Méritos comparativos da Cromatografia em Fase Líquida de Alta Eficiência em escala convencional e minituarizada

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1 Rev. Bras. Farm. 9(): 44-50, 0 ARTIGO DE REVISÃO / REVIEW Méritos comparativos a Cromatografia em Fase Líquia e Alta Eficiência em escala convencional e minituarizaa Comparative merits of conventional an miniaturize High Performance Liqui Chromatography Recebio em /0/00 Aceito em 4/0/0 Nayane Magalhães Nogueira, Brunna Thye Miyamoto Soares, Anréia Barbosa Navarro e Anrae, Anil Kumar Singh * Universiae Anhembi Morumbi, São Paulo, SP, Brasil Departamento e Farmácia, Faculae e Ciências Farmacêuticas, Universiae e São Paulo, São Paulo, SP, Brasil RESUMO A cromatografia em fase líquia e alta eficiência (CLAE) é uma técnica e separação com finaliae qualitativa e quantitativa que apresenta boa sensibiliae e permite a separação e substâncias químicas e farmacêuticas, muito utilizaa na inústria farmacêutica, laboratórios e pesquisa e em outros campos a ciência como na meicina e em análises ambientais. Nos anos recentes, iferentes fabricantes aaptaram equipamentos que permitiram a miniaturização a técnica com o esenvolvimento e instrumentação aequaa e melhoramento o sistema e controle e aos. Esses equipamentos foram enominaos cromatografia em fase líquia e ultra eficiência (CLUE). O presente trabalho teve como objetivo apresentar os méritos os métoos e CLAE e CLUE que emonstrassem, através os resultaos e análises realizaas em ambos os métoos, as principais iferenças entre eles e a possibiliae e transferência e tecnologia. A revisão emonstrou aspectos importantes e ambas as técnicas revelano que a CLUE consiste em uma evolução tecnológica a CLAE, permitino importante otimização em termos e resolução e sensibiliae. Os aos obtios neste levantamento sugerem que a CLUE poe apresentar melhor relação custo-benefício a méio ou longo prazos, além a possibiliae e minimizar o impacto ambiental e ocupacional ecorrente o uso e solventes e outras substâncias. Palavras-chave: CLAE, CLUE, Escala convencional, Escala miniaturizaa, Estuo comparativo os méritos ABSTRACT High performance liqui chromatography (HPLC) is an efficient separation technique for quantitative an qualitative analysis of chemical an pharmaceutical substances. Wiely use in the pharmaceutical inustry, research laboratories an other fiels of science, such as meicine an environmental sample analysis. In recent years, several manufacturers aapte equipment that allowe the miniaturization of technology through the evelopment of aequate instruments an improvement in ata collection an analysis. These equipments are often calle "Ultra Performance Liqui Chromatography (UPLC). This paper aime at evaluation of merits of HPLC an UPLC methos an to emonstrate using the literature results, the main ifferences between them an the possibility of technology transfer. This review shows the most important aspects of both techniques, emonstrating that the UPLC consists of a technological evolution of the HPLC, allowing a significant optimization in terms of resolution an sensitivity. The ata in this review suggest that UPLC can prove to be more cost effective in meium to long term, besies the possibility of minimizing the impact on environmental an occupational health ue to use of solvents an other substances. Keywors: HPLC, UPLC, Conventional Scale, Miniaturize Scale, Comparative Stuy of Merits * Contato: Anil Kumar Singh, Departamento e Farmácia, Faculae e Ciências Farmacêuticas, Universiae e São Paulo, Caixa postal 66355, CEP: , São Paulo, SP, Brasil, anil@usp.br 44

2 Rev. Bras. Farm. 9(): 44-50, 0 INTRODUÇÃO A cromatografia poe ser consieraa um métoo físicoquímico e separação por conter uma fase móvel e uma estacionária, seno que a amostra a ser analisaa é injetaa na entraa a coluna e a fase móvel é bombeaa continuamente fazeno com que a amostra migre e acoro com as interações e as proprieaes físico-químicas a fase móvel e a estacionária. Outro lao a coluna é instalao um etector que transmite para um registraor um sinal que é interpretao em forma e cromatograma, seno a área e a altura este proporcional a concentração o analito (Ciola, 985; Jin et al., 008). De acoro com Tonhi e coautores (00), os sistemas e cromatografia em fase líquia e alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR) consistem e uma fase estacionária e menor polariae e uma fase móvel e maior polariae, apresenta iversas vantagens por permitir o uso e solventes relativamente menos tóxicos e e menor custo, como metanol e água. Entre os méritos mais importantes o CLAE-FR incluem isponibiliae as fases estacionárias estáveis e muitos tipos iferentes, rápio equilíbrio a coluna após a muança a fase móvel, faciliae e empregar eluição por graiente, maior rapiez em análises e boa reproutibiliae as respostas. Enquanto a CLAE em fase normal têm as polariaes invertias, o que permite a separação e solutos e iferentes polariaes, massas molares e funcionaliaes químicas. Nos anos recentes, a miniaturização a técnica e CLAE tornou-se possível, com o esenvolvimento a instrumentação (bombas, injetores e etectores) resistente às altas pressões e com volumes internos muito menores (conexões, alça e amostragem, cela o etector, bombas), celas o etector sem ispersão e com alta taxa e aquisição, melhoramento no sistema e controle e e aos. As colunas cromatográficas também foram preparaas para resistir a altas pressões e com baixo volume morto e injetores com precisão na faixa e volumes pequenos (Malaner & Jarim, 009; Wren, 005). A possibiliae e transferência e um métoo já esenvolvio e valiao empregano um sistema CLAE convencional para um sistema miniaturizao é um aspecto muito importante a ser consierao, pois, muitas vezes, tem-se constituío no fator limitante para ifusão e uso o sistema miniaturizao. A transferência e um métoo já esenvolvio para outro é totalmente passível ese que os fatores como o moo e eluição empregao seja consierao (Jerkovih et al., 005). Histórico A cromatografia em fase líquia teve início em 950 e alcançou muitos avanços até os ias e hoje. Nos últimos 40 anos, foi à técnica analítica que mais se esenvolveu e é uma as mais empregaas nas inústrias farmacêuticas (Tonhi et al., 00). Seu esenvolvimento contínuo buscou inovações tecnológicas e forma a moificar a fase estacionária eixano-a mais seletiva, eficiente e quimicamente e fisicamente mais estável como novas partículas para empacotamento com iâmetros menores e formas regulares (Tonhi et al., 00). As inovações proporcionaram melhor esempenho cromatográfico, maior reproutibiliae e análises mais rápias sem pera e eficiência e a resolução (Majors, 005; Wu & Thompson, 006). Para isso, a reução o tamanho as partículas a fase estacionária e as colunas foi à alternativa mais exploraa, porém ficou limitaa por um períoo por causa a elevaa pressão resultante esta concomitante reução, que não é compatível com os sistemas cromatográficos convencionais. Entretanto, o uso e colunas empacotaas com partículas e iâmetro sub-µm se tornou possível recentemente, com o esenvolvimento a cromatografia em fase líquia miniaturizao, que oferece vantagens sobre as colunas traicionais com partículas e 3 e 5µm, com menor tempo e análise (tr), maior resolução (Rs) e maior fator e capaciae e sinais (α) (Majors, 005). Em tempos atuais há necessiae e aumentar a eficiência analítica. A CLAE em escala miniaturizaa tem emonstrao ser uma técnica promissora neste sentio. Na atualiae há interesse consierável os fabricantes os equipamentos analíticos no esenvolvimento e instrumentação e acessórios que suportam pressões elevaas, as quais oferecem benefícios na rotina e análise, como sinais com maior eficiência, tempos e retenção menores e utilização e menor quantiae e solventes (Rainville & Plumb, 007; Wren & Tchelitcheff, 006). Comparação entre os métoos CLAE E CLUE O CLAE miniaturizao, enominao Cromatografia em fase Líquia e Ultra Eficiência (CLUE) é uma nova tecnologia para proporcionar a máxima eficiência cromatográfica as partículas porosas sub - µm e, com isso, ganho em resolução, sensibiliae, tempo e retenção, velociae linear, largura e eficiência nos sinais, permitino assim uma análise mais rápia e com um gasto e solventes e amostra menores entre as análises quano comparaas com a CLAE que utiliza partículas convencionas e 0 µm, 5 µm ou 3,5 µm (Jerkovih, et al., 005; Rainville & Plumb, 007; Wren, 005; Wren & Tchelitcheff, 006). A transferência e um métoo com coluna convencional para coluna com partículas e iâmetro sub-µm poe levar em conta as iferentes necessiaes analíticas. Se as imensões a coluna são mantias e somente o tamanho a partícula é reuzio, melhorias na eficiência, na resolução e na capaciae e sinais são obtias. Se, além a reução no tamanho a partícula, as imensões a coluna também forem reuzias, o tempo e análise também será menor. A Tabela apresenta uma relação entre quea e pressão na coluna ( P), tempo e retenção (tr), e acoro com as muanças no tamanho e partículas (p), e comprimento a coluna (L). Em ambos os casos, a vazão, o perfil o graiente e o volume e amostra injetao evem ser ajustaos aequaamente (Jin et al., 008). A base essa evolução é governaa pela equação e Van Deemter, que escreve a relação entre eficiência, expressa 45

3 Rev. Bras. Farm. 9(): 44-50, 0 pela altura e pratos teóricos (H, µm), velociae linear a fase móvel (µ, mm/s) e tamanho a partícula (p): H = A p BDM + µ CD pµ + D M One D M = coeficiente e ifusão o analito, µ = velociae linear a fase móvel (mm/s), p = tamanho a partícula e A, B e C são constantes (Malaner & Jarim, 009). Tabela. Variação e pressão na coluna ( P) e tempo e retenção (tr), e acoro com as muanças no tamanho e partículas (p), e comprimento a coluna (L) (Jin et al., 008). Tamanho e partículas (p, µm) Quea e Comprimento pressão ( P, (L, cm) psi) Tempo e retenção (tr, min) 5, O termo A refere-se ao alargamento os sinais, evio aos iferentes caminhos seguios pelas moléculas o analito. Esse termo poe ser minimizao usano-se colunas e tamanho reuzio, com iâmetros internos menores, sem empacotamentos eficientes e partículas uniformes. O termo B está relacionao à ifusão longituinal ou ifusão o soluto na fase móvel e este termo poe ser minimizao com o uso e altas velociaes lineares a fase móvel. O termo C escreve a transferência e massa o analito entre a fase móvel e a fase estacionária (Malaner & Jarim, 009; Nováková et al., 006). O mínimo a curva e Van Deemter representa a vazão ótima para se obter a eficiência máxima a coluna. Isto é um compromisso entre os termos B e C. Os termos A e C são influenciaos pelo tamanho as partículas. As partículas menores tenem a reuzir a altura o prato (H) e, essa forma, são obtias colunas com um número e pratos maior, ou seja, mais eficientes. As partículas pequenas tenem a permitir trocas o soluto na fase móvel e nos poros as partículas mais rapiamente evio a menor profuniae os poros. Assim, o soluto gasta um tempo menor entre a fase móvel e a fase estacionária, eluino em sinais estreitos (Jerkovih et al., 005). Uma vantagem o uso e partículas menores que µm é que a eficiência a coluna poe ser mantia com a iminuição o seu comprimento (Figura ). Uma coluna menor permite separações rápias, uma vez que o tempo e separação é proporcional ao comprimento a coluna. Além isso, uma coluna menor, comparaa a uma maior, empregano-se a mesma vazão e fase móvel, gastano uma menor quantiae e solvente, e amostra e e fase estacionária (Wren, 005). Figura. O efeito e tamanho a sílica (p) sobre a altura o prato teórico (H) em função a vazão a fase móvel (com aaptações) (Wren, 005). No caso e eluição isocrática, o principal fator a ser consierao é o volume extra-coluna (o injetor, a cela o etector e as tubulações), que provoca alargamento os sinais cromatográficos quano não existe compatibiliae entre o volume extra-coluna o equipamento com o iâmetro a coluna. Nesse caso, uma boa separação epene a razão entre o volume extra-coluna e o volume total (coluna/extra-coluna) que eve ser sempre menor que 0% em ambos os sistemas, CLAE e CLUE. Além isso, a fase estacionária eve ser similar à o métoo já existente. Deve-se otimizar o volume e injeção e a vazão a fase móvel, que poem ser calculaos pelas equações a seguir (Malaner & Jarim, 009): V c inj = V inj c One, Vinj = volume e injeção a ser eterminao; Vinj = volume e injeção o métoo esenvolvio; c = iâmetro interno a coluna a ser empregaa; c = iâmetro interno a coluna empregaa no métoo esenvolvio; L = comprimento a coluna a ser empregaa; L = comprimento a coluna empregaa no métoo esenvolvio. One, F = vazão a fase móvel a ser eterminaa; F = vazão a fase móvel o métoo esenvolvio; p = iâmetro a partícula e fase estacionária empregaa no métoo esenvolvio; p = iâmetro a partícula e fase estacionária a ser empregaa. Para eluição as substâncias, por graiente, eve ser levao em consieração o tempo e resiência a fase móvel que resulta em variações nos tempos e retenção, comprometeno a resolução, sobretuo as primeiras substâncias eluías quano não existe compatibiliae entre o tempo e resiência a fase móvel com o iâmetro a coluna. Com isso, a transferência o métoo só é vália c F = F c L L p p 46

4 Rev. Bras. Farm. 9(): 44-50, 0 quano a razão entre o tempo e retaramento a fase móvel é constante. Além isso, a fase estacionária eve ser similar à usaa no métoo já existente e a composição inicial e final o graiente eve permanecer ecer constante. Parâmetros como volume e injeção, vazão a fase móvel, tempo a etapa isocrática o graiente e tempo e graiente evem ser otimizaos e poem ser calculaos as seguinte forma, respectivamente (Malaner & Jarim, 009): t iso = t iso F One, tiso = tempo a etapa isocrática o graiente, tiso = tempo a etapa isocrática o graiente, F = vazão a fase móvel ; F = vazão a fase móvel ; Vm = volume e retaramento a fase móvel a ser empregao; Vm = volume e retaramento a fase móvel empregao no métoo esenvolvio. t gra One, tgra = tempo a etapa o graiente ; %B = porcentagem e solvente orgânico; Slope = inclinação a rampa o graiente. Miniaturização e Geração e Resíuos Orgânicos Os laboratórios que geram resíuos químicos na sua rotina (Equipamento e CLAE), a minimização (Equipamento e CLUE) resulta em atitues, que, quano implementaas e seguias corretamente, poerão certamente reuzir a proução e resíuos e reuzir o potencial e impacto no meio ambiente (Jarim, 998). Estas uas atitues são: -) Muança e escala convencional para a miniaturização e ) Substituição e reagentes e muanças nos proceimentos. Estas uas atitues, geralmente, não requerem custo exagerao (em curto prazo o aspecto econômico é pago pela economia geraa no consumo e reagentes bem como no tratamento e isposição final esses resíuos) e são facilmente assimilaas pelos colaboraores. (Borges et al., 004; Jarim, 993). A opção pela miniaturização iante à escala traicional, está centraa em algumas vantagens, iscutias a seguir: Economia e tempo Teno em vista que os volumes usaos são menores, o tempo gasto nas análises são bem menores. Além isso, pequenos volumes emanam um períoo e tempo muito mais rápio quano preceem a instrumentação analítica (Jerkovih et al.,, 005; Majors, 005; Nováková et al., 006; Pereira, 008). F V V m m (% Bfinal % B inicial ) = slope Economia financeira A grane maioria os ensaios usaos nas rotinas laboratoriais foi esenvolvia há pelo menos uma écaa (e alguns há mais e 50 anos), e aotam a escala convencional. Na escala miniaturizaa, no entanto, raramente se usa granes quantiaes, o que representa uma ampla economia em termos e solventes e energia usaa pelos equipamentos. Nos tempos atuais, além e existir aina a a preocupação com a isponibiliae a acetonitrila (ACN), o solvente orgânico mais utilizao atualmente nas cromatografias, CLAE e/ou CLUE, que foi rasticamente reuzia, enquanto seu preço chegou às alturas exageraos (Lanças, 009; Pereira, 008). Devio à enominaa crise esse solvente, a busca por novas alternativas para minimizar, substituir, ou eliminar o uso e ACN tem sio grane, e uma as alternativas sugerias no combate à escassez esse solvente é a miniaturização a coluna cromatográfica: iminuição o iâmetro interno a coluna (micro-clae) ou nano-clae) com imensa economia e solvente e no comprimento o tubo com conseqüente iminuição no iâmetro méio as partículas. Essa opção permite uma economia menor e fase móvel e uma economia e tempo e análise maior (Lanças, 009). Seno assim, os usuários e ACN como fase móvel na cromatografia evem ficar atentos para o fato e o custo estar se elevano e a isponibiliae esse solvente estar iminuino, eveno cogitar possíveis alternativas para a utilização e outros solventes ou pela miniaturização o processo (Lanças, 009). Como foi mencionao anteriormente, é importante ressaltar que a aaptação e um ensaio e escala convencional para a miniaturização irá exigir um novo protocolo e valiação analítica. Aspectos ambientais Talvez o ponto mais importante a muança a escala convencional para a aoção a miniaturização seja a formação e um profissional mais consciente as suas responsabiliaes com a preservação ambiental (Geração e Resíuos) (Jarim, 998; Nováková et al., 006). Seno assim, a aoção a miniaturização, a qual gera uma menor quantiae e resíuos o que a escalas convencionais, reuzem rasticamente a geração e resíuos nos laboratórios (Jarim, 998; Nováková et al., 006). Segurança O manuseio e pequenas quantiaes e reagentes agressivos e solventes voláteis torna o laboratório muito menos insalubre o que quano se trabalha com os granes volumes, observaos nos proceimentos convencionais. A aoção a miniaturização melhora a qualiae o ar respirável nos laboratórios e minimiza os riscos a saúe o colaboraor (Intoxicação Ocupacional) (Jarim, 998). 47

5 Rev. Bras. Farm. 9(): 44-50, 0 A Tabela escreve uma classificação poneraa as colunas cromatográficas baseaa no iâmetro interno as colunas comercializaas na atualiae. A vazão típica empregaa, eventuais resíuos geraos com as colunas o tipo nano capilar estacam a importância e a necessiae a miniaturização a cromatografia em fase líquia (Malaner & Jarim, 009; Nováková et al., 006). Tabela. Classificação as colunas baseaa no iâmetro interno (.i.) (Malaner & Jarim, 009; Nováková et al., 006). Tipo a coluna* Diâmetro interno típico* (mm) Vazão típica empregaa (ml /min) Volume morto (ml) (L = 50 mm) Capaciae e carregamento típico (µg) Preparativa > 5 > 30 > 50,0 > ** Semi-preparativa 0 5 7,5 5000** Convencional 4,6 ou 4,0,0,6 00 Mini-bore 3,0 0,4 0,7 40 Narrobore,0 0, 0,3 0 Microbore,0 0,05 0,075 5 Micro LC-Capilar < 0,5 0,0 0,0 Nano LC-Capilar < 0, 0,0005 0,00 0,05 * Designações esses tipos e colunas não são universalmente aceites e poem variar e acoro com os fabricantes..i. típico a coluna. O volume morto é baseao em comprimentos e 50mm.** conições e sobrecarga. ESTUDOS COMPARATIVOS DO CLAE E CLUE A seguir estão apresentaos alguns resultaos e trabalhos e separações obtias empregano a cromatografia em fase liquia em escala convencional e nos sistemas miniaturizao: Separação Cromatográfica o Ibuprofeno Pereira (008) apresentou um estuo no qual comparou um métoo cromatográfico com outros ois métoos por CLUE aplicaos na separação cromatográfica o Ibuprofeno. Os referios métoos empregam uma etecção em comprimento e ona e 4nm e as separações foram obtias em temperatura e 30 C. A fase móvel foi constituía e A= 0,05% ácio fosfórico em água: ACN (66: 34, v/v) e B = ACN. Para o sistema CLAE, o graiente usao foi: 0-4,9 min. (0% e B); 5,0 54,9 min. (85% e B com graiente linear); 55,0 70,0 min. (85% e B); 70, min. (0% e B). Para o sistema CLUE A o graiente usao foi: 0-6,0 min. (0% e B); 6, 4,0 min. (85% e B com graiente linear); 4, 7,9 min. (85% e B); 8,0 min. (0% e B). Para o sistema CLUE B o graiente usao foi: 0-3, min. (0% e B); 3, 7,0 min. (85% e B com graiente linear); 7, 8,9 min. (85% e B); 9,0 min. (0% e B). Foram usaas três colunas, uma convencional (C8, 50 mm x 4,6 mm, 5 µm) e uas em escala miniaturizaa: CLUE A (C8, 00 mm x, mm,,9 µm) e CLUE B (C8, 50 mm x, mm,,9 µm). A vazão a fase móvel foi e ml/min. para CLAE e 0,55 ml/min. para CLUE A e CLUE B e o volume e injeção e 0 µl,,4 µl e 0,7 µl, respectivamente. O tempo e retenção foi 35 min. para CLAE, 9,6 min. para CLUE A e 5 min. para CLUE B. Os resultaos apresentaos sugerem que a iminuição no comprimento, iâmetro interno a coluna e no tamanho e sílica a coluna levam a uma economia a fase móvel, a amostra e e tempo e análise, tornano o métoo mais rápio, barato e que não requer uma grane quantiae e amostra. Esses aos estão apresentaos na Tabela 3. Tabela 3. Consumo e tempo e solvente em análise e Ibuprofeno nas metoologias CLAE e CLUE (Pereira, 008). Parâmetros CLAE CLUE A CLUE B Tempo e corria cromatográfica (min) 47,6 6,6 Economia e tempo - 4 vezes 7 vezes Solvente gasto por análise (ml) 47 6,93 3,63 Economia e solvente - 4 vezes 3 vezes Separação Cromatográfica a Sinvastatina A separação cromatográfica e sinvastatina foi obtia com coluna convencional (CLAE) (C8, 50 mm x 4,6 mm, 5µm) e por uas colunas miniaturizaas, CLUE A (C8, 00 mm x, mm x,7 µm) e CLUE B (C8, 30 mm x. mm x,7 µm). Os referios métoos empregaram uma etecção em comprimento e ona e 38nm e as separações foram obtias em temperatura e 45 C (Rainville & Plumb, 007). A fase móvel foi constituío e ACN: tampão fosfato, ph 4,5; (65:35, v/v) para CLAE e para CLUE A e CLUE B manteve ACN:H0 (65:35, v/v). A vazão a fase móvel foi e,5 ml/min. para CLAE e 0,56 ml/min. para CLUE A e CLUE B e o volume e injeção e 0 µl para CLAE e 0,8µl para os métoos CLUE. O tempo e retenção foi 9,8,,9 e 0,3 min. para CLAE, CLUE A e CLUE B, respectivamente. Os resultaos emonstraram iferenças significativas tanto em quantiae e fase móveis gasto e iminuição o tempo e retenção que poem ser observaos na Tabela 4, bem como uma iminuição na quantiae e amostra requeria. 48

6 Rev. Bras. Farm. 9(): 44-50, 0 Cabe notar que uma moificação na composição a fase móvel foi necessária para obter eluições mais rápias no caso e CLUE. Isso sugere que tanto o comprimento e o iâmetro interno a coluna quanto o tamanho a sílica interferem nas interações retentivas estas colunas. Assim, evios cuiaos evem ser tomaos urante as transposições e um métoo esenvolvio em escala convencional para escala miniaturizaa. Tabela 4. Consumo e tempo e solvente em análise e Sinvastatina nas metoologias CLAE e CLUE (Rainville & Plumb, 007). Parâmetros CLAE CLUE A CLUE B Tempo e corria cromatográfica (min) 0, 0,4 Economia e tempo - 5 vezes 5 vezes Solvente gasto por análise (ml) 4,4,04,04 Economia e solvente - vezes 67 vezes Separação Cromatográfica a Lorataina Recentemente, Majors (005) apresentou uma comparação entre três métoos cromatográficos aplicaos na separação e lorataina. A fase móvel foi constituía e solução 0,0M fosfato e potássio ibásico (ph 7,): MeOH: ACN (36,8; 3,6; 3,6, v/v/v). A etecção foi realizaa no comprimento e ona e 47nm e as análises foram realizaas em temperatura e 30 C. Diferentemente os casos anteriores, one os comprimentos as colunas eram iferentes, neste caso o comprimento a coluna foi iferente apenas no caso e CLAE (50 mm) contra 00 mm para CLUE A e CLUE B. O iâmetro a coluna foi e 4,6 mm para toos os métoos. Entretanto, a coluna CLAE foi empacotaa com sílica e 5µm e as colunas CLUE A e CLUE B com 3,5µm. Uma vazão e ml/min. foi empregaa em toos os casos. Assim, poe-se perceber que a vazão poe ser mantia, quano o iâmetro interno a coluna é igual e, concomitantemente, não há granes muanças no tamanho a sílica empregaa para empacotar as colunas. Por outro lao, houve uma reução no volume e injeção a amostra para evitar acesso e carga nessas colunas curtas. Neste caso, o volume e injeção foi e 5µl para CLAE, 0 µl CLUE A e 5µl para CLUE B. O tempo e retenção a lorataina foi e 3,0 min., 9,0 min. e 4,5 min., respectivamente. Assim seno, mesmo sem apresentar iferença na vazão, os resultaos emonstraos e tempo e retenção e quantiae e amostra utilizaa são melhores e acoro com a iminuição o comprimento a coluna e tamanho a partícula e empacotamento entre CLAE e CLUE, conforme emonstrao na Tabela 5. Em toos os resultaos apresentaos e iscutios verificase que iferenças significativas se evem ao tamanho reuzio as partículas que leva a uma melhor eficiência e otimização a velociae a fase móvel e a transferência e massa. Além isso, evio à menor profuniae os poros a coluna, as trocas o soluto na fase móvel são mais rápias e surgem sinais mais estreitos. Poe-se observar, também, que a iminuição o comprimento a coluna não compromete sua eficiência, mas sim apresenta outras vantagens como a iminuição o tempo e separação, quantiae e solvente gasto, quantiae e amostra e e fase estacionária, visto que esses parâmetros são proporcionais ao tamanho a coluna. Tabela 5. Consumo e tempo e solvente em análise e Lorataina nas metoologias CLAE e CLUE (Majors, 005). Parâmetros CLAE CLUE A CLUE B Tempo e corria cromatográfica (min) Economia e tempo -,5 vezes 3 vezes Solvente gasto por análise (ml) Economia e solvente -,7 vezes 3,0 vezes CONCLUSÕES A cromatografia em fase líquia e ultra-eficiência (CLUE) é uma técnica bastante recente, e já está seno utilizaa em análises e rotina em iversas áreas. Esta rápia ifusão essa técnica está relacionaa, principalmente, à isponibiliae a instrumentação totalmente esenvolvia e aequaa para as necessiaes o emprego e partículas sub--µm e altas pressões, além e materiais e empacotamento, como as partículas híbrias, que possuem esempenho cromatográfico superior às partículas e sílica pura. Com base nos resultaos que estão seno apresentaos em iversos trabalhos realizaos por pesquisaores que comparam os ois métoos, poe-se observar que, a maior parte as substâncias analisaas apresenta menor tempo e análise e e uso e solvente em quantiaes reuzias, quano as analises são realizaas em CLUE. Apesar e toas estas vantagens, poucos estuos foram realizaos para avaliar o tempo e via as colunas que são submetias a conições extremas e pressão e o custo e manutenção e um equipamento que possui uma série e particulariaes e opera em altas pressões. Além isso, nos anos recentes houve esenvolvimento tecnológico as colunas cromatográficas, especificamente as colunas para o CLUE, que sejam capazes e gerar o máximo esempenho cromatográfico. O cuiao para com o escarte e resíuos químicos oriunos e laboratórios e ensino e pesquisa é antes e tuo, um compromisso moral para com a socieae. Um programa e gerenciamento e resíuos não é uma ativiae que envolve apenas algumas pessoas a uniae geraora, mas eve ser sempre trataa como uma ativiae cujo sucesso epene e toos. Aina que nos ias e hoje 49

7 Rev. Bras. Farm. 9(): 44-50, 0 a componente financeira e qualquer empreenimento tenha assumio uma importância ecisória, é importante lembrar que um programa este tipo não poe ser analisao apenas sob esta ótica. No cenário aqui apresentao, a contabiliae ambiental mostra que qualquer programa e minimização e impacto ambiental se paga mesmo em curto prazo. Neste contexto, conclui-se que a miniaturização a técnica e cromatografia em fase líquia aplicaa na análise as substâncias químicas e proutos farmacêuticos, seja em escala microlitros ou nanolitros, é um bom caminho para preservação ambiental em tempos atuais. REFERÊNCIAS Borges MS, Zamora PP, Kunz A. Gerenciamento e Resíuos e Laboratório: As Novas Tenências e a Sustentabiliae Ambiental. In: Congresso Brasileiro e ICTR Ciência e Tecnologia em Resíuos e Desenvolvimento Sustentável & NISAN - Ciclo e Conferências sobre Política e Gestão Ambiental, 004, Florianópolis. Resíuos: Resumo os trabalhos apresentaos no ICTR Congresso Brasileiro e Ciências e Tecnologia em Resíuos e Desenvolvimento Sustentável. NISAN Ciclo e Conferências sobre Política e Gestão Ambiental. São Paulo: ICTR, 0: 0-0, 004. Ciola R. Funamentos a cromatografia a gás. São Paulo: Egar Blucher Lta, p. Jarim WF. Gerenciamento e resíuos químicos em laboratórios e ensino e pesquisa. Quim. Nova, : , 998. Jarim WF. As inústrias químicas e a preservação ambiental. Rev. Quím. In., 69: 6-8, 993. Jerkovih AD, Lobrutto R, Vivilecchia RV. The use of acquity uplc in pharmaceutical evelopment. Sep. Sci. Reef., Maio: 5 -, 005. Jin Y, Xue X, Shi H, Xiao Y, Zhang F, Liang X. HPLC an UPLC switch for TCM analysis. Moe. Trait. Chin. Me. Mater. Me., 0(): 80-84, 008. Lanças FM. Como economizar (ou eliminar o uso e) acetonitrila em tempos e crise? Scientia Chromatographica, 0: 5-60, 009. Majors RE. Fast an ultrafast HPLC on sub--µm porous particles Where o we go from here? LCGC North Am., 3: 48-55, 005. Malaner L & Jarim ICSF. O Estao a Arte a Cromatografia Líquia e Ultra Eficiência. Quim. Nova, 3: 4 -, 009. Nováková L, Matysová L, Solich P. Avantages of application of UPLC in pharmaceutical analysis. Talanta, 68: , 006. Pereira L. Transferência e métoo HPLC para U-HPLC e maior resolução e rapiez. Rev. Anal, 34: 68-76, 008. Rainville P, Plumb R. Transfer of the USP Assay for Simvastatin to UPLC. Ultraperformance LC, Jun: 9 -, 007. Tonhi E, Collins KE, Jarim ICSF, Collins CH. Fases estacionárias para cromatografia líquia e alta eficiência em fase reversa, (CLAE-RF) baseaa em superfície e óxios inorgânicos funcionalizaos. Quim. Nova, 5: 66-63, 00. Wren SAC. Peak capacity in graient ultra performance liqui chromatography (UPLC). J. Pharm. Biome. Anal., 38: , 005. Wren SAC & Tchelitcheff P. Use of ultra-perfomance liqui chromatography in pharmaceutical evelopment. J. Chromatogr. A, 9: 40-46, 006. Wu N & Thompson R. Fast an efficient separations using reverse phase liqui chromatography. J. Liq. Chromatogr. & RT, 9: ,