Enzimas extraídas de frutas e legumes barateiam procedimentos d ambiental, biológica, farmacêutica e industrial

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1 10 Enzimas extraídas de frutas e legumes barateiam procedimentos d ambiental, biológica, farmacêutica e industrial Valda Rocha, abobrinha, batata doce e pepino, à venda em toda e qualquer feira livre no país, têm agora uma nova função além de enriquecer o cardápio dos brasileiros. Pesquisadores do Laboratório de Analítica, Bioanalítica, Biossensores, Eletroanalítica e Sensores (Labbes), do Departamento de Química (DQ) da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), transformaram esses e outros vegetais em matéria-prima para o desenvolvimento de biossensores e métodos enzimáticos utilizados no processo de análise da concentração de substâncias químicas (analitos), através dos extratos brutos deles retirados. Essas enzimas podem ser aplicadas em análises de grande interesse nas áreas alimentícia, ambiental, biológica, farmacêutica e industrial, entre outras.

2 de análises químicas nas áreas alimentícia, Fatibello: O Brasil possui uma natureza rica e, portanto, tornase uma fonte inesgotável de enzimas, que podem ser aplicadas em diversas áreas do conhecimento Tradicionalmente, as determinações são feitas com o emprego de enzimas já purificadas, com custos altos. A utilização de tecidos ou extratos vegetais brutos, além de outras vantagens, faz com que os custos caiam a patamares mínimos, eliminando inclusive a necessidade de gastos com o processo de importação que, além de caro, é geralmente moroso. Um exemplo é a comparação entre os preços da peroxidase, enzima utilizada em vários tipos de análise, e a extraída da abobrinha (Cucurbita pepo). No caso da peroxidase, cinco mil unidades custam US$ 148,80, sem incluir as taxas alfandegárias de importação. Já um quilo de abobrinha gera 1,4 x 1011 unidades da enzima, a um preço que oscila entre 30 e 50 centavos de dólar. Orlando Fatibello, coordenador do Labbes, conta que a mesma comparação pode ser feita com as demais enzimas utilizadas comumente: tirosinase, urease e ascorbato oxidase. Mas não é só o fator financeiro que leva os pesquisadores a testarem vegetais como fonte de enzimas para análises químicas. Existem outras vantagens relevantes para a disseminação do uso de extratos vegetais brutos no desenvolvimento de biossensores ou em métodos de análise. Fatibello aponta, entre elas, a biodiversidade existente no país. O Brasil possui uma natureza rica e, portanto, torna-se uma fonte inesgotável de enzimas, que podem ser aplicadas em diversas áreas do conhecimento, afirma o pesquisador. Biossensores - Um biossensor é um dispositivo que conecta um material biológico (enzimas, anticorpos, antígenos, organismos, DNA e tecidos animais ou vegetais) a um transdutor (dispositivo que transforma um tipo de sinal em outro) adequado. No caso dos extratos vegetais brutos, deve ser um dispositivo capaz de transformar um sinal biológico em um sinal 11

3 Graziele Lautenschlaeger 12 Biossensor transforma sinal biológico em sinal elétrico, possibilitando a determinação da concentração de uma substância em uma amostra Equipe de pesquisadores do Laboratório de Analítica, Bioanalítica, Biossensores, Eletroanalítica e Sensores (Labbes) elétrico e, dessa forma, determinar a concentração de uma determinada substância em uma amostra. A escolha do transdutor mais adequado depende da característica da reação enzimática, das substâncias presentes (além da que se pretende determinar a concentração, o analito) e das características físico-químicas da amostra, sendo possível desenvolver biossensores amperométricos, potenciométricos, condutimétricos, ópticos, calorimétricos, piezelétricos e quimiluminescentes, entre outros. O Labbes vem trabalhando há algum tempo com biossensores ampero- Biossensores por quimiluminescência Luminescência é o termo empregado para descrever a emissão de luz que ocorre quando uma molécula no estado excitado decai para o estado fundamental. Os vários tipos de luminescência caracterizam-se em função da fonte de energia empregada para se obter o estado excitado. Assim, na quimiluminescência, a energia de excitação é produzida por uma reação química. Entretanto, não são comuns as reações capazes de produzir luminescência, uma vez que os produtos da reação no estado excitado, ao retornarem para o estado vibracional fundamental liberam energia na forma de calor e não na forma de luz. O interesse analítico da quimiluminescência surge da possibilidade de se obter moléculas fluorescentes sem a necessidade de uma fonte de irradiação prévia, minimizando problemas como excitação não seletiva ou instabilidade da fonte de radiação. Além disso, a instrumentação necessária para a implementação de métodos analíticos quimiluminescentes é relativamente simples, quando comparada com a instrumentação empregada nos demais métodos ópticos. Segundo o coordenador do Labbes, a combinação de detecção quimiluminescente de alta sensibilidade com sistemas enzimáticos de alta seletividade é de extrema importância. É ela que vem sendo objeto de estudos no Laboratório para a determinação de concentrações de peróxido de hidrogênio, glicose, colesterol, ácido úrico, glicerol e surfactantes, entre outros. métricos, potenciométricos, ópticos e por quimiluminescência. Processo - A obtenção de extratos brutos enzimáticos pode ser realizada por meio de diversos procedimentos específicos. O adotado pelo grupo de pesquisa do Labbes é descrito por Fatibello como sendo simples, rápido e eficiente, mantendo a atividade enzimática no extrato por mais tempo. No caso da abobrinha, o primeiro passo do processo é a lavagem e secagem do legume. Na seqüência, ela é descascada, picada e homogeneizada em um liquidificador com uma solução tampão fosfato (solução de uma base ou ácido fraco com sal conjugado) e o agente protetor PVP (polivinilpirrolidonas). Em seguida, o homogenato é filtrado em quatro camadas de gaze e centrifugado a 18 mil rpm (rotações por minuto), por 15 minutos, a 4 C. A solução sobrenadante é armazenada em refrigerador à mesma temperatura, sendo fonte da peroxidase. O processo é similar com outros extratos vegetais, para a obtenção de diferentes enzimas a serem aplicadas em diversos setores.

4 Comparação de preços entre enzimas purificadas e as extraídas de produtos vegetais Enzima purificada Unidades Preço em US$ Tirosinase , , Ascorbato oxidase Aplicação - Os métodos enzimáticos de análise consistem na utilização de uma enzima para converter uma substância (substrato) em outra passível de ser medida ou monitorada por alguma técnica analítica. Para isto, podem ser utilizados dois métodos: o do equilíbrio e o cinético. No primeiro, espera-se a reação enzimática atingir o equilíbrio antes de realizar o monitoramento de reagentes ou dos produtos; no método cinético, não há necessidade de esperar o fim da reação. Enquanto o método cinético tem como características maior rapidez e número elevado de determinações empregando o mesmo material biológico imobilizado, o que envolve o equilíbrio é geralmente mais preciso e não necessita de um rigoroso controle de temperatura. A escolha do método de análise depende também do sistema adotado. No Labbes, os pesquisadores trabalham com os sistemas de análises por injeção em fluxo (FIA). Nestes, o objetivo é mecanizar procedimentos de análise química e, dessa forma, reduzir o envolvimento do operador, melhorando a precisão das medidas e aumentando o Unidades 2,8x109 1,1x1011 2,3x105 Preço em US$ (por quilo) 0,30 a 0,50 1,4x1011 1,7x105 0,30 a 0,50 31,70 Feijão de soja 2,2x107 1,00 a 1,30 19,00 Pepino 2,6x106 0,40 a 0,70 Sistema de análise adotado busca a mecanização dos procedimentos, para melhorar a precisão das medidas e aumentar o número de amostras processadas por unidade de tempo Graziele Lautenschlaeger Urease Produtos naturais Após ser lavada e seca, abobrinha é homogeneizada com outras substâncias no liquidificador. O homogenato é filtrado e centrifugado. A solução sobrenadante é então armazenada em refrigerador, sendo fonte de peroxidase 13

5 14 Para a obtenção de um biossensor, imobiliza-se o material biológico em uma membrana adequada, que é então acoplada à superfície do transdutor. No esquema, o cubo representa a substância que está sendo determinada (analito). Ao difundir-se pela membrana externa, ela entra em contato com o sítio de reconhecimento (neste caso, o centro ativo da enzima), que catalisa com alta seletividade a reação de transformação do analito em produto. O transdutor pode então monitorar o decréscimo da concentração de algum reagente ou o aumento de algum produto na reação enzimática. Imobilização da enzima reduz custo e aumenta rapidez e exatidão da análise Nos procedimentos enzimáticos para a determinação de um analito de interesse, a imobilização ou insolubilização de um material biológico é extremamente importante, pois substitui a utilização desses materiais na forma solúvel, evitando assim a necessidade de removê-los do meio reacional para uma posterior aplicação. Dessa maneira, o emprego de uma enzima imobilizada, além de diminuir o custo por análise, aumenta a rapidez e exatidão do processo analítico. Os métodos de imobilização de enzimas podem ser divididos em dois grupos. Um é o da oclusão ou confinamento, que está subdividido em oclusão em gel e microencapsulação. O outro método é por ligações químicas, que subdivide-se em adsorção física, ligação química covalente e ligação química covalente cruzada. O grupo de pesquisa do Labbes emprega, na construção de biossensores, a imobilização da enzima por adsorção física e, principalmente, por ligação química covalente cruzada. Essa última consiste na formação de partículas macroscópicas a partir de ligações covalentes cruzadas entre as moléculas da enzima e as de suporte inerte. número de amostras que podem ser processadas por unidade de tempo. Em muitos casos, o consumo de reagentes e, conseqüentemente, a produção de resíduos são consideravelmente reduzidas em comparação com outros procedimentos. Nesses sistemas, alíquotas da amostra e, eventualmente, de reagentes, são inseridas em uma solução que as transporta através do percurso analítico em direção ao detector. Durante o transporte, a amostra pode receber reagentes, sofrer diluições e participar de etapas de separação e concentração. Em virtude do contato com a solução transportadora, ocorre a dispersão da amostra, originando gradientes de concentração. A dispersão é dependente das características físico-químicas das soluções, como a viscosidade, além de fatores hidrodinâmicos (vazões, volume de amostra, comprimento e diâmetro dos tubos que constituem o percurso analítico). Como a medida é feita com a amostra em movimento em relação ao detector, é obtido um sinal transiente, cuja altura pode ser relacionada à concentração da espécie medida (analito de interesse). Fungos - Além dos vegetais empregados como fonte enzimática, o Labbes, em parceria com a professora Aneli de Melo Barbosa, da Universidade Estadual de Londrina (UEL), vem utilizando a enzima lacase, obtida a partir do fungo Pleurotus ostreatus. Em condições especiais de cultivo em laboratório, o fungo produz extracelularmente a lacase, que é então separada do meio de cultivo, caracterizada e empregada na construção de biossensores para detecção de compostos fenólicos. O Pleurotus ostreatus é um cogumelo encontrado no mundo todo. Seu sabor é bem acentuado, ocupando o quarto lugar no consumo mundial, sendo conhecido nas culturas orientais como hiratake. Os biossensores desenvolvidos a partir do extrato bruto do fungo são formados por eletrodos de pasta de carbono modificados, constituídos por uma mistura na qual o pó de grafite é o componente principal. Eles são utilizados na análise química da concentração dos analitos adrenalina e dopamina em produtos farmacêuticos.

6 15 Confira as aplicações dos extratos brutos enzimáticos de alguns vegetais Produtos naturais Extrato bruto Analito Aplicação em análises (Persea americana) Adrenalina dopamina isoproterenol paracetamol Dopamina (Curcubita pepo) L-cisteína paracetamol Fenóis totais Água residuária Ácido ascórbico Produtos alimentícios e farmacêuticos Dopamina Fenóis Água residuária Hidroquinona Revelador fotográfico, creme dermatológico Peróxido de hidrogênio, água de piscina, produtos de limpeza (Ipomoea batatas) L-dopa carbidopa dopamina metildopa Fenóis totais Água residuária Hidrazina Água de caldeira Sulfito Produtos alimentícios Hidroquinona Revelador fotográfico Feijão de soja Urease (Canavalia ensiformis (L.) DC) Uréia Adubo Pepino (Cucumis hifridus) Ácido ascórbico Produtos alimentícios e farmacêuticos Ascorbato oxidase