ANÁLISE DO PODER PREDITIVO DOS GENES ARD1A E NGX6 EM PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA

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1 ANÁLISE DO PODER PREDITIVO DOS GENES ARD1A E NGX6 EM PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA Ribeiro EA 1, Silva RM 1, Canto AL 2, Moraes LHF 3, Canevari RA¹. 1 Laboratório de Biologia Molecular do Câncer, LEVB, Universidade do Vale do Paraíba, IP&D; 2 Centro de Medicina Diagnóstica, São José dos Campos, Brasil; 3 Hospital São Francisco de Assis, Departamento de Mastologia, Jacareí, Brasil. elianeribeiro319@gmail.com Resumo - No câncer de mama os linfonodos axilares são considerados o fator prognóstico mais informativo para a conduta terapêutica. A identificação de marcadores moleculares poderá ser uma ferramenta adicional na seleção mais específica das pacientes onde a remoção dos linfonodos axilares é mais indicada. O objetivo deste estudo é avaliar se os genes ARD1A e NGX6 são marcadores preditivos do envolvimento dos linfonodos axilares em pacientes com câncer de mama. Para isto, foi realizada a análise de expressão gênica pela técnica de RT-qPCR em 51 amostras de tumor primário, sendo 28 tumores primários linfonodo negativo, 23 tumores primários linfonodo positivo e 11 metástases axilares correspondentes. A expressão diferencial para os genes analisados não foi observada quando realizadas as comparações entre os grupos de tumores primários linfonodo positivo, linfonodo negativo e linfonodos correspondentes. Estes resultados sugerem que os genes ARD1A e NGX6 não tem poder preditivo no envolvimento de linfonodos em tumores mamários humanos. Palavras-chave: expressão gênica, câncer de mama, linfonodos. Área do Conhecimento: Biomedicina Introdução Considerando as estatísticas do Instituto Nacional do Câncer (INCA), a estimativa é de novos casos para o câncer de mama no Brasil em 2016 (INCA, 2016). Apesar de ser conceituado um câncer de bom prognóstico se diagnosticado e tratado apropriadamente, as taxas de mortalidade permanecem altas, uma vez que, na maioria dos casos, este tumor ainda é diagnosticado em estágios avançados. O câncer de mama é uma doença de grande heterogeneidade histológica e genética, caracterizada por diferentes diagnósticos clínicos (CANEVARI et al., 2016; PEROU et al., 2000). O potencial metastático já é possível de ser analisado no tumor primário, portanto a metástase pode ser prevista e marcadores moleculares prognósticos poderão ser detectáveis (WANG et al., 2015). O linfonodo axilar é o primeiro sítio de metástase no câncer de mama, sendo considerado o fator prognóstico mais importante, predizendo o desenvolvimento de metástases à distância (COLLEONI et al., 2006; GURLEYIK et al., 2011). Os linfonodos axilares também são utilizados como marcadores preditivos. Fatores preditivos são características clínicas, patológicas ou biológicas que estimam a probabilidade do desenvolvimento de metástases nos linfonodos axilares, que podem indicar a necessidade ou não para o procedimento da Dissecção dos Linfonodos Axilares (DLNA) onde pacientes linfonodo negativas ao diagnóstico podem ser poupadas da realização do exames de DLNA (YENIDUNYA, et al., 2011).Os fatores preditivos também podem ser particularmente úteis na clínica nos casos onde a Biópsia do Linfonodo Sentinela (BLNS) é imprecisa ou falso-negativa (presença de micrometástases), oferecendo assim uma estratégia para a redução de resultados falso negativo. Contudo, o significado biológico da presença de micrometástases em linfonodo e sua utilidade em guiar a terapia adjuvante axilar e sistêmica tem sido objeto de muitos resultados discordantes. Embora vários desses parâmetros clínicos patológicos sejam geralmente considerados fortes fatores preditivos de metástases, eles falham em classificar precisamente os tumores de mama de acordo com seu comportamento clínico e a predição de recorrência tumoral. Com o advento dos métodos diagnósticos baseados em PCR, em especial a técnica de PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR), tem sido possível a detecção de metástase em linfonodos axilares em câncer de mama, 1

2 as quais identificaram vários marcadores moleculares com significativo potencial prognóstico em relação ao risco de metástases axilares e sistêmicas. O objetivo deste estudo é avaliar se os genes ARD1A e NGX6 são marcadores preditivos do envolvimento dos linfonodos axilares em pacientes com câncer de mama. Metodologia Este estudo foi desenvolvido com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade do Vale do Paraíba (parecer número ). A expressão dos dois genes NGX6 e ARD1A foi avaliada em 51 amostras, sendo 28 tumores primários linfonodo negativo, 23 tumores primário linfonodo positivo e 11 de metástases em linfonodo correspondente. Amostras de pacientes submetidas à redução mamária foram utilizadas como controle normal do estudo. A coleta das amostras foi obtida após procedimento cirúrgico de pacientes com carcinoma mamário (mastectomia radical ou parcial). Após a coleta, a peça total foi transportada para a clínica CIPAX, São José dos Campos, SP, onde foi realizada a macrodissecção por um médico patologista. Este procedimento permite a presença de aproximadamente 80% de células tumorais no fragmento. Posteriormente, a amostra foi transportada em nitrogênio líquido e armazenada em um freezer à -80 C. As extrações do RNA foram realizadas utilizando o protocolo RNeasy Lipid Tissue (Qiagen). As determinações quantitativas e qualitativas das amostras de RNA extraídas foram realizadas pela técnica de espectroscopia de absorção no equipamento NanoDrop (ND-1000 Spectrophotometer v.3.0.1, Labtrade) e eletroforese em gel de agarose a 1%, respectivamente. A síntese de cdna foi realizada pelo sistema de síntese de primeira cadeia Superscript IV, contendo SuperScript IV / RNaseOUT Enzyme Mix, 2X First-Strand Reaction Mix, e Buffer de anelamento (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA). A análise de expressão gênica foi realizada pela técnica de RT-qPCR no equipamento ABI PRISM 7500 Sequence Detection Systems (Life Technologies, USA) utilizando o corante Platinum SYBR Green RT-qPCR Super Mix UDG (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA). Os iniciadores para amplificação dos genes alvos ARD1A e NGX6 e do gene endógeno (referência) MRLP19 foram desenhados utilizando o software Primer Express (versão 3.0) (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). As condições de reações foram estabelecidas para cada gene em particular. Por último, uma curva de dissociação foi elaborada para comprovar a especificidade da amplificação, com as seguintes condições: 1 ciclo de 95 C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 95 C e 1 minuto a 60 C. A eficiência de amplificação dos iniciadores foram determinadas pela construção de curvas-padrão a partir de diluições em série de um pool de cdna de mama normal e carcinoma mamário para todos os genes alvos ARD1A e NGX6 e o gene endógeno MRLP19. A análise do desempenho da reação foi feita pelo coeficiente de correlação da curva-padrão. A eficiência foi calculada pela fórmula: E=10-1/slope -1. Os resultados foram analisados pelo método Delta-Delta Ct (ΔΔCt) (PFAFFL, 2001), no qual para cada amostra, o valor de ΔCt foi determinado subtraindo a média das duplicatas dos valores de Ct do gene de interesse, da média das duplicatas dos valores de Ct do gene referência (MRPL19). A determinação do valor de ΔΔCt foi subtraída do valor de ΔCt das amostras normais. Este último valor foi adicionado a fórmula 2 (-ΔΔCt) e para cada amostra a quantidade de transcrito (N vezes > ou < que o normal) foi determinada pela comparação com amostras de tecido mamário normal. Foram considerados os valores de QR (quantificação Relativa ou fold change), a diminuição de expressão gênica estabelecida com QR inferior a 0,5 e o aumento de expressão gênica quando o valor de QR for superior a 2, conforme estabelecido em literatura. As análises estatísticas para os dados de RT-qPCR foram realizadas por meio do teste t de Mann Whitney utilzando o software GraphPad Prism version 5.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Os resultados foram considerados estatisticamente significantes de p value 0,05. Resultados Os RNAs extraídos apresentaram concentrações adequadas para a realização da análise de expressão gênica e razões 260/280 nm e 260/230 nm com média 1,97 e 2,0 respectivamente, o que 2

3 demonstrou a inexistência de contaminação por proteínas e reagentes nas amostras. A integridade dos RNAs pode ser visualizada por meio da eletroforese em gel de agarose, sendo possível a visualização das bandas 18S e 28S. Pela análise da curva padrão realizada para os genes alvo ARD1A e NGX6 e para o gene endógeno MRPL19 foi possível validar a eficiência de amplificação, com valor de referência do slope próximo a -3,32 que demonstra a alta eficiência de ambos os iniciadores utilizados no estudo. Para o gene ARD1A, o valor de slope foi de -3,12, o valor de eficiência dos iniciadores foi de 107 e o coeficiente de linearidade foi de 0,99. Para o gene NGX6, o valor de slope foi de -3,148, o valor de eficiência foi de 107 e o coeficiente de linearidade foi de 0,99. Para o gene endógeno MRLP19, o valor de slope foi de -3,34, o valor de eficiência foi de 98,65 e o coeficiente de linearidade foi de 0,99. Pela análise da curva de dissociação não foi verificado a presença de primer dimers ou contaminação na amostra em todos os genes analisados. Neste estudo duas análises foram realizadas (Análise 1 e Análise 2) que diferem em relação aos grupos de amostras que foram comparadas. Na análise 1, foi comparado o grupo de tumores primários de pacientes com acometimento de linfonodos versus o grupo de pacientes com tumores primários sem envolvimento de linfonodos. Nesta análise não foi detectada valor estatisticamente significativo para ambos os genes avaliados ARD1A e NGX6 (P 0,05). Os dados referentes à Análise 1 estão representados Tabela 1 e Figura 1. Tabela 1: Valores de p value referentes À comparação da expressão gênica do grupo de tumor primário sem acometimento de linfonodo com o grupo de amostras de tumor primário com acometimento de linfondos (Análise 1) e da comparação do grupo de tumor primário com os linfonodos acometidos correspondentes (Análise 2) (teste de Mann Whitney). Gene p value Análise 1 p value Análise 2 ARD1A 0,4108 0,5614 NGX6 0,6809 0,7089 Figura 1: Relação dos níveis de expressão pela técnica de RT-qPCR dos genes ARD1A (I) e NGX6 (II) nos tumores primários com e sem envolvimento de linfonodos referentes à Análise 1. (I) (II) QR: Quantificação Relativa do gene. TP: Tumor Primário Para o gene ARD1A, no grupo de pacientes com tumor primário com acometimento de linfonodos, quatro amostras apresentaram aumento de expressão (Quantificação Relativa, QR = 2,22 a 4,85) e 21 amostras apresentaram expressão normal. No grupo de pacientes com tumor primário sem acometimento de linfonodos foram observadas sete amostras com aumento de expressão (QR = 2,10 a 732,89), uma amostra apresentou diminuição de expressão (QR = 0,39) e 20 amostras apresentaram expressão normal. Ao relacionar os dois grupos (tumor primário com acometimento de linfonodos versus tumor primário sem acometimento de linfonodos) não foram observados diferença estatisticamente significativa (P value = 0,4108). Para o gene NGX6, no grupo de pacientes com tumor primário com acometimento de linfonodos, cinco amostras apresentaram aumento de 3

4 expressão (QR = 2,28 a 4,87), cinco amostras apresentaram diminuição de expressão (QR = 0,17 a 0,50) e 13 amostras apresentaram expressão normal. No grupo de pacientes com tumor primário sem acometimento de linfonodos foi observado seis amostras com aumento de expressão e 22 amostras com expressão normal. Ao relacionar os dois grupos, (tumor primário com acometimento de linfonodos versus tumor primário sem acometimento de linfonodos), não foram observados diferença estatisticamente significativa (P value = 0,6809). Na análise 2, foi comparado o grupo de tumores primários com linfonodos correspondentes das mesmas pacientes. Nesta análise não foi detectada valor estatisticamente significativa para ambos os genes avaliados ARD1A e NGX6 (P value 0,05). Os dados referentes à Análise 2 estão representados abaixo e demonstrados na Tabela 1 e Figura 2. Figura 2: Relação dos níveis de expressão gênica pela técnica de RT-qPCR dos genes ARD1A (I) e NGX6 (II) nos tumores primários positivos e linfonodos correspondentes, referentes à Análise 2. (I) (II) QR: Quantificação Relativa do gene. TP: Tumor Primário Para o gene ARD1A, no grupo com tumor primário com acometimento de linfonodos, três amostras apresentaram aumento de expressão (Quantificação Relativa, QR = 2,10 a 3,28) e em 20 amostras apresentou expressão normal. Nas amostras de linfonodos correspondentes, duas amostras apresentaram aumento de expressão (QR = 2,20 a 2,30), duas amostras apresentaram diminuição de expressão (QR = 0,01 a 0,39) e sete amostras apresentaram expressão normal. Ao relacionar os dois grupos (tumor primário versus linfonodo correspondente) não foram observados diferença estatisticamente significativa (P value = 0,5614). Para o gene NGX6, no grupo com tumor primário, cinco amostras apresentaram aumento de expressão (QR = 2,10 a 4,87), quatro amostras apresentaram diminuição de expressão (QR = 0,20 a 0,50) e quatorze amostras apresentaram expressão normal. Nas amostras de linfonodos correspondentes, três amostras apresentaram aumento de expressão (QR = 2,15 a 4,56), duas amostras apresentaram diminuição de expressão (QR = 0,44 a 0,47) e seis amostras apresentaram expressão normal. Ao relacionar os dois grupos (tumor primário versus linfonodo correspondente) não foram observados diferença estatisticamente significativa (P value = 0,7089). Discussão Em câncer de mama, os linfonodos axilares são frequentemente o primeiro sítio de metástase, sendo considerado o fator mais importante no estadiamento e na avaliação prognóstica das pacientes (PONZONE et al., 2007). Portanto, a identificação de marcadores moleculares de metástases axilares, auxilia na gestão com as pacientes permitindo que as mulheres com baixo risco de risco de envolvimento de linfonodos, possam ser poupadas de procedimentos cirúrgicos desnecessários, levando assim, a determinação de um prognóstico mais preciso, além de um melhor tratamento (MANSEL et al., 2004). Para o nosso conhecimento, o estudo de Shriver et al. (2014) avaliou o potencial preditivo de genes no envolvimento de linfonodos axilares em câncer de mama. Estes autores identificaram que os genes NGX6, ARD1A, DKK1, SERPINA1, TFF1, TFF3 e TMSB15A apresentaram expressão diferencial em tumores de mama com acometimento de linfonodos axilares quando comparados com 4

5 tumores primários linfonodo negativo. Os genes avaliados no presente estudo foram escolhidos a partir do estudo realizado por Shriver et al. (2014) e foram avaliados pelo seu potencial preditivo em tumores primários e linfonodos correspondentes obtidos de pacientes brasileiras com câncer de mama. A população brasileira é uma das populações mais heterogêneas em todo o mundo, como o resultado de cinco séculos de cruzamentos entre populações de diferentes etnias oriundas de três continentes. Por esta razão, as análises moleculares de expressão gênica pode levar a identificação de novos marcadores moleculares específicos para a população brasileira (CANEVARI et al, 2016). No presente estudo não foi evidenciado que os genes supressores tumorais ARD1A e NGX6 são marcadores preditivos para o envolvimento de linfonodos em câncer de mama. Embora existam poucos estudos relacionando o gene ARD1A nestes tumores, Zeng et al. (2014) o descrevem como um regulador de metástase por meio da inibição da motilidade celular, onde sua expressão aumentada foi correlacionada com a maior sobrevida das pacientes e com um menor número de linfonodos acometidos por células tumorais. Em relação à contribuição de ARD1A para o desenvolvimento de câncer de mama, outro estudo destes autores revelou que a expressão deste gene está correlacionada com um melhor resultado clínico das pacientes (ZENG et al., 2014). Estes resultados concordam com os observados por Seo et al. (2015), que em seu estudo relataram que ARD1A regula diversas atividades celulares, incluindo crescimento, apoptose, autofagia e diferenciação celular. Além disso, estes autores descrevem que a depleção de ARD1A leva à proliferação diminuída ou induz a apoptose nas células cancerosas humanas, podendo ser um alvo potencial para a terapia do câncer. O gene NGX6 regula a proliferação celular por meio da modulação da função da via EGFR e aumento da duração da fase G1 do ciclo celular por meio da regulação negativa das ciclinas D1, A e E. Adicionalmente, este gene possui a capacidade de aumentar a adesão celular, inibir a migração e invasão celular (WANG et. Al., 2010). Considerando a ausência de expressão diferencial de NGX6 observada em ambas às análises do presente estudo, os nossos resultados não confirmaram os obtidos de estudos prévios da literatura (SHRIVER et al., 2014). Wang et al. (2010) relatam que a expressão de NGX6 em tumores de mama foram significativamente menor quando comparados com tecidos normais, e sugeriram que este gene está envolvido com o desenvolvimento de metástases e proliferação de células cancerosas nestes tumores (WANG et al. 2010). Zhao et al. (2013) relataram em seu estudo que este gene desempenha um papel como supressor de tumor em câncer de mama. Os autores observaram que a expressão reduzida de NGX6 leva a resistência ao tratamento com tamoxifeno. Guo et al. (2010) sugerem em seu estudo que NGX6 pode desempenhar papel importante na inibição de metástases e invasão das células cancerígenas do cólon. Estes dados fornecem base experimental para terapia quimioterápica do câncer colorretal. Com base em nossos resultados, consideramos que a pesquisa de marcadores moleculares com valor preditivo tem como fundamento a realização de um tratamento específico a cada paciente. Porém, na literatura os dados ainda são questionáveis e até o momento, poucos marcadores têm sido utilizados na rotina clínica. Conclusão Com base nos resultados apresentados e análises utizadas, não foi possível detectar a existência do potencial preditivo para os genes ARD1A e NGX6 em câncer de mama. Adicionalmente, este estudo permitiu concluir que a grande heterogeneidade genética existente na população brasileira pode ser um dos fatores que influenciam a análise do potencial preditivo dos genes envolvidos na carcinogênese mamária. Referências ALEGRE M.M., ROBINSON R.A., O NEILL K.L. Thymidine Kinase 1 Upregulation Is an early Event in breast tumor formation. Journal of Oncology, vol.12, nº1, p , AKTER S. et al. Prognostic value of a 92-probe signature in breast cancer. Oncotarget (impact journals), vol.6, nº17, p ,

6 CANEVARI R.A. et al. Identification of novel biomarkers associated with poor patient outcomes in invasive breast carcinoma. Tumor Biology, [epub ahead of print], accepted: 6 July COLLEONI M. et al. Role of endocrine responsiveness and adjuvant therapy in very young women (below 35 years) with operable breast cancer and node negative disease. Annals of Surgical Oncology, vol.17, nº10, p , GUO Q. et al. NGX6 inhibits cell invasion and adhesion through suppression of Wnt/betacatenin signal pathway in colon cancer. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), vol.42, nº7, p , GURLEYIK G. et al. Tumor characteristics influencing non-sentinel lymph node involvement in clinically node negative patients with breast cancer. Journal Breast Cancer, vol.6, nº14, p , MANSEL R.E. et al. Internal mammary node drainage and is role in sentinel lymphnode biopsy: the initial Almanac experience. Clinical Breast Cancer, vol.5, nº4, p , PATANI N.R; DWEK M.V.; DOUEK M. Predictors of axillary lymph nodes metastasis breast cancer: systematic review. The Journal of Cancer Surgery, vol.33, p , PEROU C.M. et al. Molecular portraits of human breast tumors. Nature, vol.406, p , PFAFFL M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time rt-pcr. Nucleic Acids Res, vol.29, nº900, p.1-6, PONZONE R. et al. Comparison of two models for prediction of non sentinel node metastases in breast cancer. The American Journal of Surgery, vol.92, p , SEO J.H. et al. Different subcellular localizations and functions of human ARD1 variants. International journal of oncology, vol.46, p , SHRIVER C.D., HUEMAN M.T., ELLSWORTH R. Molecular signatures of lymph node status by intrinsic subtype: gene expression analysis of primary breast tumor from patients with and without metastatic lymph nodes. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, vol. 33, nº.116, p.1-6, WANG L. et al. Identification of a new seven-span transmembrane protein: NGX6a is downregulated in nasopharyngeal carcinoma and is associated with tumor metastasis. J Histochem Cytochem, vol.58, p.41 51, WANG X.N. et al. Trefoil factor 3 as a novel biomarker to distinguish between adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. Medicine (Baltimore), vol. 94, nº 20, p. 860, YENIDUNYA S., BAYRAK R., HALTAS H. Predictive value of pathological and immunohistochemical parameters for axillary lymph node metastasis in breast carcinoma. Diagnostic Pathology, vol. 6, nº18, p.1-9, ZENG Y. et al. Inhibition of STAT5a by Naa10p contributes to decreased breast cancer metastasis. Oxford University Press, vol.35, nº10, p , ZHAO W.J., WANG K. NGX6 expression improves the sensitivity of tamoxifen-resistant MCF-7 cells through modulation of the Smad signaling pathway. International journal of oncology, vol.42, p ,