X=Microrganismo. X= Microrganismo S= Substrato P= Produto. P= Produto. X=X(t) S= S(t) Limitante P= P(t) Econômico. S= Substrato

Transcrição

1 Cinética de Processos Fermentativos

2 Cinética de Processos Fermentativos Microrganismo Microrganismo ubstrato P Produto (t) (t) Limitante P P(t) Econômico ubstrato P Produto

3 Cinética de Processos Fermentativos

4 Bioprocessos Cinética de Processos Fermentativos È a analise dos valores de concentração de um ou mais componentes do sistema de cultivo, em função do tempo de cultivo. Entende-se como componentes, o microrganismo (ou biomassa), os produtos do metabolismo (metabólitos) e os nutrientes ou substratos que compõem o meio de cultura.

5 Cinética de Processos Fermentativos em o conhecimento da cinética torna-se inviável a transposição de escala do laboratório para a industria. Através da cinética possibilita uma comparação quantitativa entre condições de cultivo; Ex: ph, temperatura, geralmente obtidos em curvas de ajuste onde: (t), PP(t), (t) por variáveis como velocidade de transformação ou fatores de conversão

6 Cinética de Processos Fermentativos Parâmetros de Transformação Produtividade em biomassa: P m t Produtividade do Produto: f o ; P p P m t fp P o ;

7 Cinética de Processos Fermentativos Velocidades instantâneas de transformação: As velocidades instantâneas de reprodução de microrganismos, de consumo de substrato e de formação de produto podem ser representadas pelas seguintes expressões: Velocidades de crescimento: r x dx ; dt Velocidade de consumo de substrato r s ds ); dt Velocidade de formação de produto: r p dp dt ;

8 Cinética de Processos Fermentativos Velocidades específicas de transformação: A concentração, aumenta durante o cultivo descontínuo, aumentado o complexo enzimático da transformação de em P. Por isso, é preciso especificar com relação a. Velocidades específica de crescimento: x 1 dx ; x dt Velocidade específica de consumo de substrato s 1.( x ds ); dt Velocidade específica de formação de produto: p 1 x. dp dt ;

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10 Cinética de Processos Fermentativos Fatores de Conversão: Consideramos determinado tempo t de fermentação determinados os valores, e P: um e Fator de conversão de ubstrato em célula: Y / o o Fator de conversão de produto em célula o Y / P ; P Po Fator de Conversão de substrato em produto Y P / P o o Po ;

11 Cinética de Processos Fermentativos e os três fatores permanecerem constantes durante todo o cultivo, o que não ocorre com frequência, as três expressões anteriores pode ser aplicadas no final da fermentação com ( m ; PP m ; 0) Fator de conversão de ubstrato em célula: m _ o Y / o Fator de conversão de produto em célula m o Y / P ; Pm Po Fator de Conversão de substrato em produto Y P / P m P o o ;

12 Cinética de Processos Fermentativos Eliminando a grandeza o, pela combinação das equações: o Y e / o _ Fator de conversão de ubstrato em célula: m _ Y / O fator de conversão agora pode ser obtido de um forma mais precisa, porque o, apresenta erros experimentais mais elevado que m, Entretanto nem sempre a concentração de substrato se esgota completamente, quando o valor de é máximo. Isso ocorre porque a medida que o micro- organismo cresce forma metabólitos que podem inibir o crescimento Y / m _ o

13 Cinética de Processos Fermentativos Inicialmente o fator de conversão Y x/s /s, foi definido por Monod, e tem sido útil na análise de alguns processos como o de produção de proteína microbiana. Desde que seja conhecido o valor de Y x/s /s, é possível calcular o valor de, a partir de valor conhecido de e vice-versa versa. Este fator é útil, na determinação do valor da concentração de substrato limitante. O valor de o, definirá a concentração máxima da população microbina ( m ); 0 Yx / s.0 Em outras palavras, se em uma outra experiência, de um cultivo descontínuo, se o valor de o, for inferior ao precedente, porém com concentrações idênticas dos demais componentes, inclusive, o proporcionará um valor de m, proporcionalmente menor no final do cultivo, então vale a equação: Y. m x / s m

14 Cinética de Processos Fermentativos Durante um cultivo descontíno, sob condições especiais, concentração de não muito elevada, agitação perfeita do meio, é possível verificar a contância de Y x/s /s,, com o auxílio da expressão Y. m x / s Representando os valores experimentais de, em função de, resultando em uma reta. As mesmas considerações podem ser aplicadas para os demais fatores Y /P e Y P/ Yx/s m

15 Cinética de Processos Fermentativos Entretanto, se Y x/s /s, Y x/p ou Y p/s /s,, não forem constantes, deverão ser levado apenas seus valores instantâneos: Y / d d Y / P d dp Y P / dp d Considerando as definições de velocidades e velocidades específicas: Y / r r Y / P r r P P Y Y. Y / / P P / Y P / r r P P

16 Cinética de Processos Fermentativos Em fermentações industriais, dificilmente são observados valores constantes destes parâmetros, devido alguns fatores, como tempo de mistura, transferência de oxigênio, sistema de agitação. Além destes fatores, há de se considerar que as celulas utilizam parte do substrato, para sua manutenção: Este conceito introduzido por Pirt, considera um consumo específico para a manutenção celular m s ( r c s ) m r ( r ) + ( r ) Y / r ( r ) C s m r r Y +. / Y + / m m

17 Cinética de Processos Fermentativos e Y / e m, forem constantes a relação entre s e deve ser linear. Esta definição de fator de conversão verdadeiro, se aplica mais adequadamente aos processos fermentativos. Uma generalização mais ampla pode ser aplicada, considerando ainda o consumo de substrato para a formação de produto (r ) p Y / + Y p P / + m P

18 Cálculo das Velocidades Os cálculos das velocidades instantâneas e velocidades específicas de transformação dependem em primeiro lugar dos traçados das curvas a partir de pontos experimentais. Estes traçados e ajustes podem ser feitos manualmente, com programas de computador ou ainda atravez de curvas representadas por equações. O traçado manual, exige um bom conhecimento do processo em estudo. Em geral para um grande número de casos, os perfis das curvas de formação de microrganismos () e de formação de produto em função do tempo, apresentam forma sigmoidal crescente, enquanto o perfil de ubstrato, é decrescente

19 Cálculo das Velocidades

20 Cálculo das Velocidades 1. Após o ajuste das curvas, traçar retas tangentes, em um determinado instante t; 2. Calcular as velocidades instantâneas r, r e r P ; 3. Calcular as velocidades específica, e P.

21 Cálculo das Velocidades Instantâneas d 4 2 2g / L r 0,45g / L. h dt 6,2 1,8 4,4h dp g / L r 7,9g / L. h dt 7,1 3,3 3,8h dp g / L r P 4g / L. h dt 8,3 3,3 5h

22 Cálculo das Velocidades Específicas 2 /.. 0,13. h dt 3,5g / L 6,2 1,8 3,5g / L 3,8h 1 d g L 1 1 dp g / L 1.. 2,3. h dt 3,5 7,1 3,3 3,5g / L3,8h P 1 dp g / L ,1 h dt 3,5 8,3 3,3 3,5g / L 5h

23 Cálculo das Velocidades

24 Cálculo das velocidades

25 A curva de crescimento celular

26 A curva de crescimento celular 1. Fase lag ou de latência, segue a inoculação do meio nutritivo e é um período de adaptação; Quando uma cultura microbiana é mudada de um ambiente para outro, é necessário reorganizar ambos os seus constituintes, micro e macromoleculares; Isto pode envolver a síntese ou repressão de enzimas. A fase lag, como conseqüência, pode ser muito curta ou muito longa. Pode haver uma aparente ou pseudo fase lag quando o inóculo é pequeno ou tem baixa viabilidade, já que o crescimento somente pode ser registrado acima do nível de sensibilidade do método de análise; A duração da fase lag é bastante difícil de estimar. O objetivo geral de um bom processo seria minimizar a fase lag e maximizar a velocidade (taxa) e a duração da fase exponencial; A duração da fase lag depende: Das mudanças em composição de nutrientes experimentados pela célula; da idade e viabilidade celular; do tamanho do inóculo

27 A curva de crescimento celular 1. A fase log ou exponencial é caracterizada por uma linha reta em um gráfico semi-log de ln versus tempo; Esse é um período de crescimento balanceado ou crescimento em estado estacionário, durante o qual a velocidade de crescimento específica x, é constante e máxima m ; m Durante a fermentação a composição química do caldo está variando, já que nutrientes estão sendo consumidos e produtos metabólicos estão sendo produzidos; Como uma conseqüência, o ambiente não está em estado estacionário. Num intervalo de concentração de nutrientes, a taxa de crescimento é independente da concentração; Também, durante a fase log, a composição macromolecular da célula permanece constante.

28 A curva de crescimento celular Em algum momento, a velocidade de crescimento começa diminuir, ou devido ao desaparecimento de um nutriente essencial ou devido ao acúmulo de um produto inibidor; A célula passa por uma transição até que a velocidade de crescimento seja zero. Essa é a fase estacionária ocorre quando todas as células pararam de dividir ou quando todas as células viáveis alcançaram equilíbrio com células mortas, mas ainda há metabolismo e acúmulo de produtos na célula ou no caldo; A massa celular total, pode permanecer constante, mas o número de células viáveis provavelmente diminuirá; Como a viabilidade decresce, pode ocorrer lise celular, e a massa diminuirá; Isso leva à criação de um meio complexo de produtos de lise, e um período secundário de crescimento, pode acontecer o chamado crescimento crítico; Freqüentemente, metabólitos secundários não essenciais são formados por sistemas enzimáticos não presentes ou não funcionando previamente na célula.

29 A curva de crescimento celular Fase de Morte: Poucos estudos têm sido feitos sobre a fase de morte de culturas de células; Talvez porque a maioria dos processos microbianos descontínuos industriais são terminados antes da fase de morte começar. Na fase exponencial a velocidade de crescimento é diretamente proporcional a concentração de, Isto é: d dt m. ln i m.( t ti ) ou i [ ( t t )]. l m i

30 A curva de crescimento celular Na fase exponencial a representação semilogaritmica da concentração celular com o tempo de cultivo, resulta em uma reta, até tc: ln ln + t 0 ln ln o tempo

31 A curva de crescimento celular A fase exponencial também é caracterizada frequentemente pelo tempo de geração t g, tempo necessário para dobrar a concentração de ln i m.( t ti ) 2.i ln m.( t g i ) m ln2 0, 693 t t g g

32 TEMPO DE GERAÇÃO Crescimento de Bactérias por Divisão t g min Crescimento de Levedura t g min

33 CLAIFICAÇÃO DO PROCEO FERMENTATIVO Formação de produto metabólito pode ser relacionada a consumo de nutriente; Além do mais, formação de produto não pode ocorrer sem a presença de células; Assim, é esperado que crescimento e formação de produto estão intimamente relacionados à utilização de nutrientes que dependendo dos controles metabólitos regulatórios; A formação de produto será ligada ao crescimento e/ou concentração celular.

34 CLAIFICAÇÃO DO PROCEO FERMENTATIVO A relação cinética entre crescimento e formação de produto depende do papel do produto no metabolismo celular; As duas cinéticas mais comuns são aquelas que descrevem a síntese do produto durante o crescimento e após o crescimento ter cessado; Um exemplo menos comum aplica ao caso onde o crescimento inicialmente ocorre sem formação de produto, mas após algum período de tempo o produto começa a aparecer enquanto o crescimento continua.

35 No gráfico (a), a formação de produto é associado ao crescimento celular No gráfico (b), temos formação de produto associado ao crescimento, de uma forma mais ou menos confusa, chamada de formação de produto misto, ou, parcialmente associada ao crescimento No gráfico (c), temos formação de produto não associada ao crescimento.

36 Exemplos de Produtos Associado e Parcialmente Associado ao Crescimento

37 CLAIFICAÇÃO DO PROCEO FERMENTATIVO 1 1 / max / max p / pmax p / pmax d) t (e) t 1 p / pmax / max (f) t Os gráficos mostram: (d) formação de produto associada ao crescimento; (e) formação de produto parcialmente associada ao crescimento e (f) formação de produto não associada ao crescimento.

38 CLAIFICAÇÃO DO PROCEO FERMENTATIVO Os comportamentos relativos as funções (t), também fornecem base para classificação dos processos fermentativos, proposta por Gaden. Produto associado ao crescimento

39 CLAIFICAÇÃO DO PROCEO FERMENTATIVO Os comportamentos relativos as funções (t), também fornecem base para classificação dos processos fermentativos, proposta por Gaden. Produto parcialmente associado ao crescimento

40 CLAIFICAÇÃO DO PROCEO FERMENTATIVO Os comportamentos relativos as funções (t), também fornecem base para classificação dos processos fermentativos, proposta por Gaden. Produto formado denominado como metabólito secundário, porque não se enquadra em nenhum dos tres grupos

41 CLAIFICAÇÃO DO PROCEO FERMENTATIVO Em uma fermentação, é importante determinar se o produto é formado por em reações necessárias ao crescimento e manutenção celulares (produto primário ou intermediário) ou se o produto é formado em reações que não são essenciais ao crescimento (produto secundário do metabolismo). A correlação empírica mais utilizada para classificar a formação de um produto foi proposta por Luedeking e Piret (1959) para interpretar a formação de ácido lático por Lactobacillus delbrueckii, e apresenta a forma: p α.x + β α e β...são parâmetros do modelo e são constantes num determinado sistema de produção a valores fixos de ph e temperatura.

42 CLAIFICAÇÃO DO PROCEO FERMENTATIVO Assim, no contesto cinético, pode-se classificar o produto como: Associado ao crescimento: quando (β0 e α 0) Não associado ao crescimento: quando (β 0 e α 0)(a sua síntese inicía-se depois de o crescimento ter cessado). Parcialmente associado ao crescimento: quando ambos parâmetros são positivos. (β 0 e α 0) Este modelo simples tem-se revelado suficientemente versátil para descrever a grande maioria das cinéticas de formação do Produto. Exemplos típicos: Antibióticos (produtos secundários); Proteínas Recombinantes (produtos secundários); Ácido lático (produto intermediário); Ácido Cítrico (produto intermediário); Ácido Glucônico (produto intermediário).

43 CLAIFICAÇÃO DO PROCEO FERMENTATIVO Outra classificação, baseada na associação entre formação do produto com microrganismo em produção ou não é devida a classificação de KONO, AAI, dividido em tres grupos: Processos em que a formação do produto esta associada apenas à atividade de celulas em reprodução como, por exemplo, na produção de sorbose; Processos em que a formação de produto esta associada à atividade de todas as células, em reprodução ou não, como por exemplo a produção de ácido lático; Processos em que a formação de produto esta associada apenas à atividade das células que não se reproduzem, no caso da produção de ácido cítrico

44 INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTE NA VELOCIDADE EPECÍFICA DE CRECIMENTO Durante a maioria das fermentações descontínuas típicas, a velocidade específica de crescimento é constante e independente da concentração de nutrientes que está variando; A velocidade de crescimento, como uma velocidade de reação química, é uma função da concentração de compostos químicos; Os compostos químicos nesse caso são os nutrientes essenciais para o crescimento; A forma da relação entre velocidade de crescimento e concentração de nutriente foi observada em 1949 por Monod, O modelo de Monod tem a forma:. m K s +

45 INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTE NA VELOCIDADE EPECÍFICA DE CRECIMENTO. m K s + vel. específica de crescimento; max vel. espec. de crescimento máximo; concentração de nutriente; K constante de saturação e é igual a quando 0,5.max

46 O modelo de Monod tem a forma: Linearização da Equação de Monod K s m +. max max K max max max max K K K s s s m Portanto:

47 INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTE NA VELOCIDADE EPECÍFICA DE CRECIMENTO O significado de Ks pode ser deduzido fazendo-se Ks. Resultando x m/2. Ks representa a [] na qual x é a metade de seu valor máximo. Representação da equação de Monod. Ex: para m 0,14 h-1 e Ks 0,60 mg/l (valores hipotéticos).

48 INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTE NA VELOCIDADE EPECÍFICA DE CRECIMENTO A equação de Monod representa uma simplificação de várias situações reais: *Não prevê fase LAG (x x0) >>> Ks. *Não prevê fase estacionária (embora não seja nulo, 0; x0. *Não prevê nem um tipo de inibição. *Não se aplica a cultivos com limitação de outros nutrientes (apenas limitante). Representação da equação de Monod. Ex: para m 0,14 h-1 e Ks 0,60 mg/l (curva B), Ks 0,030 mg/l (curva A).

49 A curva apresentada pela em função do tempo (condições experimentais), apresenta um trecho máximo e constante (AB), após a fase LAG curta. Variação da (x) e do tempo de geração (tg), no cultivo descontínuo.

50 Representação da equação linearizada do modelo de MONOD: 1 K max max 1/x Ks/ máx 1/ máx 1/

51 -Outros Modelos Matemáticos: Estes modelos, como o de Monod, támbém não levam em conta o fenômeno da inibição (pelo substrato ou pelo produto).

52 O fenômeno de inibição do crescimento celular (figura abaixo) somente se aplica para valores de relativamente baixos,menores ou iguais a Ks Ks. Cinética de inibição pelo substrato (curva A) e sem inibição (---). K K K s i s i s m x + +,, *.

53 Com o objetivo de explicar a redução da velocidade específica de crescimento provocada pelos altos valores iniciais de substrato, uma modificação foi proposta para a Equação de Monod: x. m K s + * K K i, s i, s + K s Constante de saturação definida na Equação de Monod; K i,s Constante de inibição pelo substrato; max K i,s K s, quando: x, porém para um valor de, que 2 provoque a inibição, sendo assim superior ao correspondente da equação de Monod.

54 Quanto a inibição pelo produto, um equacionamento semelhante foi proposto por JERUALIMKY & NERONOVA x m. K s + * K K i, P i, P + K s Constante de saturação definida na Equação de Monod; K i,p Constante de inibição pelo produto;

55 Exercício: 4) Os dados obtidos de uma fermentação descontínua estão ilustrados na tabela abaixo. Determine: a) A forma linear do modelo matemático de Monod, demonstrando graficamente os coeficientes linear e angular. b) Os parâmetros cinéticos Ks e m, utilizando a forma linear no modelo de Monod encontrada no item (a). T (h) (g/l) (g/l) dx/dt 0,00 15,50 74,00 12,24 0,52 22,50 61,00 15,90 0,86 28,60 49,00 19,63 1,18 35,30 37,00 22,29 1,43 41,10 26,00 23,92 1,74 48,20 11,00 20,20 2,06 53,00 3,00 9,12