13/09/2018. Monitoramento de L. monocytogenes em plantas de processamento de aves e suínos. Eliminar? Quando? Como? Biofilmes. Quem? INTRODUÇÃO. Onde?

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1 Biofilmes CONTROLAR Onde? 13/09/2018 Monitoramento de L. monocytogenes em plantas de processamento de aves e suínos LUCIANO DOS SANTOS BERSOT LACOMA/DCV/UFPR PROGRAMA DE PÓS - GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL Eliminar? Quando? INTRODUÇÃO Etapas críticas do processamento Higienização Quem? Tempo x temperatura Como? Característica da grande indústria Listeria monocytogenes Persistência da contaminação Nossas pesquisas L. monocytogenes: um problema para a indústria de P.O.A.? 1

2 ABATE E PROCESSAMENTO DE P.O.A Características Velocidade de processamento Sobrecarga Característica da grande indústria Listeria monocytogenes Persistência da contaminação Nossas pesquisas Ampliação de turnos de trabalho ABATE E PROCESSAMENTO DE P.O.A. ABATE E PROCESSAMENTO DE P.O.A. Produção 2

3 ABATE E PROCESSAMENTO DE P.O.A. Os exaustivos turnos de trabalho não favorecem o sucesso da etapa de Limpeza e Desinfecção podendo proporcionar maior grau de contaminação, maior diversidade de micro-organismos e maior adesão de grupos microbianos resistentes Círculo de Sinner Ação química Ação mecânica Ação térmica Tempo de contato FERRAMENTAS BPF PPHO PROGRAMAS DE AUTOCONTROLE HACCP Característica da grande indústria Listeria monocytogenes Persistência da contaminação Nossas pesquisas Característica da grande indústria Listeria monocytogenes Persistência da contaminação Nossas pesquisas 3

4 L. monocytogenes breve apresentação Importância em MV Patógeno ambiental Grande capacidade de formar biofilmes Contaminação pós-processamento Especialmente importante em alimentos RTE Característica da grande indústria Listeria monocytogenes Persistência da contaminação Nossas pesquisas Característica da grande indústria Listeria monocytogenes Persistência da contaminação Nossas pesquisas Int J Food Microbiol Jan 31;145(1):1-8 4

5 L. monocytogenes em superfícies 1) Células de L. monocytogenes facilmente removidas de superfícies Caso recentemente depositadas Caso sejam submetidas a sanitizante adequado (C-T-T-F) Boa higiene operacional L. monocytogenes em superfícies 2) Limitar a multiplicação (frio ou secagem) É impossível evitar a contaminação 3) Uso mínimo de água em áreas onde o produto é exposto A água só deve ser aplicada durante a L&S seguido de secagem da superfície (se possível) antes do próximo turno de trabalho. L. monocytogenes em superfícies 4) Piso (novos ou velhos) devem ser higienizados sempre antes dos equipamentos APENAS UMA PALAVRA-CHAVE PREVENÇÃO DA CONTAMINAÇÃO ÁGUA 5

6 L. monocytogenes em superfícies 1) Remoção rápida das células recentemente depositadas 2) Limitar a multiplicação 3) Uso mínimo de água em áreas onde o produto é exposto 4) Iniciar a higienização pelo piso Biofilme CARPENTIER & CERF (IJFM, 2011) Fonte: Rural pecuaria Fonte: Vix Fonte: Scientific American Biofilmes - prevenção Limitar os nutrientes para o desenvolvimento Desinfecção química periódica Limpeza física periódica Isolamento dos micro-organismos e detecção de genes de adesão Estudo de potencial de formação de biofilmes 6

7 Biofilmes - remoção Altas contagens de micro-organismos (aeróbios mesófilos totais) logo após uma desinfecção pode estar relacionada Remoção incompleta de um biofilme que recolonizará a superfície Sanitização mal feita Causas para o reaparecimento de biofilmes após uma desinfecção O restante biofilme contém muitos micro-organismos viáveis adaptados ao ambiente Reaparecimento do biofilme pode ser mais rápido do que o acúmulo numa superfície limpa. O biofilme residual torna a superfície mais rugosa do que numa superfície limpa Fornece uma superfície mais propícia à adesão de microorganismos e outros compostos. Causas para o reaparecimento de biofilmes após uma desinfecção A L&D remove os polímeros extracelulares e não as células do biofilme, deixando-as assim mais expostas aos nutrientes que as rodeiam Os micro-organismos sobreviventes produzem mais polímeros extracelulares como resposta à irritação causada pelos químicos de forma rápida Causas para o reaparecimento de biofilmes após uma desinfecção Seleção para os micro-organismos menos susceptíveis à ação química do desinfetante. Estes são, geralmente, os que produzem enormes quantidades de polímeros extracelulares 7

8 Característica da grande indústria Listeria monocytogenes Persistência da contaminação Nossas pesquisas Característica da grande indústria Listeria monocytogenes Persistência da contaminação Nossas pesquisas Material e métodos ESTEIRA LISA Com aspersão de água Sem aspersão de água 8

9 Conclusões Não houve diferenças significativas nas contagens microbianas obtidas em esteiras com higiene operacional e sem o uso da água. A higienização com água a 45 C não reduziu as contagens dos indicadores utilizados sugerindo a possibilidade da eliminação deste procedimento. 9

10 Material e métodos Esteira Modular Lisa Com aspersão Sem aspersão Com aspersão Sem aspersão 10

11 5 cm Contagem de micro-organismos indicadores 4cm 100 cm² (duplicata) Média e desvio padrão (log UFC/cm 2 ) do incremento da contaminação por micro -organismos indicadores em esteiras condutoras de cortes de frango do tipo MODULAR com e sem aspersão de água. Micro-organismo Higienização Incremento entre os intervalos de coleta (log de UFC/cm 2 ) T 0 -T 1 T 1 -T 2 T 1 -T 3 T 2 -T 3 MES Com aspersão (+) 1 1,87±2,28 (+) 2,05±2,77 (+) 2,49±2,97 (+) 2,29±2,96 Sem aspersão (+) 2,22±2,86 (-) 1,41±3,07 (+) 2,29±3,19 (+) 2,34±3,03 Valor de p 2 0,07 0,103 0,146 0,682 EB Com aspersão (+) 1,43±1,74 (+) 1,06±2,15 (+) 1,32±2,06 (+) 0,98±2,17 Sem aspersão (+) 1,22±2,18 (-) 0,68±2,12 (+) 1,40±2,16 (+) 1,47±2,12 Valor de p 0,299 0,797 0,369 0,381 CT Com aspersão (+) -0,15±0,21 (-) -0,78±0,27 (+) -0,96±0,27 (-) -0,96±0,35 Sem aspersão (+) 0,13±0,31 (-) -0,08±0,33 (-) -0,77±0,38 (+) -0,18±0,24 Valor de p 0,116 0,086 0,766 0,017 EC Com aspersão (+) -0,19±0,08 (-) -0,097±0,14 (-) -0,18±-0,01 (-) -0,85±0,06 Sem aspersão (+) -0,09±-0,05 (-) -0,45±-0,003 (-) -0,03±-0,01 (+) -0,57±-0,01 Valor de p 0,092 0,216 0,05 0,024 2 Valor de p menor que 0,05 indica diferença estatística significativa na comparação de esteiras (com e sem aspersão) dentro mesmo intervalo. Média e desvio padrão (log UFC/cm 2 ) do incremento da contaminação por micro -organismos indicadores em esteiras condutoras de cortes de frango do tipo MODULAR com e sem aspersão de água. Micro-organismo Higienização Incremento entre os intervalos de coleta (log de UFC/cm 2 ) T 0 -T 1 T 1 -T 2 T 1 -T 3 T 2 -T 3 MES Com aspersão (+) 1 1,87±2,28 (+) 2,05±2,77 (+) 2,49±2,97 (+) 2,29±2,96 Sem aspersão (+) 2,22±2,86 (-) 1,41±3,07 (+) 2,29±3,19 (+) 2,34±3,03 Valor de p 2 0,07 0,103 0,146 0,682 EB Com aspersão (+) 1,43±1,74 (+) 1,06±2,15 (+) 1,32±2,06 (+) 0,98±2,17 Sem aspersão (+) 1,22±2,18 (-) 0,68±2,12 (+) 1,40±2,16 (+) 1,47±2,12 Valor de p 0,299 0,797 0,369 0,381 CT Com aspersão (+) -0,15±0,21 (-) -0,78±0,27 (+) -0,96±0,27 (-) -0,96±0,35 Sem aspersão (+) 0,13±0,31 (-) -0,08±0,33 (-) -0,77±0,38 (+) -0,18±0,24 Valor de p 0,116 0,086 0,766 0,017 EC Com aspersão (+) -0,19±0,08 (-) -0,097±0,14 (-) -0,18±-0,01 (-) -0,85±0,06 Sem aspersão (+) -0,09±-0,05 (-) -0,45±-0,003 (-) -0,03±-0,01 (+) -0,57±-0,01 Valor de p 0,092 0,216 0,05 0,024 2 Valor de p menor que 0,05 indica diferença estatística significativa na comparação de esteiras (com e sem aspersão) dentro mesmo intervalo. Média e desvio padrão (log UFC/cm 2 ) do incremento da contaminação por micro -organismos indicadores em esteiras condutoras de cortes de frango do tipo LISA com e sem aspersão de água. Micro-organismo Higienização Incremento entre os intervalos de coleta (log de UFC/cm 2 ) T 0 -T 1 T 1 -T 2 T 1 -T 3 T 2 -T 3 MES Com aspersão (+) 1 1,76±2,07 (+) 1,78±2,70 (+) 1,14±2,32 (-) 1,66±2,66 Sem aspersão (+) 1,96±2,15 (+) 1,94±2,90 (+) 1,79±2,62 (-) 1,42±2,74 Valor de p 2 0,279 0,188 0,889 0,148 EB Com aspersão (+) 0,89±1,20 (+) 0,54±1,54 (-) 0,47±1,32 (-) 0,81±1,45 Sem aspersão (+) 1,15±1,21 (-) 0,13±1,43 (+) -0,11±1,36 (+) 0,32±1,44 Valor de p 0,11 0,005 0,973 0,004 CT Com aspersão (+) 0,15±0,50 (-) -0,39±0,51 (-) -0,10±0,45 (-) -0,42±0,37 Sem aspersão (+) 0,40±0,70 (-) -0,49±0,72 (-) 0,08±0,71 (+) -0,97±0,31 Valor de p 0,462 0,220 0,571 0,206 EC Com aspersão (+) -0,04±0,16 (-) -0,42±0,15 (-) -0,04±0,20 (-) -0,93±0,03 Sem aspersão (+) 0,12±0,21 (-) -0,47±0,35 (-) 0,13±0,26 (-) -1,54±0,25 Valor de p 0,133 0,358 0,023 0,109 2 Valor de p menor que 0,05 indica diferença estatística significativa na comparação de esteiras (com e sem aspersão) dentro mesmo intervalo. 11

12 Média e desvio padrão (log UFC/cm 2 ) do incremento da contaminação por micro -organismos indicadores em esteiras condutoras de cortes de frango do tipo LISA com e sem aspersão de água. Incremento entre os intervalos de coleta (log de UFC/cm 2 ) Micro-organismo Higienização T 0 -T 1 T 1 -T 2 T 1 -T 3 T 2 -T 3 MES Com aspersão (+) 1 1,76±2,07 (+) 1,78±2,70 (+) 1,14±2,32 (-) 1,66±2,66 Sem aspersão (+) 1,96±2,15 (+) 1,94±2,90 (+) 1,79±2,62 (-) 1,42±2,74 Valor de p 2 0,279 0,188 0,889 0,148 EB Com aspersão (+) 0,89±1,20 (+) 0,54±1,54 (-) 0,47±1,32 (-) 0,81±1,45 Sem aspersão (+) 1,15±1,21 (-) 0,13±1,43 (+) -0,11±1,36 (+) 0,32±1,44 Valor de p 0,11 0,005 0,973 0,004 CT Com aspersão (+) 0,15±0,50 (-) -0,39±0,51 (-) -0,10±0,45 (-) -0,42±0,37 Sem aspersão (+) 0,40±0,70 (-) -0,49±0,72 (-) 0,08±0,71 (+) -0,97±0,31 Valor de p 0,462 0,220 0,571 0,206 EC Com aspersão (+) -0,04±0,16 (-) -0,42±0,15 (-) -0,04±0,20 (-) -0,93±0,03 Sem aspersão (+) 0,12±0,21 (-) -0,47±0,35 (-) 0,13±0,26 (-) -1,54±0,25 Valor de p 0,133 0,358 0,023 0,109 2 Valor de p menor que 0,05 indica diferença estatística significativa na comparação de esteiras (com e sem aspersão) dentro mesmo intervalo. CONCLUSÃO O uso de aspersão de água nas esteiras não exerceu influência na contaminação por micro-organismos indicadores sugerindo que a água possa ser retirada. A decisão de se retirar a água do processo de higienização contínua deve ser precedida de um estudo criterioso para garantir que a sua ausência não venha influenciar a inocuidade dos cortes. Estudo com L. monocytogenes Avaliar o efeito da higiene operacional por aspersão de água em superfícies de esteiras Pesquisa de L. monocytogenes 10 cm Momentos de coleta: T0 - após a higiene préoperacional T1-1 h antes do almoço T2-1 h antes do jantar T3-1 h antes do fim do segundo turno 10 repetições em cada linha 640 amostras SOARES, et al. 10 cm 400 cm² 12

13 C o leta i i i i Lisa co m aspersão Lisa sem aspersão M o dular co m aspersão M o dular sem aspersão 13/09/2018 Frequência de isolamento de L. monocytogenes em amostras de esteiras lisas e modulares com e sem aspersão de água. Amostras Número de positivas % N Valor de P Por linha A 25 15,6 160 <0,0001 B 52 32,5 160 C 63 39,4 160 D 2 1,3 160 Por esteira Lisa com aspersão 36 22, ,0005 Lisa sem aspersão 50 31,3 160 Modular com aspersão 19 11,9 160 Modular sem aspersão 37 23,1 160 Por momento T , ,0005 T ,6 160 T ,8 160 T ,8 160 Neste trabalho: Fatores associados ao isolamento de L. monocytogenes Desgaste dos equipamentos Volume de abate Tipo de produto Design de equipamentos Higienização pré-operacional Mapa dos perfis das linhas de processamento A, B, C e D de culturas submetidas à macrorestrição com as enzimas ApaI e AscI, de acordo com esteira, momento e data de coleta. L n h a A L n h a B L n h a C L n h a D T 0 T 1 T 2 T 3 T 0 T 1 T 2 T 3 T 0 T 1 T 2 T 3 T 0 T 1 T 2 T 3 DATA 1 A B 26/7/ B A B 08/06/ B B B 13/8/ A A B 20/8/ B B B B 09/03/ B 09/10/ /9/ A 24/9/ B B 27/9/ A A 10/01/ A1C B1A A1C A1C C1D 11/05/ A1C B1A B1A B1A 11/06/ A1C A1C B1A 11/07/ B1A B1A B1A B1A 11/08/ B1A B1A B1A B1A A1C A1C 11/09/ B1A B1A B1A D1A 14/1/ B1A B1A E1A B1A B1A D1A D1A 15/1/ B1A B1A B1A D1A B1A 16/1/ B1A A1C B1A B1A B1A B1A A1C A1C 17/1/ B1A A1C I1E 18/1/ F1E F1E F1E F1E F1E F1E F1E F1E 18/2/ F1E F1E F1E F1E F1E F1E 19/2/ F1E F1E F1E F1E F1E F1E 20/2/ F1E F1E F1E F1E F1E F1E 21/2/ F1E F1E F1E F1E F1E 22/2/ F1E F1E F1E F1E F1E F1E F1E 03/04/ F1E F1E F1E F1E F1E F1E 03/05/ F1E F1E F1E F1E F1E F1E F1E 03/06/ F1E F1E F1E F1E 03/07/ F1E G1E F1E F1E G1E 03/08/ H1G 04/08/ /09/ /10/ /11/ /12/ /4/ H1G 23/4/ /4/ /4/ /4/2013 Neste trabalho observou-se Isolamento em todas linhas de processamento Recuperação de cepas com mesmo perfil genético Falhas nos processos de higienização Persistência do patógeno no ambiente de processamento Formação de biofilmes 13

14 Neste trabalho - Conclusão A aspersão de água NÃO garantiu a eliminação de L. monocytogenes Foi evidenciada a disseminação e persistência de L. monocytogenes apontando falhas nos processos de higienização utilizados nas linhas de processamento Ocorreram falhas graves na higiene pré-operacional (10,6%) Formação de biofilme por L. monocytogenes isoladas de esteiras modulares e lisas em poliestireno, polipropileno e poliuretano. Origem Formação de biofilme Poliestireno Polipropileno Poliuretano Modular (n=54) 54 (100%) 45 (83,3%) 22 (40,7%) Lisa (n=84) 82 (97,6%) 71 (84,5%) 46 (54,8%) Valor de p 0,253 0,852 0,108 Total (n=138) 136 (98,5%) 116 (84,0%) 68 (49,3%) 1 Valor de p para comparação da formação de biofilme de acordo com a origem da cultura no mesmo material. L. monocytogenes em superfícies L. monocytogenes em superfícies 1) Remoção rápida das células recentemente depositadas 2) Limitar a multiplicação 3) Uso mínimo de água em áreas onde o produto é exposto 4) Iniciar a higienização pelo piso 1) Remoção rápida das células recentemente depositadas 2) Limitar a multiplicação 3) Uso mínimo de água em áreas onde o produto é exposto 4) Iniciar a higienização pelo piso CARPENTIER & CERF (IJFM, 2011) CARPENTIER & CERF (IJFM, 2011) 14

15 Coleta de amostras Persistência de clones de Listeria monocytogenes em ambiente de abate e processamento de suínos LOCAL ETAPA AMOSTRA Abatedouro Pocilga de Espera Piso MALLU JAGNOW SERENO DISSERTAÇÃO DE MESTRADO - PPGCA Coleta de amostras LOCAL ETAPA AMOSTRA Abatedouro Abate Carcaça após sangria Carcaça após chamuscamento Carcaça após evisceração Carcaça após lavagem 15

16 Coleta de amostras LOCAL ETAPA AMOSTRA Abatedouro Abate Carcaça Mesa de evisceração (antes e durante as atividades) Faca (antes e durante as atividades) Luvas de aço de manipuladores (antes e durante as atividades) Parede (antes e durante as atividades) Ralo(antes e durante as atividades) 16

17 Coleta de amostras LOCAL ETAPA AMOSTRA Abatedouro Câmara Fria Parede (antes e durante as atividades) Piso(antes e durante as atividades) Coleta de amostras LOCAL ETAPA AMOSTRA Abatedouro Processamento Mesa/Esteira de manipulação (*) Esteira Embalagem (*) Faca (*) Luvas de aço de manipuladores (*) Mezanino (*) Tábua de corte (*) Caixas plásticas (*) Parede (*) Ralo (*) Corte final embalado 17

18 /09/2018 Amostras com resultado positivo para Listeria sp., Listeria monocytogenes e L. innocua obtidas entre set/2016 e fev/2017 de um abatedouro de suínos Coletas com detecção de L. monocytogenes em esteiras de embalagem Amostra Momento da coleta N Listeriaspp. L. monocytogenes L. innocua Piso (20%) 01 (10%) 01 (10%) Ralo Antes (20%) 02 (20%) - Faca Durante (5%) 01 (5%) - Tábuas de corte Antes (10%) 01 (10%) - Esteira embalagem Antes (50%) 05 (50%) - Esteira embalagem Durante (60%) 06 (60%) - Ralo Antes (10%) - 01 (10%) TOTAL (2,1%) 16 (1,8%) 02 (0,2%) Coleta Esteira Antes Esteira Durante 01 X X 03 - X 04 X X 05 X X 06 X X 07 X X ANTES DURANTE Resultados - PFGE EEDP Esteira embalagem durante processamento PE Pocilga espera FDP- faca durante processamento RAAP Ralo amb abate antes processamento EEAP - Esteira embalagem antes processamento TCAP Tábua corte antes processamento RSCAP Ralo sala de cortes antes processamento

19 Conclusões FINALIZAÇÃO Persistência de clones de L. monocytogenes no ambiente Destaque para esteiras Falha na higiene pré-operacional Característica da grande indústria Listeria monocytogenes Persistência da contaminação Nossas pesquisas Monitoramento FOCO NA SUPERFÍCIE COMO? Isolamento dos micro-organismos Estudo de potencial de formação de biofilmes Dados históricos de contaminação INDICADOR x PATÓGENO Monitoramento de L. monocytogenes em plantas de processamento de produtos de origem animal LUCIANO DOS SANTOS BERSOT LACOMA/DCV/UFPR L U CIANO B E RS F P R. B R // L U CIANO B E RS CO M FA CE B O O K W W W. FA CE B O O K /L A CO MAU F P R 19

20 AGRADECIMENTOS 20