizado a ANOVA. Nestas duas análises foi utilizado o software Statgraphics.
4 Para a otimização e determinação da robustez do método foi utilizado um arranjo ortogonal L 8 (2 7 ) e analisado pelas técnicas de Taguchi, nesta análise o software utilizado foi o STATISTICA. O teste para verificação da normalidade para o ensaio de precisão foi o teste de normalidade de Shapiro-Wilk e foi utilizado o software estatístico R. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Seletividade A identidade do pico atribuído à cafeína no cromatograma da amostra, foi confirmada através da comparação de seu espectro de ultravioleta com o espectro do pico referente ao padrão de cafeína do cromatograma do padrão de referência. Pela comparação dos espectros de UV, constatou-se que o comprimento de onda máximo ( λ m ) do padrão coincidiu com o do composto de interesse em 273nm e que nos demais aspectos do espectro houve coincidência Robustez Foi utilizado o delineamento experimental de matrizes ortogonais (Método de Taguchi). Inicialmente foi planejado um experimento com 7 fatores em dois níveis (tabela 2), para se encontrar os fatores que causam um maior impacto na metodologia, sendo o nível 1 dos fatores os valores da metodologia original e o nível 2, uma variação proposta para a metodologia. Tabela 2. Fatores e níveis Planejamento 1. SÍMBOLO FATOR Nível 1 Nível 2 A Massa da amostra 0,5 2,5 (g) B Massa de MgO (g) 4 2 C Temperatura de 90 Fervura aquecimento (ºC) D Tempo de aquecimento ( min ) E Volume de Extração ( ml ) F Clenup (coluna fenil) Sim Não G Fase Móvel + polar - polar O critério de significância para os efeitos foi estabelecido como sendo ±2s. Ou seja os efeitos cujo valor não ultrapassem este valor são considerados não significativos. O gráfico dos efeitos para este experimento está representado na figura 1. S/R = -10*log10(1/N*Sum(1/y²)) 0,2 0,0-0,2-0,4-0,6-0,8-1,0-1,2-1,4-1,6 Médias para os níveis dos fatores média = -,68304 Sigma=, MS Erro=, A B C D E F G Fig. 1. Gráfico dos efeitos planejamento 1. Numa segunda etapa foi planejado um experimento de refinamento, com os 3 fatores de maior significância, tabela 3. Tabela 3. Fatores e níveis Planejamento 2. SÍMBOLO FATOR Nível 1 Nível 2 A Massa da amostra (g) 0,3 0,7 B Massa de MgO (g) 1 2 D Tempo de aquecimento ( min ) Após a análise do segundo planejamento chegou-se ao resultado final do experimento, tabela 4. Tabela 4. Otimização e Robustez. SÍMBOLO Nível Otimizado Faixa de robustez A 0,5 gramas 0,3 à 0,7 gramas B 1,5 gramas 1,0 à 2,0 gramas C Fervura - D 25 minutos 20 à 30 minutos E 300ml - F Sem purificação Com purificação G Fase móvel mais polar Fase móvel menos polar 5.3. Faixa linear e de trabalho Para a faixa linear e de trabalho, foi realizada a análise da regressão linear pelo método dos mínimos quadrados. A faixa de concentração variou entre 0,1 e 10,0µg/mL. Todos os pressupostos necessários para a análise de regressão foram satisfeitos. Os pressupostos: normalidade, homocedasticidade e independência de erros foram verificados pela análise de resíduos, a linearidade foi verificada através do coeficiente de correlação da reta de regressão. A linearidade foi avaliada pelo coeficiente de correlação da reta de regressão r = 0, (fig. 2.a)
5 A homocedasticidade foi avaliada por inspeção de um gráfico dos resíduos vs conc(ug/ml) (fig.2b), não foram detectadas grandes diferenças na variabilidade dos resíduos, para diferentes níveis de concentração. Pode - se concluir que, para o modelo ajustado, não existe violação aparente no pressuposto de igual variância a cada nível de concentração. O pressuposto da normalidade da regressão foi avaliado por inspeção do gráfico normal de probabilidade fig 3a. A independência de erros foi avaliada pelo gráfico dos resíduos padronizados vs tempo fig.3b, não sendo observado o efeito de autocorrelação positiva que se evidenciaria pela existência de um padrão na distribuição dos resíduos em relação ao tempo. Checado todos os pressupostos necessários para a análise de regressão, decidiu-se aceitar o modelo proposto como explicativo da relação entre o sinal obtido do detector e a concentração de cafeína na solução de análise. ˆ = + Yi b0 b1 X i Com b 0 = 342, e b 1 = 27440,36272 E r 2 = 0,9999 X ) 3 Área Curva de Calibração de Cafeí 2,5 2 1,5 1 0, Resíduos Padronizados Gráfico dos Resíduos -2, (8) Conc (ug/ml) Conc (ug/ml) Fig. 2. a) Curva de calibração de Cafeína e b) Gráfico dos resíduos para verificação da homocesdasticidade Gráfico Normal de Probabilidsíduos Padronizados ao longo do 99, , Porcentagem Resíduos Resíduos Padronizados 2,7 1,7 0,7-0,3-1,3 Fig. 3. a) Gráfico normal de probabilidade e b) Gráfico dos resíduos para verificação da independência dos erros. 2,7 1,7 0,7-0,3-1,3-2, Tempo 5.4. Precisão Na avaliação da precisão, foi realizado um estudo da repetitividade e da precisão intermediária do método. Foram testados dois sistemas de cromatografia líquida: Merck e Waters. Foi planejado um experimento fatorial com 8 repetições para cada equipamento em um delineamento completamente casualizado. Os dados experimentais para o ensaio de precisão são apresentados na tabela 5. Após a coleta de dados e verificação de que todos os pressupostos necessários para a análise homocedasticidade, normalidade, independência de erros e existência de outliers foram satisfeitos foi realizada a análise de variância, ANOVA. Tabela 5. Dados da ANOVA Nº Massa (g) C (g/100g) de cafeína MERCK C (g/100g) de cafeína WATERS 1 0,4551 1,0652 1, ,3993 1,0667 1, ,5256 1,0645 1, ,6164 1,0442 1, ,4993 1,0496 1, ,5054 1,0415 1, ,5075 1,0608 1, ,5021 1,0404 1,0523 A tabela 6 mostra um resumo dos resultados principais da ANOVA. Tabela 6. Resultados da precisão do método Parâmetros da validação Resultados ( 1 ) DP DPR ( % ) Repetitividade ( MercK ) 0, ,08 Repetitividade ( Waters ) 0, ,10 Precisão Intermediária ( 2 ) 0, ,09 NOTA: (1) Os resultados foram expressos em Termos de seus desvios padrão. (2) Para a precisão intermediária o parâmetro de variação é o equipamento utilizado (Merck e waters) Exatidão A exatidão do método, foi avaliada através de um ensaio de recuperação. Os dados do ensaio para verificação da exatidão do método são mostrados na tabela 7. O valor médio da recuperação foi de 94,3% e o desvio padrão relativo DPR foi de 3,7%. A porcentagem de recuperação variou de 90,7% à 99,8%.
6 Tabela 7. Resultados da tendência do método. Nº C ( g/100g ) determinada C ( g/100g ) Adicionada C ( g/100g ) recuperada % de rec 1 ( 1 ) 1, ( 1 ) 1, ,31 0,24 0,24 99,8 4 1,29 0,24 0,22 92,9 5 1,30 0,24 0,23 94,8 6 1,29 0,24 0,22 91,0 7 1,30 0,24 0,23 96,4 8 1,29 0,24 0,22 90,7 Média da recuperação (%) 94,3 DP 3,5 DPR (% ) 3,7 NOTA ( 1 ) Amostras não contaminadas Como observado na tabela acima a concentração de contaminação foi de 0,24g/100g, a concentração recuperada variou de 0,22 á 0,24g/100g. O erro máximo entre as determinações ficou em 0,02g/100g, que quando comparado com a concentração adicionada, corresponde a 8,3% da recuperação esperada, o que nos indica que a concentração escolhida para a contaminação foi muito pequena. Se tivéssemos optado por usar uma concentração de contaminação semelhante a concentração real de cafeína na erva mate ( aproximadamente 1g/100g), um erro de 0,02g/100g na análise corresponderia a apenas 2% da recuperação esperada. [4] ICH Q2A. Text on Validation of Analytical Procedures. Geneva: March [5] ICH Q2B. Validation of Analytical Procedures: Methodology. Geneva: November [6] INMETRO DOQ-CGCRE-008. Orientações Sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos. março [7] ISO Coffee Determination of caffeine content Method using high-performance liquid chromatography. Genève:1992. [8] Levine, D.M.; Berenson, M.L.; and Stephan, D. Estatística: Teoria e aplicações usando Microsoft excel em português. Tradução Teresa Cristina Padilha de Souza. Rio de Janeiro: LTC Ed., [9] Mori,T. The New Experimental Design Taguchi s Approach to Quality Engineering. Michigan:ASI Press Ed., p. [10] NBR Agrotóxico Validação de metodologia analítica para análise de teor de ingrediente ativo em produtos técnicos e formulações de agrotóxicos. Rio de Janeiro: [11] NBR ISO/IEC 17025:2001. Requisitos Gerais para Competência de Laboratórios de Ensaio e Calibração. Rio de Janeiro: [12] Valente Soares, L.M. Como obter resultados confiáveis em cromatografia. São Paulo: Revista Instituto Adolfo Lutz, 60(1):79-84, [13] VIM. Vocabulário Internacional de Termos Fundamentais e Gerais de metrologia. 2ed. Brasília: p. [3] J.R. Taylor, "An introduction to error analysis", University Science Books, Sausalito, CA, CONCLUSÃO Destacou-se neste estudo o uso das técnicas de análise fatorial: Técnicas de Taguchi e ANOVA. A análise de regressão já é bastante utilizada na análise química, aqui o que toma então um papel de maior relevância foi um estudo mais aprofundado em relação aos resíduos da análise. Ainda em grande parte dos dos laboratórios de ensaio a única preocupação é com a linearidade, verificada pelo valor do coeficiente de correlação r. Embora já existam softwares de validação de metodologias que envolvem a análise de resíduos, este é um procedimento ainda pouco ou quase nunca verificado pelos laboratórios. A validação do método, demonstrou a aplicabilidade e eficiência das técnicas estatísticas utilizadas. Autor1: Especialista, José Laurentino Ferreira, TECPAR, Rua Professor Algacyr Munhoz Mader, 3775, CIC, CEP , Curitiba, Brasil, Fone (41) , Fax (41) , e_mail: laurentino@tecpar.br Autor2: Mestre, Prof. Adilson dos Anjos, Departamento de Estatística UFPR Caixa Postal: 19081, CEP , Curitiba - PR, Brasil, Fone: / , Fax: adilson.anjos@est.ufpr.br REFERÊNCIAS [1] ANVISA. Guia para Validação de Métodos Analíticos. Brasília: [2] Draper, N. R.; Smith, H. Applied Regression Analysis. 3ed. New York: John Wiley & Sons, [3] EURACHEM. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. 1ed.1998.
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