JONATHAN DE MAGALHÃES ANDRADE UTILIZAÇÃO DE ELETROFORESE PARA CARACTERIZAÇÃO DE LEITE UHT, SORO DE QUEIJO E SUAS MISTURAS

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1 Universidade Federal de Juiz de Fora Faculdade de Farmácia e Bioquímica JONATHAN DE MAGALHÃES ANDRADE UTILIZAÇÃO DE ELETROFORESE PARA CARACTERIZAÇÃO DE LEITE UHT, SORO DE QUEIJO E SUAS MISTURAS JUIZ DE FORA MG DEZEMBRO DE 2007

2 2 JONATHAN DE MAGALHÃES ANDRADE UTILIZAÇÃO DE ELETROFORESE PARA CARACTERIZAÇÃO DE LEITE UHT, SORO DE QUEIJO E SUAS MISTURAS. Trabalho de Conclusão de Curso submetido à Universidade Federal de Juiz de Fora, como requisito para aprovação na disciplina FCO044 TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO e obtenção do grau de graduação em Farmácia e Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. Marco Antônio Moreira Furtado JUIZ DE FORA MG DEZEMBRO DE 2007

3 3 JONATHAN DE MAGALHÃES ANDRADE UTILIZAÇÃO DE ELETROFORESE PARA CARACTERIZAÇÃO DE LEITE UHT, SORO DE QUEIJO E SUAS MISTURAS. Trabalho de Conclusão de Curso submetido à Universidade Federal de Juiz de Fora, como requisito para obtenção do grau de graduação em Farmácia e Bioquímica. Comissão Julgadora: Prof. Dr. Marco Antônio Moreira Furtado (orientador) Profa. Dra. Eveline Gomes Vasconcelos Profa. Dra. Cláudia Eugênia Bravo Castro Martins APROVADA: XX DE DEZEMBRO DE 2007

4 4 Aos meus familiares, amigos e companheiros de pesquisa, dedico.

5 5 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, acima de tudo. À minha família pelo incentivo e por estarem ao meu lado em todos os momentos. Aos meus amigos pelo apoio. Ao Professor Dr. Marco Antônio Furtado, do Departamento de Alimentos e Toxicologia da Faculdade de Farmácia e Bioquímica da UFJF, pela amizade, dedicação, paciência e pela orientação durante todos esses anos. Em especial, aos meus amigos Baiana, Humberto, Macedo e Alex, que foram parte fundamental para a conclusão desta etapa.

6 6 RESUMO A determinação de perfis de proteínas e peptídeos usando métodos tradicionais de eletroforese é uma maneira de se detectar fraudes em produtos lácteos. Foi empregada eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) sob condições desnaturantes (SDS-PAGE) em: leite UHT, soro de queijo Minas Frescal e mistura desses produtos em diferentes concentrações (2%, 4%, 6%, 8% e 10%). Depois de fixados, os géis foram revelados e submetidos ao processo de secagem. Com um scanner, sua imagem foi criada e analisada usando o software ImageQuant TL de acordo com as instruções do fabricante. A mobilidade eletroforética relativa (Rf) e as respectivas massas moleculares (KDa) foram obtidas para caracterizar e identificar as proteínas do leite. Como esperado, as principais proteínas do leite UHT foram α, β e κ-caseínas, enquanto que no soro foram β-lactoglobulina e α-lactoalbumina. Com a simulação de fraude, verificou-se que o método é sensível para detecção de fraudes a partir da concentração de 2% de soro adicionado, não pela diferença dos picos das principais frações protéicas descritas acima, mas pela observação da presença de outras com alta massa molecular. Palavras-chave: eletroforese, proteínas, leite, soro, fraude.

7 7 ABSTRACT The determination of the protein and peptide profiles using traditional electrophoresis methods is one way to detect fraud in dairy products. Polyacrylamide gel electrophoresis (15% concentration) was carried out under denaturing conditions (SDS- PAGE) in: UHT milk, Minas Frescal whey and mixtures of these products in different concentrations (2%, 4%, 6%, 8% and 10%). After fixation, the gels were stained and submitted to drying process. With a scanner, its image was created and analyzed using the software ImageQuant TL according to the manufacturer s instructions. The relative electrophoretic mobility (Rf) and of the respective molecular weights (KDa) were obtained to characterize and identify milk proteins. As expected, the main proteins for UHT milk had been α, β and κ-caseins whereas for whey had been β-lactoglobulin and α-lactoalbumin. With the fraud simulation, it was verified that the method is sensible for detection of frauds from the concentration of 2% of added whey, not for the difference of the peaks of main proteins fractions described above, but by the observation of the presence of others with high molecular weights. Keywords: electrophoresis, proteins, UHT milk, whey, fraud.

8 8 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REFERENCIAL TEÓRICO Caracterização do Problema Proteínas do Leite Bovino Composição e Distribuição Aplicações Eletroforese em gel de Poliacrilamida em presença de SDS MATERIAIS E MÉTODOS Amostras de Leite UHT e Soro Preparo dos Padrões Método SDS PAGE Preparo das soluções Preparo dos géis, corrida e secagem Análise Computacional RESULTADOS E DISCUSSÕES Caracterização de amostras de leite UHT Caracterização de Amostra de Soro de Queijo Minas Frescal e Amostras Fraudulentas CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 52

9 9 1. INTRODUÇÃO A detecção no mercado de produtos fraudulentamente rotulados ou de qualidade inferior é importante tanto por razões econômicas quanto por razões de saúde pública, já que a autenticidade e a qualidade dos produtos consumidos é uma preocupação constante dos consumidores, dos profissionais, dos pesquisadores e autoridades relacionados à área de alimentos (VELOSO, 2001; FURTADO, 1989). Considerado alimento nobre e um dos mais complexos do ponto de vista nutritivo, o leite bovino propicia inúmeras alternativas de industrialização e de transformação, obtendo-se vários produtos. Entretanto, quando utilizado para o processamento de queijos, cerca de 85-90% de seu volume é retirado sob a forma de soro (SERPA, 2005), que é um subproduto rico em proteínas, pouco aproveitado e muitas vezes desperdiçado. A incorporação indevida do soro no leite de consumo, se não discriminada no rótulo, constitui fraude, uma vez que subtrai elementos no leite genuíno (FURTADO, 1989). Dos componentes protéicos do leite, as caseínas (CN) estão entre as mais importantes. Existentes em forma de micelas constituem quatro tipos: αs 1 -, αs 2 -, β- e κ- caseínas (PARDO, 2001). Dentre os métodos empregados com freqüência no estudo de proteínas do leite e nas pesquisas sobre variantes genéticas da maior fração protéica do leite como a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e os imunológicos, a eletroforese

10 10 apresenta sensibilidade, não requer reagentes especiais, nem equipamento muito dispendioso (FURTADO, 1989; VELOSO, 2002). A adaptação da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) demonstrada por LAEMMLI (1970) utilizada neste trabalho, levou aos seguintes objetivos: determinar o perfil eletroforético de marcas comerciais de leite UHT, do soro de queijo minas frescal e simulação de fraude, baseada na mistura de diferentes concentrações do soro no leite; verificar a sensibilidade do método na detecção de fraudes.

11 11 2. Referencial Teórico 2.1. Caracterização do Problema A qualidade do leite consumido no país é uma constante preocupação de técnicos e autoridades ligadas à área de saúde e laticínios. A legislação brasileira, e também a de todos os países desenvolvidos, proíbe a adição de soro de queijo ao leite de consumo. Caso a adição seja feita, o produto final deverá chamar-se bebida láctea e não poderia ser considerado leite (tipo A, B, C, esterilizado, etc.) (FURTADO, 1989; CARVALHO, 2007). A legislação brasileira (BRASIL, 1952) considera fraude a adição de soro de queijo ao leite pasteurizado, esterilizado ou em pó. Entretanto, por estar quase sempre disponível, uma vez que é um subproduto da fabricação de queijos, de custo reduzido ou nulo, torna-se economicamente atrativa a adição de soro de queijo ao leite, prejudicando diretamente o consumidor e os concorrentes que obedecem à legislação, além de incorrer em diversos crimes previstos na legislação. Uma vez que a adição de soro de queijo ao leite compromete a sua qualidade, torna-se imprescindível o controle deste importante alimento distribuído aos consumidores, para sua utilização como se fosse leite puro.

12 Proteínas do Leite Bovino Composição e Distribuição As proteínas do leite bovino são as de origem animal há mais tempo e em maior quantidade consumidas pelo homem. Também, pela facilidade de seu isolamento, são as mais estudadas e das quais se conhece a estrutura primária de quase todas as suas frações. É considerado o sistema protéico alimentício mais caracterizado e as principais frações de interesse utilizadas freqüentemente como padrão (especialmente a caseína) ou referência para estudos e avaliação de outras proteínas alimentares (FURTADO, 1999). O leite bovino contém cerca de 5,3 gramas de nitrogênio por quilograma, dos quais aproximadamente 95% estão na forma de proteínas (nitrogênio protéico) e 5% como nitrogênio não protéico. Em média, 80% do nitrogênio protéico são constituídos por caseínas e 20% por soroproteínas (WALSTRA & JENNESS, 1987). As caseínas são consideradas um grupo de fosfoproteínas específicas do leite, apresentando baixa solubilidade em ph 4,6, a 20 C. Quase toda a caseína apresentase na forma de micelas e inclui quatro tipos de cadeias polipeptídicas: αs 1, αs 2, β e κ, além de alguns derivados formados por proteólise destas cadeias. São estabilizadas por ligações hidrofóbicas e pontes salinas, com tamanho variando entre 40 e 300 ηm de diâmetro (WALSTRA & JENNESS, 1987). Tais micelas são constituídas de submicelas unidas por fosfato de cálcio, e sua estabilidade sofre influência de fatores como ph, temperatura, enzimas, agentes desidratantes, oxidantes, redutores, etc (FURTADO, 1999).

13 13 Figura 1: Modelo esquemático da micela de caseína. Fonte: BYLUND (1995). Figura 2: Micela de caseína. Fonte: BYLUND (1995). O soro de queijo é um produto que resulta da precipitação de gorduras e caseína do leite durante a fabricação de queijos, representa de 85 a 90% do volume do leite e

14 14 retém 55% de seus nutrientes. Pode representar um problema ambiental de grande relevância, que, quando liberado em rios ou esgotos públicos gera uma demanda bioquímica de oxigênio de a mg/l, o que atualmente não é permitido. (SERPA, 2005). As proteínas do soro constituem um grupo diversificado de proteínas, as quais se mantém em solução em ph 4,6. Têm grande valor nutricional e são representadas por albumina do soro bovino (BSA), imunoglobulinas, peptídeos de baixo peso molecular (provenientes da hidrólise das caseínas), β-lactoglobulina e α-lactoalbumina (WALSTRA & JENNESS, 1984; BYLUND, 1995). Aproximadamente 50% do soro produzido no mundo se encontra industrializado sob forma de bebidas fermentadas, sucos, aditivos para panificação e também na nutrição animal. (SERPA, 2005). O Quadro 1 apresenta um resumo das principais proteínas do leite, seu teor no leite de vaca e a massa molecular, indicando inclusive a abreviatura sugerida para cada fração.

15 15 QUADRO 1: Resumo das principais frações protéicas do leite bovino Proteína e sua Concentração no leite abreviatura sugerida desnatado (g/l) Massa Molecular (KDa) αs1 caseína (αs1 CN) 12 a 15 23,542 a 23,615 αs2 caseína (αs2 CN) 3 a 4 25,226 β caseína (β-cn) 9 a 11 23,983 a 24,092 κ caseína (κ-cn) 2 a 4 19,006 a 19,037 β lactoglobulina (β-lg) 2 a 4 18,277 a 18,363 α-lactoglobulina (α-la) 0,6 a 1,7 14,178 Soroalbumina (SA) 0,4 66,399 Imunoglobulina G1 (IgG1) 0,3 a 0,6 161,000 Imunoglobulina G2 (IgG2) 0,05 150,000 Imunoglobulina Ak (IgA) 0,01 385,000 a 417,000 Imunoglobulina M (IgM) 0, ,000 Componente secretor (SC) 0,02 a 0,1 63,750 Lactoferrina (LF) 0,02 a 0,1 76,110 Fonte: Adaptado de FARRELL, et al. (2004) Aplicações Quando utilizadas como ingrediente protéico em alimentos, as caseínas e as proteínas do soro, segundo Furtado (1999), demonstram características desejáveis de um ingrediente para este fim, tais como: ausência de toxicidade, mínima presença de odores, alto conteúdo protéico, mínimo teor de lipídeos, alto valor nutricional, compatibilidade com outros ingredientes e processamento, são prontamente disponíveis e economicamente viáveis. Além do elevado valor nutritivo, as proteínas do leite conferem aos produtos formulados melhor aparência e melhores propriedades sensoriais, em virtude de suas propriedades funcionais, destacando-se: solubilidade e dispersibilidade, opacidade, ligação e retenção de gordura, retenção de água, emulsificação, viscosidade, estabilidade térmica, geleificação e formação de filmes, entre outras. (KRÜGER, 2003).

16 16 As principais aplicações das caseínas incluem produtos cárneos, produtos lácteos, produtos de panificação, chocolates e confeitos, coberturas comestíveis, bebidas lácteas e achocolatadas, cremes para café, salgadinhos e "snacks" (KRÜGER, 2003). As proteínas do soro são também encontradas em suplementos alimentares, geralmente, sob a forma de pó, apresentando excelente perfil de aminoácidos, caracterizando-as como proteínas de alto valor biológico. Atletas, pessoas praticantes de atividades físicas, pessoas fisicamente ativas e até mesmo portadores de doenças, vêm procurando benefícios desta fonte protéica. (HARAGUCHI, 2006) Eletroforese em gel de Poliacrilamida em presença de SDS As proteínas são substâncias anfóteras capazes de adquirir carga positiva ou negativa em função do ph, logo, é necessário o uso de soluções tampão para a manutenção do ph do meio constante durante a eletroforese. O sistema tampão usado consiste em duas partes: o tampão do gel, usado no preparo do gel e o tampão dos eletrodos (anodo e catodo). (ALFENAS, 1991) A eletroforese consiste na migração de moléculas ionizadas, de acordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares em compo elétrico. Moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo (anodo) e moléculas com carga positiva, migram para o pólo negativo (catodo). A carga líquida das proteínas é resultado do somatório de seus aminoácidos constituintes. (SILVA JR., 2001) A velocidade de migração de uma molécula é proporcional ao campo elétrico empregado e inversamente proporcional ao seu raio, à distancia entre os eletrodos e à viscosidade do meio. Uma vez que a molécula possui sua própria carga e seu próprio tamanho, se deslocará sempre numa determinada distancia no campo elétrico a um determinado espaço de tempo. Assim, se uma mistura de proteínas for submetida à eletroforese, espera-se que cada molécula se mantenha numa estreita faixa (banda) no gel. (ALFENAS, 1991; SILVA JR., 2001). Géis de poliacrilamida são formados pela copolimerização de acrilamida e bisacrilamida na presença de presulfato de amônio e tetrametiletilenodiamina (TEMED) ou

17 17 riboflavina e TEMED. A reação de polimerização, se dá através da formação de radicais livres de acrilamida. Os íons persulfato em solução formam radicais livres de sulfato que promovem a formação desses radicais livres de acrilamida, que reagem entre si, formando então, poliacrilamida. (SILVA, 2001). As moléculas e as reações estão demonstradas nas figuras a seguir: O NH 2 Figura 3: Molécula de Acrilamida O O N H N H Figura 4: Molécula de N,N -metileno-bis-acrilamida (Bis) N N Figura 5: Molécula de Tetrametiletilenodiamina (TEMED) CONH 2 CONH 2 CONH 2 n(ch 2 CH)CONH 2 + SO 4 CH 2 =CH-CONH 2 acrilamida radical sulfato radical acrilamida Figura 6: Reação de polimerização da acrilamida. Essas reações são catalisadas pelo TEMED. A polimerização do gel requer a formação de ligações cruzadas entre as cadeias de poliacrilamida, que ocorrem por meio das moléculas de Bis. (ALFENAS, 1991). Na figura 7 observa-se a ligação cruzada entre as moléculas.

18 18 CONH 2 CONH O O NH NH O C NH O C NH CONH 2 CONH 2 O NH O C NH Figura 7: Ligação cruzada entre as moléculas de Bis e Acrilamida. Os géis de policriamida podem ser confeccionados entre duas placas de vidro (slab). E também podem ser preparados num sistema homogêneo com apenas um tampão, mas foram preparados num sistema onde existe uma descontinuidade dos tampões, do ph, e do tamanho dos poros (sistema descontínuo). Nesse caso preparase um gel de poros menores (gel de separação) que servirá para a separação das proteínas, e sobre o mesmo, um gel de poros mais largos (gel de empilhamento), confeccionado com outro tampão, que tem a função de empacotar as proteínas na interface dos dois géis. Entretanto, o gel de empilhamento pode ser omitido em muitos casos, sem a perda da resolução das proteínas (NAOUM, 1990).

19 19 Os géis de policrilamida também podem ser confeccionados na presença de SDS (sódio dodecil sulfato), um detergente que apresenta carga negativa (aniônico). Para a eletroforese nesse tipo de gel, as proteínas são primariamente solubilizadas num tampão contendo SDS e um agente redutor de pontes de dissulfeto (usa-se em geral o 2-mercaptoetanol). Esses compostos produzem uma alteração da conformação nativa das proteínas, convertendo-as em cadeias polipeptídicas desnaturadas. As moléculas de SDS ligam-se às cadeias, formando complexos SDS-proteínas que apresentam formas elipsóides. O número de moléculas de SDS que se ligam às cadeias polipeptídicas é proporcional ao peso molecular das mesmas fornecendo uma carga negativa constante por unidade de massa. Assim, segundo Naoum (1990), nesse tipo de eletroforese, a mobilidade das proteínas depende unicamente de seus pesos moleculares. Essa técnica é denominada SDSPAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis).

20 20 3. MATERIAIS E MÉTODOS A eletroforese é uma técnica reconhecidamente eficaz para a caracterização de proteínas e frações protéicas em alimentos e foi realizada em gel de poliacrilamida em condições redutoras, utilizando o detergente dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) em sistema vertical (slab), utilizando a cuba eletroforética Z , da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), conforme adaptação da metodologia clássica (LAEMMLI, 1970), que foi alterada em razão da demora do processo clássico e, além disso, os géis-teste não apresentavam boas características ao serem revelados. Alterando as tensões da corrida eletroforética na fonte elétrica (EPS301, Amersham Pharmacia Biotech), tempos de revelação e secagem do gel, obteve-se duplicatas dos géis com resultados viáveis perante a análise computacional Amostras de Leite UHT e Soro As amostras de leite UHT foram adquiridas nos supermercados de Juiz de Fora MG. Coletou-se amostras de marcas distintas de leite UHT e uma amostra de soro de queijo minas frescal. Produziu-se em laboratório 5 (cinco) amostras fraudulentas misturando o soro ao leite nas concentrações de 2%, 4%, 6%, 8% e 10%. O preparo das amostras para análise envolveu sua dissolução em solução tampão de amostra, na proporção de 500 µl de amostra para 1 ml do tampão

21 21 apropriado, em seguida submetidas a banho-maria 95 C por 5 minutos e centrifugadas em ultra centrífuga (modelo 2K15, da Sigma), em temperatura ambiente, por 15 minutos a x g Preparo dos Padrões Utilizou-se marcadores de massa molecular (LMW calibration kit for SDS eletrophoresis) da Amersham Biosciences (Buckinghamshire, England) aplicados nos penúltimos poços de cada lado e padrões de caseína (α-caseína, β-caseína e κ- caseína de leite bovino) da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) aplicados, respectivamente nos terceiro, quarto e quinto poços de cada gel. Os poços dos extremos dos géis foram descartados. O preparo dos padrões foi realizado da seguinte forma: o conteúdo dos frascos (576 µg) dos marcadores de massa molecular foi diluído em 1,0 ml de solução tampão de amostra e os padrões de caseína foram preparados pela dissolução de 1 a 2 mg de padrão em 1 ml de tampão de amostra. A seguir, foram submetidos a aquecimento a 40 C por 1 hora, em banho-maria. O marcador de massa molecular é composto de fosforilase b (músculo de coelho), massa molecular , albumina (soro bovino), massa molecular , ovoalbumina (ovo branco de galinha) , anidrase carbônica (eritrócito bovino) , inibidor de tripsina (soja) e α-lactoalbumina (leite bovino) Os padrões de caseína contêm: α s -caseína, aproximadamente 85%; no mínimo, 70% de proteínas (biureto); β-caseína, mínimo 90%, salt free e κ-caseína, mínimo 80% Método SDS PAGE O preparo dos géis (4,5% de acrilamida para o gel de empilhamento e 15% para o gel de separação) foi executada segundo metodologia clássica (LAEMMLI, 1970).

22 Preparo das soluções Acrilamida/Bis Foram dissolvidos 146 g de acrilamida e 4 g de N,N,N,N metileno bisacrilamida (BIS) em água destilada suficiente para 500 ml de solução. Tampão TRIS HCl 1,5 mol/l, ph 8,8 45,40 g de tris (hidroximetil) metil amina (TRIS) foram dissolvidos em aproximadamente 150 ml de água destilada, o ph ajustado para 8,8 com solução de HCl 1 mol/l e o volume completado com água destilada suficiente para 250 ml. Tampão TRIS HCl 0,5 mol/l, ph 6,8 Dissolveu-se 6 g de TRIS em aproximadamente 60 ml de água destilada e acrescentados 2,86 ml de HCl p.a. Procedeu-se ao ajuste do ph para 6,8 com solução de HCl 1 mol/l e completou-se o volume com água destilada suficiente para 100 ml. Tampão de eletrodo (ou de corrida), ph 8,3, solução estoque (5 vezes concentrada) Foram dissolvidos 30 g de TRIS, 144 g de glicina e 10 g de SDS em água destilada suficiente para 2 L de solução de ph ajustado para 8,3 com HCl p.a. ou NaOH p.a.; esta solução foi armazenada em geladeira. No momento da corrida, 200 ml da solução estoque de tampão de corrida foram diluídos para ml em água destilada. Dodecil sulfato de sódio (SDS) 10% m/v Dissolveu-se 10 g de dodecil sulfato de sódio (SDS) em água destilada em quantidade suficiente para 100 ml. Esta solução deve ser armazenada em temperatura ambiente. Tampão de amostra Misturou-se 4,0 ml de água destilada, 1 ml de tampão TRIS HCl 0,5 mol/l (ph 6,8), 0,8 ml de glicerol, 1,6 ml de SDS 10% m/v, 0,4 ml de 2-mercaptoetanol e 0,2 ml

23 23 de azul de bromofenol 0,5% m/v, procedendo à preparação desta solução no momento do uso. Persulfato de amônio 10% Pesou-se 0,5 g de persulfato de amônio p.a., acrescentando 4,5 ml de água destilada e dissolvendo pela agitação do frasco. Esta solução, em razão de sua instabilidade, foi preparada no momento do uso. bromofenol. Azul de bromofenol 2,0 % m/v Foram dissolvidos em água destilada suficiente para 100 ml, 2 g de azul de Solução fixadora Foram dissolvidos em água destilada suficiente para 500 ml de solução final, 200 ml de metanol e 100 g de ácido tricloroacético p.a. Solução corante Misturou-se, até dissolução completa, 1 g de azul brilhante de Comassie (Comassie Brilliant Blue) 400 ml de metanol, 100 ml de ácido acético R e 500 ml de água destilada. Solução descorante Foram dissolvidos 500 ml de metanol e 200 ml de ácido acético R em ml de água destilada. de solução. Glicerol 10% v/v Foram dissolvidos 100 ml de glicerol em água destilada suficiente para ml

24 24 Solução para Secagem do Gel Mediu-se 162,5 ml de metanol, 1,25 ml de glicerol e completou-se quantidade suficiente para 500 ml de solução Preparo dos géis, corrida e secagem Os géis de empilhamento são constituídos por 0,75 ml de acrilamida/bis (30% acrilamida, 1% bis), 1,25 ml de tampão TRIS HCl (0,5 mol/l ph 6,8), 2,95 ml de água destilada, 20 µl de TEMED e 30 µl de persulfato de amônio 10%. Os géis de separação foram preparados na concentração de 15 % de acrilamida, conforme as proporções de seus componentes. Dentre os géis-teste, tal concentração foi escolhida em razão do melhor aspecto e da melhor separação das frações protéicas. Diante disso, os géis são mais facilmente analisados pelo software. As concentrações testadas foram de 10%, 12,5%, 15% e 20%. Na Tabela 2, estão descritos os volumes empregados na metodologia adotada. Tabela 2: Preparo do gel de separação do método SDS-PAGE Componente Gel a 10 % Gel a 12,5 % Gel a 15 % Gel a 20 % Acrilamida/Bis 10 ml 12,5 ml 15 ml 20 ml Tampão TRIS HCl 1,5 mol/l ph 8,8 7,5 ml 7,5 ml 7,5 ml 7,5 ml SDS 10% m/v 0,30 ml 0,30 ml 0,30 ml 0,30 ml Água destilada 12,00 ml 9,45 ml 6,90 ml 1,90 ml Persulfato de amônio 0,30 ml 0,30 ml 0,30 ml 0,30 ml TEMED 30 µl 30 µl 30 µl 30 µl Para a corrida eletroforética, a fonte elétrica foi regulada, inicialmente, para a tensão de corrida no gel de empilhamento (60 V), a corrente para o máximo de 200 ma e ligada, iniciando-se a corrida. Quando a linha azul formada pelo marcador de corrida (azul de bromofenol) ultrapassou a linha do gel de separação (cerca de 1 hora depois), a tensão foi novamente regulada, desta vez para a de corrida no gel de separação, em 120 V, mantendo-se a regulagem da corrente. Após a corrida, os géis foram mantidos na solução fixadora por uma hora e transferidos para um recipiente contendo solução corante. Permaneceram imersos

25 25 nesta, cerca de 12 a 14 horas (overnight), sendo então transferidos para outro recipiente contendo solução descorante, onde foi mantida por cerca de 2 horas até atingir a coloração adequada. Em seguida, os géis foram transferidos para a solução de secagem e secos pelo método do bastidor demonstrado por ALFENAS (1991). Esse método consiste em deixar os géis de molho na solução de secagem por 15 minutos. Em seguida, utilizando papel celofane e arcos de bastidor, prende-se o celofane esticando o gel de forma a mantê-lo com sua forma original. Para diminuir o tempo de secagem, deixa-se o conjunto gel bastidor em posição vertical. Faz-se diminutas perfurações com estilete de ponta bem fina às margens do gel e mantém-se o conjunto gel-bastidor em posição vertical, à temperatura ambiente, por no mínimo 24 horas. Remove-se dos bastidores o conjunto celofane-gel em seguida. Quando da não utilização dos géis, ao invés de secá-los para a análise computacional, transfere-os para um recipiente contendo solução conservante de glicerol 10% v/v para seu armazenamento Análise Computacional Obteve-se imagens dos géis a partir do uso de um scanner acoplado ao computador e em seguida, essas foram analisadas pelo software ImageQuant TL da Amersham Biosciences. A partir daí, têm-se os dados de mobilidade eletroforética relativa, massa molecular, entre outros, de cada fração protéica detectada.

26 26 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES Os géis obtidos apresentaram resultados satisfatórios para as análises. Nas figuras e tabelas a seguir, observam-se os resultados dos perfis protéicos caracterizados pelas amostras de leite UHT, soro e misturas (fraude), obtido na eletroforese das amostras. Estão apresentados os resultados para as amostras de leite UHT, identificadas como letras do alfabeto, junto aos padrões (marcadores) de massa molecular e padrões de proteínas lácteas (α-caseína; β-caseína; e κ-caseína), bem como as amostras de soro de queijo minas frescal e de fraude laboratorial do leite UHT com o soro. Na análise dos géis apresentados, a utilização do software permitiu a visualização dos resultados de mobilidade eletroforética relativa (posição das bandas protéicas) das frações protéicas obtidas, que dependem exclusivamente de suas massas moleculares. Isso porque representam os perfis eletroforéticos das amostras de leite UHT, soro e misturas, obtidos em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes, ou seja, com adição de SDS (dodecil sulfato de sódio, detergente aniônico) (PEREIRA, 2003). Nas tabelas, estão dispostos os valores determinados de massa molecular (MM) e mobilidade eletroforética relativa (Rf).

27 Caracterização de amostras de leite UHT Figura 8: Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) com SDS (SDS-PAGE) em amostras de leite UHT. 1. marcadores de massa molecular; 2. α-caseína; 3. β-caseína; 4. κ-caseína; 5. amostra A; 6. amostra B; 7. amostra C; 8. amostra D; 9. amostra E; 10. amostra F; 11. amostra G; 12. marcadores de massa molecular. Densitogramas relativos à figura 8: Figura 9: Densitograma da amostra de leite UHT A.

28 28 Figura 10: Densitograma da amostra de leite UHT B. Figura 11: Densitograma da amostra de leite UHT C. Figura 12: Densitograma da amostra de leite UHT D.

29 29 Figura 13: Densitograma da amostra de leite UHT E. Figura 14: Densitograma da amostra de leite UHT F. Figura 15: Densitograma da amostra de leite UHT G. Os perfis obtidos podem ser avaliados levando-se em conta os dados da literatura sobre as massas moleculares das frações protéicas, características do leite de vaca, e a comparação com os padrões. Com auxilio da literatura, as observa-se que as frações predominantes das amostras acima são α-cn (pico demonstrado pela mobilidade entre 0,35 e 0,40) e β-

30 30 lactoglobulina (demonstrado pela mobilidade entre 0,6 e 0,7), embora haja traços de outras frações protéicas.

31 Tabela 3: Massa molecular (MM) e mobilidade eletroforética relativa (Rf) das bandas reveladas no gel de corrida; referentes à Figura 8. Linha 1 Linha 2 Linha 3 Linha 4 Linha 5 Linha 6 Bandas MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf , ,51 0, ,79 0, ,95 0, ,16 0, ,02 0, , ,57 0, ,73 0, , ,31 0, ,45 0, , ,59 0, ,57 0, , ,69 0, ,79 0, , ,8 0, ,68 0, ,95 0, ,41 0, ,8 Linha 7 Linha 8 Linha 9 Linha 10 Linha 11 Linha 12 Bandas MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf ,76 0, ,01 0, ,82 0, ,74 0, ,86 0, , ,16 0, ,15 0, ,47 0, ,47 0, ,73 0, , ,58 0, ,41 0, ,07 0, ,72 0, ,77 0, , ,22 0, ,76 0, ,32 0, ,87 0, , ,65 0, ,31 0, ,95 0, ,04 0, , ,46 0, ,82 0, ,05 0, , ,79 0, , ,2 0, ,64 0, ,81

32 32 Figura 16: Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) com SDS (SDS-PAGE) em amostras de leite UHT. 1. marcadores de massa molecular; 2. α-caseína; 3. β-caseína; 4. κ-caseína; 5. amostra H; 6. amostra I; 7. amostra J; 8. amostra K; 9. amostra L; 10. amostra M; 11. amostra N; 12. marcadores de massa molecular. Densitogramas relativos à figura 16: Figura 17: Densitograma da amostra de leite UHT H.

33 33 Figura 18: Densitograma da amostra de leite UHT I. Figura 19: Densitograma da amostra de leite UHT J. Figura 20: Densitograma da amostra de leite UHT K.

34 34 Figura 21: Densitograma da amostra de leite UHT L. Figura 22: Densitograma da amostra de leite UHT M. Figura 23: Densitograma da amostra de leite UHT N. Assim como nas amostras anteriores, houve predomínio das frações α-cn (pico demonstrado pela mobilidade entre 0,35 e 0,40) e β-lactoglobulina (demonstrado pela mobilidade entre 0,6 e 0,7), com presença de traços de outras frações protéicas.

35 Tabela 4: Massa molecular (MM) e mobilidade eletroforética relativa (Rf) das bandas reveladas no gel de corrida; referentes à Figura 16. Linha 1 Linha 2 Linha 3 Linha 4 Linha 5 Linha 6 Bandas MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf , ,8 0, ,7 0, ,6 0, ,3 0, ,7 0, , ,3 0, ,3 0, , ,4 0, ,4 0, , ,5 0, ,8 0, , ,1 0, , , ,7 0, ,8 0, ,8 0, ,7 0, ,3 0,83 Linha 7 Linha 8 Linha 9 Linha 10 Linha 11 Linha 12 Bandas MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf ,3 0, ,3 0, ,9 0, , ,2 0, , , ,1 0, , ,4 0, ,2 0, , ,3 0, ,8 0, ,8 0, ,6 0, ,4 0, , ,9 0, ,5 0, ,4 0, , ,3 0, , ,2 0, ,2 0, , ,3 0, ,7 0, , ,3 0, ,4 0, ,9 0, ,1 0, ,6 0, , ,8 0, ,68 0, ,4 0, ,7 0, ,22 0, ,7 0, ,59 0, ,5 0,8 35

36 36 Figura 24: Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) com SDS (SDS-PAGE) em amostras de leite UHT. 1. marcadores de massa molecular; 2. α-caseína; 3. β-caseína; 4. κ-caseína; 5. amostra O; 6. amostra P; 7. amostra Q; 8. amostra R; 9. amostra S; 10. amostra T; 11. amostra U; 12. marcadores de massa molecular. Densitogramas relativos à figura 24: Figura 25: Densitograma da amostra de leite UHT O.

37 37 Figura 26: Densitograma da amostra de leite UHT P. Figura 27: Densitograma da amostra de leite UHT Q. Figura 28: Densitograma da amostra de leite UHT R.

38 38 Figura 29: Densitograma da amostra de leite UHT S. Figura 30: Densitograma da amostra de leite UHT T. Figura 31: Densitograma da amostra de leite UHT U. Nas amostras acima, já ocorre uma melhor visualização e mais correta caracterização dos picos protéicos, representados pelas frações α-cn, β-cn, κ-cn (três picos centrais com mobilidade entre 0,35 e 0,55), β-lactoglobulina e α-lactoalbumina (dois últimos picos, respectivamente), além da presença de traços de peptídeos de alta massa molecular. As três primeiras frações são predominantes no leite e as duas últimas, do soro.

39 Tabela 5: Massa molecular (MM) e mobilidade eletroforética relativa (Rf) das bandas reveladas no gel de corrida; referentes à Figura 24. Linha 1 Linha 2 Linha 3 Linha 4 Linha 5 Linha 6 Bandas MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf , , ,5 0, ,8 0, ,5 0, ,9 0, , ,9 0, ,5 0, , ,1 0, , , ,1 0, ,8 0, , ,9 0, , ,5 0, ,6 0,82 Linha 7 Linha 8 Linha 9 Linha 10 Linha 11 Linha 12 Bandas MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf ,8 0, ,4 0, ,9 0, ,8 0, ,2 0, , ,5 0, ,1 0, ,8 0, ,6 0, ,5 0, , ,5 0, ,6 0, ,8 0, ,2 0, ,1 0, , ,1 0, ,4 0, ,8 0, , ,7 0, , , , ,2 0, , ,2 0, , ,7 0, ,4 0, ,4 0, ,7 0, , , ,9 0, ,9 0, ,1 0, ,7 0, ,8 0, ,1 0, ,8 0, ,3 0,84 39

40 40 Figura 32: Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) com SDS (SDS-PAGE) em amostras de leite UHT. 1. marcadores de massa molecular; 2. α-caseína; 3. β-caseína; 4. κ-caseína; 5. amostra V; 6. amostra W; 7. amostra X; 8. amostra Y; 9. amostra Z; 10. amostra AA; 11. marcadores de massa molecular. Densitogramas relativos à figura 32: Figura 33: Densitograma da amostra de leite UHT V.

41 41 Figura 34: Densitograma da amostra de leite UHT W. Figura 35: Densitograma da amostra de leite UHT X. Figura 36: Densitograma da amostra de leite UHT Y.

42 42 Figura 37: Densitograma da amostra de leite UHT Z. Figura 38: Densitograma da amostra de leite UHT AA. Nas amostras finais, da mesma forma que as amostras prévias, há o predomínio das frações α-cn, β-cn, κ-cn (três picos centrais com mobilidade entre 0,35 e 0,55), β- lactoglobulina e α-lactoalbumina (dois últimos picos, respectivamente), além da presença de traços de peptídeos de alta massa molecular.

43 Tabela 6: Massa molecular (MM) e mobilidade eletroforética relativa (Rf) das bandas reveladas no gel de corrida; referentes à Figura 32. Linha 1 Linha 2 Linha 3 Linha 4 Linha 5 Linha 6 Bandas MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf , ,7 0, ,8 0, ,8 0, ,6 0, ,9 0, , , ,1 0, , , ,8 0, , ,9 0, , , , ,9 0, , ,2 0, ,4 0, ,1 0, ,9 0, ,6 0, ,6 0, ,2 0, ,81 Linha 7 Linha 8 Linha 9 Linha 10 Linha 11 Bandas MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf ,7 0, , ,1 0, ,8 0, , ,5 0, , ,3 0, ,4 0, , ,7 0, ,4 0, ,8 0, ,2 0, , ,6 0, ,6 0, ,8 0, ,2 0, , , ,8 0, ,4 0, , , ,2 0, ,1 0, ,4 0, ,9 0, , ,1 0, ,2 0, ,2 0, , , ,6 0, ,5 0, ,4 0, ,3 0, ,1 0, ,3 0, ,6 0,82 43

44 44 Com os resultados acima, pôde-se observar um perfil bastante similar entre as amostras de leite, predominando as frações protéicas de α-cn, β-cn, κ-cn, β- lactoglobulina e α-lactoalbumina, sendo três primeiras frações predominantes no leite e as duas últimas no soro. Não houve diferenças significativas quanto às bandas principais e suas respectivas mobilidades. Entretanto, algumas amostras, inclusive em lotes de mesma marca, apresentaram traços das frações em proporções diferentes das esperadas. Isto ocorre devido à influência do tempo de validade e estoque do leite, já que suas proteínas tendem a depositar no fundo do pacote, de acordo com o processo conhecido como de coagulação doce, reduzindo sua vida útil. Além disso, o próprio tratamento térmico utilizado para o preparo da amostra pode contribuir para esta discrepância; mas, também não se deve descartar falha na homogeneização da amostra durante seu preparo. Ainda assim, foi possível a caracterização das frações protéicas principais das amostras. Para o leite de vaca, trabalhos conduzidos em condições similares (PEREIRA, 2003) indicam que as frações caseínicas aparecem na seguinte ordem crescente de mobilidade eletroforética: α (αs 2 e αs 1 ), β e κ CN. De acordo com FARRELL et al (2004), as massas moleculares das mais importantes frações caseínicas estão na faixa de 19,00 a 25,00 KDa, mas, neste experimento, elas parecem migrar até a faixa próxima ou maior que a anidrase carbônica (massa molecular 30,00 KDa), o que demonstra que as caseínas exibem comportamento anormal nestas condições. Isto pode ser justificado pela ligação em proporções variadas ao SDS pelas diferentes frações caseínicas ou pela interação entre as frações caseínicas separadas (PEREIRA, 2003). Embora os valores das massas detectadas nesta pesquisa sejam maiores que as massas descritas, esta seqüência concorda com o perfil, já que os padrões apresentaram valores semelhantes.

45 Caracterização de Amostra de Soro de Queijo Minas Frescal e Amostras Fraudulentas Figura 30: Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) com SDS (SDS-PAGE). 1. marcadores de massa molecular; 2. α-caseína; 3. β-caseína; 4. κ-caseína; 5. amostra de leite UHT sem fraude; 6. soro de queijo minas frescal; 7. fraude 2%; 8. fraude 4%; 9. fraude 6%; 10. fraude 8%; 11. fraude 10%; 12. marcadores de massa molecular. Densitogramas relativos a figura 30: Figura 31: Densitograma da amostra de leite UHT sem fraude.

46 46 Figura 32: Densitograma da amostra de soro de queijo minas frescal. Figura 33: Densitograma da amostra de fraude a 2%. Figura 34: Densitograma da amostra de fraude a 4%.

47 47 Figura 35: Densitograma da amostra de fraude a 6%. Figura 36: Densitograma da amostra de fraude a 8%. Figura 37: Densitograma da amostra de fraude a 10%.

48 Tabela 7: Massa molecular (MM) e mobilidade eletroforética relativa (Rf) das bandas reveladas no gel de corrida; referentes à Figura 30. Linha 1 Linha 2 Linha 3 Linha 4 Linha 5 Linha 6 Bandas MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf , ,7 0, ,5 0, ,4 0, ,2 0, ,4 0, , , ,1 0, , ,3 0, ,4 0, , , ,6 0, , ,2 0, ,6 0, , ,8 0, ,3 0, ,5 0, , ,8 0, ,5 0, ,87 Linha 7 Linha 8 Linha 9 Linha 10 Linha 11 Linha 12 Bandas MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf MM Rf ,6 0, ,2 0, ,5 0, ,3 0, ,3 0, , ,1 0, ,9 0, ,2 0, ,1 0, , , ,4 0, ,1 0, , ,8 0, ,9 0, , , ,3 0, ,6 0, ,1 0, ,9 0, , , ,5 0, ,8 0, ,1 0, ,5 0, , ,5 0, ,2 0, ,4 0, ,9 0, , , ,6 0, ,9 0, ,5 0, , ,4 0, , ,4 0, ,6 0, ,5 0, ,2 0, ,2 0, ,2 0, ,5 0, ,2 0, , ,5 0, ,8 0, , ,3 0, ,6 0,73 48

49 A partir das figuras abaixo, pôde-se comparar os densitogramas das amostras de leite UHT, soro e das simulações de fraude. Figura 38: Densitograma típico de leite UHT. Linha 5, conforme bandas descritas na Tabela 7. Figura 39: Densitograma relativo a linha 6: Soro de Queijo Minas Frescal. Bandas descritas conforme a Tabela 7. Figura 40: Densitograma típico de simulação fraude com soro em leite UHT (10% soro adicionado linha 11). Bandas descritas conforme a Tabela 7.

50 50 Com relação ao soro (linha 6), as bandas que apresentam mais alta coloração e, conseqüentemente, concentração, referem-se as frações β-lactoglobulina e α- lactoalbumina que apresentam migrações e massas moleculares específicas conforme FARRELL et al (2004). As linhas 7 a 11 representam injeções de leite fraudado, adicionado de percentuais crescentes de soro e observa-se um perfil correspondente ao somatório de ambos perfis (leite UHT genuíno e soro). As avaliações comparativas das fraudes com o perfil do leite genuíno não revelam as diferenças esperadas nos picos correspondentes às frações de β- lactoglobulina e α-lactoalbumina, já que, classicamente, deveriam estar aumentadas, mesmo quando da mistura a 10%. Por outro lado, ao analisar as frações de alta massa molecular, na faixa de 90,00 a 50,00 kda, observou-se que a partir da mistura de 2% de soro tais frações apresentam-se aumentadas no gráfico densitométrico, demonstrando a adição do soro ao leite.

51 51 5. CONCLUSÕES A partir das análises, observou-se que o leite UHT e o soro de queijo minas frescal apresentam perfis eletroforéticos distintos em relação às frações protéicas principais de cada produto, apesar de possuírem frações em comum, como era esperado. As frações predominantes do leite detectadas foram α-, β- e κ-caseínas, enquanto que no soro foram β-lactoglobulina e α-lactoalbumina. As diferenças entre as proporções das frações protéicas detectadas em amostras de leite de mesmo lote podem ser justificadas pela ocorrência do processo de coagulação doce, onde ocorre precipitação das proteínas do leite dentro de sua embalagem original, reduzindo sua vida útil; e também por possível má homogeneização da embalagem quando do preparo da amostra. O perfil fraudulento é constituído do somatório dos perfis do leite e do soro e mostra diferenças principalmente entre as frações protéicas de alta massa molecular, quando comparado ao perfil do leite; porém, as variações esperadas nas frações de β- lactoglobulina e α-lactoalbumina não corresponderam. Portanto, verificou-se que o método é sensível para detecção de fraudes a partir da concentração mínima empregada neste trabalho, ou seja, 2% de soro adicionado, não pela diferença dos picos nas frações de β-lactoglobulina e α-lactoalbumina mas sim, pela caracterização de outras de maior massa molecular.

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