DESCRIÇÃO DO EFEITO VASODILATADOR DO EXTRATO ETANÓLICO DE Combretum leprosum E CARACTERIZAÇÃO FARMACOLÓGICA DO MECANISMO DE AÇÃO

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1 FRANCISCO DAS CHAGAS ALVES FILHO DESCRIÇÃO DO EFEITO VASODILATADOR DO EXTRATO ETANÓLICO DE Combretum leprosum E CARACTERIZAÇÃO FARMACOLÓGICA DO MECANISMO DE AÇÃO Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Farmacologia do Curso de Pós- Graduação da Faculdade de Medicina de Ribeirão da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Mestre. Orientadora: Prof a. Dr a. Maria Cristina Oliveira Salgado RIBEIRÃO PRETO 2008

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3 ÍNDICE Abreviaturas Lista de Figuras Resumo Abstract 1. INTRODUÇÃO Plantas Medicinais Combretum leprosum Mart Drogas que relaxam o músculo liso dos vasos sangüíneos Relaxamentos dependentes de endotélio A identificação química do EDRF Relaxamentos Resistentes a Inibidores de NOS e Ciclooxigenase Cálcio, Síntese e Liberação de fatores relaxantes do endotélio Produtos de origem Vegetal e Relaxamentos mediados por endotélio Objetivo MÉTODOS Preparação do Extrato Etanólico de Combretum leprosum Mart Isolamento das Artérias e Sistema de Registro Protocolos experimentais Análise dos resultados Drogas Resultados induz relaxamentos dependentes de endotélio Atropina não reverte os relaxamentos induzidos por...21

4 3.3 Demonstração de que os relaxamentos induzidos por são...26 devidos a liberação de fator(es) relaxante(s) do endotélio que se difunde(m) para as células musculares lisas. 3.4 Os relaxamentos induzidos por são devidos à liberação de...27 óxido nítrico do endotélio que se difunde para as células musculares lisas 3.5 provoca relaxamentos resistentes ao diclofenaco e a L-NNA Relaxamentos provocados por são dependentes de Cálcio...31 extracelular 3.7 Vermelho de rutênio (VR) reverte os relaxamentos induzidos por O 4α-PDD provoca relaxamentos com o perfil farmacológico...39 semelhante aos relaxamentos induzidos por 4. Discussão Sumário e Conclusão Referências Bibliográficas...54

5 Abreviaturas 2-APB = 2- aminoetoxidifenilborato 4α-PDD = 11,12- didecanoato de 4α- Forbol B12 = vitamina B12 ou hidroxicobalamina CPA = ácido ciclopiazônico EDRF = Fator Relaxante Derivado de Endotélio EDHF = Fator Hiperpolarizante Derivado de Endotélio = Extrato Etanólico das cascas de Combretum leprosum Mart. ETYA = ácido 5,8,11,14- eicosatetrainóico GC = Guanilato Ciclase GMPc = guanosina- 3, 5 - monofosfato cíclico L-NNA = N G -nitro-l-arginina NO = Óxido nítrico NOS = Sintase de óxido nítrico ODQ = [1,2,3] oxadiazolo [4,3-a] quinoxalinone-1 SOD = Superóxido dismutase TRPV4 = Potencial Transitório de Receptor Vanilóide do subtipo 4 VR = vermelho de rutênio

6 Lista de Figuras Figura 1: Relaxamentos provocados pelo em anéis de artérias de coelho Figura 2: Relaxamentos provocados pelo em anéis de aorta torácica de rata (o), rata grávida e rata hipertensa. Figura 3: Relaxamentos provocados pelo em anéis de aorta torácica de cobaia e de camundongo. Figura 4: Atropina não afeta os relaxamentos provocados pelo em anéis de aorta torácica de rata e de coelho. Figura 5: Em tiras de aorta torácica de coelho, os relaxamentos induzidos pelo são devidos à liberação de fator(es) relaxante(s) do endotélio. Figura 6: Diclofenaco não afeta os relaxamentos provocados pelo em anéis de aorta torácica de rata e de coelho. Figura 7: L-NNA reverte os relaxamentos provocados pelo em anéis de aorta torácica de rata e de coelho. Figura 8: B12 e ODQ revertem os relaxamentos provocados pelo em anéis de aorta torácica de rata e de coelho. Figura 9: induz relaxamentos resistentes à combinação de diclofenaco mais L-NNA em anéis de aorta abdominal, de artéria mesentérica superior e de artéria carótida comum de coelho. Figura 10: Os relaxamentos causados pelo em anéis de aorta torácica de rata e de coelho são reduzidos em soluções de Krebs sem cálcio. Figura 11: VR reverte os relaxamentos induzidos pelo em anéis de aorta torácica de rata, de coelho e camundongo. Figura 12: VR não reverte os relaxamentos induzidos por Ach e CPA em anéis de aorta torácica de coelho e nem aqueles induzidos por Ach, CPA e A23187 em anéis de aorta torácica de rata. Figura 13: VR reverte os relaxamentos provocados pelo em preparações montadas em sanduíche de aorta torácica de coelho e em anéis de artéria mesentérica superior de coelho na presença de diclofenaco mais L-NNA. Figura 14: Efeitos resistentes ao VR da capsaicina e 2-APB em anéis de aorta torácica de rata.

7 Figura 15: 4α-PDD induz relaxamentos em anéis de aorta torácica de rata que são revertidos por L-NNA, B12 e ODQ. Figura 16: VR reverte os relaxamentos causados pelo 4α-PDD em anéis de aorta torácica de rata.

8 RESUMO Recentemente, numa triagem farmacológica feita em preparações de músculo liso, observamos que o extrato etanólico das cascas de Combretum leprosum Mart. () foi capaz de antagonizar a contração provocada por noradrenalina em tiras e anéis de aorta torácica de coelho. No presente trabalho caracterizamos esse efeito relaxante em anéis de aorta torácica descendente de coelho, rato, camundongo e cobaia, bem como aorta abdominal, artéria mesentérica e artéria carótida de coelho e investigamos seu possível mecanismo de ação em aorta torácica descendente de coelho e de rata. Em todas as preparações testadas, pré-contraídas com fenilefrina (0,1-1µM), o (0,5-5 µm) induziu relaxamentos que foram dependentes de endotélio, de concentração e inalterados pela atropina (0,1 µm). Em preparações do tipo sanduíche com tiras de aorta torácica de coelho, o também foi capaz de provocar relaxamentos dependentes de endotélio; esses resultados sugerem que o, de mesma forma que acetilcolina, provoca liberação de substância(s) do endotélio que relaxa(m) as células musculares lisas dessas artérias. No intuito de inferir farmacologicamente qual(is) seria(m) a(s) substância(s) liberadas, usamos anéis de aorta torácica de coelho e de rata. Nesses anéis pré-incubados com diclofenaco (10 µm), os relaxamentos provocados foram levemente diminuídos em aorta torácica de coelho, mas inalterados em aorta torácica de rata. Os relaxamentos causados pelo foram completamente revertidos por L-NNA (100 µm), vitamina B12 ( µm) e ODQ (10 µm), inibidor de sintase de óxido nítrico, inativador químico de óxido nítrico (NO) e inibidor de guanilato ciclase, respectivamente. Isso nos sugeriu inicialmente, que o estaria ativando a via L-arginina/NO/GMPc. Entretanto, em anéis de aorta abdominal, artéria mesentérica superior e artéria carótida de coelho; o induziu relaxamentos mesmo na presença de L-NNA (100 µm) e diclofenaco (10 µm), o que nos levou a reinterpretar os resultados iniciais com a seguinte hipótese: O está relaxando não simplesmente por ativar a via L- arginina/no/gmpc, mas sim por estimular o endotélio a liberar fatores relaxantes. Um fator essencial para que o endotélio seja ativado a liberar substâncias relaxantes é o aumento de cálcio livre no citosol; assim nosso próximo passo foi verificar se os relaxamentos provocados pelo o são afetados em solução

9 de Krebs isenta de cálcio. Nessas soluções, os relaxamentos provocados pelo foram fortemente deprimidos, sugerindo assim que o influxo de cálcio para o endotélio seria uma etapa crucial nos relaxamentos provocados pelo. Se o cálcio é um fator primordial para os relaxamentos provocados pelo o, então por qual (is) canal(is) esse íon estaria adentrando as células endoteliais? Testamos, então, alguns bloqueadores não seletivos de canais de cátion endoteliais, como gadolínio, SK&F 96536, níquel e vermelho de rutênio (VR). Em anéis de aorta torácica de coelho, rata e camundongo, artéria mesentérica superior e carótida de coelho e preparações do tipo sanduíche de tiras de aorta torácica de coelho os relaxamentos causados por foram revertidos apenas por VR (10-20 µm). Desde que o VR pode bloquear uma variedade de canais catiônicos, avaliamos farmacologicamente qual (is) deste(s) canal (is) seria(m) ativado(s) pelo. Examinamos três agonistas de canais TRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid): capsaicina (10-30 µm, agonista de TRPV1); 2-APB (10-30 µm, agonista de TRPV1, TRPV2 e TRPV3), e 4α-PDD (3-10 µm, agonista de TRPV4). Dentre essas substâncias, apenas o 4α-PDD provocou relaxamentos dependentes do endotélio, que foram revertidos por L-NNA (100 µm), B12 (30 µm), ODQ (10 µm) e VR (1-20 µm), em anéis de aorta de rata. Dada a semelhança farmacológica entre os relaxamentos provocados pelo e o 4α-PDD, concluímos que contém substâncias(s) que ativaria(m) os canais TRPV4 endoteliais, que levariam a um influxo de cálcio e conseqüente estimulação do endotélio a liberar substâncias que relaxariam as células musculares lisas.

10 ABSTRACT In a preliminary study of the biological effects of the ethanolic extract of Combretum leprosum () was observed a reduction of the magnitude of the noradrenaline-induced contractions in isolated strips of rabbit thoracic aorta. In the present study we investigated if the is able to relax different types of precontracted arteries and characterized the possible mechanisms involved in this effect. Rings (3-4 mm, with or without endothelium) of rabbit, rat, mice and guinea pig thoracic aorta, as well as rabbit abdominal aorta, mesenteric and carotid artery were mounted in organ bath with Krebs solution, continuously gassed with carbogenic mixture (95% O 2 /5% CO 2 ), at 37ºC, for recordings of isometric contractions. Some rings of rabbit thoracic aorta without endothelium were opened and mounted with longitudinal strips with endothelium of same dimensions (sandwich experiments). In phenylephrine ( µm) pre-contracted rings, the addiction of (0.5-5 µg/ml) elicited endothelium-dependent relaxation in all arteries tested. In rings of rabbit and rat thoracic aorta, neither atropine (0.1 µm) nor diclofenac (10 µm) affected the endothelium-dependent relaxation stimulated by. In sandwich experiments, also provoked endothelium-dependent relaxations demonstrating the release of endothelium-derived relaxing substance(s). In rings of rabbit and rat thoracic aorta; the NO-synthase inhibitors L-NNA or L- NAME ( µm), the guanylate cyclase inhibitor ODQ (10 µm), and the NO inactivator vitamin B12 (10 µm) reverted the endothelium-dependent relaxation stimulated by. In rabbit abdominal aorta, mesenteric and carotid artery rings, NO/prostanoid-independent relaxations to were observed. In rings of rabbit and rat thoracic aorta, -induced relaxations were reduced in calcium-deficient buffer and were reverted by ruthenium red (RR, µm), a calcium-permeable nonspecific cation channels blocker. In rings of rabbit and rat thoracic aorta; 4α - PDD (1-30 µm), a TRPV4 agonist, induced endothelium-dependent relaxations which were reverted by L-NNA or L-NAME ( µm), ODQ (10 µm), vitamin B12a (10 µm) and RR (1-10 µm). These observations suggest that the contains a compound (s) able to activate TRPV4 channels of rabbit and rat arterial endothelial cells leading to an increase in calcium influx which results in the production and release of substances that cause smooth muscle relaxation.

11 1. INTRODUÇÃO 1

12 1.1 PLANTAS MEDICINAIS A utilização de produtos vegetais para fins terapêuticos data desde épocas remotas. Há registros de uso de matérias retiradas de plantas para combate de diversos tipos de doenças por várias civilizações antigas, tais como a antiga Grécia, Roma, China, e antigo Egito. Durante o período correspondente aos séculos XI a XVII, a orientação para o uso terapêutico das plantas estava baseada na Doutrina das Assinaturas (Norton, 2005) segundo a qual a cor, a forma, o habitat ou outras características físicas das plantas indicavam seu possível valor terapêutico. Assim, por exemplo, a forma de serpente das raízes das plantas do gênero Rauwolfia indicaria que essa planta serviria para o tratamento de mordidas de cobra (Farnsworth,1966). Durante a idade média atribuía-se a propriedade curativa dessas plantas a existência de substâncias presentes nelas, de acordo com o princípio dos cinco elementos essenciais para a sobrevivência (água, terra, ar, fogo e a Quinta Essência) (Norton, 2005). Com o advento da química orgânica tornou-se possível purificar e isolar, a partir de extratos brutos, a(s) substância(s) responsável(eis) pelo efeito biológico predominante as quais foram denominadas de princípios ativos. Primariamente, estudiosos de produtos naturais sugeriram que essas substâncias serviriam para proteção das plantas frente às diversas situações, como predadores naturais; elas reagiriam quimicamente com as mais variadas formas de organismo animal e, quando produzissem distúrbios de alguma função animal, seriam mais precisamente denominadas venenos (Chesnut, 1902). A disponibilidade de princípios ativos quimicamente puros, junto com os avanços na fisiologia experimental no século XIX, permitiu a descrição precisa dos efeitos e a investigação de seu mecanismo de ação, que foram essenciais para o desenvolvimento de um ramo do conhecimento que posteriormente foi denominado de Farmacodinâmica, uma das grandes subdivisões da Farmacologia. Por exemplo, a atropina, princípio ativo isolado da planta Atropa belladona, contribuiu para a fundamentação da neurotransmissão colinérgica e para a teoria dos receptores farmacológicos; a reserpina, princípio ativo retirado da planta Rauwolfia serpentina, foi alicerce para a fundamentação das neurotransmissão adrenérgica, serotoninérgica e dopaminérgica. Outros princípios ativos que seguem a linha da atropina e reserpina são: curare (Chondodendron tomentosum), nicotina (espécies 2

13 da Nicotiniana), ergotamina (espécies do Ergot), cocaína (espécies da Erythroxylium), morfina (Papaver somniferum), glicosídios cardíacos (espécies da Digitalis), efedrina (Ephedra sinica); além de uma diversidade de outros princípios ativos isolados de plantas (Farnsworth, 1966) Combretum Leprosum MART. As plantas do gênero Combretum, pertencentes à família das Combretáceas, estão amplamente distribuídas em todo mundo. No Brasil a espécie Combretum leprosum Mart. foi catalogada sistematicamente em 1867, pelo botânico alemão Carl Friedrich Philipp von Martius, como arbusto encontrado em alguns estados nordestinos, sobretudo no Piauí (Flora Brasiliensis). Hoje a planta é vulgarmente conhecida na região como mofumbo, pente de macaco ou mufumbo, e faz parte da flora nativa dos estados da Bahia, Ceará e Piauí (Agra, 1996). Com as folhas e entrecascas deste arbusto são preparados infusões e xaropes que são utilizados pela população local com o intuito de produzir sedação, expectoração e alívio de distúrbios gastrointestinais, como úlceras (Matos, 1997). Recentemente, observamos que o extrato etanólico (70%) da Combretum leprosum Mart. () provocava relaxamento de tiras isoladas da musculatura longitudinal de fundus de estômago de rato sem mucosa e pré-contraídas com cloreto de potássio ou carbacol (Amaral e cols., 2003). Também observamos que o era capaz de reduzir a magnitude das contrações induzidas por cloreto de cálcio, em meio despolarizado com 125 mm de cloreto de potássio, ou por carbacol em segmentos de útero isolado de rata (Alves Filho e cols., 2005), assim como de diminuir as contrações isotônicas de tiras helicoidais de aorta torácica de coelho induzidas por noradrenalina e de relaxar anéis de aorta torácica de coelho précontraídos com fenilefrina (Alves Filho e cols., 2006). Entre estes efeitos, o mais reproduzível e que foi observado em concentrações menores, foi o relaxamento de anéis de aorta isolada de coelho. Assim, escolhemos preparações vasculares isoladas para caracterizar esse efeito relaxante do assim como para elucidar os possíveis mecanismos de ação envolvidos. 3

14 1.3. DROGAS QUE RELAXAM O MÚSCULO LISO DOS VASOS SANGÜÍNEOS As drogas vasodilatadoras provocam relaxamento do músculo liso por diversos mecanismos. Para o entendimento de seus mecanismos é necessário saber quais os elementos responsivos às drogas. Nos vasos há classicamente três tipos celulares que podem ser ativados primariamente por drogas vasodilatadoras, a saber: células endoteliais, células musculares lisas e nervos perivasculares. Assim, as drogas podem esta exercendo uma ação vasodilatadora por interferir primariamente com as células musculares lisas, entre elas podemos citar: (a) substâncias vasodilatadoras endógenas que exerce seus efeitos por ativação de receptores de membrana plasmática específicos (adrenalina); (b) bloqueadores de canais de cálcio operados por voltagem como verapamil, nifedipina e flunarizina (Fleckenstein, 1977 e Godfraind, 2005); (c) doadores de óxido nítrico (NO) como nitroprussiato de sódio (NPS), trinitrato de glicerila e outros nitratos orgânicos (Ignarro, 1999); (d) ativadores de canais de potássio como cromacalina, minoxidil e diazóxido; e (d) inibidores de fosfodiesterases como papaverina, milrinona, zaprinast ou M&B (Polson e Strada, 1996). No final da década de sessenta, Théophile Godfraind observou que a cinazirina (uma difenilpiperazina) era capaz de inibir de forma concentração dependente as contrações provocadas por cálcio em preparações de artérias mesentéricas de coelho despolarizadas por potássio (Godfraind, 2005). Em preparações de músculo liso vascular de artérias coronárias, pulmonares e cerebrais foi facilmente demonstrada uma inibição do acoplamento excitação-contração (relaxamento), principalmente em tiras espirais despolarizadas com potássio, por verapamil e D600 (nifedipina) (Fleckenstein, 1977). Essas drogas, por esses efeitos, foram inicialmente descritas como antagonistas de cálcio (Fleckenstein, 1977 e Godfraind, 2005). Uma vez que essas drogas também inibem o influxo de cálcio induzido por noradrenalina ou potássio, em estudos radioquímicos, foram denominadas mais recentemente de bloqueadores de canais de cálcio operados por voltagem (Godfraind, 2005). A ativação de nervos perivasculares é classicamente conhecida por induzir vasoconstrição mediada por substâncias liberadas por nervos adrenérgicos. Em 4

15 determinadas espécies de animais e condições experimentais, ocorre liberação de substâncias vasodilatadoras (acetilcolina, NO, e/ou peptídeo intestinal vasoativo) quando os nervos não adrenérgicos são estimulados. Na vasculatura também há nervos aferentes que enviam sinais para a medula espinhal, estes nervos são conhecidos por serem sensíveis à capsaicina e por liberarem uma variedade de peptídeos vasoativos (taquicininas, substância P, neuroquininas e peptídeo relacionado ao gene de calcitonina) (Hill e cols., 2001). Drogas isoladas da maconha (Cannabis sativa), como delta-9-tetrahidrocanabinol e canabinol, foram descritas como capazes de ativar nervos sensoriais perivasculares sensíveis à capsaicina, em preparações de artérias hepáticas e mesentéricas isoladas de rato, e essas respostas não foram mediadas por nenhum dos dois receptores canabinóides clássicos ou pelo receptor vanilóide do subtipo 1 (Zygmunt e cols., 2001). Na década de setenta, observou-se que os relaxamentos devidos à estimulação de nervos não-adrenérgicos não-colinérgicos, em artérias cerebrais isoladas de cão, por nicotina são devidos à ativação de receptores nicotínicos, considerando que o hexametônio abolia esta resposta (Toda, 1975). Estas respostas relaxantes para a nicotina foram abolidas pela remoção de cálcio extracelular e por inibidores de sintase de NO (NOS), sugerindo assim que o influxo de cálcio e a ativação da NOS são essenciais para que a nicotina exerça seus efeitos relaxantes (Toda e cols., 2003) RELAXAMENTOS DEPENDENTES DE ENDOTÉLIO Em 1980 Furchgott e Zawadzki, trabalhando no departamento de Farmacologia da Universidade do Estado de New York, observaram que tanto anéis quanto tiras de aorta torácica de coelho, quando pré-contraídos com noradrenalina, eram relaxados pela adição de acetilcolina e que esses relaxamentos eram abolidos ou mesmo convertidos em resposta contrátil quando essas mesmas preparações eram destituídas de suas células endoteliais. Baseados nessa observação, estes autores propuseram que a acetilcolina estimularia o endotélio a liberar substância(s) que relaxariam as células musculares lisas adjacentes. Evidências experimentais que corroboraram com essa hipótese vieram a partir da montagem de experimentos em Sanduíche, nos quais uma tira transversal (anel aberto) com o endotélio destruído 5

16 era testada montada separadamente ou montada junta com uma tira longitudinal de mesmas dimensões (superfície luminal contra superfície luminal) com ou sem as células endoteliais intactas. Novamente, foram observados relaxamentos induzidos por acetilcolina apenas nas preparações onde se tinha montado uma tira transversal juntamente com uma tira longitudinal com endotélio. Neste mesmo artigo (Furchgott e Zawadzki, 1980), foram apresentadas evidências farmacológicas sugerindo que esta substância relaxante seria derivada do ácido araquidônico ou outro ácido graxo insaturado liberado por fosfolipase A2 (sensível a mepacrina) e que depois seria oxidado por lipoxigenases (sensíveis ao ácido 5,8,11,14 eicosatetraenóico, ETYA). Depois que este fenômeno foi verificado para outros agonistas endógenos (bradicinina, substância P, histamina, trombina, serotonina), bem como para substâncias exógenas (A23187) e em várias preparações vasculares de diferentes animais, Furchgott (1983) cunhou o termo EDRF (Fator Relaxante Derivado do Endotélio). Relaxamentos dependentes de endotélio foram depois caracterizados como sendo mediados por EDRF numa diversidade de mamíferos, tais como: ratos, cães, gatos, cobaias, porcos, camundongos, macacos e humanos. Além do mais, existem diferenças quanto à espécie de animal estudada e ao estímulo farmacológico aplicado. Van de Voorde e Leusen (1983) estudaram o efeito da histamina em cinco espécies diferentes (camundongo, rato, cobaia, coelho e gato) e verificaram relaxamentos dependentes de endotélio somente no rato e coelho, sendo que os relaxamentos na aorta de rato foram inibidos por ETYA, mas não por quinacrina. Cherry e colaboradores (1984) também estudaram as diferenças entre espécies examinando a ação da bradicinina em anéis de artérias isoladas de cão, gato, coelho e humano. Esses pesquisadores encontraram que apenas as artérias do cão (esplênica, gástrica, celíaca, femoral, renal, coronária, pulmonar e mesentérica superior) e humana (artérias mesentéricas) requeriam a presença das células endoteliais para a ação vasodilatadora da bradicinina. Também nesse estudo, verificou-se que os relaxamentos dependentes de endotélio induzidos por bradicinina em artérias mesentéricas superior de cão foram parcialmente revertidos por quinacrina e ETYA (Cherry e cols., 1984). Deste modo, fica claro uma especificidade de animal, tipo de vaso e estímulo estudado para a observação de relaxamentos dependentes de endotélio que seriam mediados por EDRF. 6

17 Antes que fosse identificada a natureza química do EDRF, estudos iniciais focaram no mecanismo de relaxamento provocado por este fator. Assim, Rapoport e Murad (1983), baseados nas informações sobre o mecanismo pelo qual os compostos com o grupo nitro (nitroglicerina e NPS) causam relaxamentos, sugeriram que o mecanismo do relaxamento provocado por EDRF seria semelhante àquele provocado por compostos com o grupo nitro. Como o mecanismo de relaxamento induzido por estes compostos estava relacionado à ativação da guanilato ciclase (GC) e a formação de guanosina-3,5 -monofosfato cíclico (GMPc), estes pesquisadores examinaram em tiras de aorta de rato se os relaxamentos provocados pelo EDRF seriam acompanhados de aumentos nas concentrações de GMPc, medidas por radioimunoensaio. Eles verificaram que os relaxamentos dependentes de endotélio induzidos por acetilcolina, histamina e A23187 foram acompanhados por aumentos nas concentrações de GMPc, assim como foi o relaxamento independente de endotélio induzido por NPS. Além do mais, tanto o relaxamento quanto os aumentos nas quantidades de GMPc induzidos por acetilcolina, mas não aqueles por NPS, foram parcialmente antagonizados por quinacrina e completamente prevenidos por ETYA (Rapoport e Murad, 1983). Também foram realizados estudos em aorta de coelho com resultados semelhantes aos encontrados em aorta de rata (Furchgott e cols., 1989). Nesse caso, anéis de aorta de coelho foram montados para permitir o registro de tensão e, em determinado momento de contração ou relaxamento, foram rapidamente congelados com nitrogênio liquido, para depois serem ensaiados para sua quantidade de GMPc. De maneira semelhante aos resultados em aorta de rato, os relaxamentos dependentes de endotélio induzidos por acetilcolina e A23187 foram precedidos de aumentos nas concentrações de GMPc (Furchgott e cols., 1984) A IDENTIFICAÇÃO QUÍMICA DO EDRF Experimentos realizados em forma de cascata ajudaram na identificação química do EDRF. Griffith e cols (1984) utilizando uma abordagem experimental da perfusão em cascata, onde se monitorava a pressão de perfusão duma preparação de artéria coronária esquerda de coelho sem endotélio (detectora), que era perfundida com líquido proveniente de um segmento de aorta torácica descendente 7

18 de coelho com endotélio (doadora), observaram que: a) acetilcolina diminuiu a pressão de perfusão da detectora apenas quando aplicada na doadora; b) variando o comprimento do trajeto do perfusato entre e doadora e detectora foi possível determinar o tempo de trânsito do EDRF e assim calcular a meia vida em cerca de 6 segundos; c) ditiotreitol, fenidone ou ácido nordihidroguaiarético, drogas com atividade varredora de radicais livres, quando aplicadas no trajeto entre doadora/receptora aboliram o efeito do EDRF liberado. A mesma abordagem foi utilizada por Gryglewski e cols. (1986) utilizando tiras de aorta torácica de coelho montadas em cascata, todas funcionalmente desprovidas de endotélio, como tecido detector e células endoteliais da aorta de porco em cultura, aderidas em microesferas e empacotadas em colunas cromatográficas, como doador. Nesse sistema experimental, os autores observaram relaxamentos das tiras detectoras provocados por bradicinina e A23187, mas não para a acetilcolina, quando adicionados na cultura de células endoteliais doadoras, e que esse efeito era diminuído à medida que o líquido de perfusão era passado para as tiras mais distais às células endoteliais, permitindo assim calcular a meia vida do EDRF ao redor de 4 a 7 segundos (Gryglewski e cols., 1986). Em outra série de experimentos, pesquisadores do mesmo grupo fizeram as seguintes observações: (1) a tira detectora relaxava com a adição de NPS ou trinitrato de glicerila; (2) uma solução NO, assim como o EDRF liberado após estimulação da doadora com bradicinina, relaxava as tiras detectoras com uma velocidade de declínio semelhante, com meia vida de aproximadamente 4 segundos; (3) havia uma correlação da faixa de concentração de NO que provocava relaxamento e a quantidade de NO, medida por quimioluminescência, liberada por bradicinina; (4) hemoglobina, que reage tanto com EDRF como NO, abolia os relaxamentos induzidos por EDRF e NO; (5) superóxido dismutase (SOD), enzima que inativa o íon superóxido (O 2), aumentava a meia vida tanto do NO como os relaxamentos provocados por bradicinina (Palmer e cols., 1987). Também usando o método de perfusão em cascata ou preparações isoladas de anel de aorta de coelho, Furchgott obteve evidência conclusiva de que o EDRF é quimicamente semelhante ao NO. Em seu bioensaio, Furchgott utilizou um segmento de aorta torácica descendente de coelho, com endotélio, como doadora para um anel da mesma artéria sem endotélio (detector). Dessa forma, quando a acetilcolina era adicionada na aorta doadora, ocorria relaxamento na detectora, que 8

19 estava contraída com fenilefrina. As observações experimentais de Furchgott podem ser sumarizadas como: (1) o anel detector relaxava com a adição de uma solução de NO; (2) a solução de NO, assim como o EDRF liberado após estimulação da tira doadora com acetilcolina, relaxavam o anel detector com uma velocidade de declínio semelhante, com meia vida de aproximadamente 2 segundos; (3) hemoglobina e azul de metileno, aboliram os relaxamentos induzidos pela acetilcolina perfundida ou pelo NO gerado a partir de uma solução acidificada de nitrito; (4) hidroquinona, fenidona e sulfato ferroso, que geram superoxido (O 2), inibiram os relaxamentos provocados pela acetilcolina perfundida ou por adição no detector de uma solução de NO; (5) SOD aumentava os relaxamentos provocado pela solução de NO, mas intrigantemente não alterava os relaxamentos provocados por acetilcolina em preparações de anéis com endotélio intacto (Furchgott, 1989). Estabelecida a identidade química do EDRF como sendo o NO, as pesquisas se direcionaram para responder à seguinte questão: quais são as vias que as células endoteliais utilizam para sintetizar NO? Palmer e cols. (1988), utilizando o bioensaio já descrito acima, observaram que L-arginina aumentava os relaxamentos provocados pela bradicinina quando infundida numa cultura de células endoteliais de aorta de suína. Esse efeito foi isomérica e estruturalmente específico, uma vez que não foi observado com D-arginina, L-ornitina, L-homoarginina e outros análogos estruturais da L-arginina. L-arginina também aumentou a quantidade de NO (medido por quimioluminescência) liberado por bradicinina e A23187 em culturas de células endoteliais de aorta suína. Nessas mesmas células, usando L-arginina marcada com o isótopo 15 do nitrogênio ( 15 N), medida de espectrômetria de massa indicou que 15 N é captado para formar NO (Palmer e cols., 1988). Esse experimento sugeriu a existência de enzimas sintetizadoras de NO, que utilizam L-arginina como substrato. Posteriormente, foi estabelecido que essa reação era catalisada por enzimas denominadas sintases de NO (NOS), dependentes de cálcio-calmodulina, e que são competitivamente inibidas por análogos da L-arginina, tais como a N G - monometil-l-arginina (L-NMMA), que abole a liberação de NO induzida por acetilcolina em aorta de coelho (Rees e cols., 1988). 9

20 1.6. RELAXAMENTOS RESISTENTES A INIBIDORES DE SÍNTASE DE NO E CICLOOXIGENASES No final da década de setenta, Kuriyama e Suzuki (1978) observaram que a acetilcolina provoca hiperpolarização de segmentos de artéria mesentérica superior de coelho e que estas mesmas eram abolidas por aumento da concentração de potássio. Eles também observaram que a acetilcolina induz relaxamentos em tiras pré-contraídos com potássio de artéria mesentérica superior de coelho (Kuriyama e Suzuki, 1978). No final da década de oitenta, Feletou e Vanhoutte (1988) com a proposta de verificar no bioensaio se o(s) produto(s) liberado(s) do endotélio de segmentos de artéria femoral (doadora) seriam capazes de provocar mudanças na tensão e no potencial de membrana do músculo liso de tiras de artéria coronária descendente anterior esquerda e de artéria epicárdica de cão, respectivamente (detectoras), observaram que: (1) a acetilcolina relaxa a coronária descendente apenas se a doadora tiver endotélio, (2) a acetilcolina hiperpolariza a artéria epicárdica apenas se a doadora tiver endotélio, (3) ouabaína, quando colocada nas detectoras, bloqueava as hiperpolarizações mas não os relaxamentos provocados pela acetilcolina, e (4) indometacina não afetava nem as hiperpolarizações nem os relaxamentos provocados pela acetilcolina (Feletou e Vanhoutte, 1988). Essas observações sugeriram que os dois fenômenos (relaxamentos e hiperpolarizações) são devidos a diferentes fatores derivados do endotélio. Na mesma época, Chen e cols. (1988) observaram que em artéria pulmonar principal isolada de rato, os relaxamentos e as hiperpolarizações eram dependentes de endotélio, mas apenas os relaxamentos eram reduzidos pela hemoglobina e pelo o azul de metileno, substâncias que inibem as respostas mediadas por EDRF. Essas observações fizeram os autores sugerir a existência de Fator(es) Hiperpolarizante(s) Derivado(s) do Endotélio (EDHF) e que este não era o EDRF e nem um produto derivado da ciclooxigenase, uma vez que a indometacina não afetava essas hiperpolarizações (Chen e cols. 1988). Esse fenômeno depende do leito vascular estudado e parece ser predominante em vasos de resistência (Shimokawa e cols., 1996). Essa hiperpolarização persiste na presença de inibidores da síntese de NO e da síntese de prostaglandinas derivadas de ciclooxigenases (COX) e pode corresponder aos relaxamentos descritos também em vários leitos vasculares e artérias isoladas que são resistentes 10

21 à inibição da COX e da NOS. Por exemplo, na aorta torácica de rato a acetilcolina induz relaxamento dependente do endotélio que é abolido pelo inibidor de NOS N G - nitro-l-arginina (L-NNA), enquanto que na artéria mesentérica superior de rato a acetilcolina provoca relaxamentos dependentes do endotélio mesmo na presença de indometacina (inibidor de COX) e de L-NNA, sugerindo que estes relaxamentos seriam mediados por EDHF (Nagao e cols., 1992). Esses relaxamentos, porém, são abolidos pela elevação da concentração extracelular de potássio ou pela combinação de caribdotoxina e apamina, bloqueadores de canais de potássio ativados por cálcio. Estes relaxamentos mediados por EDHF também foram descritos em preparações de artérias de coelho, tais como aorta abdominal, carótida, ilíaca, femoral, mesentérica superior e renal (Cowan e cols., 1993; Chaytor e cols., 2003; Hutcheson e cols., 1999; Kagota e cols., 1999). Uma diversidade de mecanismos tem sido proposta para explicar estes relaxamentos bem como a hiperpolarização das células musculares lisas dependentes de endotélio; assim, há evidências de o EDHF possa ser: (a) os íons potássio, que em baixas concentrações relaxam e hiperpolarizam artérias hepáticas de rato por mecanismos sensíveis ao bário e à ouabaína e são liberados durante a hiperpolarização induzida por acetilcolina das células endoteliais (Edwards e cols. 1998); (b) ácidos epoxieicosatrienóicos, que são produtos derivados do ácido araquidônico e sintetizados por uma família de enzimas do citocromo P450 (epoxigenases), e parecem mediar os relaxamentos e a hiperpolarizações induzidas por bradicinina em artérias coronárias suínas (Hecker e cols. 1994; Fisslthaler e cols. 1999); (c) peróxido de hidrogênio, que em artérias mesentéricas de camundongo parecem mediar os relaxamentos e as hiperpolarizações dependente de endotélio causados pela acetilcolina (Matoba e cols. 2000); (d) ácidos trihidroxiecosatrienóicos derivados do ácido araquidônico por ação da lipoxigenases e hidroperóxido isomerase; há evidências experimentais de que o ácido 11,12,15 trihidroxiecosatrienóico é o EDHF liberado pela a acetilcolina em aorta de coelho (Campbell e cols. 2003); (e) peptídeo natriurético C, que além de relaxar artérias mesentéricas de rato, é liberado durante a hiperpolarização induzida por acetilcolina das células endoteliais e de hiperpolarizar as células musculares lisas por mecanismos sensíveis ao bário e a ouabaína (Chauchan e cols. 2003). Um fato interessante é que na artéria carótida de coelho as características farmacológicas e 11

22 químicas do EDHF se assemelham ao próprio NO, que nesse caso seria derivado de outras fontes além da NOS (Cohen e cols., 1997) CÁLCIO, SÍNTESE E LIBERAÇÃO DE FATORES RELAXANTES DO ENDOTÉLIO A observação de que os relaxamentos dependentes de endotélio causados por acetilcolina e A23187, em anéis de aorta torácica de coelho e rato (Winquist e cols.,1985; Singer e Peach, 1982), e que a liberação de EDRF provocada por acetilcolina, em experimentos de bioensaio (aorta torácica de coelho como doadora e artéria coronária de coelho como detectora, Griffith e cols., 1986), eram abolidos quando não se adicionava cálcio à solução nutritiva, levaram à sugestão de que o influxo de cálcio do meio extracelular para o endotélio é um fator necessário para estes relaxamentos. Relaxamentos dependentes de endotélio resistentes a inibidores de NOS e COX também são dependentes da presença de cálcio extracelular (Feletou e cols., 2006). Uma vez estabelecida a necessidade de aumento da concentração de cálcio intracelular para que as células endoteliais sejam estimuladas a liberar fatores relaxantes, as atenções foram voltadas para as vias responsáveis por este aumento. As substâncias capazes de provocar relaxamentos dependentes de endotélio podem aumentar a concentração citosólica livre de cálcio por diversas maneiras. Uma forma de aumentar a concentração intracelular livre cálcio é o uso de drogas com atividade inibitória da bomba que transporta o cálcio para retículo sarcoplasmático (ATPase de cálcio), como o ácido ciclopiazônico (CPA) e a tapsigargina. Em experimentos em cascata com preparações de artérias de coelho (segmento de aorta abdominal como doador e anéis de aorta torácica como detectora); a adição de CPA e de tapsigargina no doador provocou relaxamentos transitórios da detectora, que foram abolidos pelo éster metílico da L-NNA (L- NAME), um inibidor da NOS. Por outro lado, os relaxamentos na detectora induzidos por acetilcolina infundida no doador são reduzidos pelo prévio tratamento da doadora com CPA e tapsigargina (Hutcheson e cols., 1997). Em anéis de aorta torácica de rato pré-contraídos com fenilefrina, tapsigargina tanto inibe os 12

23 relaxamentos provocados por acetilcolina e A23187 quanto provoca relaxamentos dependentes de endotélio que são abolidos por L-NAME (Huang e cols., 2000). Em experimentos de medida da concentração de cálcio intracelular em células endoteliais isoladas de aorta de coelho, mediante indicadores fluorescentes, a acetilcolina aumentou a concentração citosólica de cálcio e esse aumento foi dependente tanto do cálcio extracelular como do cálcio presente em estoques intracelulares. Assim, nessas preparações sem cálcio na solução de perfusão, acetilcolina e CPA provocavam aumentos transitórios nas concentrações citosólicas de cálcio e os aumentos induzidos por acetilcolina eram reduzidos CPA (Li e van Breemen, 1996; Sasajima e cols., 1997). Já nessas preparações com cálcio na solução de perfusão, acetilcolina e CPA provocavam aumentos nas concentrações citosólicas de cálcio e os aumentos provocados pela acetilcolina eram bloqueados por CPA (Li e van Breemen, 1996). Em preparações pressurizadas de artéria mesentérica superior de rato, a acetilcolina provocava elevações nas concentrações intracelulares de cálcio nas células endoteliais e esses aumentos envolviam dois componentes: o primeiro componente transitório não foi afetado por remoção de cálcio extracelular e foi inibido por CPA e o segundo componente mantido, subseqüente, foi abolido pela remoção de cálcio extracelular, pelo CPA e pelo SKF96365, um bloqueador não seletivo de canais de cátions (McSherry e cols. 2005). Todas essas observações sugerem que o aumento na concentração de cálcio provocado pela acetilcolina seja mediado por 2 mecanismos: o primeiro depende da liberação de cálcio de estoques intracelulares (retículo endoplasmático) cuja depleção promove o influxo de cálcio a partir do meio extracelular, classicamente denominado influxo capacitivo ou influxo de cálcio operado por estoque (Putney, 1986 e Nillius, 2003). O segundo mecanismo, que não requer a depleção dos estoques intracelulares de cálcio, envolve a ativação de canais permeáveis ao cálcio localizados na membrana plasmática, seja por via indireta (ativação mediada por receptores) ou direta (ativação do próprio canal iônico), (Nilius e Droogmans, 2001). 13

24 1.8. PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL E RELAXAMENTOS MEDIADOS POR ENDOTÉLIO Em recente revisão, McNeill e Jurgens (2006) catalogaram 128 espécies de plantas com atividade vasodilatadora, das quais foram isolados 67 compostos químicos com esta atividade. Esses autores selecionaram nessa revisão apenas os trabalhos nos quais foram estudados os possíveis mecanismos de ação. Destes estudos, cerca de 62% descreveram relaxamentos dependentes de endotélio; 26% descreveram relaxamentos independentes de endotélio e cerca de 12% descreveram relaxamentos dependentes e independentes de endotélio (McNeill e Jurgens, 2006). Assim, os mecanismos de relaxamento de preparações vasculares induzidos por produtos derivados de plantas parecem ser de uma diversidade semelhante à sua própria diversidade química. A observação de que baixa incidência de doenças cardiovasculares em populações da França e outros países do Mediterrâneo, apesar da alta dieta de gordura saturada (Paradoxo Francês), foi correlacionada com a alta freqüência de consumo de vinho tinto e impulsionou pesquisas nos mecanismos da atividade biológica tanto de extratos feitos de vinho tinto como de compostos químicos (flavonóides) isolados destes. Inicialmente, foram verificados relaxamentos dependentes de endotélio mediados por EDRF provocados por extratos de alguns vinhos, em anéis de aorta de rato, que foram tanto revertidos como prevenidos por inibidores de NOS, além de serem acompanhados por um aumento nas quantidades de GMPc (Flitzpatrick e cols., 1993). Posteriormente, foram observados relaxamentos dependentes de endotélio por uma variedade de extratos vegetais (frutas, nozes, chás e ervas) que foram acompanhados por elevações nas quantidades de GMPc em preparações de aorta de rato (Flitzpatrick e cols., 1995). O efeito relaxante de extratos de vinho foi atribuído ao seu conteúdo de compostos polifenólicos e a fração mais ativa tem uma alta quantidade de taninos condensados oligoméricos; dessa fração foi isolado o composto com maior potência relaxante, delfinidina (Andriambeloson e cols., 1998). O fato de que os compostos polifenóis do extrato de vinho tinto também eram capazes de induzir relaxamentos dependentes de endotélio na presença de inibidores de NOS e COX em artérias mesentéricas de rato, descarta estas enzimas como o alvo primário de ação desses compostos. 14

25 Também foi encontrado que os polifenóis do extrato de vinho tinto são capazes de induzir elevações tanto na concentração intracelular de cálcio como extracelular do íon superóxido em células endoteliais de aorta de boi (Duarte e cols.,2004) OBJETIVOS No presente estudo, foram realizados experimentos para caracterizar o efeito relaxante do no músculo liso vascular e investigar o(s) possível(eis) mecanismo(s) envolvido (s) nesse efeito. Especificamente, foram concebidos experimentos para responder as seguintes questões: 1. Em aorta de coelho esse relaxamento é dependente da presença do endotélio? 2. Esse efeito relaxante ocorre em outras artérias de coelho e na aorta torácica de outros animais? 3. Finalmente, para identificar o possível mecanismo de ação do, foram realizados experimentos em aorta de coelho e de rata para responder as seguintes questões: 3.1- O relaxamento por é devido à liberação de substâncias relaxantes a partir do endotélio? 3.2- Quais são os fatores endoteliais liberados pelo? 3.3- Qual o mecanismo pelo qual o estimula o endotélio? 15

26 2. MÉTODOS 16

27 2.1. PREPARAÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DE COMBRETUM LEPROSUM MART. Foram coletadas cascas de Combretum leprosum durante o período das 9:30 às 10:30 h da manhã do dia 15 de julho de 2005, no setor de caprinocultura do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Piauí, em Teresina. Exsicatas (n 10667) foram depositadas no Herbário Graziela Barroso da mesma instituição. As cascas foram deixadas secar durante dois dias a aproximadamente 40 C e o pó das mesmas foi obtido por meio de moagem em moinho elétrico. O extrato foi preparado por percolação com uma solução aquosa de etanol 70% em temperatura ambiente e depois concentrada em rota-evaporador a 50 C para gerar o extrato seco, obtendo-se, assim, um rendimento de cerca de 20% de pó seco. O extrato foi livremente diluído em água destilada para experimentos farmacológicos ISOLAMENTO DAS ARTÉRIAS E SISTEMA DE REGISTRO Foram utilizados coelhos neozelandeses (2,5 3,5 Kg), ratos Wistar ( g), cobaias inglesas ( g) e camundongos suíços (25-30 g); machos ou fêmeas obtidos do biotério central do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Uma linhagem de ratas com hipertensão arterial espontânea e ratas Wistar entre o vigésimo e vigésimo segundo dia de gestação também foram utilizadas em alguns experimentos. Os protocolos experimentais utilizados estavam de acordo com os princípios éticos na experimentação animal adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Os animais foram sacrificados por secção dos vasos cervicais, após anestesia com pentobarbital sódico (50 mg/kg, i.p.). Após abertura da cavidade torácica, a aorta torácica descendente foi rapidamente removida e colocada numa placa de Petri contendo solução de Krebs (composição em mm: NaCl 116, KCl 4,5, NaH 2 PO 4 1,14, MgCl 2.6H 2 O 1,16, CaCl 2.2H 2 O 2,5, NaHCO 3 25 e glicose 11,1), onde foi dissecada de tecidos aderentes e gordura. Em alguns coelhos, além da aorta torácica, foram retiradas as artérias aorta abdominal, carótida comum e mesentérica superior. As artérias foram seccionadas em anéis (3-4 mm). Alguns anéis tiveram o 17

28 endotélio danificado por meio de um leve deslizamento feito com uma superfície metálica, de diâmetro compatível, no lúmen do anel. Os anéis foram suspensos entre finos suportes metálicos e montados em cubas para órgão isolado (5-10 ml) contendo solução de Krebs a 37 o C e borbulhada continuamente com mistura carbogênica contendo 5% CO 2 95% O 2. Os anéis de aorta de rato, camundongo e cobaia foram montados dentro de uma tensão de repouso de 2, 1 e 3 g, respectivamente, enquanto os anéis de artérias de coelho numa tensão de 3-4 g. A tensão de cada anel foi continuamente registrada por meio de um transdutor de força isométrico conectado a um polígrafo. Alguns experimentos foram realizados para demonstrar a liberação de substâncias pelo endotélio. Nesses experimentos, conhecidos como preparações em Sanduíche, descritos por Furchgott e Zawadzki (1980), foram utilizadas tiras isoladas de aorta torácica de coelho. Uma tira foi cortada num eixo paralelo ao do fluxo sangüíneo na aorta, essa tira foi desprovida de endotélio por meio de um leve deslizamento de sua superfície luminal num papel de filtro, sendo denominada tira longitudinal ou tira detectora. Outra tira foi confeccionada a partir de um anel que foi aberto e sua superfície luminal foi preservada ou não de endotélio; essa tira foi denominada tira transversal ou tira doadora. As duas tiras foram cortadas com a mesma dimensão e montadas em cubas para órgão isolado com o auxilio de grampos cirúrgicos das seguintes formas: (I) Uma tira detectora junto com uma tira doadora sem endotélio; (II) uma tira detectora junto com uma tira doadora com endotélio; (III) uma tira detectora na ausência de tira doadora; e (IV) uma tira doadora na ausência de tira detectora. Nas preparações em que se montaram tiras juntas, foi sempre registrada a tensão da tira detectora PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS Os anéis ou tiras foram deixados em equilíbrio por um período entre 3 (coelho) a 2 h (rato, camundongo e cobaia), sendo trocada a solução de Krebs a cada 20 minutos. Após a primeira hora, para testar a viabilidade das preparações, foi induzido uma contração com fenilefrina (0,1-1 μm). Depois da segunda hora de lavagem, adicionou-se novamente fenilefrina e no platô de sua contração, a integridade do endotélio foi verificada pelo relaxamento induzido pela a adição de 18

29 acetilcolina (0,1-0,3 μm). Foram considerados anéis com endotélio intacto aqueles em que acetilcolina reduziu pelo menos 60% da contração induzida por fenilefrina. Depois de lavagem da preparação, induziu-se novamente contração com fenilefrina e foram adicionadas, no platô da contração, concentrações cumulativas de (0,5, 1,5 e 5 μg/ml) ou concentrações isoladas de acetilcolina. Em aorta torácica de rata pré-contraídas com fenilefrina também foram investigados os efeitos de 11,12- didecanoato de 4-alfa-forbol (4α-PDD, 1-30 μm), capsaicina (10-30 μm), 2-difenilboraniloxetanamina (2-APB,1 μm) ou A23187 (1 μm), ou ácido ciclopazônico (CPA, 1 μm). Após a adição das drogas supracitadas em anéis contraídos com fenilefrina, esperou-se um tempo para o qual a resposta (se essa ocorresse) atingisse um nível estável. Em seguida, foram adicionados atropina (1 μm), N G -nitro-l-arginina ( L- NNA, μm ), vitamina B12 ( μm ), ODQ (10 μm), ou vermelho de rutênio (1-30 μm). Em algumas preparações os efeitos de acetilcolina e de foram examinados na presença de diclofenaco (10 μm), um inibidor da COX ANÁLISES DOS RESULTADOS Os resultados foram expressos como percentagem de alteração da tensão induzida por fenilefrina após a adição das drogas. Estes valores foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) DROGAS Acetilcolina, atropina, capsaicina, fenilefrina e vitamina B12 foram obtidos da Sigma. CPA e ODQ foram obtidos de Tocris. A23187, 2-APB, 4α-PDD e diclofenaco foram obtidos de Calbiochem. L-NNA foi obtido de Research Biochemicals International. Vermelho de rutênio foi obtido de LC Laboratories. 19

30 3. RESULTADOS 20

31 3.1. INDUZ RELAXAMENTOS DEPENDENTES DE ENDOTÉLIO Em anéis de aorta torácica descendente, de aorta abdominal e de artéria mesentérica superior de coelho, o (0,5, 1,5 e 5 μg/ml) induziu relaxamentos dependentes de concentração apenas em preparações com endotélio intacto (Figura 1A-C). Qualitativamente, em dois experimentos realizados com anéis de artéria carótida comum de coelho, o também provocou relaxamentos dependentes de concentração e de endotélio (Figura 1D). O também induziu relaxamentos de forma dependente da concentração e do endotélio em anéis de aorta torácica de rata e rato (n=2), de rata com dias de gestação e de rata com hipertensão arterial (n=2) (Figura 2). O também induziu relaxamentos de forma dependente da concentração e de endotélio em anéis de aorta torácica de camundongo (n=2) e cobaia (n=2) (Figura 3) ATROPINA NÃO REVERTE OS RELAXAMENTOS INDUZIDOS POR O relaxamento induzido por acetilcolina é devido à ativação de receptores muscarínicos presentes nas células endoteliais, assim questionamos se os relaxamentos induzidos por poderiam envolver ativação destes receptores. A atropina (0,1 μm) reverteu os relaxamentos induzidos por acetilcolina em cerca de 95±4% (n=7) em anéis de aorta de coelho e cerca de 109±5% (n=3) em anéis de aorta de rata, mas não provocou efeitos significantes nos relaxamentos provocados por (Figura 4 e 5). 21

32 A 120 +E -E 2g Tensão (%) E (4) +E 5min 0 (13) B 0,5 1,5 5,0 0,5 1,5 5, , μg/ml +E -E 2g Tensão (%) (4) -E +E 0,5 1,5 5,0 0,5 1,5 5,0 5min 0 (4) μg/ml C +E -E 0,5 1,5 5,0 2g 5min 0,5 1,5 5,0 (%) Tensão (3) -E +E (13) μg/ml D +E -E 2g 5min 0,5 1,5 5,0 0,5 1,5 5,0 Figura 1: Efeitos provocados por (µg/ml) em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (, 10-7 M para aortas e 10-6 M para mesentérica e carótida), de artérias com (+E) e sem endotélio (-E) de (A) aorta torácica, (B) aorta abdominal, (C) artéria mesentérica superior e (D) artéria carótida comum de coelho. À esquerda, registros representativos e, à direita, representação gráfica das médias±epm, com o número de experimentos entre parênteses. 22

33 A 120 +E - E 1g 5min Tensão (%) (5) -E +E (6) B 0,5 1,5 5,0 +E - E 0,5 1,5 5,0 1g Tensão (%) , μg/ml (2) -E +E C 0,5 1,5 5,0 0,5 1,5 5,0 5min 0 (4) (μg/ml) +E -E 0,5g 0,5 1,5 5,0 0,5 1,5 5,0 5min D +E -E 1g 5min 5,0 5,0 Figura 2: Efeitos provocados por (µg/ml) em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (, 10-7 M), de aorta torácica com (+E) e sem endotélio (-E) de (A) rata normotensa, (B) rata grávida, (C) rato e (D) rata com hipertensão arterial. À esquerda, registros representativos e, à direita, representação gráfica das médias±epm, com o número de experimentos entre parênteses. 23

34 A +E -E 1g 5min -6 0,5 1,5-6 0,5 1,5 B +E -E 0.25g 0, 2g ,0 5min ,0 Figura 3: Registros representativos dos efeitos provocados por (µg/ml) em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (, 10-6, M), de aorta torácica com (+E) e sem (-E) endotélio de (A) cobaia e de (B) camundongo. 24

35 A 100 (7) 2g 5min Tensão (%) 50 (8) (7) (2) Ach Atr L 0,5 1,5 5,0 Atr 0 Ach Ach + Atr + Atr B 120 (3) 1g 5min Tensão (%) (3) (3) (3) Ach Atr 5,0 Atr 0 Ach Ach + Atr + Atr Figura 4: Atropina (Atr, 10-7 ) reverte os relaxamentos dependentes de endotélio provocados por acetilcolina (Ach, 10-6 ), mas não aqueles provocados por (µg/ml) em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (, 10-7 ) de aorta torácica de coelho (A) e rata (B). À esquerda, registros representativos e, à direita, representação gráfica das médias±epm, com o número de experimentos entre parênteses. L=Lavagem. 25

36 3.3. DEMONSTRAÇÃO DE QUE OS RELAXAMENTOS INDUZIDOS POR SÃO DEVIDOS À LIBERAÇÃO DE FATOR(ES) RELAXANTE(S) DO ENDOTÉLIO QUE SE DIFUNDE(M) PARA AS CÉLULAS MUSCULARES LISAS. Em dois experimentos em sanduíche com tiras de aorta torácica descendente de coelho (ver métodos), observamos relaxamentos induzidos por acetilcolina e apenas nas tiras sem endotélio (detectora) que foram montadas juntas com tiras com endotélio (doadoras) (Figura 5). Assim, de forma semelhante ao fenômeno descrito para a a, o provoca liberação de EDRF. Tira Transversal (-E) Tira Longitudinal (-E) 1g min Tira Transversal (-E) Tira Longitudinal (+E) Tira Longitudinal (+E) -7 Ach ,5 3,0 Figura 5: Registro representativo dos efeitos provocados por (µg/ml) e acetilcolina (Ach) em preparações de tiras montadas em sanduíche, pré-contraídas com fenilefrina (), de aorta torácica descendente de coelho com a tira doadora com (+E) e sem (-E) endotélio (ver métodos). 26

37 3.4. OS RELAXAMENTOS INDUZIDOS POR SÃO DEVIDOS A LIBERAÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO DO ENDOTÉLIO QUE SE DIFUNDE PARA AS CÉLULAS MUSCULARES LISAS. Existe um grande corpo de evidências de que relaxamentos dependentes do endotélio induzidos por acetilcolina em várias espécies animais e leitos vasculares são mediados por mecanismos dependentes de produção de prostaciclina (PGI 2 ), NO e/ou EDHF (Moncada, 1977; Furchgott e Zawadzki, 1980; Feletou, 2006). Assim, verificamos o efeito do diclofenaco, um inibidor de COX, nos relaxamentos dependentes do endotélio induzidos por. Em anéis de aorta torácica de coelho, a pré-incubação com diclofenaco (10 μm) não afetou significativamente os relaxamentos provocados por acetilcolina (1,0 μm) e por (1,5 μg/ml) (Figura 6A). O mesmo foi verificado em anéis de aorta torácica de rata (n=2), onde diclofenaco não alterou os relaxamentos provocados por acetilcolina (1,0 μm) ou (5,0 μg/ml), como representado no experimento da Figura 6B. Esses dados sugerem que a liberação de prostaglandinas derivadas de COX não seria um fator de primordial importância nos relaxamentos induzidos por na aorta torácica de coelho e de rata. Como já enfatizado na introdução, há evidências experimentais de que o EDRF é o próprio NO em aorta de coelho e que sua formação no endotélio se daria a partir da L- arginina, uma reação catalisada por NOS. Como já demonstramos a liberação de EDRF pelo, testamos se seus relaxamentos são afetados pela L-NNA, um análogo da L-arginina e inibidor da NOS. Em anéis de aorta torácica de coelho ou rata (Figura 7) os relaxamentos provocados por (5,0 µg/ml) foram completamente revertidos por L-NNA (100 µm). Além disso, L-NNA aumentou as contrações induzidas por fenilefrina em cerca de 10% (n=5) em aorta de coelho e 45% (n=8) em aorta de rata. 27

38 A Sem Di 1g 2min 90 Com Di Ach 1,5 Tensão (%) (5) (8) (11) (11) 0 Ach Ach+Di + Di Ach 1,5 B Sem Di Ach 5,0 Com Di 1g 5min Ach 1,5 3,0 5,0 EEC L Figura 6: Efeito da pré-incubação com diclofenaco (Di, 10-5 M) nos relaxamentos provocados por (µg/ml) e acetilcolina (Ach, 10-6 M) em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (, 10-7 M), de aorta torácica de (A) coelho e (B) e rata. À esquerda, registros representativos e, à direita, representação gráfica das médias±epm, com o número de experimentos entre parênteses. 28

39 A 120 (5) 2g 5min Tensão (%) (5) 0 0,5 1,5 5,0 L-NNA + L-NNA B 160 (8) 0.5g 5min Tensão (%) (8) 0 0,5 1,5 5,0 L-NNA + L-NNA Figura 7: L-NNA (10-4 M) reverte os relaxamentos provocados por (µg/ml) em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (, 10-7 M), de aorta torácica de (A) coelho e de (A) rata. À esquerda, registros representativos e, à direita, representação gráfica das médias ± EPM, com o número de experimentos entre parênteses. 29

40 Como a L-NNA reverteu completamente o relaxamento causado por, é plausível sugerir que o EDRF liberado por em anéis de aorta torácica de coelho e rata é o NO sintetizado a partir da NOS. Portanto, nessas preparações, se o NO for realmente o EDRF é de se esperar que hidroxicobalamina (B12) e ODQ, respectivamente um seqüestrador químico do NO e um inibidor de GC, também revertam os relaxamentos provocados por NO. Em anéis de aorta torácica de coelho e de rata os relaxamentos provocados por (1,5-5,0 µg/ml) foram completamente revertidos pela B12 ( µm) (Figura 8 A e C). Também em anéis de aorta torácica de coelho, os relaxamentos provocados por (1,5-5,0 µg/ml) foram completamente revertidos por ODQ (10 µm) (Figura 8 B). Da mesma forma como para a L-NNA, tanto B12 quanto ODQ aumentaram as contrações induzidas por fenilefrina; estes aumentos foram, respectivamente, de cerca de 30% (n=5) e 36% (n=6) em anéis de aorta torácica de coelho. Já em anéis de aorta torácica de rata, B12 (10 µm) aumentou as contrações causadas por fenilefrina (10-7 M) em cerca de 38% (n=6) PROVOCA RELAXAMENTOS RESISTENTES AO DICLOFENACO E A L-NNA Em preparações onde foram descritos relaxamentos dependentes de endotélio induzidos por drogas mesmo na presença de inibidores de COX e NOS, tais como na aorta abdominal e artéria mesentérica de coelho, testamos se é capaz de relaxar essas artérias nessas condições. Em anéis de artérias abdominais em solução de Krebs contendo diclofenaco (10 μm) e pré-incubados (20 min) com L-NNA (100 μm), observamos que: (1) ocorrem aumentos de contrações provocadas por fenilefrina; (2) os relaxamentos causados por são apenas reduzidos (Figura 9). Nessas condições experimentais, também observamos relaxamentos dependentes de endotélio induzidos por em anéis de aorta mesentérica superior (n=2) e de artéria carótida comum (n=2) de coelho (Figura 9). Uma vez que nessas condições, estes relaxamentos têm sido atribuídos à liberação de EDHF e que este necessita de cálcio, que funciona como um fator 30

41 chave nesse processo e também nos relaxamentos mediados por EDRF (NO), sugerimos que o possa estar estimulando o influxo de cálcio endotelial RELAXAMENTOS PROVOCADOS PELO SÃO DEPENDENTES DE CÁLCIO EXTRACELULAR Realizamos alguns experimentos, com o intuito de examinar se a concentração extracelular de cálcio é um fator determinante para os relaxamentos provocados por. Na ausência de cálcio na solução de Krebs necessitamos adicionar uma concentração maior de fenilefrina para induzir contrações significativas; isso é consistente com a necessidade de influxo de cálcio para que haja contrações do músculo liso vascular provocadas por agonistas dos receptores alfa-adrenérgicos do subtipo 1 (Hill, 2000). Tanto em anéis de aorta torácica de coelho (n=2) como de rata (n=2), observamos uma redução nos relaxamentos para o (1.5 µg/ml) (Figura 10). Esses resultados sugerem que o influxo de cálcio para células endoteliais é uma etapa limitante para os relaxamentos provocados por. 31

42 A 160 (5) 2g Tensão (%) (4) 5min 0 0,5 1,5 5,0 B12 +B12 B 160 (5) 2g 5min Tensão (%) (5) C 160 (6) 1g 5min (6) 0 +B12 0,5 1,5 5,0 ODQ 0 + ODQ Tensão (%) 0,5 1,5 5,0 B12 Figura 8: Vitamina B12 (B12, 10-4 M) e ODQ (10-5 M) reverteram os relaxamentos provocados por (µg/ml) em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (, 10-7 M), de aorta torácica de coelho (A e B). B12 (10-5 M) reverte o relaxamento induzido por (µg/ml) em anéis, pré-contraídos com (10-7 M), de aorta torácica de rata (C). À esquerda, registros representativos e, à direita, representação gráfica das médias±epm, com o número de experimentos entre parênteses. 32

43 A Diclofenaco 2g 5 min Diclofenaco - +L-NNA (%)Tensão * * 0-7 0,5 1,5 5,0-7 0,5 1,5 5, μg/ml B 2g Diclofenacō +L - NNA 5min -5,7 0,5 1,5 5,0-6,0 0,5 1,5 5,0 C Diclofenaco +L-NNA 2g -6 0,5 1,5 3,0-6 5 min 0,5 1,5 3,0 Figura 9: Efeito de diclofenaco (Di, 10-5 M) + L-NNA (10-4 M) nos relaxamentos provocados por (µg/ml) em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (), de (A) aorta abdominal, (B) artéria mesentérica superior e (C) artéria carótida de coelho. À esquerda, registros representativos e, à direita, representação gráfica das médias±epm, com o número de experimentos entre parênteses. 33

44 A 0 Ca++ Ca++ 1g 5min 1,5 1, B 0 Ca++ Ca++ 0,5g 5min 1,5 1, Figura 10: Registro representativo do efeito da solução de Krebs sem (0 Ca++) ou com cálcio (Ca++) nos relaxamentos provocados por (µg/ml) em anéis, précontraídos com fenilefrina () de aorta torácica de (A) coelho e (B) rata. 34

45 3.7. VERMELHO DE RUTÊNIO (VR) REVERTE OS RELAXAMENTOS INDUZIDOS POR Uma vez verificado que os relaxamentos provocados pelo são reduzidos quando se incuba a preparação em solução de Krebs sem cálcio, nossa próxima etapa foi testar se alguns bloqueadores de influxo de cátions para o endotélio afetam estes relaxamentos. Numa triagem preliminar, adicionamos no platô dos relaxamentos induzidos por : gadolínio, SKF96365, níquel e vermelho de rutênio (VR) em concentrações variadas entre 1-30 µm. Apenas o VR reverteu significativamente os relaxamentos induzidos por, em anéis de aorta torácica de coelho, rata e camundongo (Figura 11). Esses relaxamentos foram revertidos em cerca de 88±5 % (n=8) (aorta torácica de rata), 81±5% (n=5) (aorta torácica de coelho) e 77±13% (n=4) (aorta torácica de camundongo). Em um experimento controle em aorta torácica de coelho o VR não reverteu os relaxamentos provocados pela acetilcolina (10-6 M) e CPA (10-5 M); e em aorta torácica de rata o VR também não reverteu os relaxamentos causados por acetilcolina (10-6 M), A23187(10-6 M) e CPA (10-6 M) (Figura 12). Assim, sugerimos um determinado grau de especificidade de ação do VR versus. Corroborando com a hipótese de que os relaxamentos provocados por são (1) devidos à liberação tanto de EDRF quanto de EDHF; (2) dependentes de influxo cálcio e (3) são sensíveis ao VR, um bloqueador de canais não seletivos para cátions, nosso próximo passo foi examinar se o VR seria capaz de reverter os relaxamentos induzidos por em experimentos do tipo sanduíche e em experimentos com diclofenaco e L-NNA pré-incubados. Como observado na Figura 13, o VR também é capaz de reverter os relaxamentos provocados por em experimentos sanduíche com tiras de aorta torácica de coelho (n=2) e em experimentos em artérias mesentéricas superiores (n=2) na presença de diclofenaco (10-5 M) e L-NNA (10-4 M) 35

46 A 100 (5) 2g Tensão (%) 50 (5) 5min ,5 VR 1,5 ECL 1,5 + VR B 100 (8) 1g 5min Tensão (%) 50 (8) ,0 VR 5,0 5,0 + VR C 100 (4) 0.25g -4.7 VR 5min L Tensão (%) 50 (4) -6 3,0 VR 0 3,0 ECL 3,0 + VR Figura 11: O vermelho de rutênio (VR, 20 μm) reverte os relaxamentos provocados por (µg/ml) em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (), de aorta torácica descendente de (A) coelho de (B) rata e de (C) camundongo. À esquerda, registros representativos e, à direita, representação gráfica das médias±epm, com o número de experimentos entre parênteses. 36

47 A 2g 5min Ach VR -4,7 CPA VR -4,7 5,0 VR -4,7 B 1g 5min Ach VR -5,5 Ach VR -5 Ach VR -4,7 Ach VR -4,5 1,5 VR -4.7 A VR ,5-6 CPA VR -5 Figura 12: VR não reverte os relaxamentos provocados por (A) acetilcolina (Ach, 10-6 M) e CPA (10-5 M) em anéis pré-contraídos com fenilefrina (, 10-7 M) de aorta torácica de coelho ou (B) por Ach (10-6 ), CPA e A23187 (10-6 M) em anéis de aorta torácica de rata. Registros representativos de experimentos únicos. 37

48 A 2g 5min -7 1,5 3,0 VR -4,7 B 2g 5min -6 0,5 1,5 5,0 VR -4,7 Figura 13: Vermelho de rutênio (VR, 10-4,7 M) reverte os relaxamentos provocados por (µg/ml) em experimentos sanduíche de (A) tiras de aorta torácica e (B) em anéis de artéria mesentérica de coelho na presença de diclofenaco (10 µm) e L-NNA (100 µm), pré-contraídos com fenilefrina (). 38

49 3.8. O 4α-PDD PROVOCA RELAXAMENTOS COM PERFIL FARMACOLÓGICO SEMELHANTE AOS RELAXAMENTOS INDUZIDOS POR Vermelho de rutênio é uma droga que é capaz de bloquear de uma maneira não seletiva canais de cátions. No endotélio, a natureza molecular de uma diversidade de canais de cátions sensíveis ao VR tem sido identificada. Dentre estes canais podemos citar os da família TRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid, em português Potencial Transitório de Receptor da família Vanilóide) (TRPV1, TRPV2, TRPV3 e TRPV4). Assim, examinamos os efeitos de capsaicina (10-30 µm); 2-difenil- boraniloxetanamina (2- APB, 1-30 µm); 11,12-didecanoato de 4α-forbol (4α-PDD, 1-30 µm), respectivamente agonistas de TRPV1, TRPV1/2/3 e TRPV4, em anéis de aorta de rata pré-contraídos com fenilefrina. Em anéis de aorta torácica de rata, capsaicina (n=2) induziu um discreto relaxamento que foi independente de endotélio, enquanto 2-APB (n=2) provocou relaxamento dependente e independente de endotélio. Estes relaxamentos não foram revertidos pelo VR, como mostrado em um experimento controle (Figura 14). Em anéis de aorta torácica de rata, 4α-PDD induziu relaxamentos que se assemelharam farmacologicamente aos relaxamentos produzidos pelo, uma vez que foram dependentes de endotélio e de concentração e, em um experimento controle, foram revertidos por L-NNA (100 µm), B12 (30 µm) e ODQ (10 µm) (Figura 15). Os relaxamentos provocados pelo 4α-PDD também foram revertidos pelo VR (3 µm) (Figura 16). Uma diferença entre os relaxamentos por 4α-PDD e foi a dessensibilização provocada por adição de concentrações cumulativas de 4α-PDD. Por este motivo as adições dessa droga foram realizadas de forma não cumulativa. 39

50 A +E -E 1g 5min - 5,0-5,5 Capsaicina -5,0-5,5 Capsaicina B +E -E 1g 5min -5,0-4,5 2-APB -5,0-4,5 2-APB C 1g - 5,0-5,5 Capsaicina VR 5min -5,5-5,0 VR 2-APB Figura 14: Registros representativos dos efeitos da (A) capsaicina e de (B) 2-APB em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (, 10-7 M), de aorta torácica de rata com (+E) ou sem (-E) endotélio e de vermelho de rutênio (VR, 10-5 M) nos relaxamentos provocados por capsaicina e 2-APB em anéis com endotélio. 40

51 A +E +E 100 (4) (3) 4α PDD -5,5 4αPDD -5,0 Tensão (%) 50 (5) (5) -E -E 0 +E +E -E -E 4α-PDD 3,0 μm 4α-PDD 10 μm 4α-PDD 3,0 μm 4α-PDD 10 μm B 4αPDD -5,5 4αPDD -5,0 1g 5 min 4αPDD L-NNA 4αPDD B12-6,0-4,0-6,0-4,5 4αPDD -6,0 ODQ -5,0 Figura 15: (A) Efeitos do 4α-PDD em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (, 10-7 M), de aorta torácica de rata. À esquerda, registro representativo e, à direita, gráfico das médias±epm, com o número de experimentos representados entre parênteses. (B) Registros representativos da reversão dos relaxamentos induzidos por 4α-PDD por L- NNA, B12 e ODQ. 41

52 A 1 g 5 min 4 α -PDD 10 µm VR 3,0 µm 4αPDD 3,0µM VR 3,0µM 4αPDD 10µM VR 3,0µM B (5) (4) Tensão (%) (5) 0 4α-PDD 3μM 4α-PDD 3μM+ VR 4α-PDD 10μM 4α-PDD 10μM+VR (4) Figura 16: Reversão dos relaxamentos provocados por 4α-PDD em anéis, précontraídos com fenilefrina (, 10-7 M), de aorta torácica de rata. (A) Registros representativos. (B) Gráfico das médias±epm, com o número de experimentos entre parênteses. 42