DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR A BASE DE PEROXIDASE E ESFERAS MAGNÉTICAS PARA DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS

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1 DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR A BASE DE PEROXIDASE E ESFERAS MAGNÉTICAS PARA DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS Gabriela Valério Faculdade de Química CEATEC gabizinhavaleriio@hotmail.com Renata K. Mendes Valente Metrologia Química, Quimiometria e Química Analítica CEATEC renatavalente@puc-campinas.edu.br Resumo: Este trabalho descreve a caracterização e o uso de um biossensor enzimático confeccionado com a enzima peroxidase, presente no extrato vegetal da abobrinha, imobilizada sobre partículas magnéticas de Fe 2 O 3 para a determinação de compostos fenólicos. Os fenóis estão presentes em efluentes de diversas indústrias, principalmente nas de papel e celulose, tintas e desinfetantes e também em esgotos domésticos. A importância desta análise, é que mesmo em baixas concentrações, o fenol pode ser muito tóxico, prejudicando a fauna e a flora e até causar danos à saúde. Os sensores químicos são dispositivos pequenos, robustos, portáteis, de fácil manipulação e não necessitam da adição contínua de reagentes para a sua operação podendo, assim, fornecer informações confiáveis continuamente. Portanto, o sensor químico tem sido um elemento chave na instrumentação analítica dispensando, em muitos casos, a utilização de aparelhos complexos e a necessidade de uma enorme infraestrutura de suporte. O biossensor é um sensor químico que tem como elemento de reconhecimento uma molécula biológica, no caso a enzima peroxidase. Nesse reconhecimento, há uma interação chamada chave-fechadura ou enzima-substrato, pelo qual apenas o analito que possuir as mesmas características do sítio ativo da molécula se encaixa na biomolécula. O sinal é dado após a interação enzima-substrato passar por um transdutor. O contato da enzima com as partículas magnéticas de Fe 2 O 3 é indispensável, pois estas imobilizam mais biomoléculas na sua área de superfície, gerando maior sensibilidade. Palavras-chave: Biossensor enzimático, compostos fenólicos,partículas magnéticas. Área do Conhecimento:Ciências Exatas e da Terra Química CNPq. 1. INTRODUÇÃO O aumento inadvertido verificado nas últimas décadas da produção e utilização de produtos químicos, como por exemplo, os compostos fenólicos têm causado problemas de poluição ambiental de maneira generalizada, praticamente em todas as partes do mundo. A proteção ao meio ambiente vem adquirindo grande importância na sociedade contemporânea, que tem cobrado mecanismos, rápidos e eficientes, de controle dos processos de contaminação ambiental [1]. Encontra-se um grande número de poluentes orgânicos, possuindo uma estrutura fenólica, (sendo mais de trezentos diferentes compostos), que foram detectados em águas residuais das indústrias de papel, celulose e desinfetantes, principalmente [2]. Dentro deste contexto, é importante contar com novas metodologias de determinação e quantificação dos diversos tipos destes poluentes, com rapidez, seletividade e sensibilidade, características encontradas especialmente nos biossensores. Os biossensores podem ser definidos como um sensor químico cujo reconhecedor é um componente biológico ativo, o que significa que um processo bioquímico é a fonte do sinal analítico. Assim uma das características dos biossensores, é a sua alta seletividade com relação a um determinado analito [3]. Dentro do grupo de biossensores, existem os enzimáticos, que devido à procura pela utilização de técnicas de baixo custo estar atraindo grande interesse na área, as enzimas provenientes de tecidos brutos de vegetais se apresentam como alternativas àquelas purificadas na confecção destes dispositivos. Além disso, podem oferecer grandes vantagens, tais como a grande disponibilidade de material biológico encontrado no Brasil e boa estabilidade do bioelemento [4].

2 Desta forma, para a construção de um biossensor enzimático que possa detectar um composto poluente de interesse ambiental, que no caso será o fenol, é necessária a utilização da enzima adequada, tal como a peroxidase [5]. A peroxidase é uma óxido-redutase presente em vários vegetais como pêssego, abobrinha, tomate, soja, rabanete, nabo e batata doce. Essa enzima, na presença de peróxido de hidrogênio, catalisa a oxidação de alguns substratos como monofenóis, difenóis, polifenóis, entre outros [6]. Porém, para que os biossensores possam apresentar alta sensibilidade e seletividade, é necessária a escolha apropriada do suporte e dos reagentes utilizados no processo de imobilização. Uma das ferramentas mais recentes para a imobilização efetiva de enzimas em biossensores se refere ao uso de microesferas (micropartículas) magnéticas, como suporte para o material biológico [7]. Estas microesferas magnéticas respondem à aplicação de um campo magnético e possuem a vantagem de se dispersarem quando este campo é removido, ou seja, oferecem a conveniência da separação magnética. Desta maneira, as partículas podem ser separadas facilmente de uma fase líquida usando um pequeno imã. Assim, a biomolécula pode ser imobilizada nestas partículas magnéticas e posteriormente serem incorporadas ao material que formará a superfície sensora, permitindo que somente as enzimas fortemente ligadas às esferas sejam utilizadas no desenvolvimento de biossensores. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de biossensores de pasta de carbono a base de peroxidase, extraída da abobrinha, e imobilizada sobre partículas magnéticas de Fe 2 O 3 para a detecção de compostos fenólicos. 2. METODOLOGIA 2.1 Materiais e equipamentos Os equipamentos utilizados foram: balança de precisão Shimadzu W 220, centrífuga Excelsa II modelo 206 MP Fanem, espectrofotômetro UV/Vis HP Agilent 8453, phmetro Digimed DM 20, agitador magnético e potenciostato PGSTAT 30 AUTOLAB (Metrohm). Os reagentes utilizados foram: solução Guaiacol 2% (Dinâmica), Peróxido de Hidrogênio P.A (Vetec), óleo mineral (Nujol), Fosfato dibásico de sódio heptahidratado P.A (Synth) e Fosfato monobásico de potássio P.A (Synth), Pó de Grafite (Aldrich), Partículas Magnéticas de Fe 2 O 3 (cedidas pela Prof. Elizabeth F. de Souza). 2.2 Obtenção do extrato enzimático A partir do Quadro 1, é possível analisar as etapas da obtenção do extrato enzimático da abobrinha, no caso, a enzima peroxidase. Uma vez que esta é ideal para detectar fenol na presença de peróxido de hidrogênio. Quadro 1. Extração da atividade enzimática Preparação do biossensor usando partículas magnéticas de Fe 2 O 3 Primeiramente em um frasco Eppendorf de 250 µl, foram colocados 50 µl de esferas magnéticas. Estas foram lavadas três vezes com 100 µl de tampão fosfato 0,1 mol L -1 (ph 7,0), agitando-se por um minuto. Em seguida foi colocado em contato com um ímã para atrair as partículas, uma vez que são magnéticas, assim foi possível retirar o liquido e fazer novamente outra lavagem. Após a lavagem das partículas, foram adicionados 200 µl do extrato vegetal da abobrinha para a imobilização da enzima peroxidase sobre as partículas magnéticas por simples adsorção física, ou seja, sem reações químicas. A imobilização foi feita com agitação de um minuto a cada 5 minutos de repouso e mantida em um refrigerador. Depois de 30 minutos, foi agitado novamente por um minuto e o frasco foi colocado em contato com o ímã para retirar o líquido restante. Adicionou-se 50 µl de tampão fosfato e novamente agitou-se por mais um minuto e permaneceu em geladeira. Após, em um almofariz foram pesados 0,0625g de pó de grafite e adicionados 50 µl da solução contendo a enzima imobilizada nas partículas magnéticas. O sistema foi homogeneizado por 20 minutos, adição de uma gota de óleo Nujol e após, a maceração por mais 20 minutos. Desta forma, a pasta foi embutida no eletrodo para a realização das leituras no potenciostato novamente. Para estudar o efeito da imobilização da peroxidase via partículas magnéticas, outro biossensor foi

3 desenvolvido sem a adição das partículas e foi usado como controle. Anais do XVIII Encontro de Iniciação Científica ISSN Curva de calibração Após otimizadas as condições experimentais (tempo de interação das partículas magnéticas com a enzima, concentração de enzimas e de partículas) e testes de precisão do dispositivo e reprodutibilidade de preparação, foi realizada a curva de calibração para o biossensor. Assim, foram feitas várias adições de concentrações diferentes de guaiacol para se obter os valores de correntes em cada caso. Assim que a reta foi definida, foi obtida a equação de reta para aplicar na quantificação da amostra e encontrar o valor real da concentração Análise de composto fenólico em amostras de interesse ambiental Neste último estudo verificou-se a exatidão do biossensor, utilizando uma amostra fortificada com o fenol em estudo, no caso o guaiacol e realizou-se a varredura cíclica. Uma amostra de água residual industrial foi contaminada com 2, mol L -1 de guaiacol e, após ajuste do ph para 7,0, o biossensor foi inserido nessa solução para realização da medida, juntamente com um eletrodo de referência de Ag/AgCl e um contra eletrodo de platina. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Avaliação do comportamento do biossensor na presença e ausência de imobilização enzimática via partículas magnéticas de Fe 2 O 3 Este estudo foi realizado para verificar se a enzima imobilizada sobre as partículas magnéticas gera uma resposta maior que a enzima adicionada diretamente ao pó de grafite, pois quando a enzima é colocada em contado com as partículas magnéticas de Fe 2 O 3, ocorre uma alteração do suporte de imobilização. As respostas do biossensor apenas em solução tampão fosfato 0,1 mol L -1 ph 7,0; do biossensor sem partículas magnéticas em solução tampão fosfato 0,1 mol L -1 ph 7,0 juntamente com o peróxido de hidrogênio 10,3 mmol L -1 e o guaiacol 0,05mol L -1 ; e o biossensor com imobilização prévia das enzimas sobre as partículas nas mesmas condições experimentais, são representadas na Figura 1. Figura 1. Leitura do biossensor em solução tampão fosfato e a comparação da resposta dos biossensores com a enzima imobilizada nas partículas e diretamente no pó de grafite em solução contendo o composto fenólico (guaiacol). Na Figura 1, podemos observar a resposta de cada biossensor e a leitura apenas em solução tampão fosfato, que não gera resposta por não possuir picos devido a ausência do composto fenólico. Mas quando há adição de guaiacol, na presença de peróxido de hidrogênio, ocorre a reação enzimática. Verifica-se que a resposta do biossensor cujo elemento de reconhecimento biológico é imobilizado sobre as partículas magnéticas é muito maior que a resposta do biossensor sem as partículas de Fe 2 O 3. Isso era esperado uma vez que as partículas aumentam superfície de contato, permitindo que mais biomoléculas sejam imobilizadas no eletrodo. O mecanismo da reação enzimática para a oxidação de guaiacol na presença de peróxido de hidrogênio, pode ser melhor visualizado No Quadro 2. Quadro 2. Mecanismo da reação enzimática da oxidação de guaiacol (composto fenólico) catalisada pela enzima peroxidase [3]..

4 Onde o Fe 3+ é o cofator da peroxidase (HRP), os compostos I e II representam os intermediários da reação, sendo os estados enzimáticos de oxidação +5 e +4, respectivamente, QH 2 pode ser representado pelo guaiacol e Q, tetraguaiacol. O composto I é reduzido a composto II e o composto II a HRP (Fe 3+ ), pelo mediador QH 2. O tetraguaiacol é, então, rapidamente reduzido no eletrodo guaiacol. A corrente é proporcional à concentração de guaiacol no meio (mantendo-se a concentração do peróxido de hidrogênio constante), sendo que esta corrente pode ser relatada em termos de atividade enzimática Otimização das condições experimentais Com a finalidade de verificar as condições experimentais nas quais as respostas do biossensor eram mais adequadas, foram realizados alguns estudos de otimização. O primeiro estudo realizado foi a avaliação da influência da quantidade de partículas magnéticas na resposta do biossensor. As seguintes quantidades foram testadas: 25 µl, 50 µl,100 µl, 150 µl. A melhor quantidade das partículas magnéticas de Fe 2 O 3 no dispositivo é a de 25 µl, devido a curva apresentar maior resposta nestas condições experimentais. Conforme a quantidade de partícula no biossensor vai aumentando, a resposta vai diminuindo. Isso porque com o aumento da quantidade de partículas, aumenta-se a quantidade de enzimas imobilizadas, causando uma saturação no sistema e a consequente diminuição no sinal. Para que haja construção de biossensores estáveis, um teste é otimizar o tempo em que a enzima fica em contato com o suporte sólido em que será imobilizada. Tempos muito baixos podem causar uma interação fraca, levando a lixiviação da biomolécula com a lavagem do dispositivo. Foram estipulados os seguintes tempos de interação entre a enzima e as partículas para este estudo: 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos e 60 minutos. Permaneceu constante o valor de 25 µl da quantidade de partículas obtidas no estudo anterior. O estudo foi realizado em solução tampão fosfato 0,1 mol L -1 ph 7,0, peróxido de hidrogênio 10,3 mmol L -1 e guaiacol 0,05 mol L -1. Foi observado que há um aumento na resposta da corrente quando se aumenta o tempo de interação entre as partículas e a enzima. No entanto, isso ocorreu até 30 minutos de interação. No tempo de 60 minutos, há uma diminuição do sinal eletroquímico, devido à saturação do sistema pela imobilização de uma maior quantidade de biomolécula. Por isso, o tempo de 30 minutos de interação foi selecionado nos experimentos subseqüentes. Outra avaliação importante se refere à influência da concentração de peroxidase no desempenho do biossensor. Foram estudadas as seguintes concentrações enzimáticas: 391,1 Unidades, 782,2 Unidades, 1564,4 Unidades e 3128,8 Unidades. Foi possível averiguar que a concentração de enzima que apresentou melhor resultado foi a de 1564,4 Unidades, devido a maior resposta de corrente elétrica. Quantidades mais baixas de peroxidase apresentaram menores valores de corrente devido a menores concentrações de enzima no biossensor. O valor de 3128,8 U ml -1 apresentou um valor muito próximo ao de 1564,4 U ml -1. Como um dos objetivos da utilização de biossensores é a diminuição do custo da análise e, uma vez que não houve ganho significativo na corrente entre essas duas quantidades, a concentração de 200 µl ou 1564,4 Unidades foi selecionada para os experimentos posteriores. 3.3 Estudo da reprodutibilidade de preparação do biossensor e repetibilidade das medidas Para avaliar a reprodutibilidade de preparação do biossensor, foram preparados 5 biossensores diferentes (mas contendo os mesmos parâmetros) e as medidas serão realizadas nas mesmas condições, ou seja, em uma mesma solução contendo 5 ml de tampão fosfato, guaiacol 0,05 mol L -1 e peróxido de hidrogênio 10,3 mmol L -1. A variação entre as medidas destes 5 biossensores apresentou um desvio padrão relativo (DPR %) de 10%. Embora a imobilização da enzima sobre as partículas magnéticas aumentem a resposta voltamétrica, diminuem um pouco a reprodutibilidade do sistema quando comparado com o biossensor sem as partículas magnéticas (CV=6%, n=5). Para o estudo de repetitividade das medidas, foram feitas medidas usando um mesmo biossensor por 7 vezes, sem alterar nenhum parâmetro, ou seja, o biossensor foi imerso em uma solução contendo 5 ml de tampão fosfato, guaiacol 0,05 mol L -1 e peróxido de hidrogênio 10,3 mmol L -1 e feita a varredura por sete vezes nas mesmas condições experimentais. O DPR (%) para as medidas foi de 6,6%. Valores até 9% são aceitáveis para biossensores enzimáticos baseados em extratos vegetais.

5 3.4 Obtenção da curva de calibração Após a otimização das condições experimentais, foi avaliado o comportamento do biossensor em diferentes concentrações do fenol, que pode ser observado na Figura 2. O excesso de fenol no meio faz com que a enzima não consiga mais realizar a oxidação, e desta forma perde a linearidade. A equação da reta é observada na equação (1). y (A) = 0,00121x + 1,991 x 10-6 (mol L -1 ) Eq (1) (R 2 = 0,9978, n= 12) 3.5 Quantificação do composto fenólico em amostras de interesse ambiental Após a construção da curva de calibração, o biossensor foi testado para quantificação de guaiacol em amostras de interesse ambiental. Para isso, uma amostra de água residual industrial foi contaminada com 2, mol L -1 de guaiacol. A Figura 4 mostra o voltamograma obtido com o biossensor na amostra contaminada. Figura 2. Voltamogramas cíclicos para verificação do comportamento do biossensor em diferentes concentrações de guaiacol nas condições experimentais otimizadas Analisando a Figura 2, observa-se um aumento da resposta do sensor com a elevação da concentração do fenol no meio. Para a obtenção dos valores de corrente, foi necessário à análise das curvas no potencial em que a oxidação do fenol é maior, ou seja, 0,157 V. Assim, foi possível construir uma curva de calibração como pode-se observar na Figura 3, para avaliação do comportamento da linearidade dessa resposta. Figura 4. Voltamograma cíclico obtido com o biossensor em amostra residual de indústria (ph 7,0) contaminada com guaiacol. Utilizando-se a equação da reta obtida com a curva de calibração, é possível encontrar a concentração da amostra, substituindo o valor da corrente da amostra que é 2,24 x 10-6 (E=0,157 V), conforme amostrado abaixo: y = 0,00121x + 1,991 x 10-6 x =,,, x = 2,05 x 10-4 mol L -1 Figura 3. Curva de calibração obtida com o biossensor proposto O biossensor utilizando a enzima peroxidase imobilizada nas partículas magnéticas de Fe 2 O 3, responde bem com a variação de concentração de fenol e apresentou linearidade de 10 µmol L -1 até a concentração de 620 µmol L -1, uma vez que após esta última concentração, os valores começaram a se deslocar da reta devido a saturação do sistema. Desta forma, é possível afirmar que o biossensor é confiável, uma vez que o valor da concentração na amostra é muito próximo ao valor adicionado na matriz. Valor adicionado: 2,08 x 10-4 Valor encontrado: 2,05 x 10-4

6 Erro: Erro = 1,46% x 100 %,,, O erro relativo obtido, de 1,46%, possui valor bem baixo indicando que o biossensor realiza análises de fenol em amostra de interesse ambiental com exatidão e pode ser usado em análises de rotina em laboratórios. 4. CONCLUSÕES Os compostos fenólicos estão largamente presentes na natureza e estes, mesmo em pequenas concentrações, são altamente tóxicos e prejudiciais à saúde humana, animal e vegetal. O fenol é o subproduto da degradação de matériasprimas presente nos efluentes industriais de papel e celulose, tintas e desinfetantes que após serem liberados, são lançados nos rios mais próximos. Com a finalidade de detectar a quantidade de fenol na água de rios, foi necessário desenvolver métodos mais sensíveis, seletivos, rápidos, de fácil utilização. Estas são as características de um biossensor. E para ter um custo mais reduzido, foi utilizado extrato vegetal que contem enzima peroxidase obtida da abobrinha, criando assim o biossensor enzimático. Pôde-se verificar que o biossensor contendo as enzimas imobilizadas nas particulas magnéticas de Fe 2 O 3 aumenta a sensibilidade do dispositivo, embora diminua ligeiramente a reprodutibilidade do sistema. No caso do teste de repetibilidade, nas condições ótimas do biossensor, foi observado que não existe muita alteração de uma leitura para outra, mostrando um erro relativo baixo entre as medidas, ou seja, há precisão. Após a aplicação do biossensor na amostra fortificada com 2,08 x 10-4 mol.l -1, pode-se encontrar uma concentração muito próxima desta. Isso indica que o biossensor construído é confiável e produz medidas exatas. REFERÊNCIAS [1] FATIBELLO, F. O.; CAPELATO, M. D. (2002) Construção e aplicação de biossensores usando diferentes procedimentos de imobilização da peroxidase de vegetal em matriz de quitosana. Quim. Nova, vol. 25, p [2] ICHI, S.; MARZOUKI, M. N.; KORRI, Y. H. (2002) Direct monitoring of pollutants based on naeletrochemicalbiossensor with power novel peroxidase. Biosens. Biolectron. vol.24, p [3] MARQUES, P. R. B. O.; YAMANAKA, H. (2008) Biossensores baseados no processo de inibição enzimática. Quím. Nova, vol.31, no.7, p [4] MOCCELINI, S. K.; VIEIRA, I. C.; LIMA, F.; LUCCA, B. G.; BARBOSA, A. M. J.; FERREIRA, V. F. (2010) Determination of thiodicarb using a biosensor based on alfalfa sprout peroxidase immobilized in self-assembled monolayers. Talanta, vol.82, p [5] OZONER, S. K.; YLMAZ, F.; CALIK, A.; KESKLINLER, B.; ERHAN, E.A. (2011). A novel poly (glycinemethacrylate-co-3-thienylmenthyl methacrylate), polypyrrolecarbono nanotube horseradish peroxidase composite film electrode for the detection of phenolic compounds.current Appl. Phys., vol. 11, n. 3, p [6] OLIVEIRA, I. R. W. Z.; VIEIRA, I. C. Construção e aplicação de biossensores usando diferentes procedimentos de imobilização da peroxidase de vegetal em matriz de quitosana. (2006) Quím.Nova, vol.29, n. 5, p [7] MENDES, R.K.; LASCHI, S.; STACH- MACHADO, D.R.; KUBOTA, L.T.; MARRAZZA, G. (2012) A disposable voltammetricimmunosensor based on magnetic beads for early diagnosis of soybean rust. Sensors and Actuators B: Chemical, vol , n.20, p AGRADECIMENTOS Ao CNPq pela bolsa concedida e à PUC-Campinas pela oportunidade.