RESUMO TÍTULO. Aplicação da Técnica Difusional DOSY de RMN no Estudo de Produtos Naturais AUTORES

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1 RESUM TÍTUL Aplicação da Técnica Difusional DSY de RMN no Estudo de Produtos Naturais AUTRES Raquel Ferreira da Silva, Edson de Souza Bento, Lúcia Maria Conserva e Maria Lysete de Assis Bastos. INTRDUÇÃ A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é um dos métodos utilizados na análise estrutural de compostos químicos. Para o químico, a utilidade da RMN se deve ao fato de que qualquer isótopo possível de ser observado por RMN (p.ex., 1H, 13C, 31P, etc.) em diferentes ambientes químicos, irá produzir deslocamentos químicos distintos para as diversas linhas espectrais. Portanto, tornou-se possível se observar um isótopo específico em um ambiente particular, mesmo em estruturas complexas. s parâmetros que podem ser medidos com base nos sinais espectrais resultantes (posições dos sinais, intensidades, largura do sinal e multiplicidades) podem ser interpretados em termos de estrutura molecular, conformação, movimentos moleculares e outros processos de troca química. Antes de se executar uma medida de RMN, é importante decidir qual a resolução espectral requerida. Para equivalentes razões sinal/ruído, o tempo de aquisição é proporcional ao recíproco da resolução. Para se aumentar a resolução, deve-

2 se aumentar o tamanho da memória ou diminuir a largura espectral. A resolução é proporcional à potência do campo magnético (Bo), com a dispersão espectral tornandose maior à medida que a força de Bo aumenta. A sensitividade é também melhorada com o aumento da potência do campo Bo. É importante notar que, à medida que se trabalha com moléculas cada vez maiores, a interpretação dos resultados é prejudicada não somente pelos espectros mais complexos (com mais sobreposição de sinais), mas também pelo alargamento das linhas de ressonância devido ao fato de que os núcleos de interesse passam a relaxar mais rapidamente [1]. presente trabalho consiste na aplicação da Técnica Difusional DSY de RMN no estudo químico do extrato do caule de uma espécie vegetal da flora alagoana (Zeyheria tuberculosa (Vell) Bur.), a qual apresenta atividade antimicrobiana. A espécie Z. tuberculosa (Figura1) é uma árvore de médio a grande porte, conhecida como "Ipê tabaco ou felpudo, com tronco reto, cilíndrico e casca grossa cinza-clara a pardo-amarelada. A folha inteira, assim como o resto da planta, é recoberta por uma camada espessa, semelhante a um veludo, daí a origem do nome popular. Seus ramos geralmente são grossos, ásperos, e felpudos quando novos. As folhas são opostas cruzadas, pentadigitadas e grandes. A inflorescência surge após a brotação das folhas, em forma de cachos entre os meses de novembro a fevereiro. Seus frutos se apresentam capsulados na forma oval, externamente revestidos de densas expansões semelhantes a um pêlo grosso lenhoso, com inúmeras saliências, tipo tubérculos, sendo esta a razão do nome da espécie. As sementes são achatadas, branco-amareladas, felpudas, que germinam facilmente quando colocadas sob uma fina camada de solo ou palha úmida. Esta espécie, de grande potencial econômico, está ameaçada de extinção em decorrência da atuação humana em atividades agropecuárias, madeireiras e de carvoaria. Esta espécie vegetal não possui habitat único, no território brasileiro, podendo ser encontrada nos cerrados, na mata atlântica e região amazônica [2].

3 Figura 1 - Foto da espécie vegetal Zeyheria tuberculosa (Vell) Bur.* *Fonte: URL: Acessado em 26/07/2009. A amostra estudada [JMZtCC (68-72)] foi isolada no Laboratório de Pesquisa em Química de Produtos Naturais (LPqPN), tendo como responsável a Profª. Drª. Lúcia Maria Conserva. BJETIV Elucidação Estrutural de Compostos obtidos a partir de extratos de plantas com base em dados de RMN. METDLGIA a) Inicialmente foi feito um levantamento bibliográfico do composto estudado, visando a origem, o interesse farmacológico e medicinal;

4 b) A amostra JMZtCC (68-72), contendo 16,00 mg, foi preparada utilizando-se CDCl 3 (Clorofórmio Deuterado) como solvente; c) Em seguida, esta amostra, foi submetida a experimentos uni- e bidimensionais de RMN ( 1 H, 13 C, DEPT 90, DEPT 135, HSQC, HMBC, CSY e DSY), com o objetivo da elucidação das estruturas do composto estudado; d) s experimentos de RMN foram efetuados em aparelho Bruker Avance 400 ( 1 H: 400 MHz; 13 C: 100 MHz), sendo processados e analisados com o uso do programa TPSPIN; RESULTADS E DISCUSSÃ A Técnica DSY s experimentos com a técnica DSY foram executados, ajustando-se três parâmetros: tempo de difusão Δ (intervalo entre a aplicação dos pulsos de gradiente), potência do gradiente de campo, g, e tempo de aplicação do gradiente de campo, δ. s valores foram modificados buscando obter curvas de decaimento exponenciais e espectros DSY com coeficientes de difusão distintos para os compostos presentes em cada uma das quatro soluções em estudo [3,4]. Identificação estrutural da substância codificada de JMZtCC (68-72) A análise do espectro de RMN 1 H (Figura 2) revelou a presença de sinais cujos valores de deslocamentos químicos e multiplicidades estão condizentes com a presença de esqueleto de flavonas com o anel A do tipo 5,6,7-trissubstituído, [δ 6,70 (s, H-3) e δ 6,83 (s, H-8)]. Adicionalmente, foram observados sinais múltiplos para o anel B, integrados para um e dois hidrogênios, coerentes com a presença de anéis aromáticos não substituídos [δ 7,90 (m, 1H, H-2 e H-6 ), δ 7,53 (m, 2H, H-3 e H-5 ) e δ 7,51 (m,

5 1H, H-4 )], além de sinais para três grupos metoxilas [δ 4,00 (s, Me-5), δ 3,93 (s, Me-6) e δ 3,99 (s, Me-7)]. Estes valores são referentes ao componente principal. Na região espectral de 0.0ppm a 2.0ppm (Figura 2) observa-se a presença de sinais cujos valores de deslocamentos químicos e multiplicidade são condizentes com a presença de esqueleto de ácido graxo saturado de cadeia longa. Como essa substância não é de interesse no material estudado sua estrutura não foi proposta. ácido é um componente minoritário na amostra, sua presença e a de algumas impurezas são indicativos de que a amostra trata-se de uma mistura. Esta mistura foi submetida ao experimento DSY para separar as substâncias presentes, de acordo com o coeficiente de difusão de cada uma. Me Me A 2 3 2' B 6' 4' Me Figura 2- Espectro de RMN - 1 H para a JMZtCC (68-72), em CDCl 3. Experimento foi realizado com 16 pulsos. Para se obter o espectro DSY 2D da amostra JMZtCC (68-72) (Figura 4) foi necessário a execução de sete experimentos DSY 1D (Figura 3) a partir do espectro de RMN 1 H (Figura 2) utilizando os parâmetros apresentados na Tabela 1.

6 Tabela 1 Parâmetros usados para a aquisição dos experimentos de DSY 1D para a JMZtCC (68-72). Parâmetros de Aquisição Experimentos g (gpz6)% δ (p30)µs Δ (d20)s 1 1 H (Fig. 2) DSY 1D 1% DSY 1D 95% DSY 1D 95% DSY 1D 95% DSY 1D 95% DSY 1D 95% DSY 1D 95% s espectros DSY 1D mostrados na Figura 3 estão dispostos para facilitar a comparação dos mesmos de acordo com os parâmetros utilizados para a aquisição dos dados. Foi possível observar que houve uma diminuição das intensidades dos sinais de acordo com a mudança de cada um dos parâmetros utilizados para a aquisição dos dados que, posteriormente, possibilitou a execução do experimento DSY 2D, cujo espectro é mostrado na Figura 4. espectro DSY 2D (Figura 4) foi obtido utilizando-se os parâmetros dos experimentos 2 e 8 (DSY 1D, Fig. 3). Utilizou-se a seqüência de pulso ledbpgp2s, aplicando-se de 1% a 95% como potência de gradientes, inicial e final, respectivamente, com 64 experimentos, cada um com 16 pulsos.

7 Figura 3 Espectros de RMN - DSY 1D dispostos de 2 a 8 para a JMZtCC (68-72) obtidos a partir dos parâmetros apresentados na Tabela 1. Figura 4 Espectro de RMN - DSY 2D obtido para a JMZtCC (68-72) a partir dos dados dispostos na Tabela 1, utilizados nos experimentos DSY 1D (2 a 8).

8 experimento DSY para a JMZtCC (68-72) permitiu a observação de uma pequena difusão entre os componentes da amostra. Apesar dos coeficientes de difusão dos componentes presentes na mistura terem valores próximos e a grande sobreposição de sinais, os deslocamentos químicos apresentados em F2 são os mesmos para o espectro de RMN 1 H. s sinais que correspondem ao componente principal apresentam coeficiente de difusão -9.1 m 2.s -1 em F1, enquanto que o sinal com coeficiente de difusão -8.7 m 2.s -1 corresponde ao solvente CDCl 3. coeficiente de difusão do ácido graxo foi encontrado como sendo -9.2 m 2.s -1. s espectros de 13 C, DEPT 90 e DEPT 135 evidenciaram a presença de 18 átomos de carbono sendo mostrados nas Figuras 5, 6 e 7 respectivamente. Dentre esses carbonos, existem oito não hidrogenados (C) [δ 161,37 (C-2), δ 177,53 (C-4), δ 152,75 (C-5), δ 140,60 (C-6), δ 158,01 (C-7), δ 154,78 (C-9), δ 113,12 (C-10) e δ 131,76 (C- 1 )], sete monohidrogenados (CH) [δ 108,58 (C-3), δ 96,47 (C-8), δ 126,19 (C-2 e C- 6 ), δ 129,18 (C-3 e C-5 ) e δ 131,50 (C-4 )] e três triidrogenados (CH 3 ) [δ 62,40 (Me-5), δ 61,76 (Me-6) e δ 56,51 (Me-7). Me Me A 2 3 2' B 6' 4' Me Figura 5 Espectro de RMN - 13 C para a JMZtCC (68-72), em CDCl 3, cuja seqüência de pulso utilizada foi zgpg30, com pulsos.

9 Figura 6 Espectro de RMN DEPT 90 para a JMZtCC (68-72). experimento foi realizado com pulsos. Figura 7 Espectro de RMN DEPT 135 para a JMZtCC (68-72). experimento foi realizado com pulsos.

10 s experimentos bidimensionais processados mostraram as correlações apresentadas na Tabela 2. Tabela 2 Correlações entre os átomos de 13 C e 1 H para a JMZtCC (68-72). C * 1 H (δ ppm) 13 C (δ ppm) DEPT 90 (δ ppm) DEPT 135 (δ ppm) HSQC (δ ppm) HMBC (δ ppm) CSY (δ ppm) 2-161, ,70 e 7, , ,70 e 6, , ,00; 6,70 e 6, , ,93 e 6, , ,99 e 6, , , , ,70 e 6, , ,70; 7,51; 7,53 e 7,90 - CH 3 6,70 s 108,58 108,58 108,58 ¹H (6,70) ,83 s 96,47 96,47 96,47 7,90 m - 2 J ~ 0,97 126,19 126,19 126,19 Hz 7,53 m - 3 J ~ 0,88 129,18 129,18 129,18 Hz 7,51 m - 4 J ~ 1,00 131,50 131,50 131,50 Hz 7,53 m - 5 J ~ 0,88 129,18 129,18 129,18 Hz 7,90 m - 6 J ~ 0,97 126,19 126,19 126,19 Hz CH 3 Me-5 4,00 s 62,40-62,40 Me-6 3,93 s 61, 76-61, 76 Me-7 3,99 s 56,51-56,51 C * : Carbono quaternário. ¹³C (108,58) ¹H (6,83) ¹³C (96,47) ¹H (7,90) ¹³C (126,19) ¹H (7,53) ¹³C (129,18) ¹H (7,51 ) ¹³C (131,50) ¹H (7,53) ¹³C (129,18) ¹H (7,90) ¹³C (126,19) ¹H (4,00) ¹³C (62,40) ¹H (3,93) ¹³C (61, 76) ¹H (3,99) ¹³C (56,51) - - 7,51; 7,53 e 7,90 7,51; 7,53 e 7,90 7,90 7,51; 7,53 e 7,90 7,51; 7,53 e 7,90 7,90 (C-6 ) 7,51 (C-4 ) e 7,53 (C-5 ) 7,53 (C-3 e C-5 ) 7,51 (C-4 ) e 7,53 (C-3 ) 7,90 (C-2 )

11 RMN - HSQC 1 J C-H Figura 8 Espectro de RMN HSQC para a JMZtCC (68-72), utilizando-se a seqüência de pulso hsqcetgpsi, com 2048 experimentos e 8 pulsos para cada experimento. RMN - HMBC 2-3 J C-H Figura 9 Espectro de RMN HMBC para a JMZtCC (68-72), utilizando-se a seqüência de pulso hmbcgplpndqf, com 2048 experimentos e 8 pulsos para cada experimento.

12 RMN - CSY 2-3 J H-H Figura 10 - Espectro de RMN - CSY para a JMZtCC (68-72), utilizando-se a seqüência de pulso cosygpmfph, com 2048 experimentos e 8 pulsos para cada experimento. Com o experimento CSY (Figura 10) foi possível estabelecer as correlações entre os hidrogênios que estão acoplados por 2-3 Ј H,H (acoplamentos geminais e vicinais, mensuráveis no espectro 1D). Eventualmente, sinais devidos a 4-6 Ј H,H são também visíveis (acoplamento a longa distância, raramente mensuráveis no espectro 1D) [1]. Todos os experimentos foram realizados à temperatura de 23 C, utilizando sondas de 5mm, de detecção direta e inversa.

13 A Figura abaixo mostra o espectro de RMN HMBC, representado pelos sinais em azul que ilustram o acoplamento direto dos carbonos 3, 8 e os carbonos das metilas com os seus respectivos hidrogênios, fenômeno que só deveria acontecer no experimento de RMN HSQC, cujo sinais aparecem em vermelho. Este acoplamento ocorreu devido ao forte valor das constantes de acoplamento entre os núcleos, em função de que parâmetros experimentais não foram ajustados para que esses sinais fossem cancelados. Me Me A ' 1' 3' B 6' 4' 5' Me Figura 11 - Espectro de RMN HMBC sobreposto pelo espectro de RMN HSQC para a JMZtCC (68-72). A análise conjunta dos dados espectrais até então discutidos permitiram propor para a substância codificada de JMZtCC (68-72) a seguinte estrutura de flavona: Me Me A 2 3 2' B 6' 4' Me Figura 12 Estrutura para a JMZtCC (68-72) 5,6,7-Trimetoxiflavona.

14 CNCLUSÃ Com a utilização da técnica difusional DSY foi possível realizar o estudo de misturas de substâncias químicas. Entretanto, é imprescindível que as substâncias em mistura possuam um grau de diferenciação estrutural, e ainda, que apresentem poucas sobreposições de sinais de RMN de 1 H. Assim como toda técnica de RMN, o DSY apresenta também suas limitações. Através da análise dos espectros uni- e bidimensionais foi possível fazer a elucidação estrutural para a substância codificada de JMZtCC (68-72). REFERÊNCIAS BIBLIGRÁFICAS 1. SILVERSTEIN, R. M.; Bassler, G. C.; Morril, T. C.; Identificação Espectroscópica de Compostos rgânicos, Pauletti, P.M., Bolzani, V.S., Young, M.C.M. (2003) Constituintes químicos de Arrabidaea samydoides (BIGNNIACEAE). Quim. Nova, 26, VIZZTT, L.; Tese de Doutorado, Universidade Federal de São Carlos, Brasil (2004). 4. Bruker, A Tutorial for TopSpin Version 1.3; DSY and Diffusion by NMR. 5. Kutney, J. P., Hanssen, H. W. (1971) 5,6,7-Trimetoxiflavone and 5,6,7,8,- Tetrametoxiflavone from Zeyhera tuberculosa. Phytochemistry. Palavras-chave: RMN, DSY, Elucidação Estrutural, Espectroscopia.