Apostila de Aulas Práticas

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1 Apostila de Aulas Práticas Bacteriologia Nutrição Raquel de Souza Sant Anna (Monitora da Disciplina de Bacteriologia em 2007) Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira (Professor Adjunto de Bacteriologia) 2007

2 Apresentação O aprendizado teórico e prático de microbiologia, incluindo a bacteriologia, é muito importante para o profissional da área de nutrição. As áreas de atuação em controle microbiológico de alimentos, treinamento de manipuladores, tecnologia na produção de alimentos, entre outras, exigem um profundo conhecimento desta disciplina. A apostila é o material de apoio às aulas práticas disponibilizado aos alunos. Esta contém explicações teóricas e práticas dos procedimentos a serem realizados em cada aula de forma clara e didática. A disciplina já possuía uma apostila de aulas práticas desde 2001, mas é necessária constante renovação para que os assuntos sejam abordados de maneira atualizada e direta para despertar o interesse dos alunos. Cada assunto apresenta uma introdução contendo a teoria do tema abordado, assim como a sua aplicação e importância no exercício da profissão, objetivando o melhor entendimento do tema, dos materiais a serem utilizados, da execução e dos resultados obtidos. No final de cada assunto o aluno poderá tirar as suas conclusões da prática executada e encontrará algumas questões de fixação. A apostila apresenta, também, figuras ilustrando a atividade a ser realizada, facilitando a compreensão do aluno. Finalmente procurou-se acentuar a importância e aplicação de cada prática no contexto das atividades de um nutricionista de modo a estimular o aprendizado. Esperamos que você, aluno, aproveite ao máximo este recurso didático! Lembre-se, qualquer dúvida, não hesite em perguntar ao seu professor ou aos monitores! Os autores.

3 Índice Como trabalhar no laboratório de microbiologia... 1 Assunto 1: Meios de cultura e Técnicas de Semeadura... 5 Assunto 2: Bactérias no Ambiente Assunto 3: Controle Microbiano Assunto 4: Coloração de Gram Assunto 5: Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos TSA (Antibiograma) Assunto 6: Cocos Gram positivos Assunto 7: Coloração de Zihel-Neelsen (Visualização de Bactérias Espiraladas) Assunto 8: Bacilos Gram-negativos Assunto 9: Contagem em Placa e Técnica do Número Mais Provável (NMP) Bibliografia... 80

4 Como trabalhar no laboratório de microbiologia É importante que falemos brevemente obre como devemos nos portar dentro de um laboratório de microbiologia em geral, não importando se o microorganismo estudado será uma bactéria, um fungo ou um vírus. Cuidados fundamentais Alguns experimentos que nós realizaremos podem ser perigosos se você manipular os materiais impropriamente ou executar os procedimentos incorretamente. São necessárias algumas medidas de segurança quando se trabalha com microorganismos e substâncias químicas, além de vidros, banhos-maria ferventes, instrumentos cortantes e outros materiais. Se você tiver qualquer problema com materiais ou procedimentos, não hesite em chamar o professor ou o monitor para te auxiliar. Procedimentos de Precaução e Segurança O laboratório de microbiologia é um lugar onde culturas de microorganismos são manipuladas e examinadas. Este tipo de atividade deve ser realizado em conjunto com boas técnicas assépticas, num local de trabalho limpo e organizado. Também como técnicas assépticas, todos os materiais que serão utilizados serão esterilizados para eliminar todos os microorganismos presentes ali, e deve-se tomar muito cuidado para não haver recontaminação deste material com microorganismos do ambiente. Geralmente, os microorganismos estudados não são patogênicos, mas ainda assim, devemos manipular qualquer cultura ou qualquer organismo como se fosse potencialmente patogênico, lembrando que muitos microorganismos que geralmente não são patogênicos podem causar doenças oportunistas. Cada estudante deve aprender e praticar as práticas assépticas no laboratório. Isto é importante para prevenir a contaminação de suas mãos, cabelos e roupas com material contaminado, além de evitar a contaminação do seu trabalho e proteger seus colegas que estarão trabalhando na bancada ao lado. A importância da assepsia e desinfecção apropriadas está descrita na apostila e será observada em uma das aulas práticas. Em geral, todos os procedimentos de segurança e precauções tomados no laboratório de microbiologia se resumem em: 1 restringir os microorganismos presentes em culturas e amostras aos recipientes (vidros ou sacos de coleta, placas ou tubos) quando da sua coleta, crescimento (incubação) ou sua análise; 2 prevenir a contaminação com microorganismos ambientais (normalmente presentes nas mãos, cabelos, roupas, superfícies e no ar) das amostras e culturas analisadas, o que pode interferir nos resultados obtidos. Mãos e superficies devem ser higienizados e tratadas com anti-sépticos e desinfetantes corretos, jalecos devem ser utilizados, cabelos compridos devem ser presos para trás, e as áreas de trabalho devem estar livres de objetos desnecessários. Lembre-se que na hora de transferir os microorganismos ou culturas não devemos utilizar a boca (por exemplo, para pipetar). 1

5 A conduta pessoal no laboratório de microbiologia deve ser sempre observada. O monitor ou professor deve ser sempre consultado caso haja algum problema. Conduta geral no laboratório 1 Sempre identifique e confira o seu material antes de iniciar os trabalhos no laboratório. 2 Antes de entrar no laboratório, retire casacos, jaquetas, etc. Estes itens devem ser deixados em uma prateleira com sua bolsa ou mochila, papéis e outros itens que não serão utilizados na aula prática. 3 Para entrar no laboratório, todos os estudantes devem estar usando seu jaleco, de preferência limpo e branco. 4 No início e no final de cada aula prática, os alunos devem limpar e desinfetar a sua bancada com uma solução desinfetante própria. Este espaço deve ser mantido limpo e arrumado durante o decorrer de toda a aula prática. 5 Antes de começar devemos lembrar: - prenda seu cabelo comprido para trás, longe da chama do Bico de Bunsen; - não use jóias e acessórios durante a aula prática; - mantenha seus dedos, lápis, caneta e qualquer objetos longe da sua boca; - não fume, coma ou beba nada no laboratório; - não fique andando pelo laboratório, pois atividades desnecessárias podem causar acidentes, distrair os outros alunos e promover contaminação. 6 Lembre-se de trazer uma caneta que escreva em vidro (caneta para retro, cd, marcador, etc.) 7 Anote todos os detalhes da aula prática e faça os exercícios de fixação de cada assunto. 8 Se você está em dúvida quanto ao procedimento, confira na apostila. Se a dúvida persistir, chame o professor ou monitor. Evite tirar dúvidas com os colegas de outros grupos. 9 Se respingar cultura em suas mucosas (boca, olhos) ou qualquer tipo de acidente ocorrer, chame o professor ou monitor imediatamente. Limpe o local com papel toalha e ponha desinfetante sobre o local (superfícies inanimadas) por 15 minutos, retirando com papel toalha. 10 Avise ao professor ou monitor sobre qualquer acidente (corte, queimadura) que ocorra. 11 Nunca retire culturas ou equipamentos do laboratório em quaisquer circunstâncias. 12 antes de sair do laboratório, cuidadosamente lave e faça a anti-sepsia em suas mãos. Lembre-se de lavar seu jaleco para a próxima aula prática. 2

6 Como trabalhar com o microscópio Em primeiro lugar é essencial que você conheça as partes ópticas e mecânicas dos microscópios: - Mantenha o microscópio livre de poeira, vapores ácidos e do contato com reagentes. Para mantê-lo seco, cubra com capa de flanela, pois evita o pó e a multiplicação de fungos (Obs: as capas devem ser lavadas periodicamente). - Não manusear o equipamento com as mãos sujas ou molhadas. - Jamais comer ou beber próximo ao equipamento. - Na remoção do equipamento, segure-o firmemente com uma das mãos no braço e outra na base, ou com as duas no braço, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfície plana, evitando qualquer movimentação brusca. Nunca desloque o aparelho com a lâmpada acesa ou logo após ter sido apagada. - Muita atenção é necessária quando se observa a preparação em meio líquido, pois há sempre o risco de molhar a lente frontal da objetiva; portanto o conselho é retirar o excesso de líquido com papel de filtro, antes de colocar a lâmina sobre a platina; em de acidente, enxugar imediatamente com papel absorvente macio. 3

7 - Na observação de uma preparação, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para focalizar com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma: à Escolha uma estrutura na preparação, mova a lâmina até que o objeto fique exatamente no centro do campo, em seguida mude para a objetiva de maior aumento, olhando por fora para evitar o choque com a lamínula. à Olhar pela ocular e abaixar o tubo ou elevar a platina com o macrométrico muito lentamente; assim que a imagem aparecer, mesmo confusa, parar e completar a focalização com o micrométrico. à O uso da objetiva de imersão é mais delicado, pois a distância focal entre a face da objetiva e a parte superior da lamínula, diminui quando a ampliação é aumentada. à Em primeiro lugar, assegure-se da existência de algo no campo, posicionando a objetiva de menor aumento. à Certifique-se que a iluminação e o objeto estão bem centrados, suspenda o tubo e coloque uma gota de óleo no centro da operação; o óleo deve ter o mesmo índice de refração da objetiva; à Abaixe o tubo até colocar a lente frontal em contato com a gota de óleo ainda convexa, até a mudança de forma da mesma; suspenda levemente o tubo, mas sem perda de contato com a gota, coloque os olhos nas oculares e abaixe o tubo muito lentamente; assim que a imagem aparecer, complete a focalização com o micrométrico. 4

8 Assunto 1: Meios de cultura e Técnicas de Semeadura Introdução O estudo de bactérias exige o prévio isolamento e identificação, para tanto, são utilizados diversos meios de cultura diferentes. Meio de cultura é uma mistura de nutrientes que possibilitam o crescimento in vitro de microorganismos. A maioria das bactérias cresce em meios de cultura. As exceções são as ricketsias, clamídias, Mycobacterium leprae e Treponema, que são parasitos intracelulares obrigatórios. Neste caso, estes microorganismos podem ser cultivados em culturas de células e ovos embrionados. Inoculação é a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a transferência de um determinado número de microorganismos para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a sua identificação. A inoculação das bactérias em diferentes meios envolve várias técnicas de semeadura. Toda a manipulação realizada em laboratório (com meios, cultura e material utilizado) requer certos cuidados para evitar a contaminação. Esses procedimentos são denominados técnicas assépticas. Fundamentação teórica Meios de Cultura Os diversos meios de cultura existentes podem ser classificados de diversas formas: Quanto à composição Naturais Artificiais São aqueles encontrados na natureza, de origem vegetal (p.ex.: pedaço de batata, de abóbora) ou animal (p.ex.: gema de ovo, pedaço de carne) São aqueles fabricados em laboratório, constituído de substâncias químicas, podendo ser definidos ou indefinidos (complexos) Definidos Indefinidos Possui composição definida, ou seja, se conhece qualitativa e quantitativa sua composição. A sua composição real não é conhecida, apenas é feita uma estimativa qualitativa. Por exemplo: meios suplementados com sangue, gema de ovo, alimentos... Quanto ao estado Líquido São desprovidos de Agar à caldo 5

9 físico Quanto à finalidade e características Semi-sólido Sólido Simples Enriquecido De enriquecimento Seletivo Diferencial Indicadores De estoque Apresentam em sua composição até 1% de Agar. Apresentam em sua composição de 1,5 a 2,5% de Agar. Só possui os nutrientes básicos para o crescimento das bactérias em geral. Além dos nutrientes básicos possui elementos nutritivos a mais, como fatores promotores de crescimento (sangue...), mas não é específico. É suplementado com nutrientes específicos para o microorganismo que se deseja pesquisar. Além disso, possui nutrientes agentes inibidores de determinados microorganismos, mas não permite o isolamento da bactéria, pois é um meio líquido. Por exemplo: aminoácidos (lisina à Salmonella) Possui agentes inibidores de determinados microorganismos. Permite a identificação e isolamento da bactéria, pois é um meio sólido (permite a visualização de UFCs). Por exemplo: Agar EMB à inibe Gram+ Permite a diferenciação de diferentes microorganismos. Por exemplo: a diferenciação de bactérias fermentadoras e não fermentadoras da lactose no Agar EMB. Possuem agentes que indicam determinadas reações no meio, para a determinação do metabolismo das bactérias. Por exemplo: ferro no meio à pode indicar a produção de H 2 S pelo enegrecimento do meio. (sulfeto ferroso) *** geralmente o agente é um indicador de ph Meios onde são estocadas culturas puras para posterior utilização. Geralmente são meios semisólidos. Técnicas de Semeadura As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos de um meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para um outro meio de cultura. Para garantir que apenas o microorganismo desejado seja semeado, são utilizadas as técnicas assépticas: procedimentos que devem ser adotados visando a não contaminação de materiais, meios e culturas. As técnicas de assepsia incluem: è fazer a desinfecção da área de trabalho e anti-sepsia das mãos ANTES e DEPOIS de qualquer trabalho. (1) 6

10 è trabalhar SEMPRE na área de segurança: uma área de aproximadamente 10 cm ao redor da chama do bico de Bunsen. (2) è esterilizar adequadamente todo material (p.ex.: alças e agulhas bacteriológicas) ANTES e DEPOIS de seu uso à sempre aquecer da base para a ponta, evitando a formação de aerossóis. (3) è flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculações, evitando a contaminação da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o microorganismo desejado será inoculado. (4) De acordo com as características físicas dos meios de origem e destino, além da finalidade da inoculação, podem-se utilizar diferentes técnicas de inoculação. A transferência de inóculo de um meio para outro também é denominada genericamente como repique. A seguir, veremos quais são as técnicas de inoculação: Semeadura em meios sólidos Meio inclinado em tubos Estria sinuosa: semear com alça ou agulha bacteriológica, em zig-zag, partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio). Objetivo: obtenção de intensa massa de microorganismos ou Estria Reta: semear com agulha bacteriológica, fazendo uma linha reta, com cuidado de não ferir o Agar, partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio). 7

11 Objetivo: obtenção de pequena massa de microorganismos. Meio em camada alta Picada Central: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas. Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas. Meio em placa de Petri Pour-plate ou disseminação (método em profundidade): Transferir 1 ml da cultura para placa de Petri vazia, colocar ml do meio fundido (e resfriado a cerca de C) sobre a cultura e homogeneizar suavemente com movimentos circulares. Objetivo: contagem bacteriana. É utilizado também para análise de microorganismos anaeróbios, adicionando uma outra camada de meio fundido após o endurecimento da primeira camada. Estria simples: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A estria pode ser realizada em movimento de zigzag (estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre o meio (estria reta). Objetivo: Essa técnica é muito utilizada para visualização de determinadas propriedades metabólicas, como a produção de enzimas hidrolíticas (hidrólise de substâncias do meio - gema de ovo, sangue...), e produção de pigmentos. Esgotamento em estrias ou estrias múltiplas: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A placa é dividida em 4 quadrantes e a inoculação pode ser feita de 2 tipos: à em 3 estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag. Quando atingir a metade, 8

12 ou girar a placa 90 e estriar até a metade (1/4 da placa), girar mais 90 e estriar o meio restante. à em 4 estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90, estriar 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90, estriar mais 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90 e estriar o restante do meio. Objetivo: obtenção de colônias isoladas. É importante não cruzar as estrias (não tocar a alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a cada estria e obter as colônias isoladas. Pode-se, alternativamente, flambar a alça entre as estrias e tocar a ponta da estria anterior, arrastando um pequeno inóculo para a próxima estria. Spread-plate ou distensão: Transferir 0,1 ml da cultura para o meio sólido na placa e espalhar uniformemente com a própria ponta da pipeta, ou alça bacteriológica / swab / alça Drigalsky. Objetivo: obtenção de crescimento confluente, ou para contagem bacteriana. Esta técnica é muito utilizada na realização de antibiogramas. Semeadura em meios semi-sólidos Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas. Além disso, o meio também é utilizado para estocar culturas puras. 9

13 Semeadura em meios líquidos Difusão: uma alçada da colônia (Agar em placa) ou da cultura (de outro meio ou líquido) é introduzida no meio líquido, com agitação da alça, para maior difusão dos microorganismos (da alça para o meio e homogeneização no meio). Pode-se inclinar o tubo a 30 e esfregar o inóculo na parede do mesmo, quando o tubo retornar à posição original o inóculo se difundirá no meio. Objetivo: é um repique genérico para crescimento bacteriano em meio líquido. Objetivos Após a realização da atividade prática você será capaz de: è executar e determinar a finalidade das principais técnicas de semeadura de bactérias em diferentes meios (líquidos, semi-sólidos e sólidos), tanto em tubos quanto em placas; è caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada um; è identificar e executar as técnicas de assepsia em laboratório. Material Para a atividade prática serão utilizados: - Placa de Petri com Agar - Tubo com Agar inclinado - Placa de Petri estéril - Tubo com Agar semi-sólido - Tubo com Agar em camada alta - Cultura bacteriana em caldo e em Agar - Amostra de água em tubo (para a técnica do pour plate) - Pipetas estéreis - Alça e agulha bacteriológicas 10

14 Execução da prática A partir de cultura em placa: - a partir de um crescimento isolado obtido em placa, pegar uma colônia com auxílio de uma alça bacteriológica e transferir para o tubo com caldo, através do processo de difusão. A partir de cultura em caldo: - a partir de um crescimento obtido em caldo, realizar as seguintes inoculações: 1. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com caldo, através da técnica de difusão. 2. Com auxílio de uma alça ou agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar inclinado, através da técnica de estria (sinuosa ou reta). 3. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para a placa com Agar, através da técnica de esgotamento em estrias (3 ou 4 estrias). 4. Com auxílio de uma agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar semisólido, através da técnica de picada central. 11

15 A partir da amostra de água: - com o auxílio de uma pipeta estéril, transferir 1 ml da amostra de água para uma placa estéril e adicionar o meio fundido, realizando a técnica do pour plate. 12

16 Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37 C por 24 horas. Observar e interpretar o crescimento nos meios, destacando aquele empregado no isolamento de colônias (esgotamento em estrias). Exercícios de fixação 1. Qual a diferença entre os meios de enriquecimento e seletivo? 2. Qual a finalidade da técnica do spread plate ou técnica do espalhamento? 3. Por que não devemos cruzar as estrias na técnica do esgotamento em estrias? 4. Por que devem ser realizadas as técnicas assépticas? 5. Por que utilizamos diferentes meios durante a análise de um determinado material (p.ex.: alimento)? 6. Para uma cultura que esteja guardada há muito tempo (sob refrigeração), qual o tipo de meio devemos utilizar para retornar a utilizá-la numa atividade prática? 7. Para determinar a presença de um microorganismo específico num material que esteja muito contaminado, quais os tipos de meios que devemos utilizar? 13

17 Observações 14

18 Assunto 2: Bactérias no Ambiente Introdução A presença de bactérias pode ser verificada em quase todos os ambientes. A exposição de alimentos, sua manipulação e conservação incorretas, são fatores que levam à sua contaminação por microorganismos. Os microorganismos podem ter relação com o alimento de três formas: è adicionados intencionalmente: são aqueles que provocam alterações desejáveis nos alimentos, como os lactobacilos, que fermentam o leite, transformando-o em iogurte, queijo (etc). è deterioradores: durante o seu desenvolvimento, estes microorganismos causam mudanças desagradáveis nos alimentos, tornando-os impróprios para o consumo, como os coliformes, que deterioram alimentos como queijos frescais, leite (etc). è patogênicos: podem colonizar o alimento e representam um risco à saúde de quem ingerir este alimento (com o microorganismo ou com toxinas formadas por este), como Salmonella sp., Staphylococcus aureus e outros. Fundamentação teórica As bactérias estão presentes em todos os ambientes. Muitas vezes, sua presença não é prejudicial, como os microorganismos que colonizam a nossa pele e o nosso trato gastrintestinal. Algumas vezes esta presença é até benéfica, como a utilização de microorganismos na indústria de alimentos na produção de alimentos fermentados, como diversas bebidas. Quem nunca ouviu falar em alimentos pré e pró bióticos? São alimentos que contém em sua composição microorganismos vivos que, quando no nosso organismo, causam reações benéficas (como auxiliar a regulação do trânsito gastrintestinal), ou estimulam os microorganismos da nossa microbiota normal a exercer seu papel benéfico no nosso organismo (como a produção de vitamina K pelas bactérias do nosso trato gastrintestinal). Mas, nem sempre a relação alimento x microorganismos x homem é benéfica. Diversos microorganismos têm a capacidade de nos causar doenças, até mesmo os microorganismos da nossa microbiota normal (em casos de redução da atividade imunológica, causando doenças oportunistas), e muitos casos podem ser veiculados por alimentos. É importante ressaltar que os alimentos por si só não são fontes de contaminação, mas podem veicular esta contaminação adquirida, podendo causar doenças. As principais fontes de contaminação são o solo e a água, as plantas, os utensílios utilizados na preparação do alimento (contaminação cruzada), o trato gastrintestinal do homem e de animais, os próprios manipuladores de alimentos, a ração animal, a pele dos animais, e até o ar. A indústria de alimentos vem crescendo e a preocupação com a obtenção de alimentos com qualidade tanto do ponto de vista tecnológico (o alimento deve ser nutritivo, competitivo, aceitável no mercado, etc.) quanto microbiológico (segurança alimentar) está cada vez mais desenvolvida. O nutricionista tem papel fundamental nesse controle, pois a manipulação, preparo e conservação inadequados estão freqüentemente associados a doenças (intoxicações ou infecções) microbianas. O manipulador de alimentos deve ter treinamento constante para que não contamine o alimento com técnicas e hábitos anti-higiênicos. 15

19 É dever do nutricionista conhecer os riscos associados à precariedade no cuidado com os alimentos para melhor orientação e supervisão das atividades de qualquer UAN (Unidade de Alimentação e Nutrição), restaurante ou indústria, evitando a disseminação de doenças através dos alimentos. Objetivos Após a realização da atividade prática você será capaz de: è constatar a presença de bactérias no ambiente; è compreender a importância dos critérios básicos de higiene na produção e manipulação de alimentos, visando evitar a contaminação dos mesmos por bactérias ambientais ou por portadores de microorganismos patogênicos; è diferenciar fontes de contaminação e veículos de contaminação; è comentar sobre o papel de bactérias ambientais como eventuais deterioradoras de alimentos. Material - 2 Placas de Petri com Agar - swab estéril Execução da prática Bactérias no ambiente: - 1 placa com Agar deve ser exposta ao ambiente, fora da área de segurança. Cada grupo deixará a placa em exposição por um tempo diferente (5 / 10 / 15 / 20 minutos) - após o tempo de exposição, a placa deve ser tampada novamente. Bactérias nas superfícies: - 1 placa com Agar deve ser dividida em 4 quadrantes - em cada quadrante deve ser inoculado um material diferente, para a verificação de bactérias em diversas superfícies, de acordo com o diagrama representado a seguir: 16

20 Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37 C por 24 horas. Observar e interpretar o crescimento nos meios. Exercícios de fixação 1. Qual o papel do nutricionista na qualidade microbiológica dos alimentos? 2. Por que é necessário tomar medidas de controle no ambiente em que se preparam e/ou manipulam alimentos? 3. O que é contaminação cruzada? 4. Os alimentos podem ser considerados fonte de contaminação? 5. Quais são as principais fontes de contaminação dos alimentos? Observações 17

21 Assunto 3: Controle Microbiano Introdução Como já vimos, as bactérias estão em quase todos os ambientes e superfícies, e não é desejável que muitos materiais se contaminem com elas, como os alimentos, os utensílios utilizados na sua preparação, medicamentos, e outros. Para tanto, podemos aplicar diversos métodos de controle microbiano. O crescimento microbiano é fortemente influenciado por fatores ambientais (fatores extrínsecos), quais sejam: temperatura ambiental, umidade relativa do ambiente, composição gasosa do ambiente. O controle microbiano compreende uma série de procedimentos com a finalidade de reduzir a quantidade, eliminar, diminuir / impedir a multiplicação de microorganismos existente em ambientes, utensílios, e superfícies vivas ou inanimadas. A conservação de alimentos envolve sempre o uso de uma ou mais técnicas empregadas no controle microbiano. Fundamentação teórica Antes de conhecer os processos utilizados para controle microbiano e compreender seu modo de ação, é importante que alguns conceitos muito utilizados sejam definidos: è Desinfecção: redução do número de microorganismos em uma matéria inanimada (ambientes, superfícies, objetos, alimentos) è Sanitização: igual a desinfecção (termo utilizado na indústria de alimentos) è Esterilização: destruição total de microorganismos em um material è Anti-sepsia: redução do número de microorganismos em matéria viva (pele) è Assepsia: conjunto de técnicas e/ou medidas assépticas, que visam a não contaminação de algo (por exemplo, de alimentos durante o preparo) Definidos estes conceitos, podemos comentar sobre os principais meios de controle microbiano, que pode ser feito através de agentes químicos ou físicos. Controle Microbiano por Agentes Físicos Calor Pode ser utilizado em duas formas: calor seco e calor úmido. 18

22 É o método mais empregado para destruição de microorganismos devido ao seu baixo custo de aplicação, fácil aplicação, eficácia e praticidade. Calor seco Calor úmido Modo de ação: Oxidação de componentes celulares Modo de ação: Desnaturação de componentes celulares Flambagem - Definição: contato direto do material a ser tratado com o fogo. É esterilizante - Aplicação: materiais metálicos (p.ex.: alça bacteriológica) Forno ou estufa - Definição: o material é submetido a uma temperatura de C por 1 2 horas. É esterilizante - Aplicação: vidrarias e metais (material cirúrgico) Incineração - Definição: queima total do material. É esterilizante. - Aplicação: materiais descartáveis (principalmente materiais hospitalares) Pasteurização - Definição: aplicação de calor inferior a 100 C. É desinfetante (não elimina formas esporuladas). Pode ser classificada em: à lenta: 63 C / 30 minutos à rápida: 72 C / 15segundos - Aplicação: diversos alimentos são pasteurizados, como sucos, leite, etc. Fervura - Definição: aplicação de calor a 100 C por 15 minutos. É desinfetante (não elimina formas esporuladas). - Aplicação: alimentos em geral, p.ex.: leite Autoclavação - Definição: aplicação de calor a 121 C a uma pressão de 1 atm, por minutos. - Aplicação: materiais, meios, utensílios. Diversos alimentos são tratados por este processo, p.ex.: alimentos enlatados (apertização). Esterilização - Definição: aplicação de calor maior que 100 C. Alimentos denominados UAT (UHT) são submetidos a uma temperatura de C por 2 4 segundos e rapidamente resfriados e acondicionados em recipientes estéreis. - Aplicação: diversos alimentos, como o leite UAT O calor úmido é mais eficaz que o calor seco, pois a água é melhor condutora de calor quando comparada com o ar. 19

23 Não ionizantes Ionizantes Radiações Luz Ultravioleta - possui atividade máxima num comprimento de onda de 260 nm - é desinfetante - geralmente é utilizado em ambientes - não é penetrante à desinfecção apenas superficial - a lâmpada tem vida útil de 200 horas (aproximadamente) - age no DNA microbiano, gerando mutações letais Radiação Gama - é esterilizante - mais energético que UV, atua num comprimento de onda menor - age ionizando componentes celulares, levando à morte - muito utilizado em produtos hospitalares descartáveis - seu uso nas indústrias de alimentos está crescendo - possui baixo poder de penetração à desinfecção apenas superficial Clarificante Esterilizante Filtração - retém as impurezas grosseiras - é desinfetante - possui poros iguais ou menores que 1 mm, podendo reter, inclusive, alguns vírus. Outros Pressão osmótica Dessecação Liofilização Baixas temperaturas Adição de NaCl - também conhecida como salga - reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo microbiano. Também pode causar lise osmótica da célula bacteriana. - muito utilizada em produtos cárneos (carne seca, pescado) Adição de outros sólidos (açúcares) - utilizado na fabricação de compotas e alimentos em calda - reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo microbiano - muito empregado para conservação de frutas e hortaliças - retirada umidade do alimento em maior ou menor grau - reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo microbiano - aplicação de dessecação em vácuo (pressão negativa) - reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo microbiano - seu emprego na indústria de alimentos é crescente Refrigeração 20

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