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1 Nome: RG: Assinatura: Código do Candidato: M01... Código do Candidato: M01 Leia com atenção antes de iniciar a Prova A duração da prova será de 3 horas. O candidato somente poderá ausentar-se da sala após decorridos 30 minutos do início da prova. Todas as respostas deverão ser escritas a CANETA AZUL OU PRETA, na folha de respostas oficial. O candidato deverá colocar o seu Código do Candidato em cada uma das folhas do caderno de prova no canto superior direito. O candidato não poderá levar a prova. Não haverá folhas de respostas sobressalentes. O candidato poderá levar apenas a Folha de Respostas - Rascunho. Boa Prova.

2 Código do Candidato: M01 CONHECIMENTOS ESPECÍFICOS 10 questões discursivas, valendo 1 ponto cada 1) Um dos efeitos importantes nas reações fotodinâmicas é o chamado photobleaching. Com relação a este efeito responda: a. Como esse fenômeno ocorre? (0,5 ponto) b. O photobleaching deve ou não depender da quantidade de oxigênio molecular livre presente na vizinhança? Justifique sua resposta. (0,5 ponto) 2) A fluorescência como ferramenta de diagnóstico de tecidos biológicos é usualmente obtida com excitação na região de 400 nm. a. Para esse comprimento de onda, quais são os principais absorvedores e fluoróforos biológicos presentes no tecido biológico? (0,5 ponto) b. Qual profundidade de análise aproximada empregando a técnica de espectroscopia de fluorescência pode ser obtida com essa excitação? (0,5 ponto) 3) Como poderia funcionar uma terapia fotodinâmica operando com excitação de dois fótons? Quais os principais limitantes do uso desta técnica para o tratamento de tumores? 4) Como o espectro da radiação de corpo negro, descrita pela lei de Plank, demonstra a existência dos quantum de luz? 5) Quando a radiação eletromagnética interage com a matéria (átomos, moléculas), desde o micro-ondas até o raio X, que tipo de fenômenos devem ocorrer considerando a absorção ou o espalhamento de energia? Explique brevemente cada um e sua importância. 6) Uma fonte de luz pontual irradia 40 W de energia, de forma isotrópica em todo espaço. Calcule como deve variar a intensidade de luz como função da distância até essa fonte. Qual é a amplitude do campo elétrico quando a intensidade for de 200 mw/cm 2? 7) Descreva resumidamente a óptica de um microscópio confocal e de um microscópio por absorção de dois fótons. Discuta as vantagens e desvantagens dos dois sistemas para uma amostra tecidual espessa. 8) (1 ponto) A transferência de energia ressonante do tipo Förster (FRET) é um mecanismo de transferência de energia não radiativo entre dois cromóforos. Um cromóforo emissor de luz (doador), inicialmente no estado eletrônico excitado, pode 2

3 transferir energia para outro cromóforo aceitador através de acoplamento de dipolodipolo sem decair radiativamente. A eficiência de transferência kt ET= ko+ kt depende da taxa de transferência k T =1/τ T e da taxa de decaimento radiativo do doador k o =1/τ o, em que τ T é um tempo típico de transferência e τ o é o tempo de vida do estado excitado do doador. De acordo com a teoria de Förster, a taxa de transferência k T é inversamente proporcional à sexta potência da distância r entre o doador e o aceitador através da relação k k ( R R) 6 =, sendo R o o raio de transferência de Förster, a T o o distância entre o doador e aceitador que corresponde a uma eficiência de transferência de 50%. 10 I(t) = I 1 e -t/τ T + I 2 e-t/τ ο Intensidade I (u.a) Tempo (ns) Figura 1. A técnica FLIM (do inglês, Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) produz imagem confocal em que cada pixel está associado um tempo de decaimento da fluorescência. Experimentos baseados em FLIM-FRET exploram o decréscimo do tempo de vida do doador através da eficiência da transferência de energia. A eficiência do processo FRET pode ser obtida, a princípio, da imagem de tempo de vida do doador. Na Figura 1 apresenta a curva de decaimento da fluorescência I(t) do doador (em escala 3

4 mono-log) de um experimento FLIM-FRET que envolve a interação de duas proteínas distintas, uma delas marcada com um cromóforo doador e a outra com um aceitador. A curva de decaimento resultante I(T) do doador pode ser aproximada pelo modelo de duas exponenciais (ver Figura), com uma componente com tempo de vida lento (fração de proteínas marcadas com doador sem interação) e outra componente rápida (fração de proteína com interação). Da curva de decaimento da fluorescência, estime a) (0,25 ponto) A eficiência E T do processo FRET; b) (0,25 ponto) O valor a razão ( R ) 6 o R ; c) (0,25 ponto) A razão N fret /N o entre o número de proteínas que interagem N fret e o número que não interagem N o ; d) (0,25 ponto) Dê valores típicos que definem um bom fluoróforo para uso como marcador para uso em um microscópio confocal por fluorescência comercial para: - Coeficiente de extinção (cm -1 M -1 )= ; - Eficiência quântica= ; - Deslocamento Stokes entre fluorescência e absorção (nm)= ; - Eficiência quântica de fotodegradação= ; -Faixa espectral de emissão (nm)= ; 9): (1 ponto) a) (0,5 ponto) A Figura 2 abaixo mostra o corpo de uma objetiva que contém gravado várias especificações importantes que, na sua maioria, são características essenciais indicadas por todos os fabricantes. Descreva sucintamente o significado de cada uma dessas características na ordem indicada. b) (0,5 ponto) Considerando condições ideais para um microscópio confocal, calcule a resolução lateral (FWHM) da objetiva acima. 4

5 Questão 3:(1 ponto) Características temporais de varredura de um microscópio confocal são esquematizadas na Figura 3a. A imagem de 33 µmx33 µm (512x512 pixels) foi feita com um laser pulsando com repetição de 40 MHz (Figura 3b). Determine: a) (0,2 ponto) Tempo por pixel; b) (0,2 ponto) Número de pulsos do laser por pixel; c) (0,2 ponto) A taxa de contagem de fótons por segundo; d) (0,2 ponto) Número de fótons coletados por pixel; e) (0,2 ponto) Todos os fótons coletados no intervalo de tempo 3617,55 µs<t<3623,40 µs pertencem a que pixel? Figura 3: 5

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