Métodos Físicos de Análise - RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR. Métodos Físicos de Análise. Métodos Físicos de Análise

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1 - RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR Prof. Dr. Leonardo Lucchetti Mestre e Doutor em Ciências Química de Produtos Naturais NPPN/UFRJ Depto. de Química de Produtos Naturais Farmanguinhos Fiocruz Docente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde Fiocruz Docente do Curso de Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica Farmanguinhos Fiocruz O que é e para que serve? - dá informação sobre o número de núcleos quimicamente não equivalentes (hidrogênios e carbonos, principalmente) - dá informação sobre o ambiente dos núcleos (estado de hibridização, átomos ligados etc) Fundamentos - o sinal para a RMN de 13 C é 10-4 vezes menor que o sinal para o 1 H - o sinal para o núcleo de 13 C apresenta apenas cerca de 1% da intensidade do sinal do núcleo de 1 H devido às propriedades magnéticas e à sua abundância natural de 1,1% - sinais de 13 C ocorrem em uma faixa muito maior que os de 1 H, facilitando a identificação e contagem dos núcleos individuais Spins nucleares são orientados randomicamente na ausência (a) de um campo magnético externo; na presença de um campo externo B 0, apresentam orientação específica (b) Alguns spins nucleares são alinhados paralelamente ao campo externo Orientação de mais baixa energia Maior probabilidade Alguns spins nucleares são alinhados de forma antiparalela ao campo externo Orientação de energia mais alta Menor probabilidade 1

2 Quando os núcleos são alinhados paralelamente a um campo magnético externo são irradiados com uma determinada frequência de radiação eletromagnética, a energia é absorvida e os núcleos têm seus spins deslocados a um alinhamento antiparalelo de mais alta energia Núcleos que são submetidos a este deslocamento em resposta à radiação aplicada são considerados como ressonantes A frequência necessária para a ressonância depende da força do campo externo e da identidade dos núcleos. A diferença de energia E entre os estados de spin nucleares depende da força do campo magnético aplicado Muitos núcleos exibem o fenômeno da ressonância: Todos os núcleos com número ímpar de protons Todos os núcleos com número ímpar de neutrons Núcleos com número par de tanto protons como neutrons não apresentam ressonância 2

3 Não é possível exibir esta imagem no momento. A frequência de absorção não é a mesma para todos os núcleos de 1 H e 13 C Núcleos nas moléculas são cercados por eletrons Eletrons geram pequenos campos magnéticos locais que atuam em oposição ao campo aplicado, blindando os núcleos do efeito do campo externo O campo efetivo realmente sentido pelo núcleo é o campo aplicado reduzido pelos efeitos de blindagem locais Cada núcleo quimicamente distinto em uma molécula está em um ambiente eletrônico diferente e, consequentemente, em um campo efetivo diferente Cada núcleo quimicamente distinto de 13 C ou 1 H em uma molécula experimente diferentes campos efetivos e exibirão sinais diferentes para a RMN de 13 C ou 1 H Β efetivo = Β aplicado Β local 1 H, 25 o C, 60MHz no estado mais baixo no estado mais alto 9 núcleos = população em excesso RMN! 200MHz = MHz = MHz = 96 Preocupação com a água! Concentração da água em solução aquosa: ~100 M Concentração de amostra: tipicamente 1 mm! Vários problemas de faixa dinâmica (fator de )!!! Originalmente achava-se que a RMN de biomoléculas em solução aquosa não era possível 3

4 Adquirindo o espectro... Amostra: mg, nm, fg; sólida ou líquida Solventes deuterados: D 2 O Py-d 6 DMSO-d 6 CD 3 OD MeCO-d 6 CDCl 3 Uso de referência: TMS Operação esquemática de um espectrômetro de RMN 300 MHz NMR 900 MHz NMR 4

5 Informações do espectro de RMN 1 H: 1. Número de sinais: quantos tipos diferentes de hidrogênios há na molécula. 2. Posição dos sinais (deslocamento químico): que tipos de hidrogênios há na molécula. 3. Áreas relativas sob os sinais (integração): quantos hidrogênios de cada tipo há na molécula. 4. Padrão de desdobramento de sinais: quantos hidrogênios vizinhos há na molécula. Deslocamentos Químicos O gráfico de RMN 1 H O campo baixo, desblindado, fica à esquerda e precisa de uma força de campo menor para a ressonância O campo alto, blindado, fica à direita e requer campo com mais força para a ressonância A absorção do tetrametilsilano (TMS) é usada como referência Fatores que afetam o deslocamento químico ( 13 C): 1. Deslocamento afetado por átomos eletronegativos vizinhos Carbonos ligados a átomos eletronegativos absorvem em campo baixo (comparando aos respectivos alcanos) 2. Hibridização do carbono carbonos sp 3 geralmente absorvem de 0 a 90 δ carbonos sp 2 geralmente absorvem de 110 a 220 δ C=O absorvem de 160 a 220 δ 5

6 A maioria dos deslocamentos químicos em RMN 1 H ocorrem dentro da faixa de 0 a 10 δ, exceto para hidroxilas de ácidos carboxílicos (geralmente ocorrem entre δ) Deslocamento químico aumento do campo magnético em frequência fixa aumento da frequência em campo magnético fixo 6

7 7

8 Ambiente Químico e Deslocamento Químico Alguns fatores que afetam o deslocamento químico Efeitos estereoeletrônicos 1. Indutivos 2. Hibridação 3. Anisotropia magnética (mudança de propriedade física em função da direção) 4. Ressonância 5. Repulsão eletrônica 6. Densidade eletrônica 7. Efeito isotópico 8. Efeito do solvente 8

9 Efeito indutivo Diferença de eletronegatividade H 3 C-X X F OMe Cl N Br I C H δ 1 H 4,3 3,24 3,0 2,3 2,7 2,2 0,9 0,2 δ 13 C 75,4 49,3 25,1 28,3 10,0-20,7 5,7-2,3 Efeito indutivo Diferença de eletronegatividade Quanto mais substituído, maior o efeito indutivo Composto CHCl 3 CH 2 Cl 2 CH 3 Cl δ Efeito indutivo Diferença de eletronegatividade A influência do substituinte diminui com a distância Composto -CH 2 Br -CH 2 CH 2 Br -CH 2 CH 2 CH 2 Br δ

10 Tipo de hibridação Diferença de eletronegatividade e anisotropia sp 3 sp 2 sp δ 1 H 0,7 3, ,5 3 δ 13 C Repulsão eletrônica (WW) Compressão estérica e distorção de nuvens eletrônicas a b c d δ Ha > δ Hc δ 13 Cb < δ 13 Cd Repulsão eletrônica (WW) Compressão estérica e distorção de nuvens eletrônicas δ H = 0,92 δ H = - 1,40 10

11 Ressonância (a) Hα 6.2 ppm Hβ 6.8 ppm (b) Hα 6.2 ppm Hβ 4.6 ppm Campo elétrico δ = - 1,82 β β E = - 3,36 β β δ = - 5,18 Efeito de solvente CDCl 3 b a EFEITO DE SOLVENTE H-1 H-4 H-3 H-5 H-2 c H-7 c H-6a,b C 5 D 5 N b a 11

12 13 C: Influências nos deslocamentos - estado de hibridização do carbono - eletronegatividade de grupos ligados ao carbono carbono sp3 é mais blindado que sp2 um átomo eletronegativo desblinda o carbono ao qual está ligado Tipo de carbono Deslocamento químico (δ), ppm Tipo de carbono Deslocamento químico (δ), ppm RCH RC CR R 2 CH R 2 C CR R 3 CH R 4 C Tipo de carbono Deslocamento químico (δ), ppm Tipo de carbono Deslocamento químico (δ), ppm RCH 2 Br RCH 2 Cl RCH 2 NH RCH 2 OH RCH 2 OR O RCOR O RCR

13 Espectros de (a) RMN 1 H e (b) 13 C do acetato de metila. TMS: calibração Uma vez que os três hidrogênios em cada metila estão em um mesmo ambiente eletrônico, eles são blindados na mesma intensidade e são considerados equivalentes Núcleos quimicamente equivalentes sempre mostram a mesma absorção Os três hidrogênios em cada metila apresentam o mesmo sinal em RMN 1 H As duas metilas não são equivalentes: dois grupos de hidrogênios absorvem em posições diferentes Quando a frequência de radiação é mantida constante e a força do campo aplicado é variada, cada núcleo em uma molécula entre em ressonância em campos com força levemente diferente, permitindo o mapeamento da estrutura carbono-hidrogênio de uma molécula orgânica 13

14 O espectro de RMN 13 C do acetato de metila mostra três sinais, um para cada um dos três carbonos quimicamente distintos na molécula RMN requer mais tempo (cerca de 10-3 s) comparativamente ao IV (cerca de s) Se duas espécies que se interconvertem rapidamente estão presentes em uma amostra, o espectro no IV será único para ambas; porém, em RMN, será registrado um espectro da média esta característica pode seu usada para medir cinética de reações e a energia de ativação de processos muito rápidos 14

15 A área sob o sinal é proporcional ao número de protons que o geram Integrar (medir eletronicamente) a área sob cada sinal torna possível determinar o número relativo de cada proton na molécula A absorção de um proton pode se dividir em múltiplos sinais - multiplete O espectro de RMN 1 H NMR do bromoetano mostra quatro sinais (um quarteto) em 3.42 δ para os proton de CH 2 Br e três sinais (um triplete) em 1.68 δ para protons de CH 3 Absorções múltiplas, chamadas de desdobramento spin-spin, são causadas pela interação dos spins de núcleos vizinhos Pequenos campos magnéticos produzidos por um núcleo afetam os campos sentidos pelos núcleos vizinhos Se os protons se alinham com o campo aplicado, o campo efetivo sentido pelos vizinhos é levemente maior Se os protons se alinham contra o campo aplicado, o campo efetivo sentido pelos vizinhos é levemente menor 15

16 Regra do n + 1 Protons que apresentam número de vizinhos equivalente apresentam (n + 1) sinais em seus espectros de RMN 1 H Acoplamento spin-spin Sinal de RMN desdobrado S = 2nI + 1 S = MULTIPLICIDADE n = N o. DE ESPÉCIES VIZINHAS I = N o. DE SPIN I = 1/2 1 H, 13 C, 19 F, 31 P S = n + 1 n J a,b Multiplicidades 16

17 Triângulo Métodos Físicos de Pascal de Análise S = = 2 dupleto S = = 2 dupleto 17

18 S = = 3 tripleto S = = 2 dupleto S = = 3 tripleto S = = 4 quarteto S = = 2 S = = 2 Duplo-dupleto S = = 2 S = = 2 Duplo-dupleto S = = 2 S = = 2 Duplo-dupleto 18

19 !! dddd!! H-2 2 J H-2, F 3 J H-2, H-3b 3 J H-2, H-1 3 J H-2, H-3a 3 a 1 b 2 A origem do acoplamento spin-spin Tipo - X Tipo - Y Fatores que afetam o acoplamento spin-spin Ângulo de ligação Eletronegatividade Tensão de torção Comprimento de ligação Distância entre os átomos 19

20 Resumo do desdobramento spin-spin na RMN 1 H 1. Protons quimicamente equivalentes não apresentam desdobramento Os três protons C-H são quimicamente equivalentes não há desdobramento Os quatro protons C-H são quimicamente equivalentes não há desdobramento 2. O sinal de um proton com n protons equivalentes vizinhos é dividido em um multiplete de (n + 1) sinais com constante de acoplamento J Ocorre o desdobramento Desdobramento geralmente não observado Por que não há desdobramento em RMN 13 C? Porque a abundância natural baixa torna improvável que dois núcleos de 13 C sejam adjacentes na mesma molécula Não há acoplamento de spins carbono-hidrogênio A molécula é irradiada com um pulso de radiofrequeência para cobrir as frequências de ressonância dos carbonos e hidrogênios simultaneamente A inversão dos spins dos hidrogênios é tão rápida que a média de seus campos magnéticos locais é zero Constante de Acoplamento Distância entre os picos em um multipleto Denominado como J e medida em hertz (Hz) Geralmente situa-se na faixa de 0 a 18 Hz A mesma constante de acoplamento é compartilhada pelos grupos de hidrogênios cujos spins estão acoplados As constantes de acoplamento são independentes da força do campo do espectrômetro 20

21 EXEMPLOS Cannabis sativa Cannabis sativa 21

22 Cannabis sativa Cannabis sativa Cannabis sativa Fragmentação do 9 -THC (EI-MS) 22

23 Anfetaminas Anfetaminas Anfetaminas 23