INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR. Paulo Figueiredo

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1 INTRODUÇÃO À QUÍMICA ALIMENTAR Paulo Figueiredo

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3 To my father...

4 Índice Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica 1 Capítulo 2 Reactividade Química 10 Capítulo 3 Ligações Químicas 14 Capítulo 4 Cinética Química 17 Capítulo 5 Qualidade dos Dados Analíticos 20 Capítulo 6 Amostragem 24 Capítulo 7 Proteínas 26 Capítulo 8 Lípidos 41 Capítulo 9 Hidratos de Carbono 58 Capítulo 10 Água 70 Capítulo 11 Vitaminas e Minerais 79 Capítulo 12 Aditivos Alimentares 90 Capítulo 13 Contaminantes Alimentares 94 Capítulo 14 Aromas 102 Capítulo 15 Técnicas de Separação 105 Capítulo 16 Métodos Espectrométricos 126 Capítulo 17 Ensaios Imunológicos 146 Capítulo 18 Métodos de Análise em Biotecnologia 152 Bibliografia 156

5 Capítulo 1 Nomenclatura em Química Orgânica A química orgânica estuda os compostos que contêm átomos de carbono (Tabela 1.1). Apesar de existir um grande número de compostos orgânicos, estes são constituídos por uma relativamente pequena quantidade de partes semelhantes, combinadas de diversos modos, o que nos permite compará-los entre si. Estas partes são denominadas grupos funcionais. A identificação destes grupos funcionais e a capacidade de prever a reactividade de uma molécula, tendo como base as propriedades dos seus grupos funcionais, são uma das pedras basilares da química orgânica. Tabela 1.1 Compostos orgânicos Hidrocarbonetos Álcoois Éteres, aldeídos e cetonas Ácidos carboxílicos e ésteres Aminas e amidas Compostos aromáticos Grupos funcionais são átomos, iões ou grupos de átomos específicos com propriedades consistentes, caracterizados por possuirem uma composição elementar e ligações específicas, as quais conferem uma dada reactividade à molécula que os contém. Os principais grupos funcionais podem ser encontrados na Tabela 1.2. Um átomo de carbono saturado encontra-se ligado a 4 outros átomos e é designado como tetravalente. Hidrocarbonetos insaturados possuem uma ou mais ligações duplas (alcenos) ou triplas (alcinos) entre átomos de carbono. As moléculas orgânicas podem exibir diversos tipos de isomerismo. Isómeros conformacionais são formados por rotação das ligações simples C-C. Estereoisómeros são moléculas com o mesmo padrão de ligações, mas cujos átomos possuem diferentes arranjos espaciais. Existem 2 tipos de estereoisómeros: enantiómeros e diastereómeros. Enantiómeros são como imagens no espelho um do outro. Diastereómeros são isómeros que não são imagens espelhadas um do outro. 1

6 Tabela 1.2 Família química Grupo Fórmula Fórmula gráfica Exemplo Álcool Hidroxilo ROH Metanol Aldeído Aldeído RCHO Acetaldeído Alcano Alquilo RH n Metano Alceno Alcenilo R 2 C=CR 2 Etileno

7 Família química Grupo Fórmula Fórmula gráfica Exemplo Alcino Alcinilo RCɼCR Acetileno Amida Carboxamida RCONR 2 Acetamida Amina primária RNH 2 Metilamina Aminas Amina secundária R 2 NH Dimetilamina Amina terciária R 3 N Trimetilamina

8 Família química Grupo Fórmula Fórmula gráfica Exemplo Compostos azo Azo RN 2 R metilo Alaranjado de Ácido carboxílico Carboxilo RCOOH Ácido acético Éter Éter ROR Éter dietílico Éster Éster RCOOR Butirato de etilo Haleto de alquilo Haleto RX Cloroetano

9 Família química Grupo Fórmula Fórmula gráfica Exemplo Cetona Cetona RCOR Metil etil cetona Peróxido Peroxi ROOR Peróxido de di-tert-butilo Derivados do benzeno Fenilo RC 6 H 5 Cumeno Fosfato Fosfato ROP(=O)(OH) 2 Gliceraldeído 3-fosfato Tiol Sulfidrilo RSH Mercaptoetanol

10 Diz-se que os enantiómeros possuem quiralidade, ou seja não têm um plano de simetria, não podendo ser sobrepostos à sua imagem no espelho. Num composto orgânico, qualquer átomo ligado a 4 átomos ou cadeias diferentes pode ser considerado quiral. Fig. 1.1 Enantiómeros. A configuração dos compostos orgânicos pode ser descrita segundo três nomenclaturas, a actividade óptica, a configuração relativa (mais antigas e em desuso) e a configuração absoluta. Os isómeros ópticos recebem a designação (+) ou (-) consoante fazem rodar o plano da luz polarizada no sentido dos ponteiros do relógio (+) ou no sentido contrário (-). Também são utilizadas as designações dextrorotatório para o isómero (+) e levorotatório para o (-). A configuração relativa usa o gliceraldeído (o açúcar mais simples) como modelo e designa as moléculas que rodam o plano da luz no sentido dos ponteiros do relógio como D e as que a rodam no sentido contrário como L. De notar que não existe relação entre as notações (+)/(-) e D/L, pois esta última apenas refere se a estereoquímica do composto está relacionada com o enantiómero dextrorotatório ou levorotatório do gliceraldeído. Fig. 1.2 Configurações relativas do gliceraldeído. No caso dos aminoácidos existe uma regra empírica que facilita a atribuição da designação D ou L. Se os substituintes COOH, R, NH 2 e H estiverem dispostos à volta do carbono quiral no sentido contrário ao dos ponteiros do relógio, teremos um D-aminoácido; no caso contrário um L- aminoácido (Figura 1.3). 6

11 Fig. 1.3 Configurações relativas da alanina. Na nomenclatura de configuração absoluta, os centros quirais são designados R ou S, de acordo com um sistema em que é atribuída uma ordem de prioridades aos seus substituintes, baseada no seu nº atómico. Deste modo, não existe qualquer relação fixa com as duas outras nomenclaturas. Fig. 1.4 Notação R/S. A nomenclatura R/S só se aplica no caso de ligações simples. Para o caso de ligações duplas carbono-carbono, utiliza-se a notação cis/trans ou, preferencialmente, a mais recente E-/Z-. Fig. 1.5 Alcenos com configurações cis/trans. No caso de os dois átomos de carbono terem substituintes idênticos (Figura 1.5) a designação cis corresponde a Z e a trans a E. Já no caso de os substituintes serem diferentes, isso nem sempre corresponde à verdade. A nomenclatura cis/trans apenas deverá ser utilizada se ambos os átomos de carbono numa ligação dupla tiverem um átomo de H como substituinte. Na Figura 1.6 está exemplificada a aplicação da nomenclatura E/Z. Dividindo a ligação dupla em duas metades, atribuem-se prioridades (baseadas no nº atómico) a cada par de substituintes. No caso de os substituintes com 7

12 igual ordem de prioridade serem simétricos relativamente ao corte imaginário, a ligação será designada Z e se não forem simétricos E. Fig. 1.6 Aplicação da notação E-/Z- a alcenos. De uma forma simples, considera-se que dois estereoisómeros são diastereómeros se apenas um centro quiral diferir entre eles. Se uma molécula tiver apenas um carbono assimétrico (estereocentro), ela exibirá duas formas que serão imagens espelhadas uma da outra. Se a molécula tiver dois carbonos assimétricos, existirão quatro configurações possíveis, sendo impossível que as quatro sejam todas imagens no espelho umas das outras. Ou seja, quanto maior o número de centros quirais numa molécula, mais provável é a existência de confórmeros diferentes, e portanto de diastereómeros. O número de confórmeros possíveis numa molécula quiral é 2 n, onde n indica o nº de centros quirais Fig. 1.7 Diastereómeros. Os compostos aromáticos são um conjunto de moléculas estáveis, devido ao total preenchimento e baixa energia dos seus orbitais ligantes, possuindo 4n+2 electrões. As ligações electrónicas estão dispostas numa forma cíclica. A aromaticidade pode ser definida como uma propriedade química em que um anel conjugado de ligações não saturadas, pares de electrões ou orbitais vazias exibem uma estabilidade superior à resultante apenas do efeito de conjugação. Tal é devido à capacidade que os electrões têm de circular por todos os átomos, os quais estão ligados por ligações simples e duplas alternadas. Estas ligações podem ser consideradas como híbridos de ligações simples e duplas, sendo todas idênticas entre si. 8

13 A aromaticidade é regulada pela regra de Hückel, a qual diz que uma molécula, para ser considerada aromática, terá que possuir um nº par de electrões deslocalizados, mas esse número não poderá ser múltiplo de 4. A regra indica que uma molécula aromática terá 4n+2 electrões, em que n = 0,1,2,3, Fig. 1.8 Exemplos de moléculas aromáticas. Compostos cíclicos, com 4n+2 electrões (n = 1, 2, 3,...). 9

14 Capítulo 2 Reactividade Química Existem diversos mecanismos de reacções com compostos orgânicos, nomeadamente adição, eliminação, substituição e rearranjos. Muitas delas ocorrem em alimentos antes ou durante o seu processamento. Numa reacção de adição, 2 moléculas combinam-se para formar uma única molécula maior. Existem dois tipos de adição: electrofílica e nucleofílica. Uma adição nucleofílica é uma reacção em que existe a remoção de uma ligação pela criação de duas novas ligações covalentes. Habitualmente, os compostos aos quais é feita a adição possuem ligações carbono-carbono duplas ou triplas. Fig. 2.1 Reacção de adição electrofílica. Na adição nucleofílica, a ligação é removida pela criação de duas novas ligações covalentes pela adição de um nucleófilo (substância doadora de um par de electrões ligantes, numa ligação química). As reacções de adição nucleófila estão limitadas a moléculas com ligações múltiplas carbono-carbono ou carbono com outro átomo. Fig. 2.2 Reacção de adição nucleofílica. O oposto de uma reacção de adição é uma reacção de eliminação. Nestas reacções dois substituintes são removidos de uma molécula. A reacção pode dar-se num único passo (E2) ou em dois passos (E1). A eliminação bimolecular (E2) resulta na formação de uma ligação e os dois grupos de partida (habitualmente um hidrogénio e um halogénio) terão que ser coplanares. Neste caso, a quebra das ligações carbono-hidrogénio e carbono-halogénio dá-se num único passo. 10

15 Fig. 2.3 Exemplo de uma reacção de eliminação E2. Na eliminação unimolecular E1 ocorre em primeiro lugar um passo de ionização em que a quebra da ligação carbono-halogénio dá lugar à formação de um carbocatião. No passo seguinte dá-se a desprotonação do carbocatião. Fig. 2.4 Exemplo de uma reacção de eliminação E1. Numa reacção de substituição, um grupo funcional de uma molécula é substituído por um outro grupo. Podem existir diversos tipos de substituição, sendo as mais relevantes a substituição nucleofílica e a electrofílica. A substituição nucleofílica pode por sua vez ser alifática ou aromática, conforme a natureza da molécula que sofre a substituição. Neste tipo de reacção, um nucleófilo liga-se a um átomo com carga positiva ou parcialmente positiva. Este átomo (electrófilo) faz parte de um grupo de saída. Existem dois possíveis mecanismos numa substituição nucleofílica, S N 1 e S N 2, em que 1 e 2 representam a ordem da cinética reaccional. Numa reacção S N 2, a adição do nucleófilo e a eliminação do grupo de saída ocorrem em simultâneo. Uma reacção S N 1 ocorre em dois passos. Numa reacção de substituição electrofílica, um electrófilo desloca um outro substituinte, frequentemente um hidrogénio. Este tipo de substituição é característico de compostos aromáticos, embora também possa ocorrer em compostos alifáticos. Neste tipo de reacção, é um composto electrofílico que desloca um grupo funcional, podendo a reação ocorrer em dois passos (S E 1) ou num único passo (S E 2). No mecanismo S E 1, o substrato primeiro forma um carbanião e um resíduo orgânico com carga positiva. Segue-se uma rápida 11

16 recombinação do carbanião com o electrófilo. No mecanismo S E 2 existe um único estado de transição, no qual coexistem a nova ligação e a antiga. Fig. 2.5 Exemplo de substituição nucleofílica. Fig. 2.6 Sequência de passos numa substituição electrofílica. Existe um terceiro tipo de reacções de substituição, importante na química alimentar, a substituição radicalar, a qual envolve uma sequência de 2 ou 3 passos. No 1º passo, a iniciação, é criado um radical livre. No passo final, ou terminação, o radical reage com outra espécie radical, parando a cadeia reaccional. No caso de a reacção não terminar, o radical continua a reagir, originando novos radicais, disponíveis para novas reacções. Este passo intermédio é designado propagação. 12

17 Fig. 2.7 Mecanismo de reacção numa substituição radicalar. Quando uma molécula orgânica sofre uma alteração, de modo a originar um seu isómero estrutural, essa reacção é designada rearranjo. Fig. 2.8 Exemplo de uma reacção de rearranjo. 13

18 Capítulo 3 Ligações Químicas As ligações químicas são responsáveis pelas interacções de atracção entre átomos e moléculas. O conceito de ligação química está associado à partilha de electrões entre os átomos participantes na ligação. Os electrões sofrem uma atracção electromagnética dos núcleos atómicos, devido à diferença de cargas eléctricas. Na formação de ligações químicas, alguns electrões deslocam-se parcialmente de um átomo para outro(s). Esta deslocação é favorecida por uma redução do estado de energia, causada por um rearranjo das cargas, resultando numa redução da distância média entre os electrões de todos os átomos ligados e os seus núcleos. A transferência de carga provocada pelo movimento dos electrões, origina uma atracção electromagnética entre os átomos participantes na ligação. É a esta força atractiva entre átomos que se chama ligação química. As ligações químicas podem ser divididas em covalentes e iónicas. Nas primeiras, há uma partilha de electrões entre os átomos; nas segundas, um conjunto de átomos possui um excesso de electrões, enquanto o outro tem uma deficiência de electrões, havendo uma transferência de electrões entre núcleos atómicos. Numa ligação iónica existe uma atracção electrostática entre átomos ionizados. Fig. 3.1 Ligações químicas. 14

19 A teoria da ligação de valência diz que uma ligação química se forma quando dois electrões de valência, nos seus respectivos orbitais atómicos, colaboram para manter dois núcleos juntos, devido a um efeito de redução da energia do sistema. Esta teoria baseia-se em 6 princípios: 1. A ligação entre um par de electrões forma-se devido à interacção entre um electrão desemparelhado em cada um dos átomos. 2. Os spins dos electrões têm que ser opostos. 3. Uma vez emparelhados, os electrões não poderão participar noutra ligação. 4. A transferência electrónica envolve apenas uma função de onda por cada átomo. 5. Os electrões disponíveis no mais baixo nível energético formam as ligações mais fortes. 6. Entre dois orbitais atómicos, aquele que consegue uma maior sobreposição com um orbital de outro átomo formará a ligação mais forte, a qual tenderá na direcção do orbital concentrado. Fig. 3.2 Ligação de valência em BF 3 : 3 orbitais sp 2 do átomo de Boro sobrepostos a 3 orbitais p, um por cada átomo de Flúor. Uma teoria alternativa, para explicar a natureza das ligações químicas, é a teoria dos orbitais moleculares, a qual utiliza uma combinação linear de orbitais atómicos para formar orbitais moleculares, os quais cobrem a totalidade da molécula. Nesta teoria, os orbitais moleculares são divididos em orbitais ligantes, anti-ligantes e não ligantes. Se os electrões de um orbital tiverem maior probabilidade de se encontrar entre os núcleos atómicos que noutra posição qualquer, o orbital será ligante. No caso contrário, o orbital molecular será anti-ligante. Os orbitais ligantes reforçam a ligação e os anti-ligantes enfraquecem-na. Num orbital não ligante, os electrões encontram-se em orbitais mais próximos do núcleo e não influenciam a força da ligação química. 15

20 Fig. 3.3 Orbitais moleculares na molécula de hidrogénio (H 2 ). As duas teorias são hoje em dia consideradas complementares. As ligações covalentes e iónicas são ligações intramoleculares. As ligações formadas entre duas ou mais moléculas são designadas ligações intermoleculares. Exemplos comuns em química dos alimentos são interacções entre dipolos e ligações de hidrogénio. 16

21 Capítulo 4 Cinética Química A cinética química descreve a dependência da velocidade das alterações químicas em função de condições como a concentração dos reagentes, a temperatura, o ph e a força iónica. A velocidade da alteração é habitualmente representada como dependente das concentrações dos reagentes elevadas a uma potência. velocidade = k[a] x [B] y (4.1) Em 4.1, k é a constante de velocidade. A ordem da reacção (x+y) é igual ao nº de moléculas envolvidas no passo mais lento (o que determina a velocidade) da reacção. Em química alimentar, a generalidade das reacções são descritas por cinéticas de ordem 0 ou 1. Numa sequência de reacções, é o passo limitante que habitualmente determina a ordem da cinética. A velocidade de uma reacção é influenciada pelo estado físico dos reagentes e suas concentrações, pela temperatura à qual ocorre e pela presença ou não de catalisadores. Reacções ácidas, formação de sais e permutas iónicas são reacções rápidas. Pelo contrário, quando são formadas ligações covalentes ou grandes moléculas, as reacções tendem a ser lentas. Quando os reagentes estão no mesmo estado, o movimento térmico coloca-os em contacto mas, quando estão em diferentes fases, a reacção está limitada pela interface existente entre os reagentes. Segundo a teoria das colisões, as moléculas têm que colidir para reagirem. Nessa perspectiva, quanto maior a concentração dos reagentes, maior a frequência das colisões entre si. A frequência das colisões também aumenta com a temperatura. No entanto, existe uma mais importante dependência cinética da temperatura, dado que a energia térmica de uma molécula aumenta com a temperatura. Desse modo, ao aumentar a temperatura, aumenta o teor de moléculas de reagente com energia suficiente para reagir, ou seja energia mais elevada que a energia de activação (E a ). A energia de activação, expressa pela equação de Arrhenius (4.2) indica que a constante de velocidade (k) depende da temperatura T (em graus 17

22 Kelvin). Nesta equação, A é o factor de frequência e R a constante universal dos gases. E a k RT ln A (4.2) A velocidade de uma reacção químicapode ser alterada através da utilização de substâncias chamadas catalisadores. Um catalisador é uma substância que modifica o estado de transição de uma reacção, de modo a reduzir a energia de activação, aumentando a velocidade da reacção, mas não sendo consumido por esta. Fig. 4.1 Diferenças na energia de activação de uma reacção na ausência ( ) e na presença (----) de um catalisador. Enquanto a cinética química descreve a velocidade das reacções químicas, a termodinâmica química determina a extensão dessas reacções. Numa reacção reversível, alcança-se o equilíbrio químico quando as velocidades das reacções directa e inversa são iguais e as concentrações de reagentes e produtos deixam de variar. De uma forma geral, a variação de energia livre ( G) de uma reacção determina a ocorrência de uma transformação química e a cinética descreve a velocidade dessa reacção. Uma reacção pode ser fortemente exotérmica e ter uma variação de entropia positiva, mas na prática não ocorre porque é demasiado lenta. Se um reagente tiver capacidade de originar dois produtos diferentes, será formado o que for termodinamicamente mais estável, excepto em circunstâncias especiais, caso em que se diz que a reacção está sob controlo cinético. A energia livre de Gibbs é a energia, associada a uma reacção química, que pode ser utilizada para produzir trabalho. É definida pela equação (4.3) em que G é a variação na energia livre de Gibbs, H é a variação de entalpia, T a temperatura absoluta e S a variação em entropia. Quando G < 0 a reacção é 18

23 espontânea, se G > 0 a reacção é não espontânea e se G = 0 estamos em condições de equilíbrio (nem a reacção directa nem a inversa são favorecidas). G = H T S (4.3) A expressão 4.4 relaciona a constante de equilíbrio com a energia livre de Gibbs. G 0 representa a energia livre de Gibbs no equilíbrio. Keq 0 G e RT (4.4) 19

24 Capítulo 5 Qualidade dos Dados Analíticos É necessária uma atitude crítica relativamente aos resultados analíticos, de modo a compreender o seu significado e as suas limitações. A precisão depende do método utilizado e só pode ser melhorada até um certo ponto. Para obter um compromisso aceitável entre a qualidade dos resultados e o tempo do analista, é necessário conhecer a natureza e origem dos erros produzidos. Tal é possível através do uso de métodos estatísticos, tornados mais úteis devido à utilização conjunta de técnicas informáticas. Esta manipulação de dados é designada por quimiometria. Definem-se de seguida alguns conceitos básicos da quimiometria: Exactidão (accuracy) proximidade de uma medida ou resultado ao seu verdadeiro valor. Expressa em termos de erro. Erro a diferença entre o resultado verdadeiro e o resultado medido. Deve ser expresso como erro absoluto, a diferença real entre o verdadeiro valor e o valor medido, nas mesmas unidades. Por vezes apresentado como erro relativo, ou seja uma percentagem do valor medido relativamente ao verdadeiro. Média média aritmética de um conjunto de medidas (replicadas). Precisão a variabilidade de uma medida. Pode ser expressa em termos absolutos ou relativos. O desvio padrão é o melhor indicador da precisão. Desvio padrão ( ) calculado a partir da expressão 5.2 em que x i é um resultado medido, N é o número de replicadas e x é a média dessas replicadas. Para um elevado número de amostras usa-se N e para um pequeno número (30 ou menos) usa-se N-1. 1 N i N x 2 (5.1) i 1 i 1 2 i N 1 s x x (5.2) N 1 Desvio padrão relativo (coeficiente de variação) usado para comparar precisões. 20

25 s 100 CV (5.3) x Variância é o quadrado do desvio padrão. A sua utilidade prática advém do facto de os valores serem aditivos s x y z s x s y s (5.4) z Fig. 5.1 Ilustração dos conceitos de excatidão e precisão. a) boa exactidão e boa precisão; b) boa precisão e má exactidão; c) boa exactidão e má precisão; d) má exactidão e má precisão. Consoante a sua origem, os erros podem ser classificados como determinados ou indeterminados. Os primeiros podem ser quantificados e corrigidos; os segundos são aleatórios, não podendo ser quantificados. Os erros têm como habitual origem: o operador, o equipamento ou o método. Podem ser detectados pela análise de brancos ou de padrões ou ainda análises independentes, utilizando métodos diferentes ou alternativos. Na avaliação da qualidade dos dados analíticos é importante conhecer a sensibilidade e o limite de detecção do equipamento. A sensibilidade está relacionada com a dimensão da variação do equipamento em resposta à variação na concentração do composto. Dá indicação da variação que se pode fazer na composição da amostra até ser notada uma alteração na resposta do equipamento. O limite de detecção é o menor incremento detectável com um determinado grau de confiança (geralmente 1%). Para avaliar a qualidade dos métodos utilizados e dos resultados obtidos deve proceder-se a uma análise estatística desses resultados. Um número mínimo de vinte e cinco replicadas deve ser usado, de modo a obter uma amostra estatisticamente representativa. Como este número é difícil de atingir, quer do ponto de vista prático, quer económico, terão que ser utilizados métodos estatísticos eficazes com menor número de dados. Os resultados são apresentados com um certo número de algarismos significativos. Num número, todos os algarismos conhecidos com rigor mais o primeiro algarismo incerto, constituem os algarismos significativos desse 21

26 número. Por exemplo, numa medida de g, com rigor de g, há cinco algarismos significativos. Se a medida fosse de g, teríamos três algarismos significativos, para o mesmo rigor, pois o 0 só é considerado significativo quando faz parte do número. Quando um resultado é obtido por adição ou subtracção de dois valores, os algarismos significativos são determinados a partir das incertezas absolutas. Considere-se a adição de e , cujo resultado é A incerteza surge no quarto algarismo, portanto o resultado deveria ser apresentado como No caso do resultado ser obtido a partir de uma multiplicação ou divisão, os algarismos significativos são determinados a partir da incerteza relativa do valor menos rigoroso. Nos dois valores anteriores, tem a maior incerteza relativa (12 ppm), logo o produto x = tem um desvio absoluto de x = Aqui a incerteza aparece no terceiro algarismo e o resultado deveria ser apresentado como Em análise quantitativa exige-se que uma medida analítica exiba uma proporcionalidade rigorosa e fiável relativamente à composição da amostra. Para estabelecer essa proporcionalidade, é necessário efectuar procedimentos de calibração. Numa calibração simples, é preparada uma gama de padrões, contendo diversas concentrações do analito em estudo. Estes padrões são analisados segundo um método padrão e é obtida uma curva de calibração sinal vs. quantidade do analito. A partir deste gráfico podem interpolar-se os valores das amostras desconhecidas. Fig. 5.2 Exemplo de uma curva de calibração. Uma boa curva de calibração deverá ser linear numa gama alargada de concentrações. Idealmente deverá passar pela origem, mas não é obrigatório que tal aconteça. 22

27 O coeficiente de correlação r define o ajuste dos dados a uma linha recta. É dado por r xi x yi y xi x yi y 2 2 (5.5) O valor de r deverá ser o mais próximo possível de ou , valores que correspondem a uma correlação perfeita. O coeficiente de determinação r 2 dá uma melhor percepção do ajuste dos dados. 23

28 Capítulo 6 Amostragem Dada a impossibilidade de analisar todos os componentes de um dado lote para avaliar a sua qualidade ou outros parâmetros, é seleccionada uma parte do todo e considera-se que esta porção é representativa da totalidade do produto. A obtenção de uma porção, ou amostra, representativa do todo, é designada por amostragem e a quantidade total da qual foi retirada a amostra é chamada população. Os dois objectivos primários da amostragem são o cálculo do valor médio de uma característica e determinar se esse valor médio respeita as especificações definidas no plano de amostragem. As regras para amostragem em alimentos específicos estão delineadas em guias como Official Methods of Analysis da AOAC International, de modo a poderem ser executadas pelos analistas em condições que validem os dados obtidos. Uma população ideal seria uniforme e idêntica em todas as circunstâncias, designando-se por homogénea. A amostragem em tal população é simples, podendo uma amostra ser tirada aleatoriamente, sendo os dados obtidos sempre representativos do todo. No entanto, a maioria das populações são heterogéneas, tendo a amostragem que ter tal facto em consideração. A amostra deve ser retirada de diversos locais numa população, para garantir a sua representatividade. Para líquidos deve agitar-se antes de retirar a amostra. Para sólidos, devem retirar-se amostras de vários pontos. O tamanho óptimo de uma amostra, para obter representatividade, pode ser determinado através de análise estatística, usando o teste de t. O tamaho da amostra depende da exactidão requerida. Se o tamanho de partícula da amostra for demasiado grande para a análise pretendida, ele terá de ser reduzido. A amostra poderá ser dividida em quartos e serem utilizados os dois quartos opostos. Muitas amostras requerem trituração para assegurar uma análise mais rigorosa. Existem diversos instrumentos para triturar alimentos, adaptados aos diversos tipos de amostras. A trituração de amostras húmidas pode provocar 24

29 perca de humidade e alterações químicas. A congelação ou a secagem das amostras pode reduzir estas percas e devem ser efectuadas sempre que possível. Por outro lado, o processo de trituração não deverá provocar aquecimento da amostra e o contacto da amostra com superfícies metálicas deverá ser evitado, se a amostra se destinar à análise de minerais. Um mau armazenamento das amostras pode também ser um factor de erro para os dados analíticos obtidos. As amostras devem estar protegidas dos factores ambientais (humidade, ar, luz, calor) que as possam afectar. Em alguns casos poderão ser utilizados conservantes para proteger amostras de alimentos. Muitos alimentos contêm enzimas, as quais podem causar degradação dos componentes a analisar. Por esse motivo, a actividade enzimática deve ser eliminada ou controlada antes da análise, através de métodos seleccionados de acordo com as características do alimento. Os métodos mais comuns são desnaturação e inactivação das enzimas a temperatura elevada ou limitação da sua actividade por congelação, podendo também ser utilizada a alteração do ph ou adição de agentes redutores no caso das enzimas com actividade oxidante. Os alimentos com teor elevado de gordura apresentam maiores dificuldades para preparação de amostras. A sua trituração é difícil, requerendo frequentemente prévia congelação e os lípidos insaturados são sensíveis à oxidação, necessitando armazenamento em vácuo ou sob atmosfera de azoto. Poderão ser-lhes adicionados antioxidantes, desde que não interfiram com a análise. 25

30 Capítulo 7 Proteínas As proteínas são grandes moléculas orgânicas, compostas por aminoácidos ligados entre si. Estas ligações peptídicas (Fig. 7.1) são formadas entre os grupos carboxilo e amino de dois aminoácidos adjacentes. Dos cerca de 500 aminoácidos encontrados na natureza, apenas 20 aminoácidos diferentes são capazes de formar proteínas. A composição em aminoácidos de uma proteína determina o valor biológico desta, de onde a importância do desenvolvimento de métodos analíticos que permitam a identificação dos aminoácidos resultantes da hidrólise de uma proteína. 10 ou 11 destes 20 aminoácidos não são sintetizados pelo organismo humano, sendo apenas adquiridos através da dieta, daí resultando a sua classificação como aminoácidos essenciais. Fig. 7.1 Reacção de condensação entre 2 aminoácidos, originando uma ligação peptídica. As diferentes características químicas destes aminoácidos (Fig. 7.2) estão na base da estrutura tridimensional das proteínas e da sua função. A estrutura das proteínas pode ser classificada como: primária uma sequência de aminoácidos secundária estruturas regularmente repetidas estabilizadas por ligações de hidrogénio. Adoptam a conformação de hélice alfa ou folha beta terciária formação de um núcleo hidrofóbico, estabilizado por pontes salinas, ligações de hidrogénio, pontes bissulfito e modificações pós-translacionais quaternária interacções entre várias proteínas Em função da sua estrutura, as proteínas podem ser classificadas como fibrosas ou globulares (Fig. 7.3). As proteínas fibrosas, apenas encontradas em animais, são insolúveis em água devido à sua estrutura secundária e possuem 26

31 funções de armazenamento ou usadas em tendões, músculos e ossos. As proteínas globulares são hidrossolúveis, devido a possuirem estrutura terciária e desempenham diversas funções nos organismos, entre as quais hormonal e enzimática. Fig. 7.2 Estruturas químicas dos 20 aminoácidos componentes das proteínas. As proteínas sofrem desnaturação quando expostas a temperaturas elevadas, alterações de ph, de força iónica ou de solvente e ainda a manipulações intensas, como por exemplo durante o processamento de alguns alimentos. A desnaturação proteica consiste na perca da sua estrutura. 27

32 Fig. 7.3 Estruturas proteicas. A análise de proteínas nos alimentos é relevante para a correcta rotulagem das embalagens, para a investigação das suas propriedades funcionais e para a determinação da sua actividade biológica. Existem métodos analíticos que podem ser aplicados quando se pretende determinar o teor proteico total, o teor de uma dada proteína, o teor proteico durante o isolamento e purificação de uma dada proteína, o teor de azoto não proteico, a composição em aminoácidos e o valor nutritivo de uma proteína. O método de Kjeldahl permite determinar o teor de azoto orgânico total de um alimento. Todos os compostos orgânicos são digeridos com ácido sulfúrico, na presença de catalisadores e o azoto orgânico total é convertido em sulfato de amónio. O material digerido é neutralizado com uma base e destilado numa solução de ácido bórico. Os aniões borato formados são titulados com uma solução padrão de ácido, obtendo-se o teor de azoto na amostra. Este 28

33 resultado pode ser relacionado com o teor proteico na amostra, através de um factor de conversão. As amostras usadas têm que ser trituradas e homogeneizadas. A digestão é feita com auxílio de catalisadores e resulta na formação de sulfato de amónio. O carbono e o hidrogénio presentes são convertidos em CO 2 e H 2 O. Proteína ɹ (NH 4 ) 2 SO 2 (7.1) Depois de diluir o material digerido com água, adiciona-se tiossulfato de sódio em meio básico, para neutralizar o ácido sulfúrico. A amónia formada é destilada numa solução de ácido bórico, contendo indicadores. (NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH ɹ 2NH 3 + Na 2 SO 4 + 2H 2 O (7.2) NH 3 + H 3 BO 3 ɹ NHŸ + H 2 BO (7.3) O ião borato (quantidade proporcional à de azoto) é titulado com uma solução padrão de HCl, permitindo calcular o número de moles de N na amostra, o qual é igual ao número de moles de NH 3, que por sua vez é igual ao de HCl. H 2 BO + H + ɹ H 3 BO 3 (7.4) Deve ser feito um branco para subtrair o teor de azoto dos reagentes daquele da amostra. Vol. ácido corrigido 14 g N %N = N HCl x x x 100 peso da amostra (g) mol (7.5) Nesta fórmula N HCl é a concentração de HCl em mol.l -1, o volume de ácido corrigido corresponde ao volume de HCl gasto para titular a amostra menos o gasto para titular o branco e 14 é a massa atómica do azoto. Utiliza-se um factor de correcção para converter a percentagem de azoto em percentagem de proteína. Como a maioria das proteínas contém 16% de azoto, normalmente esse factor é de 6.25 (100/16=6.25). Estão publicados factores de conversão específicos para diversos alimentos, encontrando-se alguns dos quais expressos na Tabela 7.1. Este é um método aplicável a todo o tipo de alimentos, barato e exacto mas algo lento e requer manipulação de reagentes corrosivos. O método de Kjeldahl tem sofrido modificações que permitem um aumento da sua eficácia e também uma automação ou semi-automação das medidas e também a sua utilização para medir teores na ordem dos g. 29

34 Tabela 7.1 Alimento Factor Ovos ou carne 6.25 Lacticínios 6.38 Trigo 5.70 Outros cereais e oleaginosas 6.25 Amêndoas 5.18 Amendoins 5.46 Coco 5.30 Um método alternativo, que também mede o azoto orgânico total, é o de Dumas. Neste processo, as amostras são pesadas e introduzidas num reactor de combustão. O azoto libertado é medido num cromatógrafo gasoso que lhe está anexo. O método de Dumas também se aplica a todos os alimentos, mas é mais rápido e permite automação, tendo ainda a vantagem de não utilizar reagentes perigosos. Para calcular o teor proteico dos alimentos é necessário recorrer aos mesmos factores de conversão usados no método de Kjeldahl. O teor proteico pode também ser determinado através da espectroscopia no infravermelho, tendo por base o princípio de que diferentes grupos funcionais numa amostra absorvem radiação a diferentes frequências. No caso das proteínas utilizam-se as bandas de absorção características das ligações peptídicas (6.47 m, nm, nm e nm), permitindo calcular a concentração proteica. Este método é aplicável a uma vasta gama de alimentos e as análises são rápidas, mas tem a desvantagem de requerer uma calibração prévia do equipamento, que poderá ser demorada. O método do biureto é um processo químico que permite determinar a concentração de proteínas num alimento, baseado no princípio de que substâncias contendo ligações peptídicas reagem com iões Cu 2+ em meio básico. A absorvância da cor produzida pode ser medida a 540 nm e a sua intensidade é prporcional à concentração de proteínas na amostra. O reagente do biureto (inclui sulfato de cobre, NaOH e tartarato de sódio e potássio, usado para estabilizar os iões Cu 2+ em meio básico) é adicionado a uma solução da proteína e após estabilização durante minutos à temperatura ambiente mede-se a absorvância relativamente a um branco do reagente. No caso de a mistura reaccional não se apresentar límpida é necessário efectuar uma centrifugação ou filtração da mesma, antes de ler a absorvância. Para obter a concentração proteica é necessário obter previamente uma curva padrão, usando para o efeito albumina do soro bovino (BSA). 30

35 Fig. 7.4 Método do biureto. À direita água com reagente do biureto; à esquerda alteração de cor produzida quando se adiciona o reagente a uma proteína. Este método pode ser usado para determinar concentrações de proteínas em cereais, carnes e soja e como método qualitativo em rações para animais. Este é um dos métodos mais simples para análise de proteínas, sendo mais barato e mais rápido que o de Kjeldahl e tem poucos interferentes. As principais desvantagens são uma menor sensibilidade que outros métodos e necessidade de pelo menos 2-4 mg de proteína. Para utilizar como método quantitativo é necessário comparar os valores obtidos com uma curva padrão. O método de Lowry é um procedimento que combina a reacção do biureto com a redução do reagente de Folin-Ciocalteau por resíduos de tirosina e triptofano das proteínas. Forma-se uma cor azulada que pode ser medida a 750 nm (elevada sensibilidade para baixas concentrações de proteína) ou a 500 nm (baixa sensibilidade para elevadas concentrações de proteína). As proteínas a determinar são inicialmente diluídas para garantir uma gama de absorvâncias apropriada, de seguida é-lhes adicionada uma solução de tartarato de sódio e potássio e carbonato de sódio. Após incubar 10 minutos à temperatura ambiente, adiciona-se uma solução de sulfato de cobre-tartarato de sódio e potássio-hidróxido de sódio, deixando-se de novo à temperatura ambiente durante 10 minutos. Adiciona-se o reagente de Folin-Ciocalteau, sendo a mistura incubada a 50 ºC durante 10 minutos. Lê-se a absorvância a 650 nm (modificação do método original) e comparam-se os valores obtidos com os de uma curva padrão obtida com BSA. É um método muito sensível e mais específico que a maioria dos outros e é bastante rápido, no entanto apenas funciona com proteínas previamente extraídas do alimento e pode ser afectado pela presença de interferentes como sejam alguns açúcares, lípidos e tampões. 31

36 O método de Bradford é outro método colorimétrico para determinação do teor proteico, baseado na mudança de cor de um reagente (azul brilhante de Coomassie) de vermelho para azul, quando se liga a proteínas. O seu máximo de absorvância muda de 465 nm para 595 nm e a intensidade a este último comprimento de onda é proporcional à concentração de proteína na amostra. Este método, tal como outros semelhantes, tira partido da natureza anfotérica das proteínas. Quando a solução que contém a proteína é acidificada a um ph inferior ao valor do seu ponto isoeléctrico (pi) o pigmento forma uma ligação electrostática. Para efectuar a determinação de proteínas por este método, o pigmento é dissolvido em 95% de etanol e acidificado com 85% de ácido fosfórico, sendo de seguida adicionado a soluções contendo a proteína e um padrão (BSA). Lê- -se a absorvância a 595 nm contra um branco do reagente e a concentração da proteína é calculada a partir da curva padrão para a BSA. O método de Bradford é muito usado em purificação de proteínas, devido à sua rapidez, sensibilidade e existência de poucos interferentes. Alterações ao procedimento original permitem a determinação de g de proteínas. A capacidade que as proteínas possuem de reduzir iões Cu 2+ a iões Cu + é utilizada no método do ácido bicinchoninico (BCA) para a sua determinação quantitativa. O reagente BCA (sal de sódio do BCA, carbonato de sódio, NaOH e sulfato de cobre) é adicionado à solução de proteína, deixa-se incubar a 37 ºC durante 30 minutos (ou à temperatura ambiente durante 2 h ou ainda a 60 ºC durante 30 minutos) e lê-se a absorvância a 562 nm contra um branco do reagente. A quantificação é feita a partir de uma curva padrão obtida com BSA. O método pode ser adaptado para medir g. A sua principal desvantagem reside no facto de outros compostos com capacidade de reduzir o cobre (açúcares redutores, ) poderem interferir. As proteínas exibem uma forte absorvância a 280 nm, devido à presença dos aminoácidos triptofano e tirosina. Como o teor destes aminoácidos nas proteínas dos alimentos é razoavelmente constante, a absorvância a 280 nm pode ser usada para calcular a concentração de proteínas, através da lei de Beer. Como a composição das diversas proteínas é diferente, é necessário conhecer o seu coeficiente de extinção molar, de modo a determinar a sua concentração. Para proceder à análise, as proteínas têm que ser dissolvidas num tampão ou numa base, sendo aplicável com maior eficácia a proteínas previamente extraídas dos alimentos. Pode sofrer interferências da presença de ácidos 32

37 nucleicos, os quais também absorvem a 280 nm. É um método rápido e relativamente sensível. Não destruindo a amostra, pode utilizar-se a proteína para posteriores análises. A maioria das técnicas utilizadas para separação de proteínas explora as diferenças em tamanho, solubilidade e carga, as características de adsorção e a afinidade biológica para outras moléculas. A separação por precipitação explora as diferenças de solubilidade das proteínas. Estas são determinadas pelo tipo e carga dos aminoácidos componentes. As proteínas podem ser selectivamente precipitadas alterando o ph, força iónica, constante dieléctrica, ou temperatura. Este é um processo habitualmente utilizado nas fases iniciais de uma sequência de purificação e apresentam maiores vantagens quando se trabalha com grandes quantidades de material. Sais neutros podem ser usados para aumentar a força iónica do meio e precipitar proteínas. O mais usado é o sulfato de amónio, sendo alternativas NaCl, KCl ou outros. Este processo é designado salting out e desenrola-se em dois passos. Primeiro adiciona-se (NH 4 ) 2 SO 4 numa concentração ligeiramente inferior à necessária para precipitar a proteína (quando a solução é centrifugada, as proteínas menos solúveis são precipitadas, enquanto a proteína de interesse permanece em solução) e depois adiciona-se (NH 4 ) 2 SO 4 até perfazer uma concentração imediatamente superior à necessária para precipitar a proteína de interesse (quando a solução é centrifugada, a proteína precipita e as outras mais solúveis permanecem no sobrenadante). O ponto isoeléctrico (pi) de uma proteína corresponde ao ph ao qual uma proteína em solução não possui carga. As proteínas formam agregados e precipitam a esse valor devido à não existência de repulsão electrostática entre elas. Como as proteínas possuem diferentes valores de pi, podem ser separadas ajustando o ph da solução. A solubilidade de uma proteína a um dado ph e força iónica depende da constante dieléctrica da solução. Esta propriedade serve de base à separação de proteínas por fraccionamento em misturas de água e solventes orgânicos. A adição de solventes miscíveis com água (etanol, acetona) reduz a constante dieléctrica da água e reduz a solubilidade da maioria das proteínas. Muitas proteínas desnaturam e precipitam quando aquecidas ou submetidas a valores de ph muito altos ou muito baixos. As proteínas que são estáveis a temperaturas elevadas ou a valores extremos de ph podem ser separadas das restantes. 33

38 A cromatografia de adsorção é usada na separação de proteínas, tendo por base a diferente afinidade das proteínas para a fasee estacionária ou para o eluente. As cromatografias de afinidade e de permuta iónica usam esta propriedade para separar proteínas. A cromatografia de permuta iónica é a técnica de separação de proteínas mais utilizada, sendo usadas sobretudo resinas aniónicas (com carga positiva). A proteína de interesse é adsorvida à resina sob condições tampão (força iónica e ph) que maximizem a afinidade da proteína para a resina. As restantes proteínas, tendo cargas diferentes, não são adsorvidas. As proteínas que ficam ligadas à resina são depois eluídas por alteração gradual do ph ou da força iónica do eluente. Na cromatografia de afinidade, a proteína é separada numa fase estacionária contendo um ligando covalentemente ligado ao suporte sólido. Os ligandos usados incluem inibidores enzimáticos, substratos enzimáticos, coenzimas, anticorpos e alguns pigmentos. A proteína é eluída sob condições tampão (ph, força iónica, temperatura e concentração proteica) que maximizem a ligação da proteína ao ligando. As restantes proteínas e outras moléculas que não se ligam ao ligando são eluídas. No final, a proteína ligada será eluída da coluna alterando as condições de ph, temperatura ou concentração do sal ou do ligando no tampão usado como eluente. Fig. 7.5 Separação de proteínas utilizando a cromatografia de afinidade. Esta técnica é muito eficaz na separação de proteínas, mas apresenta a desvantagem da necessidade de utilização de fases estacionárias caras. 34

39 Diversos métodos cromatográficos para separação de proteínas foram adaptados para utilização em sistemas de HPLC. As proteínas podem ser separadas com base no seu raio de Stokes, o raio médio da proteína em solução, o qual depende da conformação da proteína. Uma das técnicas que tem em conta essa propriedade para separar proteínas é a diálise. São utilizadas membranas semi-permeáveis, as quais apenas permitem a passagem de pequenas moléculas. Coloca-se uma solução contendo a proteína num tubo de diálise, o qual é colocado num grande volume de água ou de tampão, sob agitação suave. Os solutos de baixo peso molecular saem para fora do tubo, enquanto o tampão entra. Este método é simples mas demorado (12 h ou mais). Fig. 7.6 Separação de proteínas utilizando o processo de diálise. Um processo alternativo e mais rápido passa pela utilização de membranas de ultrafiltração, estando a sua utilização quase restrita a laboratórios de investigação. A cromatografia de exclusão molecular é outra técnica utilizada para separação de proteínas, esta baseada no seu tamanho. Uma solução contendo a proteína elui através de um suporte sólido poroso. As moléculas maiores que os poros são excluídas, atravessando rapidamente a coluna. As moléculas de menores dimensões são retidas nos poros, eluindo muito lentamente. Moléculas de tamanhos intermédios interagem parcialmente com o suporte e eluem a tempos intermédios. Deste modo, a ordem de eluição segue a diminuição do tamanho da molécula. Existem suportes com diversas dimensões de poro, podendo ser utilizados para fraccionar eficazmente proteínas. 35

40 Esta técnica também pode ser utilizada para calcular pesos moleculares de proteínas, fazendo eluir em conjunto proteínas de peso desconhecido e padrões de peso molecular conhecido. Um gráfico do volume de eluição para cada proteína em função do logaritmo do seu PM dá uma recta. A electroforese permite separar proteínas a partir de uma mistura complexa, por migração diferencial destas através de uma matriz sólida, à qual é aplicado um campo eléctrico. A técnica mais utilizada para separar proteínas é a electroforese de zona e os géis de poliacrilamida, as matrizes mais utilizadas. A separação depende da fricção da proteína na matriz e da sua carga, de acordo com: Mobilidade = tensão aplicada x carga da molécula fricção da molécula (7.6) Uma proteína apresenta carga negativa se o ph da solução for superior ao seu pi e carga positiva se o ph for inferior ao seu pi. A dimensão da carga e a tensão aplicada determinarão a extensão da migração da proteína num campo eléctrico. Quanto mais alta a tensão aplicada e mais forte a carga da proteína, maior a migração. A migração também depende do tamanho e forma da molécula, ou seja do raio de Stokes da proteína. Um aumento do raio de Stokes origina um aumento da fricção e uma redução da mobilidade. Deste modo, as proteínas mais pequenas tendem a migrar mais rapidamente. Finalmente, uma redução no tamanho do poro do gel provoca uma redução na mobilidade. Fig. 7.7 Separação de proteínas por electroforese em gel. Na electroforese não desnaturante, as proteínas são separadas na sua forma nativa com base na carga, tamanho e forma da molécula. Na electroforese com desnaturação (ou SDS-PAGE), utiliza-se um gel de poliacrilamida e um detergente aniónico (dodecil sulfato de sódio - SDS) para separar proteínas com base no seu tamanho. As proteínas, depois de reagir com um agente redutor (adicionado en conjunto com o detergente), ligam-se 36

41 ao SDS e adquirem carga negativa, sendo depois separadas em função do seu tamanho. Adiciona-se habitualmente um corante (azul de bromofenol) à solução contendo a proteína. Sendo uma molécula pequena, o corante migra à frente das proteínas e permite seguir o andamento da migração. Após concluída esta, o gel é corado de maneira a permitir a visualização das bandas das proteínas. A mobilidade relativa de cada proteína é calculada por comparação com a do corante. distância percorrida pela proteína R m = (7.7) distância percorrida pelo corante O peso molecular pode ser determinado por esta via, relacionando o R m de uma proteína com os R m de proteínas padrão, de PM conhecido. Traça-se um gráfico dos logaritmos dos PM dos padrões em função dos seus R m e usa-se esse gráfico para extrapolar os PM das proteínas desconhecidas. A focagem isoeléctrica é uma modificação da electroforese em que as proteínas são separadas, de acordo com a sua carga, num campo eléctrico aplicado a um gel, no qual se produziu um gradiente de ph. As proteínas migram para o local em que o ph do gel iguala o seu pi. Esta é uma das técnicas de separação de proteínas com melhor resolução. Fig. 7.8 Princípio de separação de proteínas por focagem isoeléctrica. A focagem isoeléctrica e o SDS-PAGE podem ser combinados na electroforese em duas dimensões, muito útil para separar misturas muito complexas de proteínas. As proteínas são primeiro separadas por focagem 37

42 isoeléctrica, com base na sua carga, sendo depois separadas por SDS-PAGE, segundo os seus tamanho e forma. Fig. 7.9 Electroforese em duas dimensões de proteínas. A electroforese capilar partilha dos mesmos princípios que a electroforese convencional, quando aplicada à separação de proteínas. A principal diferença é a utilização de um tubo capilar no lugar de um gel. O principal factor de separação é o fluxo electroosmótico gerado no interior do tubo. O sistema (Fig. 7.10) é composto por um tubo capilar, dois reservatórios com tampões, uma fonte eléctrica e um detector. As proteínas, depois de separadas são analisadas por detectores de absorção electrónica (os mais comuns), fluorescência ou condutividade eléctrica, semelhantes aos utilizados em HPLC. Fig Esquema de um equipamento de electroforese capilar. 38

43 Existem três variantes de electroforese capilar, aplicadas à separação de proteínas: electroforese capilar de zona, electroforese capilar com SDS e focagem isoeléctrica capilar. A electroforese capilar de zona é semelhante à electroforese em gel clássica, exceptuando que as proteínas são separadas no interior de tubos capilares cheios com um tampão do ph desejado. a parede interna do capilar possui carga negativa e atrai catiões do tampão para formar uma dupla camada iónica na interface entre o capilar e o tampão. Quando se aplica um campo eléctrico, esses catiões são atraídos para o cátodo e puxam as outras moléculas na mesma direcção. Isto permite que catiões, aniões e moléculas neutras sejam separadas numa única corrida. O fluxo elctroosmótico pode ser controlado por alteração do ph ou da força iónica do tampão. Na electroforese capilar com SDS as proteínas são desnaturadas e dissociadas na presença de SDS e de um agente redutor, sendo depois separadas no capilar. A focagem isoeléctrica capilar usa um gradiente de ph no interior do capilar para separar as proteínas. A análise de aminoácidos é usada para determinar quantitativamente a composição em aminoácidos de uma proteína. A proteína é primeiro hidrolisada para libertar os aminoácidos, os quais são depois separados por métodos cromatográficos e quantificados. As técnicas cromatográficas usadas são a permuta iónica, RP-HPLC e GC. A hidrólise é habitualmente feita na presença de HCl 6N durante 24 h, mas como os aminoácidos não têm um comportamento homogéneo nestas condições, é necessário proceder a alguns procedimentos especiais para prevenir a ocorrência de erros na determinação. O triptofano é completamente destruído durante a hidrólise, sendo necessário proceder a uma hidrólise alcalina seguida de cromatografia para o quantificar. Os aminoácidos metionina, cisteína, treonina e serina são progressivamente destruídos durante a hidrólise, portanto a duração desta influenciará os resultados obtidos. As percas de treonina e serina podem ser calculadas por hidrólise das amostras durante três períodos diferentes (24, 48 e 72 h, por exemplo). Pode ser feita uma compensação para a destruição de aminoácidos por extrapolação para o tempo zero, considerando que a degradação segue uma cinética de 1ª ordem. A cisteína e a cistina podem ser 39

44 convertidas em ácido cístico, mais estável, o qual é depois hidrolisado e cromatografado. Asparagina e glutamina são convertidos quantitativamente em ácido aspártico e ácido glutâmico, respectivamente, não podendo ser quantificados. Isovalina e leucina são hidrolisados mais lentamente, sendo por isso os seus valores calculados a partir de um hidrolisado com 72 h e, finalmente, a tirosina pode sofrer oxidação. A separação por cromatografia de permuta iónica utiliza um gradiente de ph e força iónica e pós-derivatização com nihidrina, para produzir formas coradas, as quais podem ser medidas espectrofotometricamente. Em RP-HPLC, a derivatização é feita antes da entrada na coluna, com feniltiocarbamil (ou outros compostos) e a quantificação é feita por um detector de absorção electrónica. A quantificação de cada aminoácido é feita com a ajuda de um padrão interno. Este padrão interno é, habitualmente, um aminoácido não encontrado nos alimentos, como a norleucina. 40

45 Capítulo 8 Lípidos Os lípidos podem ser descritos como substâncias solúveis em solventes orgânicos e incluem gorduras, óleos, ceras, colesterol, esteróis e as quatro vitaminas lipossolúveis (A, D, E e K). Os termos gorduras e óleos são usados para descrever triacilgliceróis, respectivamente no estado sólido e no estado líquido. Devido ao seu elevado grau de saturação, os triacilgliceróis de origem animal tendem a ser sólidos, equanto que os provenientes de peixes e plantas tendem a ser óleos. Fig. 8.1 Exemplos de diversos lípidos. Os triacilgliceróis são formados por uma molécula de glicerol esterificada com três ácidos gordos. Estes três ácidos gordos podem ser todos diferentes, todos iguais ou dois iguais e um diferente. O comprimento das cadeias dos ácidos gordos existentes nos triacilgliceróis naturais é variável, embora as estruturas com 16, 18 e 20 carbonos sejam as mais frequentes. Nos animais e nas plantas, os ácidos gordos possuem número par de átomos de carbono, mas alguns microrganismos são capazes de sintetizar ácidos gordos com número ímpar. Esta é a razão pela qual nos ruminantes se encontram ácidos gordos com número ímpar de átomos de carbono, pois as bactérias existentes no rúmen são capazes de os produzir. 41

46 Fig. 8.2 Estruturas de ácidos gordos saturados (lineares) e insaturados. Os ácidos gordos são ácidos carboxílicos com cadeias alifáticas mais ou menos longas, as quais podem ser saturadas ou insaturadas. Nos ácidos gordos insaturados, as ligações duplas (insaturações) podem ocorrer em configuração cis ou trans. Nos ácidos gordos cis, as cadeias exibem uma curvatura, restringindo a liberdade conformacional da molécula. Quanto maior o número de ligações cis, menor a flexibilidade. Já nos ácidos gordos trans, não se verifica esse efeito conformacional e as moléculas adoptam configurações semelhantes às dos ácidos gordos saturados. Fig. 8.3 Ácido oleico nas configurações cis e trans. Na natureza, a maioria dos ácidos gordos ocorre na configuração cis. Nos alimentos, uma fracção pode ocorrer em configuração trans devido ao processamento dos alimentos, como por exemplo na operação de hidrogenação que está na origem da produção de gorduras sólidas a partir de óleos alimentares. 42

47 Existem diversos sistemas de nomenclatura para os ácidos gordos insaturados: nome comum nomes habitualmente utilizados, não obedecendo a qualquer sistematização. Ex: ácido oleico nome IUPAC a contagem começa na ponta ácido carboxílico e as ligações duplas são designadas cis/trans ou E/Z. Nomenclatura sistemática. Ex: ácido (9Z)-octadec-9-enoico nomemclatura x cada ligação dupla é indicada por x, o que indica que a ligação dupla se encontra na xª ligação carbonocarbono, contando a partir da ponta do ácido carboxílico. Cada ligação dupla é precedida pela designação cis ou trans. Ex: ácido cis- 9 -octadecenoico nomenclatura n-x ( -x) indica que a ligação dupla está situada na xª ligação carbono-carbono, contando a partir da cauda alifática. A notação é muito comum na literatura, mas a IUPAC dá preferência à notação n. Ex: -9, n-9 números de lípidos na nomenclatura C:D, C designa o :número de átomos de carbono e D o número de ligações duplas. Ex: 18:1 O corpo humano é capaz de sintetizar todos menos dois dos ácidos gordos de que necessita. Estes dois, o ácido linoleico e o ácido -linolénico, considerados ácidos gordos essenciais, encontram-se amplamente distribuídos em óleos vegetais. Os fosfolípidos são semelhantes aos triacilgliceróis, com a excepção de que um dos grupos hidroxilo do glicerol está ligado a um grupo fosfato, o qual por sua vez se encontra ligado a um outro grupo orgânico (Fig. 8.1). Os ácidos gordos insaturados podem sofrer ataques por parte de agentes oxidantes levando à formação de flavours desagradáveis. Frequentemente, a oxidação ocorre através de reacções radicalares, nas quais se formam compostos intermédios, denominados hidroperóxidos, os quais se degradam a aldeídos e cetonas voláteis, que são os responsáveis pelo forte flavour final. O teor lipídico total de um alimento é habitualmente determinado a partir de métodos de extracção com solventes orgânicos. A polaridade dos solventes influencia a solubilidade dos lípidos e a quantificação dos mesmos. Para além destes métodos, outros baseados nas propriedades químicas e físicas, são utilizados para a determinação do teor em gordura dos alimentos. A preparação da amostra para análise de lípidos depende do alimento e dos lípidos presentes. Por tal razão, não existe um método único para a extracção de todos os tipos de lípidos em todos os alimentos. Um factor em 43

48 comum é a necessidade de preparar a amostra sob uma atmosfera inerte de azoto e a baixa temperatura, para minimizar reacções químicas, tais como a oxidação. Outros passos comuns, que contribuem para a eficácia do método analítico, são a remoção da água, a redução do tamanho de partícula e a separação dos lípidos ligados a proteínas e/ou hidratos de carbono. Uma parte significativa dos lípidos em certos alimentos (lacticínios, pão, farinha e produtos cárneos) está ligada a proteínas e hidratos de carbono, impedindo a sua eficaz extracção com solventes não polares. Antes da extracção, tais alimentos devem ser sujeitos a uma hidrólise ácida, de modo a quebrar ligações covalentes e iónicas. A amostra pode ser pré-digerida com HCl 3 N, a refluxo durante 1 h e pode adicionar-se etanol e hexametafosfato para facilitar a separação dos lípidos dos restantes componentes, antes da extracção daqueles por solvente. Os requisitos de um solvente para extracção de gorduras são uma elevada capacidade de dissolver lípidos e baixa ou nula para proteínas, aminoácidos e hidratos de carbono. O solvente a usar deve evaporar rapidamente e não deixar resíduos, possuir um ponto de ebulição relativamente baixo e não ser inflamável nem tóxico, tanto no estado líquido como no gasoso. Deve ainda ser não higroscópico e barato. Sendo difícil encontrar um solvente ideal, que preencha todos estes requisitos, opta-se pelo uso habitual de éter etílico e éter de petróleo, existindo ainda as alternativas de hexano e pentano. O éter etílico é um melhor solvente para gorduras que o éter de petróleo, mas é relativamente caro, apresenta maior risco de explosão e de incêndio, é higroscópico e forma peróxidos. O éter de petróleo é uma mistura de compostos (principalmente pentano e hexano) e é mais hidrofóbico que o éter etílico. É selectivo para lípidos mais hidrofóbicos, é mais barato, menos higroscópico e menos inflamável que o éter etílico. Utiliza-se frequentemente uma combinação de dois ou três solventes, para optimizar a extracção. É necessário utilizar uma razão solvente/soluto adequada para maximizar a extracção de lípidos dos alimentos. O método de Goldfish é um processo de extracção contínua por solvente, em que um solvente quente flui continuamente sobre a amostra contida num recipiente de cerâmica. O teor de gordura é obtido a partir da perca de peso da amostra ou por pesagem da gordura removida. Um método contínuo é mais rápido e eficaz que um semi-contínuo, mas pode resultar numa extracção incompleta. O cálculo da gordura é obtido a partir da equação

49 Peso de gordura = (proveta + gordura) - proveta (8.1) e a percentagem de gordura com base no peso seco por gordura na amostra/g % Gordura = x 100 amostra seca/g (8.2) Fig. 8.4 Um extractor de Goldfish. O método de Soxhlet é um exemplo de processo de extracção semi- -contínua, em que o solvente se acumula no recipiente de extracção durante minutos, envolvendo completamente a amostra, e depois é recirculado para o balão de aquecimento. O teor de gordura é medido a partir do peso da amostra inicial subtraindo a gordura perdida ou por pesagem da gordura removida. Fig. 8.5 Um extractor de Soxhlet. 45

50 Este é um método mais lento que o de Goldfish, mas permite uma extracção mais completa da gordura. No caso de amostras com mais de 10% de água, estas terão que ser previamente secas até atingirem um peso constante (~5 h). O cálculo do teor de gordura é também efectuado a partir da equação 8.2. O método de Mojonnier para extracção de gordura por solventes é um processo descontínuo em que a extracção é realizada com uma mistura de éter etílico e éter de petróleo num balão chamado de Mojonnier. A gordura extraída é seca até peso constante e exprime-se em percentagem por peso. Fig. 8.6 Extracção em balão de Mojonnier. Este método tem a vantagem de não exigir remoção prévia de humidade da amostra e aplica-se quer a alimentos líquidos quer a sólidos, mas requer a preparação diária de um branco de água destilada em duplicado, para efectuar os cálculos. O teor de gordura é dado por % Gordura = 100 x peso prato + gordura - peso prato - peso médio do resíduo do branco (8.3) peso amostra Existem dois métodos que utilizam interacções entre o solvente e a amostra a pressões e temperaturas elevadas, a extracção por fluidos supercríticos (SFE) e a extracção acelerada por solvente (ASE). Estes métodos apresentam a característica de reduzir o consumo de solventes orgânicos, com o consequente benefício ambiental. No caso de SFE, é completamente eliminado o uso de solventes orgânicos perigosos, sendo substituídos por um solvente inerte e não tóxico, como o CO 2. Quando submetido a condições de temperatura e pressão elevadas e ultrapassa o seu ponto crítico, passa a exibir propriedades de fluido supercrítico. Neste estado, a sua densidade facilita a extracção de gorduras, e as suas propriedades semelhantes às de um gás facilitam a sua remoção do extracto, no finnal da extracção. A sua densidade 46

51 pode ser alterada por variação da pressão e/ou temperatura, aumentando a selectividadde para componentes específicos. Fig. 8.7 Diagrama de fases de uma substância, ilustrando o estado supercrítico. Na extracção por fluidos supercríticos, a gordura extraída é precipitada, após separação do solvente, seca e quantificada como percentagem de gordura por peso da amostra. O teor em gordura é obtido através de peso gordura + recipiente - peso recipiente % Gordura = x 100 peso amostra seca (8.4) Um extractor supercrítico pode ser acoplado a um cromatógrafo gasoso, permitindo uma rápida e eficaz separação e quantificação dos componentes da gordura extraída. Fig. 8.8 Diagrama de um extractor supercrítico. 47

52 O método ASE não elimina completamente a necessidade de solventes orgânicos, mas reduz significativamente o seu consumo. A extracção de gordura ocorre a temperaturas muito superiores à do ponto de ebulição do solvente usado, aumentando a solubilidade e a difusão dos lípidos da amostra para o solvente, encurtando o tempo de extracção e a quantidade de solvente. Fig. 8.9 Funcionamento de um extractor ASE. A extracção pode funcionar em modos estático ou dinâmico, usando um solvente não polar. No modo estático, a extracção dá-se sem fluxo de solvente para o exterior, enquanto que em modo dinâmico, solvente fresco flui continuamente através da amostra. O solvente é separado, por evaporação, da gordura e esta é seca e pesada para quantificação. Esta é feita a partir da eq Os resultados são comparáveis aos obtidos por extracção em Soxhlet, com menor dispêndio de tempo e solvente. A extracção em modo dinâmico é mais rápida, mas usa mais solvente; o modo estático usa menos solvente mas é mais lento. A combinação dos dois métodos produz melhores resultados globais e é frequentemente utilizada. A extracção de lípidos pode também ser feita por métodos que não utilizam solventes, quer químicos quer instrumentais. No método de Babcock, adiciona-se H 2 SO 4 à amostra, num recipiente apropriado (garrafa de Babcock). O ácido digere as proteínas, produz calor e liberta a gordura. A gordura é isolada por centrifugação e adição de água quente e é medida volumetricamente na parte graduada da garrafa de Babcock, mas o resultado é expresso como percentagem de gordura por peso da amostra. O método não é capaz de determinar fosfolípidos nem é aplicável a alimentos contendo açúcar ou chocolate. 48

53 Fig Exemplos de garrafas de Babcock. O método de Gerber é semelhante ao de Babcock, mas utiliza ácido sulfúrico e álcool amílico. O ácido digere as proteínas e hidratos de carbono, liberta a gordura e liquefá-la devido ao calor gerado. Este método é mais simples e rápido que o de Babcock. O álcool amílico impede a queima dos hidratos de carbono, permitindo um uso mais amplo. Um outro método químico é o método do detergente, em que este reage com as proteínas formando um complexo, levando à quebra de emulsões e à libertação da gordura. A amostra é pipetada para uma garrafa de Babcock e adiciona-se um detergente aniónico, o qual dispersa a camada proteica que estabiliza a gordura, para a libertar. De seguida adiciona-se um detergente não iónico para separar a gordura dos restantes componentes. A gordura é medida volumetricamente e expressa como percentagem. O índice de refracção é característico para cada tipo de gordura, variando os valores com o grau e tipo de insaturação e teor de gordura. A gordura é extraída com um solvente (bromonaftaleno), e o índice de refracção do solvente é comparado com os índices de refracção da solução com a gordura extraída e da gordura, segundo a equação 8.5, em que V é o volume de bromonaftaleno, d a densidade da gordura, n o índice de refracção da gordura, n 1 o índice de refracção do bromonaftaleno, n 2 o índice de refracção da solução extraída e W o peso da amostra. % Gordura = 100 x Vd( n1 n2) W ( n n) 2 (8.5) Comparativamente com os métodos anteriores, os métodos instrumentais são, em geral, rápidos, não destrutivos, exigem pouca preparação da amostra e 49

54 consomem poucos reagentes. No entanto, alguns equipamentos são caros e é frequente a necessidade de curvas de calibração. A ressonância magnética nuclear (NMR) pode ser usada para medir lípidos de forma não destrutiva. É um método rápido e exacto, que permite um elevado grau de automação. Na quantificação e caracterização de lípidos em alimentos usa-se o NMR de baixa resolução, em que se obtém informação sobre a intensidade do sinal e tempo de relaxação da amostra sujeita ao campo magnético aplicado. Estes dados podem ser usados para determinar a quantidade de lípidos, o teor de lípidos sólidos e líquidos teores de água e óleo presentes. O NMR é aplicado no modo pulsado, em que o campo magnético é aplicado durante períodos muito curtos. Nesta modalidade, os sinais dos núcleos 1 H dos diversos componentes dos alimentos podem ser distinguidos através das suas relaxações nucleares. Os núcleos em fases sólidas relaxam muito rapidamente, enquanto que os protões em fases líquidas relaxam muito devagar. A intensidade dos sinais é proporcional ao número de núcleos de hidrogénio, ou seja ao teor de hidrogénio. Esta intensidade pode ser convertida em teor de óleo, usando métodos de calibração. Esta técnica permite medir teores de água e de óleo, teor de gorduras sólidas e razão sólido/líquido. A utilização de espectrometria de NMR exige que as amostras estejam a temperatura constante, já que é uma técnica cujo sinal varia com a temperatura. A absorção de raios X é um método rápido, que tem sido usado para análise de lípidos em carnes. Baseia-se no facto de que a absorção de raios X é maior em carne magra do que em carne gorda. A quantificação é feita por comparação com curva padrão obtida a partir de uma extracção com solvente. A medição da constante dieléctrica pode ser usada para determinar o teor lípidico de um alimento, tendo por base o princípio de que a constante dielétrica varia com o teor de óleo. Os valores medidos são comparados com os obtidos a partir de uma curva de calibração, preparada a partir de uma extracção com solventes. As gorduras originam uma absorção a 5.73 m, cuja intensidade é proporcional à concentração de gorduras na amostra. A espectroscopia de infra-vermelho é usada para determinar o teor de gorduras em alimentos, tendo por base essa propriedade, podendo o método ser utilizado durante o processamento dos alimentos, já que se trata de uma técnica não destrutiva. 50

55 As medidas de ultra-sons também são não destrutivas e podem ser usadas para determinar a composição de diversos alimentos, baseadas no facto de que os vários componentes possuem diferentes propriedades acústicas. As medidas são efectuadas a partir de modelos empíricos ou teóricos. O teor de óleo nas oleaginosas pode ser determinado a partir da medida da densidade das sementes e estabelecendo uma correlação entre esse valor e o medido para o teor de gordura através de um método de extracção por solventes. Por motivos de rotulagem, nutricionais ou outros é frequente haver necessidade de medir não apenas o teor em gordura total de um alimento mas também de caracterizar a sua composição lipídica. Parâmetros como o teor de colesterol, de ácidos gordos saturados e insaturados e mesmo o tipo de ácidos gordos presente são importantes para determinar a conservabilidade de um produto e influem no seu processamento. As amostras utilizadas para caracterização de óleos e gorduras devem ser preparadas sob condições que evitem a sua oxidação (exposição a calor, luz ou ar) e a presença de água e devem apresentar-se límpidas, sem sedimentos. A refractometria é uma das técnicas utilizadas para caracterizar gorduras, trabalhando a 20 ºC com óleos e às temperaturas a que as restantes gorduras se apresentam fluidas. O índice de refracção, para além de permitir uma análise qualitativa, devido a possuir um valor específico para cada substância, é proporcional à saturação do ácido gordo, podendo ser usado para medir o grau de saturação. Este método apresenta as desvantagens de ser influenciado pela presença de ácidos gordos livres, pela oxidação dos ácidos gordos e ser dependente da temperatura. Existem diversos métodos que permitem medir o ponto de fusão de uma gordura, com o objectivo de determinar a sua composição, sendo todos eles algo subjectivos quanto ao valor medido e, portanto, relativamente pouco rigorosos. O índice de iodo é uma medida do grau de insaturação. Define-se como a quantidade (em peso) de iodo absorvida por 100 g de amostra. Quanto maior a insaturação, mais iodo é absorvido, ou seja quanto maior o índice de iodo, maior o grau de insaturação. Uma amostra de óleo ou gordura é dissolvida num solvente apropriado e é-lhe adicionada uma quantidade conhecida de iodo (ou outro halogéneo). Dáse uma adição às ligações duplas (8.6). Adiciona-se uma solução de iodeto de potássio para reduzir o excesso de ICl e produzir iodo livre (8.7). Este iodo livre 51

56 é depois titulado com uma solução padrão de tiossulfato de sódio, usando amido como indicador, o qual muda de azul para incolor (8.8). ICl (excesso) + R-CH=CH-R ɹ R-CHI-CHCl-R + ICl (8.6) ICl + 2KI ɹ KCl + KI + I 2 (8.7) I 2 + amido + 2Na 2 S 2 O 3 ɹ 2NaI + amido + Na 2 S 4 O 6 (8.8) O índice de iodo é calculado a partir da equação 8.9, em que B é o volume de titulante usado para titular um branco, S o volume de titulante para a amostra, N a concentração de Na 2 S 2 O 3 (mol/1000 ml), W o peso da amostra e a massa de iodo (g/mol). B S xnx126.9 Índice de iodo x100 (8.9) W O índice de saponificação mede a quantidade de base necessária para saponificar uma determinada quantidade de óleo ou gordura. A gordura é tratada com uma base degradando-a em glicerol e ácidos gordos. O índice de saponificação é expresso como a quantidade de KOH necessária para saponificar 1 g de amostra. Este índice é uma medida do peso molecular médio dos triacilgliceróis presentes na amostra. Se este valor médio for dividido por 3, dá um peso molecular médio aproximado para os ácidos gordos presentes. Na prática, quanto menor o índice de saponificação, maior a cadeia dos ácidos gordos. Uma solução alcoólica com KOH em excesso é adicionada à amostra, aquecendo-se para saponificar a gordura. O KOH que não reage é titulado com HCl, usando fenolftaleína como indicador e o índice é calculado através da equação 8.10, onde B é o volume de titulante para o branco, S o volume de titulante para a amostra, N a concentração de HCl (mmol/ml), W o peso da amostra e 56.1 a massa de KOH (mg/mmol). B S xnx56.1 Índice de saponificação x100 (8.10) W As medidas de acidez das gorduras geralmente reflectem a quantidade de ácidos gordos hidrolisados dos triacilgliceróis. A percentagem em peso de um dado ácido gordo designa-se ácido gordo livre (FFA free fatty acid) e o índice de acidez define-se como a quantidade de KOH necessária para neutralizar os ácidos livres presentes em 1 g de óleo ou gordura. A percentagem de FFA é frequentemente referida a ácido oleico e calcula-se a partir de uma amostra de 52

57 gordura fluida à qual são adicionados etanol a 95% e o indicador fenolftaleína. Após titulação com NaOH, o valor é calculado usando V x N x 282 % FFA (como oleico) = x 100 W (8.11) em que V é o volume de NaOH usado para titular, N a concentração de NaOH, W o peso da amostra e 282 o peso molecular do ácido oleico. Numa gordura bruta, este valor é uma estimativa da quantidade de óleo que será perdida durante a refinação. Numa gordura refinada, um índice de acidez elevado indica uma incorrecta refinação ou degradação da gordura após armazenamento ou utilização. No caso de os ácidos libertados serem voláteis, o valor de FFA pode ser uma medida da rancidez hidrolítica. A percentagem de gorduras sólidas numa amostra pode ser determinada por NMR. A proporção de gorduras sólidas em alimentos (margarinas, cremes para barrar,...) tem importância no que se relaciona com as suas propriedades funcionais, tais como a textura. As gorduras podem sofrer processos de degradação, originando a produção de sabores e aromas indesejados, globalmente designados por ranço. A rancidez das gorduras pode provir da lipólise (rancidez hidrolítica) ou da oxidação lipídica (rancidez oxidativa). A lipólise designa a hidrólise dos triacilgliceróis. Quando os ácidos gordos que os compõem possuem cadeias curtas, a lipólise resulta na formação de compostos voláteis, frequentemente caracterizados por aromas desagradáveis. A oxidação lipídica (ou autoxidação) ocorre através de um mecanismo com radicais livres, o qual origina a produção de hidroperóxidos, que por sua vez sofrem degradação com produção de diversos produtos, incluindo aldeídos, cetonas, ácidos orgânicos e hidrocarbonetos. Existem diversos métodos que permitem a quantificação da oxidação lipídica em alimentos, a maioria dos quais requer a extracção de lípidos antes de efectuar a análise. O índice de peróxidos é um método titrimétrico, que parte do pressuposto que todos os compostos reactivos são peróxidos ou produtos análogos resultantes da oxidação lipídica. A amostra é dissolvida numa mistura de ácido acético e isooctano, à qual é adicionado um excesso de KI. O iodeto reage com os peróxidos, libertando iodo. Esta solução é titulada com tiossulfato de sódio, usando amido como indicador. 53

58 ROOH + KI ɹ ROH + KOH + I 2 (8.12) I 2 + amido (azul) + 2Na 2 S 2 O 3 ɹ 2NaI + amido (incolor) + Na 2 S 4 O 6 (8.13) O índice de peróxidos é então calculado a partir da equação 8.14, em que S é o volume de titulante usado para a amostra, B o volume de titulante para o branco, N a concentração de tiossulfato de sódio, W o peso da amostra e 1000 o factor de conversão de g para kg. ( S B) x N Índice de peróxidos = x 1000 W (8.14) Como este índice mede um produto transiente de oxidação (os peróxidos formados sofrem, também eles, degradação para formar outros produtos) quando se obtém um valor baixo, tal pode significar quer um início quer um estado adiantado de oxidação. Para distinguir entre os dois, deve medir-se o índice de peróxido em função do tempo, durante um certo período. Um valor de 0 indica uma gordura de elevada qualidade e um valor superior a 20 corresponde a uma gordura de má qualidade. Uma desvantagem na aplicação deste método a alimentos é a necessidade de uma amostra de 5 g de gordura ou óleo. O índice de p-anisidina calcula a quantidade de aldeídos e insaturados, formados como produtos secundários de oxidação de óleos e gorduras. Estes aldeídos reagem com a p-anisidina formando um composto corado, podendo ser medido espectrofotometricamente. O índice é obtido multiplicando por 100 o valor da absorvância a 350 nm, de uma solução contendo 1 g de óleo diluído para 100 ml de isooctano e p-anisidina. O índice totox indica a oxidação total de uma amostra através dos índices de peróxidos e de p-anisidina: Índice totox = índice de p-anisidina + 2 x índice de peróxidos (8.15) Este índice totox aumenta continuamente ao longo da oxidação. Os compostos orgânicos voláteis (VOCs) presentes nas gorduras e óleos estão associados ao seu flavour, qualidade e susceptibilidade à oxidação. Incluem-se neste grupo os produtos secundários da oxidação lipídica, responsáveis pelos sabores e aromas desagradáveis das gorduras e óleos oxidados. Entre os compostos habitualmente medidos incluem-se pentano, pentanal, hexanal e 2,4-decadienal. A medição, por GC, do hexanal no espaço de cabeça é uma indicação da extensão da oxidação. Os detectores habitualmente utilizados são o de ionização de chama (FID) ou de massa (MS) 54

59 e a quantidade de hexanal formada é calculada a partir da área do respectivo pico. Este método apresenta a vantagem de não exigir prévia extracção de lípidos. O ensaio do ácido tiobarbitúrico (TBA) mede um outro produto secundário da oxidação dos lípidos, o malonaldeído. Baseia-se na reacção de malonaldeído com o TBA para produzir um composto colorido, o qual é medido espectrofotometricamente. Como a reacção não é específica para o malonaldeído, os resultados são por vezes apresentados como medida de substâncias reactivas com TBA (TBARS). O ensaio pode ser feito directamente com o alimento, mas este sofre habitualmente uma destilação prévia, para eliminar interferentes e só depois se faz reagir o destilado com o TBA. A absorvância da solução é medida a 530 nm e os valores são convertidos, usando uma curva padrão, a mg de malonaldeído por kg de amostra. Alternativamente, o teor de malonaldeído pode ser medido através de uma análise do destilado por HPLC. O malonaldeído também é um produto transiente da oxidação, mas o ensaio do TBA apresenta melhores correlações com a avaliação sensorial da rancidez que o índice de peróxido. As ligações duplas dos lípidos passam de não conjugadas a conjugadas quando sofrem oxidação. Os compostos com ligações duplas conjugadas apresentam absorções características, podendo essa propriedade ser utilizada para identificar a existência de oxidação numa amostra. As amostras líquidas são pesadas e diluídas para um volume que permita obter um valor de absorvância entre 0.1 e 0.8. A absorvância é então medida a 232 nm (dienos conjugados) e 270 nm (trienos conjugados) contra um branco do solvente. O método dos dienos e trienos conjugados permite seguir as primeiras fases de uma oxidação, não existindo uma boa correlação em etapas mais adiantadas. A estabilidade de um alimento relativamente à oxidação pode ser determinada através de ensaios acelerados, os quais provocam artificialmente a rápida oxidação por exposição das amostras ao calor, oxigénio, catalisadores metálicos, luz ou enzimas. Estes ensaios partem da condição de que as reacções que ocorrem nestas condições artificiais são as mesmas que ocorrem em condições normais. 55

60 Um destes ensaios usa um forno a cerca de 60 ºC, no qual é colocado o óleo ou a gordura. O ensaio permite simular condições de armazenamento, mas num período muito mais curto. Actualmente designa-se por ensaio em forno de armazenamento e é uma actualização do ensaio em forno de Schaal. Um outro método mede o tempo necessário para que o oxigénio comece a desaparecer de um sistema fechado. Designado por bomba de oxigénio, este método usa um contentor hermeticamente fechado, ligado a um medidor de pressão. A amostra é colocada no seu interior e adiciona-se O 2 até alcançar uma pressão de ~690 kpa (100 psi). De seguida, coloca-se o contentor num banho de água a ferver. Mede-se o tempo que demora a atingir uma queda brusca de pressão, correspondente à rápida absorção de O 2 pela amostra. A fracção lipídica, presente num alimento, pode ser caracterizada pela sua composição em ácidos gordos, mono, di e triacilgliceróis, fosfolípidos, esteróis, pigmentos e vitaminas lipossolúveis. A cromatografia gasosa é ideal para a análise de lípidos, podendo ser utilizada para determinar a composição em ácidos gordos totais, distribuição e posição dos ácidos gordos, estabilidade e oxidação, detecção de adulterações e antioxidantes. Quando combinada com a espectrometria de massa, a cromatografia gasosa permite a identificação dos compostos separados. A cromatografia líquida (HPLC) também tem aplicações na análise de lípidos e a cromatografia em camada fina (TLC) usa-se em ensaios de rotina devido à sua simplicidade e baixo custo. O perfil em ácidos gordos de um alimento é determinado após extracção dos lípidos e análise do extracto em GC capilar. Para aumentar a volatilidade, os triacilgliceróis e os fosfolípidos são saponificados e os ácidos gordos livres resultantes são esterificados, formando ésteres metílicos (FAMEs). Fig Reacção de formação de ésteres metílicos de um ácido gordo, em meio básico. A maioria das gorduras e óleos naturais extraídos das plantas contém apenas ligações duplas cis (não conjugadas), mas os extraídos de fontes animais podem conter pequenas quantidades de ligações duplas trans. Estas ligações trans também podem resultar de processos como a oxidação, 56

61 extracção, aquecimento e hidrogenação. A determinação de isómeros trans pode ser efectuda por GC, mas também por espectrometria de infra-vermelho. A concentração de ácidos gordos trans pode ser medida a partir da absorção a 966 cm -1. Para obter um espectro de IV, a amostra terá que estar no estado líquido e os ácidos gordos terão que ser convertidos nos respectivos ésteres metílicos. Usa-se elaidato de metilo como padrão externo, para calcular o teor em compostos trans. Os métodos cromatográficos, HPLC e GC, são as técnicas mais recentes utilizadas para determinar mono, di e triacilgliceróis. Para quantificar colesterol num alimento, é necessário saponificar os lípidos extraídos da amostra. O colesterol, que fica na fracção não saponificada, é extraído e derivatizado para formar éteres trimetilsililados, que serão analisados por GC. No caso de alimentos cárneos e congelados, não é necessária a prévia extracção da gordura, podendo saponificar-se directamente a amostra. Os produtos de oxidação do colesterol podem se quantificados por GC, HPLC ou TLC. 57

62 Capítulo 9 Hidratos de carbono Designa-se por hidrato de carbono qualquer composto orgânico de fórmula (CH 2 O) n com n 3. Quimicamente, os hidratos de carbono são aldeídos ou cetonas, com diversos grupos hidroxilo ligados. Os hidratos de carbono simples, que não podem ser hidrolisados a açúcares mais simples são chamados monossacáridos. Fig D-glucopiranose, um monossacárido. Os monossacáridos são classificados de acordo com três características: a posição do grupo carbonilo, o número de átomos de carbono e a quiralidade. Se o grupo carbonilo é um aldeído, o monossacárido designa-se por aldose; se o grupo carbonilo for uma cetona, o monossacárido será uma cetose. Os açúcares simples com valores n de 3, 4, 5 e 6 são designados por trioses, tetroses, pentoses e hexoses. Cada átomo de carbono com um OH substituinte, exceptuando o primeiro e o último carbonos, são assimétrcos podendo exibir configurações R ou S. A nomenclatura D ou L tem em conta a orientação do carbono assimétrico mais afastado do grupo carbonilo. Numa projecção de Fischer, se o grupo hidroxilo está à direita da molécula, o açúcar será D e no caso oposto será L. Os grupos aldeído ou cetona de um monossacárido reagem reversivelmente com um grupo hidroxilo de outro átomo de carbono, formando um anel heterocíclico. Se o anel tiver cinco membros é uma furanose e se tiver seis uma piranose. Na forma cíclica, o átomo de carbono do grupo carbonilo (carbono anomérico) torna-se um centro quiral com duas conformações possíveis: o átomo de oxigénio pode ficar acima ou abaixo do plano do anel, 58

63 originando dois possíveis anómeros. Num anómero, o grupo OH do carbono anomérico fica situado no lado oposto do anel relativamente ao grupo CH 2 OH; num anómero, o CH 2 OH fica no mesmo lado do plano do anel relativamente ao hidroxilo do carbono anomérico. Fig. 9.2 A azul está representado o átomo de carbono mais afastado do grupo carbonilo (vermelho). Como o OH está à direita, este é um açúcar D. Fig. 9.3 Anómeros e da glucose. Nos açúcares simples, o grupo aldeído do carbono 1 pode sofrer uma hidrogenação, resultando na formação de um álcool polihidroxilado ou poliol. Alguns destes compostos ocorrem na natureza, podendo também ser produzidos industrialmente. Estes compostos possuem menor teor calórico, são melhor tolerados por diabéticos e não provocam formação de cáries, comparativamente com os açúcares normais. Os monossacáridos podem ligar-se uns aos outros, formando oligossacáridos ou polissacáridos. A ligação covalente entre dois monossacáridos designa-se ligação peptídica. Os oligossacáridos mais simples são os dissacáridos, como a lactose ou a sacarose. A sacarose não possui um carbono anomérico, sendo considerado um açúcar não redutor. Pelo contrário, a maioria dos monossacáridos e dissacáridos como a lactose têm capacidade de reduzir Cu 2+ a Cu + (teste de Fehling) sendo designados açúcares redutores. 59

64 Fig. 9.4 Sacarose, o dissacárido mais abundante na natureza. A partir de dez unidades monoméricas, os hidratos de carbono são habitualmente designados polissacáridos. Alguns dos polissacáridos mais importantes na natureza são o amido, a celulose e o glicogénio. O amido é uma mistura dos polissacáridos amilose e amilopectina em diferentes proporções. A celulose é um polímero linear de unidades de D-glucose ligadas por ligações (1ɹ4). Fig. 9.5 Cadeia de celulose, evidenciando as ligações de hidrogénio formadas entre as unidades D-glucose. O equivalente do amido nos animais é o glicogénio, também um polissacárido de glucose com funções de armazenamento. A pectina é um heteropolissacárido estrutural, encontrado nas plantas terrestres. A sua estrutura difere de planta para planta, nas diferentes partes das plantas e mesmo durante o desenvolvimento das plantas. Como os hidratos de carbono possuem uma elevada gama de solubilidades, os métodos de preparação de amostra para a sua análise são também variados. 60

65 Fig. 9.6 Esquema mostrando a estrutura fortemente ramificada do glicogénio. Para analisar os hidratos de carbono na maioria dos alimentos, efectua-se um primeiro passo de secagem (pode servir para determinar o teor de humidade). Após secagem, a amostra é finamente triturada e faz-se a extracção dos lípidos por Soxhlet, usando uma mistura 95:5 v/v clorofórmio/metanol. A extracção da fracção lipídica facilita a mais completa extracção de hidratos de carbono. Os produtos alimentares contêm frequentemente substâncias que interferem com as medidas de mono e oligossacáridos presentes. Por essa razão, a amostra, depois de seca e sujeita à extracção da fracção lipídica, é extraída a quente com 80% de etanol, na presença de carbonato de cálcio para neutralizar alguma acidez. Os hidratos de carbono são solúveis em solventes polares, mas outros componentes dos alimentos (polissacáridos, proteínas,...) são insolúveis em etanol quente a 80%. O passo de extracção é repetido, de modo a ssegurar uma completa extracção dos mono e oligossacáridos. O extracto ainda conterá outras substâncias, para além dos hidratos de carbono. Como estes são neutros e aquelas possuem carga, os contaminantes podem ser removidos por técnicas de permuta iónica. 61

66 A solução etanólica contendo o extracto é sujeita a secagem, num evaporador rotativo a ºC e o resíduo resultante é dissolvido num volume conhecido de água, para posterior análise. A determinação do teor total em hidratos de carbono pode ser feita tirando partido da reacção característica dos hidratos de carbono com ácidos fortes. Nestas condições (o efeito pode ser reforçado a temperatura elevada) produzem-se diversos furanos, os quais podem condensar entre si ou com outros produtos, originando substâncias de cor castanha e preta. Entre estes outros produtos que reagem com os furanos, contam-se os compostos fenólicos. O método mais utilizado para determinar hidratos de carbono totais é a condensação com o fenol em meio de ácido sulfúrico (método do fenol/ácido sulfùrico). Este método é simples, rápido, sensível, rigoroso e específico para hidratos de carbono. Prepara-se uma solução com os hidratos de carbono a determinar e um branco com água. Adiciona-se uma solução aquosa de fenol, mistura-se e adiciona-se ácido sulfúrico. A solução fica com uma cor amarelo- -alaranjada e a sua absorvância é medida a 490 nm. O método do fenol e outros usados para medir o teor de açúcares redutores não envolvem reacções estequiométricas, dependendo a extensão da reacção da estrutura do açúcar. Por este motivo, é necessária a utilização de curvas de calibração, frequentemente com D-glucose. O método mais utilizado para determinar teores de açúcares redutores é o método de Somogyi-Nelson. Este e outros métodos semelhantes podem ser usados em conjunto com métodos enzimáticos para determinar oligo e polissacáridos. Os métodos enzimáticos usam hidrolases específicas para converter oligo e polissacáridos em monossacáridos ou unidades repetitivas de oligossacáridos, os quais podem ser medidos pelos métodos usados para determinar açúcares redutores. O método de Somogyi-Nelson baseia-se na redução de Cu 2+ a Cu + pelos açúcares redutores. Os iões Cu +, por sua vez, reduzem um complexo de arsenomolibdato em ácido sulfúrico. A redução deste complexo origina uma cor azul intensa e estável, a qual pode ser medida espectrofotometricamente a 520 nm, contra um branco de água. Como a reacção não é estequiométrica, tem que usar-se uma curva de calibração para quantificar os açúcares redutores. Existem outros métodos baseados na redução, em meio alcalino, de Cu 2+ a Cu +. Nestas condições, o Cu + precipita na forma de Cu 2 O, de cor vermelho- -tijolo. O método de Munson-Walker é um deles, podendo o precipitado ser medido por gravimetria, por titulação com tiossulfato de sódio, por titulação com permanganato de potássio, por titulação na presença de azul de metileno 62

67 (método de Lane-Eynon) e por electrólise. Todas estas variantes requerem a utilização de curvas de calibração, devido à especificidade de reacção de cada açúcar. Em geral, é conveniente identificar cada hidrato de carbono presente e determinar as suas concentrações, para o que será necessário optar por outros métodos. HPLC é o método mais eficaz para a análise de oligo e monossacáridos, podendo também ser usado para análise de polissacáridos, após hidrólise destes. Como os hidratos de carbono possuem pk a elevados (12-14) em soluções com ph alcalino alguns grupos hidroxilo dos hidratos de carbono são ionizados, permitindo a separação em colunas de permuta aniónica. A sequência de eluição é geralmente alditóis, monossacáridos, dissacáridos e oligossacáridos de maior cadeia. A cromatografia de permuta aniónica é habitualmente utilizada em conjunto com detectores electroquímicos. As resinas de permuta catiónica podem ser usadas em alternativa, invertendo-se aqui a ordem de separação. A maior eficácia destas colunas está na separação de monossacáridos. HPLC também pode ser usada em fase normal para análise de hidratos de carbono. Usando fases estacionárias com grupos amino e fases móveis acetonitrilo/água conseguem separar-se os hidratos de carbono na ordem monossacáridos, alditóis, dissacáridos e outros oligossacáridos. Alguns açúcares reagem com os grupos amino e a fase estacionária vai perdendo eficácia, embora modificações recentes na fase estacionária permitam a regeneração da mesma. As colunas de fase reversa mostram alguma eficácia na separação de mono, di e trissacáridos, mas os monossacáridos tendem a coeluir com baixos tempos de retenção. A detecção em HPLC de hidratos de carbono pode ser feita por índice de refracção, detectores electroquímicos ou por derivatização pré e pós-coluna. Os detectores de índice de refracção podem ser aplicados a todos os hidratos de carbono e apresentam uma resposta linear numa ampla gama de concentrações, mas não são compatíveis com a utilização de gradientes. Os detectores de amperometria pulsada são utilizados em cromatografia de permuta aniónica e permitem a detecção quer de açúcares redutores quer de não redutores. 63

68 A derivatização dos hidratos de carbono pré-coluna ou pós-coluna permite aumentar a sensibilidade de detecção por detectores de absorção electrónica ou de fluorescência. A cromatografia gasosa permite a análise quantitativa e qualitativa de hidratos de carbono, com a limitação de que estes têm que sofrer uma derivatização (em dois passos) para serem convertidos em compostos voláteis. A detecção é habitualmente efectuada por detectores de ionização de chama (FID). O processo de derivatização é diferente para açúcares neutros e para amostras contendo ácidos urónicos. Vários métodos enzimáticos têm sido empregues para a determinação de hidratos de carbono, em particular do amido. Estes métodos apresentam a vantagem de serem frequentemente específicos para a substância a ser estudada. É recomendado que as amostras destinadas a serem determinadas por métodos enzimáticos sofram um tratamento prévio que permita a quebra de emulsões, precipitação de proteínas e absorção de cores. Este tratamento de Carrez envolve a adição de hexacianoferrato de potássio (K 4 [Fe(CN) 6 ]), seguida da adição de sulfato de zinco (ZnSO 4 ) e de hidróxido de sódio (NaOH). Na determinação enzimática de D-glucose, esta é quantitativamente oxidada pela enzima glucose oxidase a D-glucono-1,5-lactona e H 2 O 2. O peróxido de hidrogénio reage com um pigmento na presença de peroxidase e origina a formação de um composto corado, o qual é medido espectrofotometricamente, permitindo a quantificação da D-glucose. O único método de confiança para determinação do teor total em amido baseia-se na conversão total de amido em D-glucose por enzimas (amilases) e posterior determinação da D-glucose por uma enzima específica. Este método apresenta problemas de quantificação com o amido resistente (amido e produtos de degradação do amido que resistem à digestão no intestino delgado). Existem quatro tipos de amido resistente: a) amido preso em matrizes alimentares, fisicamente inacessível a amilases; b) amido que resiste à hidrólise enzimática devido à natureza dos seus grãos (amido de batata,...); c) amido que recristalizou após gelatinização (ex: batatas cozidas e arrefecidas); d) amido que foi estruturalmente modificado, de maneira a torná- -lo menos susceptível à digestão. O problema causado pelo amido resistente pode ser, em parte, solucionado por dispersão do amido em DMSO (dimetil sulfóxido) e posterior 64

69 conversão quantitativa em D-glucose por tratamento com -amilase, conseguindo-se assim a despolimerização e solubilização do amido. Fig. 9.7 Determinação enzimática da D-glucose. Para determinar o amido total, uma amostra é finamente triturada, colocada num tubo de ensaio e é-lhe adicionado etanol a 80%. Adiciona-se DMSO e agita-se vigorosamente. Aquece-se em água a ferver, retira-se do banho e adiciona-se uma solução de -amilase. Agita-se bem e volta a colocar- -se no banho de água. Ao fim de 5 minutos, o tubo é levado a 50 ºC, adiciona- -se tampão de acetato de sódio (ph 4.5) e amiloglucosidase. Agita-se e incuba- -se a 50 ºC. De seguida, o conteúdo do tubo é transferido para um balão volumétrico, ajustando-se o volume com água destilada. Após agitação vigorosa, retiram-se alíquotas, adiciona-se uma mistura de glucose oxidase/peroxidase (reagente GOPOD) e incuba-se a 50 ºC. Finalmente, mede- -se a bsorvância da amostra contra um branco do reagente GOPOD. Utilizam-se glucose e um amido com baixo teor de proteínas e lípidos como padrões, após determinação dos respectivos teores de humidade. Não existe um método oficial para determinação de pectina, mas existem alguns métodos publicados, baseados na sua precipitação com etanol, em alimentos em que é o único polissacárido presente. O ácido D-galacturónico é um elemento constante na composição das pectinas (frequentemente mais de 80%). As ligações dos ácidos urónicos são difíceis de hidrolisar sem degradação da molécula, pelo que os métodos que utilizam hidrólise ácida e cromatografia não são aplicáveis à análise de pectinas. 65

70 Um dos métodos usados faz saponificação da amostra em NaOH, seguida da sua acidificação e adição de Ca 2+, para precipitar a pectina. O pectato de cálcio precipitado é recolhido, lavado, seco e pesado. Define-se fibra dietética como a soma dos componentes não digeríveis de um alimento. Na sua maioria é composta de polissacáridos (celulose, hemiceluloses e lenhina). A fibra dietética é composta por uma parte de fibra solúvel e outra de fibra insolúvel. A fibra insolúvel é composta por celulose, celulose microcristalina usada como aditivo alimentar, lenhina, hemiceluloses presas na matriz linhocelulósica e amido resistente. Os restantes polissacáridos, incluindo diversas hemiceluloses, a maioria da pectina e a maioria das gomas/hidrocolóides compõem a fibra solúvel. O teor em fibra dietética de um alimento pode ser calculado por dois processos: gravimétrico e químico. Nos métodos gravimétricos, os hidratos de carbono digeríveis, lípidos e proteínas são removidos por catálise enzimática ou solubilizados selectivamente. A parte não digerida ou não solubilizada é filtrada e pesada. Nos métodos químicos, os hidratos de carbono digeríveis são removidos por digestão enzimática e os componentes da fibra hidrolisados em meio ácido. De seguida, medem-se os monossacáridos libertados, considerando que o seu teor corresponde ao teor de fibra. Todos os métodos usados para determinação de fibras incluem um passo de aquecimento a ºC (10 min a 3 h) para gelatinizar os grânulos de amido, tornando-os passíveis de ser hidrolisados. Só o amido resistente não será hidrolisado. As medidas de fibra requerem que as amostras sejam secas e finamente trituradas e funcionam melhor em amostras com menos de 10% de lípidos. Quando a amostra possui um teor lipídico superior, os lípidos são removidos por extracção com éter de petróleo ou hexano. A amostra é depois seca em estufa de vácuo a 70 ºC e triturada. As amostras não sólidas com menos de 10% de fibra devem ser analisadas após liofilização. Se tiverem mais de 10% de fibra, forem homogéneas, com tamanho de partícula suficientemente pequeno para permitir uma remoção eficaz de hidratos de carbono digestíveis e de proteína e possuirem um baixo teor de lípidos, podem ser analisadas sem secagem. Entre os métodos gravimétricos inclui-se o método para determinação de fibra bruta. Este é um método antigo, que foi utilizado até à década de 1970 para determinar o teor de fibra em alimentos para humanos. A fibra bruta é determinada por extracção sequencial da amostra com H 2 SO % e NaOH 1.25%. O resíduo insolúvel é recolhido por filtração, seco, pesado e incinerado, 66

71 de modo a corrigir para a eventual contaminação por minerais. Este método não tem em conta as hemiceluloses, pectinas e gomas/hidrocolóides, já que estes são solubilizados e removidos. Os métodos com detergentes ácido e neutro foram desenvolvidos para obter uma determinação mais correcta de fibra. O método com detergente ácido mede a lenhina e a celulose e o método com detergente neutro mede lenhina, celulose e hemiceluloses. Nenhum destes métodos permite medir pectinas ou gomas. No entanto, como os componentes não medidos estão geralmente presentes em muito pequenas quantidades, estes métodos são aceites para analisar rações para animais. O método gravimétrico de referência para medir fibras em alimentos para consumo humano faz a medida das fibras total, solúvel e insolúvel. Este método usa amostras secas, livres de lípidos e trituradas. As amostras são digeridas com -amilase, glucoamilase e protease, para remover amido e proteínas. A fibra insolúvel é recolhida por filtração e a fibra solúvel é precipitada por adição de etanol a 78% e depois recolhida por filtração. Este resíduo é lavado com etanol e acetona, seco na estufa e pesado. De seguida é analisado para verificar da existência de proteína e cinzas [fibra = peso do resíduo - (peso de proteínas + peso das cinzas)]. Para determinar os teores de fibra solúvel e insolúvel, depois do tratamento com glucoamilase, filtra-se a mistura sobre Celite (ajuda a filtração). A fibra insolúvel, retida no filtro, é lavada com água e o filtrado será a fibra solúvel. Para a precipitar, adiciona-se etanol a 95% e água. Após filtrado, o precipitado será lavado com etanol a 78%. No final, o resíduo de fibra (total, insolúvel ou solúvel) é lavado com etanol a 95% e acetona, seco em estufa e pesado. O teor de fibra tem que ser corrigido para a presença de proteínas e minerais complexados com constituintes das paredes celulares. Pode determinar-se o teor de amido resistente suspendendo o resíduo em KOH 2M. A base vai solubilizar o amido resistente, o qual é depois digerido com glucoamilase (após ajuste do ph a um valor entre 4.0 e 4.7). A glucose libertada é determinada por via enzimática ou colorimétrica. Durante todo este procedimento experimental, é necessário preparar brancos dos reagentes em duplicado, de modo a efectuar os cálculos (Fig. 9.8). 67

72 Fig. 9.8 Determinação dos teores de fibra total, insolúvel e solúvel. R1 R2 B = 2 P A (9.1) R1 R2 P A B %Fibra = 2 x 100 m1 m2 2 (9.2) Nas equações 9.1 e 9.2, B é o valor do branco, P o da proteína, A o das cinzas, m 1 e m 2 são os pesos das amostras em duplicado e R 1 e R 2 os pesos dos resíduos, também em duplicado. A fibra total é igual à soma da fibra insolúvel com a fibra solúvel. A fibra total também pode ser determinada directamente por pesagem do produto de digestão com glucoamilase, após adição de etanol a 95%, aquecido a 60 ºC e seguindo o procedimento usado para determinação da fibra solúvel. Nos métodos químicos, o teor em fibra é dado pela soma de todos os monossacáridos não provenientes do amido mais a lenhina. Os monossacáridos podem ser medidos por métodos colorimétricos ou cromatográficos (HPLC, GC). A soma das hexoses, pentoses e ácidos urónicos dá o teor total em polissacáridos. O principal método químico para determinação de fibra é o método Englyst-Cummings, no qual o amido é gelatinizado e digerido por enzimas. Os restantes polissacáridos são hidrolisados com ácido sulfúrico. Os açúcares neutros são determinados por cromatografia e os ácidos urónicos por colorimetria. Em alternativa, todos os monossacáridos podem ser medidos por colorimetria. 68

73 No método Englyst-Cummings, as amostras são misturadas com DMSO e aquecidas em água a ferver, de modo a gelatinizar o amido. O amido será digerido com pululanase e a proteína com pancreatina. A digestão do amido será completada pela adição de glucoamilase. A fibra será precipitada pela adição de etanol a 100% seguida de refrigeração. Por centrifugação separa-se o resíduo de fibra. Segue-se a lavagem da fibra com, sucessivamente, etanol, a 85% (2 vezes), etanol a 100% e acetona, em cada caso seguida de centrifugação. O resíduo final é seco e os polissacáridos presentes são hidrolisados por incubação em H 2 SO 4 concentrado a 35 ºC, posteriormente diluído para 2 M e a mistura aquecida em água a ferver durante 1 h. A fracção hidrolisada é usada para análise de açúcares, uma parte para determinação cromatográfica dos açúcares neutros e a restante para determinação de ácido urónico por colorimetria. O peso de fibra é dado pela soma dos açúcares neutros com o ácido urónico. Estes métodos são usados para determinar teores de fibra total. Quando se pretende determinar o teor de fibra insolúvel, substitui-se o etanol absoluto por um tampão de ph 7 e a fibra hidrossolúvel é extraída por aquecimento, durante 30 min, da mistura digerida em água a ferver. A fibra insolúvel é separada por centrifugação, lavada, seca e hidrolisada com ácido. O teor em fibra solúvel será obtido por subtracção do teor de fibra insolúvel da fibra total (fibra solúvel = fibra total fibra insolúvel). É possível determinar o teor em celulose na fibra total se não se efectuar o passo de hidrólise com H 2 SO 4 concentrado, passando directamente para a hidrólise dos restantes polissacáridos com H 2 SO 4 2 M. O peso dos monossacáridos resultantes desta hidrólise é igual ao peso dos polissacáridos não celulósicos e o teor em celulose é dado por fibra total polissacáridos não celulósicos. 69

74 Capítulo 10 Água A água é a molécula mais abundante na superfície terrestre e é o principal constituinte de muitos alimentos. Influencia directamente a sua degradação e a sua textura. É o meio em que ocorrem diversas reacções químicas e é um reagente nos processos hidrolíticos. É uma estrutura molecular simples. Cada átomo de hidrogénio está ligado covalentemente ao átomo de oxigénio através de um par de electrões partilhados. O oxigénio possui ainda um outro par de electrões não partilhados. A água é uma molécula polar, ou seja possui uma distribuição desigual da sua densidade electrónica. A molécula possui uma carga negativa parcial ( - ) perto do átomo de oxigénio, devida a um par de electrões não partilhados e cargas positivas parciais ( + ) junto dos átomos de hidrogénio. Fig Representação esquemática do dipolo formado por uma molécula de água. A molécula da água possui uma estrutura tetraédrica ligeiramente deformada. Cada molécula de água está coordenada com quatro outras moléculas de água através de ligações de hidrogénio. A estrutura da água é desestabilizada pela solubilização de sais ou moléculas com grupos polares e/ou hidrofóbicos. Esta estrutura tridimensional fortemente organizada está na base de muitas das propriedades invulgares da água, tais como a sua grande estabilidade e elevados pontos de fusão e ebulição. 70

75 A molécula de água pode sofrer uma auto-ionização, com a formação dos iões H 3 O + e OH -. 2H 2 O Ý H 3 O + + OH - (10.1) Fig Estrutura tetraédrica de moléculas de água, ligadas por pontes de hidrogénio. Sendo um processo reversível, pode definir-se uma constante de equilíbrio, K w. ' K w + - H3O OH (10.2) HO 2 Como [H 2 O] é constante, pode escrever-se K w =[H 3 O + ][OH - ]= Daqui deriva o conceito de ph=-log[h 3 O + ]. A água afecta a conservabilidade dos alimentos, não devido ao seu teor mas sim à sua actividade. A actividade da água (a w ) define-se como a pressão de vapor da água acima de uma dada substância dividida pela pressão de vapor da água pura, à mesma temperatura e varia entre 0 e 1. a w P (10.3) P 0 Na prática, a actividade da água descreve a quantidade de água em equilíbrio disponível para a hidratação de uma dada substância. Um valor igual a 0 indica a total ausência de moléculas de água livre disponíveis, enquanto que um valor de 1 indica água pura. A relação entre o teor de água e a actividade da água é indicada pelas isotermas de sorção da substância. Estas apresentam uma forma sigmóide, com 71

76 pequenas variações conforme a estrutura física, a composição química, a temperatura e a capacidade de retenção de água do alimento. Quando a w < 0.3, estamos na zona de absorção primária, onde as moléculas de água poderão estar ligadas a pontos de absorção primários (-COOH) que por sua vez se ligam a outras moléculas de água por pontes de hidrogénio. Para valores de a w entre 0.4 e 0.8, existe a possibilidade de reacções químicas e enzimáticas rápidas, devido ao aumento da concentração dos reagentes. Nesta zona, o crescimento de microrganismos é nulo ou muito rduzido. Acima de 0.9, as reacções químicas e enzimáticas podem ver a sua velocidade reduzida pela baixa concentração dos reagentes e haverão condições para crescimento microbiano. Fig Isotermas de sorção, mostrando as três diferentes zonas. O teor de humidade nos alimentos apresenta grandes variações, dependendo do alimento. Em função dessa variedade, são também vários os métodos disponíveis para a sua determinação. Dependendo da forma em que a água se encontra no alimento (livre, adsorvida ou água de hidratação) o método escolhido poderá medir mais ou menos da humidade presente. Durante a preparação duma amostra para determinação do seu teor em humidade, será necessário minimizar percas ou ganhos de humidade acidentais: reduzindo a exposição atmosférica; minimizando aquecimento por fricção durante a trituração da amostra; reduzindo o volume do espaço de cabeça no recipiente de armazenamento, para minimizar as percas por equilíbrio da humidade com o ambiente; reduzindo variações de temperatura. Os métodos mais simples para determinação do teor de humidade baseiam-se na secagem em estufa e medição da perca de peso. Nestes 72

77 métodos, a quantidade de humidade medida depende do tipo de estufa usada, das condições no interior da estufa, do tempo e da temperatura de secagem. Estes métodos têm por base o ponto de ebulição da água que é inferior aos da generalidade dos outros componentes alimentares. No entanto, alguns desses componentes degradam a 100 ºC, como o caso dos hidratos de carbono, libertando água (10.4). A água determinada nestes casos será sobreavaliada relativamente ao verdadeiro valor. C 6 H 12 O 6 ɹ 6C + 6H 2 O (10.4) Outras reacções, como por exemplo a hidrólise da sacarose (10.5), reduzem o teor de humidade medido. Sacarose + H 2 O ɹ Glucose + Frutose (10.5) Outros problemas, embora menos sérios, resultam da perca de componentes voláteis, contribuindo para a perca de peso da amostra. Por outro lado, pode ocorrer ganho de peso devido à oxidação de ácidos gordos insaturados e de outros compostos. Existem três tipos de estufas usadas para determinação do teor de humidade, estufas de convecção, com ventilação forçada e de vácuo. As estufas de convecção são as menos precisas, já que podem existir variações de temperatura no seu interior de ~10 ºC. Nas estufas de ventilação forçada essa variação é inferior a 1 ºC. As estufas de vácuo têm pequenas variações de temperatura no seu interior e a vantagem de eliminar a humidade interior. Fazendo a secagem sob pressão reduzida, é possível obter, num prazo mais curto, uma mais completa remoção de água e voláteis sem decomposição da amostra. Os recipientes utilizados para secagem de amostras são de diversas formas e materiais, podendo ter tampa ou não. As tampas impedem a perca de material durante o aquecimento. Sempre que possível, é aconselhável o uso de material descartável. Estes recipientes devem ser sempre manipulados com o auxílio de pinças, de modo a não deixar dedadas (iriam influir no peso) e devem ser sempre bem secos em estufa antes de serem utilizados. 73

78 Fig Estufa de vácuo, utilizada na determinação de humidade. Alguns alimentos tendem a formar crostas ou a aglomerar quando secos, conduzindo a resultados errados. Para impedir que tal suceda, mistura-se areia seca e previamente pesada. Usando estes métodos, os teores de humidade e de sólidos totais são calculados por peso da amostra húmida - peso da amostra seca %Humidade = x 100 peso da amostra húmida (10.6) peso da amostra seca %Sólidos totais = x 100 peso da amostra húmida (10.7) As amostras são secas durante um dado período de tempo e depois pesadas ou, em alternativa, são feitas secagens e pesagens sucessivas até serem obtidas duas medidas seguidas idênticas. A secagem por micro-ondas permite uma determinação rápida e precisa do teor de humidade. Os modelos mais recentes permitem um controlo da temperatura e alguns vêm equipados com uma balança no interior, permitindo seguir a perca de água durante a secagem. Alguns equipamentos combinam a secagem por micro-ondas com o efeito do vácuo, permitindo medições muito rápidas. A amostra tem que ser uniforme e colcada no centro do aparelho de modo a assegurar uma secagem uniforme e completa. Fig Medidor de humidade por micro-ondas. Uma alternativa para secagem rápida de alimentos é a secagem por radiação infra-vermelha. O teor de humidade em alimentos pode ser determinado por destilação, usando técnicas directas ou por refluxo. A humidade de um alimento é 74

79 codestilada com um solvente de ponto de ebulição superior e que seja imiscível com a água. Os métodos por destilação provocam menor degradação térmica dos alimentos do que a secagem em estufa a temperaturas mais elevadas. A destilação por refluxo é mais utilizada que a destilação directa. A destilação por refluxo usa um solvente menos denso que a água (o mais utilizado é o tolueno). O aquecimento leva à formação de uma emulsão, na forma de vapor, de água em tolueno. Quando o vapor sobe, dá-se condensação e a inversão da emulsão, com tolueno disperso na água. Ao arrefecer, a turvação vai desaparecendo lentamente. O processo é repetido até não se conseguir destilar mais água e o volume desta é medido. Fig Montagem para destilação por refluxo da humidade de um alimento. O método de Karl Fischer é um processo químico para determinação do teor de humidade, particularmente adaptado a alimentos que produzem resultados de má qualidade quando aquecidos ou submetidos a vácuo. Este método tem por base a reacção de redução de iodo por SO 2 na presença de água. 2H 2 O + SO 2 + I 2 C 5 H 2 SO 4 + 2HI (10.8) O método foi modificado de modo a incluir metanol e piridina num sistema que permita a dissolução do iodo e SO 2 : C 5 H 5 N. I 2 + C 5 H 5 N. SO 2 + C 5 H 5 N + H 2 O 2C 5 H 5 N. HI + C 5 H 5 N. SO 3 (10.9) 75

80 C 5 H 5 N. SO 3 + CH 3 OH C 5 H 5 N(H)SO 4. CH 3 (10.10) O I 2 em excesso que não reage com a água pode ser visualmente determinado. O ponto de viragem é vermelho-acastanhado e pode também ser determinado, com maiores sensibilidade e rigor, por potenciometria. Fig Titulador de Karl Fischer para determinação do teor de humidade. No método de Karl Fischer, adiciona-se directamente o reagente de Karl Fischer (KFR) se a humidade na amostra estiver acessível. No caso de não estar acessível, é necessário extraí-la primeiro com um solvente apropriado (metanol, ). Esse extracto será depois titulado com o reagente de Karl Fischer. Antes de efectuar o cálculo do teor de humidade numa amostra, é necessário determinar a equivalência de humidade no reagente de Karl Fischer (KFR eq ). Este valor representa a quantidade equivalente de humidade que reage com 1 ml de reagente de Karl Fischer. Como o valor de KFR eq varia com o tempo, a padronização terá que ser verificada antes de cada utilização. O valor de KFR eq pode ser determinado com padrões de água, água em metanol ou tartarato de sódio. Com tartarato de sódio, o valor de KFR eq é dado por: KFR eq = 36 g H2O/mol Na 2C4H 4O6 2H2O x S x g/mol x A (10.11) em que S é o peso do tartarato de sódio e A o volume de reagente necessário para a titulação do tartarato de sódio. Uma vez conhecido o valor de KFR eq, determina-se o teor de humidade usando a equação 10.12: 76

81 KFR eq x K s %H2O = x 100 S (10.12) em que K s é o volume de reagente usado para titular a amostra e S o peso da amostra. O teor de humidade em alimentos pode ainda ser determinado através de métodos físicos, como sejam os métodos electroquímicos, a hidrometria, a refractometria, a espectrometria de IV e a medição do ponto de congelação. Os métodos electroquímicos baseiam-se na medida da constante dielétrica, que é mais elevada na água que na maioria dos outros solventes e na medida da condutividade, que aumenta com o teor de humidade na amostra. Nestes métodos há necessidade de calibrar os instrumentos com padrões. Em alimentos que contenham mais de % de humidade não é possível utilizar métodos electroquímicos. A hidrometria mede a densidade com picnómetros, hidrómetros ou a balança de Westphal. A refractometria é usada para medir teores de humidade em produtos líquidos ricos em açúcar e em leite condensado. Como todos os compostos possuem um índice de refracção, a refractometria pode ser usada para identificação de compostos, comparando o valor medido com os da literatura. O índice de refracção varia com a concentração do composto, permitindo calcular teores de humidade, mas também com a temperatura e o comprimento de onda, pelo que se terá que trabalhar em condições controladas. A utilização da espectrometria de IV na determinação do teor de humidade baseia-se na existência de bandas de absorção a nm e nm, características do estiramento dos OH da água. O ponto de congelação da água é utilizado para determinar o teor de humidade no leite. Este valor varia entre ºC e ºC, sendo a média ºC. A determinação do ponto de congelação permite identificar adulterações por adição de água e é feita através da fórmula seguinte, em que T é o ponto de congelação da amostra: T %H2O adicionada = x (10.13) No caso de se pretender determinar se um alimento é perecível, a medição do teor de humidade não dá uma boa indicação, pois a água associa- 77

82 -se de diferentes formas com os alimentos. A água mais fortemente ligada não está disponível para o crescimento microbiano, ao contrário da menos ligada. O cálculo da actividade da água (a w ) é uma melhor indicação dessa disponibilidade da água para crescimento microbiano. 78

83 Capítulo 11 Vitaminas e minerais As vitaminas são compostos orgânicos existentes em pequenas quantidades nos alimentos, mas essenciais como nutrientes. São habitualmente separadas em lipossolúveis (A, D, E e K) e hidrossolúveis. No ser humano são encontradas as 4 lipossolúveis e 9 hidrossolúveis (8 vitaminas B e vitamina C). Tabela 11.1 Nome genérico Vitamina A Vitamina B 1 Vitamina B 2 Vitamina B 3 Vitamina B 5 Vitamina B 6 Vitamina B 7 Vitamina B 9 Vitamina B 12 Vitamina C Vitamina D Vitamina E Vitamina K Designação química Retinóides (retinol, retinóides, carotenóides) Tiamina Riboflavina Niacina, niacinamida Ácido pantoténico Piridoxina, piridoxamina, piridoxal Biotina Ácido fólico, ácido folínico Cianocobalamina, hidroxicobalamina, metilcobalamina Ácido ascórbico Ergocalciferol, colecalciferol Tocoferóis, tocotrienóis Filoquinona, menaquinonas Designa-se por vitamina um composto que não é sintetizado em suficiente quantidade pelo organismo, tendo que ser obtido através da alimentação. As vitaminas são classificadas quanto às suas actividades biológica e química, não quanto à sua estrutura. Por exemplo, o termo vitamina A é usado para designar os compostos retinal, retinol e diversos carotenóides. As vitaminas possuem diversas funções bioquímicas, incluindo hormonal (ex. vitamina D), antioxidante (ex. vitamina E) e reguladora (ex. vitamina A). a maioria das vitaminas (ex. complexo B) funciona como precursores de 79

84 coenzimas, participando no metabolismo. Nalguns casos (ex. biotina), as próprias vitaminas funcionam como coenzimas, caso do ácido fólico. H C CH CH CH 3 OH Retinol CH 3 H C CH CH CH 3 O Retinal CH 3 H C CH CH CH 3 H 3 C -Caroteno CH 3 CH 3 CH 3 H 3 C CH 3 Fig Três dos compostos habitualmente designados por vitamina A. Os teores em vitaminas podem ser determinados segundo três estratégias: ensaios biológicos em seres humanos e animais, ensaios microbiológicos e ensaios físico-químicos. Os ensaios biológicos apenas serão utilizados se não existir uma outra alternativa. Como algumas vitaminas são sensíveis à luz, ao oxigénio, ao calor e a alterações de ph, deverão ser tidas precauções adequadas na preparação e armazenamento das amostras. Em geral, os métodos de análise de vitaminas requerem a sua prévia extracção do alimento. Os métodos de extracção são quase sempre específicos para cada vitamina e envolvem tratamentos com ácidos, bases, solventes, enzimas ou aplicação de calor. Em particular, para: ácido ascórbico extracção a frio com ácido metafosfórico/ácido acético; vitaminas B 1 e B 2 ebulição (ou autoclave) em ácido seguida de tratamento enzimático; niacina aquecimento em autoclave em ácido (produtos não derivados de cereais) ou em base (cereais); vitaminas A, E ou D extracção em solvente orgânico, saponificação e nova extracção com solvente orgânico. Adicionam- -se antioxidantes, para impedir oxidações. 80

85 A análise das vitaminas lipossolúveis pode exigir a sua saponificação. Os ensaios microbiológicos estão limitados às vitaminas hidrossolúveis. O crescimento de um dado microrganismo numa amostra contendo a vitamina a analisar é comparado com o seu crescimento em meio contendo quantidades conhecidas dessa vitamina. O crescimento pode ser medido em termos de turbidez, produção de ácido, gravimetria ou respiração. Existem métodos microbiológicos oficiais para análise de niacina e folato. Os métodos químicos permitem analisar um maior número de vitaminas: A, E, C, B 1 e B 2. A vitamina A é sensível à radiação UV, ar e outros agentes oxidantes, temperaturas elevadas e humidade, pelo que é necessário trabalhar com equipamento adequado, sob condições não oxidantes e a temperatura controlada. O único método considerado rigoroso para determinação de vitamina A é a cromatografia líquida (HPLC). A amostra é primeiro saponificada (após adição de pirogalol, que vai servir de antioxidante) depois a vitamina A é extraída com um solvente orgânico e concentrada, seguindo-se a determinação por HPLC. A cromatografia permite separar os isómeros trans-retinol e cis-retinol e as respectivas determinações são feitas a partir das equações abaixo. trans-retinol = A A T ST x W V T x DF (11.1) cis-retinol = A A C SC x W V C x DF (11.2) A T é a área do pico de trans-retinol na amostra, A C é a área do pico de cisretinol na amostra, A ST e A SC as áreas dos picos dos padrões de trans e cisretinol, respectivamente, W T e W C os pesos de amostra, DF o factor de diluição e V o volume da amostra. A vitamina E encontra-se nos alimentos sob oito formas diferentes, os tocoferóis,, e e os quatro tocotrienóis correspondentes (,, e ). A análise de vitamina E é feita em HPLC de fase normal, com detecção por fluorescência, com excitação a 290 nm e leitura da emissão a 330 nm. Dependendo da origem da amostra, os procedimentos analíticos diferem, fazendo-se, para a generalidade dos alimentos, uma saponificação sob refluxo, na presença de pirogalol, seguida por uma extracção com hexano e injecção no 81

86 cromatógrafo. No caso de margarinas e outras gorduras vegetais sólidas, dissolve-se a amostra em hexano, adiciona-se MgSO 4 para remover a água, filtra-se e injecta-se o filtrado em HPLC. Os óleos são dissolvidos em hexano e directamente injectados no HPLC. Fig As oito formas de vitamina E encontradas nos alimentos. A quantificação da vitamina E é feita recorrendo ao método do padrão externo. A vitamina C (ácido L-ascórbico e ácido L-dehidroascórbico) é muito susceptível a degradação oxidativa, sobretudo a ph elevado e na presença de Fe 3+ e Cu 2+. Deste modo, a sua análise deverá realizar-se a baixo ph e na presença de um agente quelante. A oxidação suave do ácido ascórbico resulta na formação de ácido dehidroascórbico, o qual pode ser reconvertido em ácido ascórbico por reacção com agentes redutores. A determinação de vitamina C pode ser feita por dois métodos diferentes, um titrimétrico e outro com análise por espectroscopia de fluorescência. No método titrimétrico, o ácido ascórbico é oxidado a ácido dehidroascórbico por um indicador corado. No final da titulação, o indicador em excesso é rosado em meio ácido e poderá ser quantificado por absorção electrónica a 545 nm. O cálculo do teor em ácido ascórbico (mg por g ou ml de amostra) é feito usando a equação 11.3, em que C é o peso de ácido ascórbico por ml de indicador, V o volume de indicador usado para titular a amostra diluída, DF o factor de diluição e WT o peso da amostra. DF teor em ácido ascórbico = C x V x (11.3) WT 82

87 O método microfluorimétrico mede tanto o ácido ascórbico como o ácido dehidroascórbico. Após oxidação do ácido ascórbico a ácido dehidroascórbico, faz-se reagir este com o-fenilenodiamina, formando um composto fluorescente, o qual é medido com excitação a 356 nm e emissão a 440 nm. Para compensar a possível existência de interferentes é necessário preparar um branco com ácido bórico antes da adição da solução de o-fenilenodiamina. O cálculo do teor em ácido ascórbico (mg por g ou ml) é dado pela equação 11.4, em que A e C são as intensidades de fluorescência da amostra e do padrão, respectivamente, B e D são as intensidades de fluorescência dos brancos da amostra e do padrão, respectivamente, S é a concentração do padrão, DF o factor de diluição e WT o peso da amostra. A B DF teor em ácido ascórbico = x S x C D WT (11.4) A medição do teor em vitamina B 1 baseia-se na medida da fluorescência da sua forma oxidada, o tiocromo. Como o tiocromo é sensível à luz, todos os passos a seguir à oxidação devem ser feitos ao abrigo da luz forte. A própria tiamina (vitamina B 1 ) é sensível ao calor, sobretudo em meio alcalino, pelo que o procedimento deve ser efectuado com rapidez. A tiamina é oxidada por K 2 Fe(CN) 6 e a leitura do tiocromo é feita com excitação a 365 nm e emissão a 435 nm. É preparado um branco para corrigir para a presença de interferentes e a quantificação é feita com recurso a padrões da vitamina, usando a fórmula seguinte: S - S C 25 Vo Std - Std A V WT b teor em tiamina = x x x b p (11.5) S e S b são as intensidades de fluorescência da amostra e do branco da amostra, respectivamente, Std e Std b são as intensidades de fluorescência do padrão e do branco do padrão, respectivamente, C é a concentração do padrão, A é o volume da alíquota usada, 25 o volume final eluído, V p o volume que atravessa a coluna cromatográfica, V o, o volume de diluição da amostra original e WT o peso da amostra. O teor em vitamina B 1 é expresso em mg/g. A determinação da vitamina B 2 (riboflavina) segue também um método fluorimétrico. A riboflavina é oxidada por KMnO 4 e o produto formado é doseado por fluorescência, com excitação a 440 nm e leitura de emissão a 565 nm. É necessário ter atenção à sensibilidade da vitamina B 2 à radiação UV. Para calcular o teor em riboflavina (mg/g) usa-se a fórmula: A- C CS DF teor em riboflavina = x x B - A V WT (11.6) 83

88 A e C são as intensidades de fluorescência da amostra contendo água e hidrossulfito de sódio (redutor), respectivamente, B é a intensidade de fluorescência da amostra contendo o padrão da vitamina, CS a concentração do padrão, V o volume da amostra usada na medida de fluorescência, DF o factor de diluição e WT o peso da amostra. Os minerais são os constituintes que permanecem, sob a forma de cinzas, após a combustão de tecidos vegetais e animais. Podem ser divididos em elementos essenciais, microelementos e ultra-microelementos. Os elementos essenciais são Na, K, Ca, Mg, Cl e P e possuem essa designação devido a serem necessários na dieta humana em teores superiores a 50 mg/dia. Os microelementos (Fe, I, F, Zn, Se, Cu, Mn, Cr, Mo, Co, Ni) são necessários em concentrações inferiores a 50 mg/dia. O seu papel biológico é variado (em vitaminas, enzimas e outras proteínas) e a sua deficiência resulta em problemas metabólicos. A deficiência nos elementos Al, As, Ba, Bi, B, Br, Cd, Cs, Ge, Hg, Li, Pb, Rb, Sb, Si, Sm, Sn, Sr, Tl, Ti e W parece estar associada a alguns problemas de saúde, mas não estando completamente estabelecidas relações causa/efeito nem as dosagens requeridas, sabendo-se apenas serem muito baixas. Os elementos essenciais e os microelementos exibem diversas actividades, como sejam eléctrólitos, constituintes de enzimas e constituintes estruturais de ossos e dentes. Os teores em minerais nos alimentos variam durante o seu processamento e a sua absorção pelo organismo depende da presença de outros compostos (proteínas, péptidos, aminoácidos, polissacáridos, açúcares, lenhina, fitina e ácidos orgânicos) que a eles se ligam, aumentando ou reduzindo a sua absorção. A análise de minerais em alimentos pode ser feita por diversos processos, sendo em geral necessário extrair os minerais previamente da amostra. Um dos principais problemas existentes, na preparação de uma amostra para análise de minerais, é a existência de contaminação causada pelo equipamento, pelo que deverão, sempre que possível, ser utilizados materiais não metálicos. O ligando etilenodiaminatetraacetato (EDTA) forma complexos com diversos iões minerais, permitindo a sua utilização em titulações complexométricas para análise de minerais. Os pontos finais das titulações podem ser determinados usando outros quelantes, com constantes de 84

89 coordenação menores que o EDTA (menor afinidade para os iões) e que originam cores diferentes nos estados livre e complexado. Fig Complexo formado entre Ca 2+ e EDTA. A principal aplicação deste método é na análise de cálcio e magnésio para determinação da dureza da água, mas também é utilizado para determinar o teor de cálcio em vegetais e outros alimentos em que os teores de magnésio e fósforo são baixos. A titulação por precipitação está na origem de métodos utilizados pela indústria alimentar na determinação de minerais. O método de Mohr para determinação de cloretos é um deles e baseia-se na formação de um sólido de cor laranja (cromato de prata) após o ião prata, proveniente do nitrato de prata adicionado, ter complexado todo o cloreto disponível. Ag + + Cl - ɹ AgCl (11.7) 2Ag + + CrO 4 2- ɹ Ag2 CrO 4 (11.8) Fig Método de Mohr. Titulação antes (esquerda) e após (direita) a formação do precipitado. Uma das aplicações do método de Mohr é na determinação de sal em alimentos. 85

90 No método de Volhard, um excesso de uma solução padrão de nitrato de prata é adicionada a uma solução de uma amostra contendo cloreto. O excesso de prata é depois titulado com uma solução padrão de tiocianato de potássio ou amónio, usando Fe 3+ como indicador. FeSCN é vermelho, permitindo identificar a existência de SCN - não ligado a Ag +. A quantidade de prata, que precipita com o cloreto presente na solução da amostra, é calculada por subtracção do excesso de prata do total originalmente adicionado. Ag + + Cl - ɹ AgCl (11.9) Ag + + SCN - ɹ AgSCN (11.10) SCN - + Fe 3+ ɹ FeSCN (11.11) A reacção permite determinar a quantidade de prata não complexada com o cloreto. Os métodos colorimétricos utilizam compostos que, após reacção com a substância a determinar, formam produtos coloridos. Existem vários destes compostos capazes de reagir selectivamente com diversos minerais. O produto de reacção colorido é solúvel e pode ser quantificado por espectroscopia de absorção electrónica, utilizando a lei de Lambert-Beer. A quantificação é habitualmente efectuada com recurso a uma curva de calibração feita com padrões. De modo a ter o mineral livre de interferentes, é necessário proceder a uma prévia incineração da amostra, obtendo assim as suas cinzas, a partir das quais se solubiliza o mineral a determinar. Os métodos colorimétricos são geralmente muito específicos, podendo ser executados sem separação dos diversos minerais existentes nas cinzas e, em muitos casos, permitem obter uma precisão semelhante à da absorção atómica. Foram desenvolvidos diversos eléctrodos para medidas selectivas de vários aniões e catiões (brometo, cálcio, cloreto, fluoreto, potássio, sódio e sulfito). Estes eléctrodos selectivos de iões permitem determinar a actividade iónica, a qual pode ser considerada próxima da concentração dos iões medidos. Esta aproximação só é válida em condições de baixas concentrações e força iónica controlada. A relação entre a actividade iónica e a concentração é dada por A = C (11.12) 86

91 O coeficiente de actividade ( ) varia em função da força iónica, o que justifica a utilização de tampões para ajuste da força iónica nas amostras e nos padrões. A eficácia destes eléctrodos é afectada pela presença de interferentes, sobretudo por iões com carga e tamanho semelhantes aos que se pretende determinar. Como também a temperatura afecta a resposta dos eléctrodos, é necessário trabalhar a temperatura constante. A concentração do ião de interesse pode ser calculada através de uma curva de calibração, da adição de um padrão ou por determinação do ponto final de uma titulação. O método de adição de padrão é usado quando existe um número pequeno de amostras, não permitindo o desenvolvimento de uma curva de calibração. Os eléctrodos selectivos podem ser usados para determinar o ponto final de uma titulação, usando compostos que formam precipitados ou complexos fortes com o ião a analisar. Define-se como cinza o resíduo inorgânico que resulta da combustão ou total oxidação da matéria orgânica de um alimento. Existem dois tipos de procedimentos para análise de cinzas, o método das cinzas secas, usado sobretudo para determinação do teor em cinzas e análise de alguns minerais específicos e o método das cinzas húmidas (oxidação) que serve de preparação para a análise de diversos minerais. Os alimentos secos não requerem qualquer preparação prévia, mas os restantes necessitam uma secagem antes da obtenção das suas cinzas. Os alimentos ricos em gordura poderão ter que sofrer uma prévia extracção de lípidos, para além da secagem. As cinzas secas são obtidas numa mufla capaz de atingir ºC. A água e os compostos voláteis são vaporizados e os compostos orgânicos degradados, na presença de oxigénio do ar, a CO 2 e óxidos de azoto. A maioria dos minerais é convertida em óxidos, sulfatos, fosfatos, cloretos e silicatos. Alguns elementos (Fe, Se, Pb e Hg) podem ser parcialmente volatilizados, pelo que este método não é adequado se se pretende analisar os componentes individuais de uma amostra. Para determinar a composição mineral de um alimento recorre-se ao método das cinzas húmidas. Neste método, as substâncias orgânicas são oxidadas por ácidos, agentes oxidantes ou combinações de ambos. Os minerais são solubilizados sem volatilização. As amostras podem provir de outras determinações que necessitam de usar material seco. A maioria do material vegetal deverá ser seco em duas etapas, primeiro a 55 ºC e depois a uma temperatura superior, de modo a impedir a interferência da lenhina. Se as amostras vegetais tiverem um teor de humidade inferior a 15% não é necessário secá-las previamente. 87

92 Alguns alimentos requerem tratamentos adicionais, antes da obtenção das cinzas, devido a terem elevados teores de gordura ou humidade (salpicos, dilatação) ou açúcares (formação de espuma) o que impede a perca de amostra. Carnes, açúcares e compotas deverão ser secos num banho de vapor ou com uma lâmpada de infra-vermelhos. Adicionam-se uma ou duas gostas de azeite (que não produz cinzas) para permitir a saída de vapor à medida que se vai formando uma crosta na amostra. As cinzas secas são obtidas por incineração a 525 ºC ou mais, existindo diversos tipos de recipientes para o efeito. A escolha do material de que estes são feitos depende da natureza da amostra. Os de quartzo são resistentes a ácidos e halogéneos, mas não a bases, a temperaturas elevadas. Os de Vycor são estáveis a 900 ºC, mas os de Pyrex apenas até 500 ºC. Recipientes de porcelana possuem propriedades semelhantes às dos de quartzo, mas tendem a quebrar com variações bruscas de temperatura. Devido ao seu baixo preço, são frequentemente os escolhidos. Os recipientes de aço são resistentes a ácidos e a bases e são baratos, mas podem originar contaminações com crómio e níquel. A platina é provavelmente o melhor material, mas é muito cara. Existem também recipientes descartáveis, de fibra de quartzo, os quais suportam temperaturas até 1000 ºC e, sendo porosos, permitem rápidos aquecimento e arrefecimento. Após incineração, os recipientes devem ser arrefecidos num exsicador, antes de pesados. O teor em cinzas será calculado a partir de: peso após incineração - peso do cadinho % cinza = x 100 peso da amostra x coeficiente de matéria seca (11.13) em que: coeficiente de matéria seca = % sólidos 100 (11.14) No método das cinzas húmidas, não existe um único ácido capaz de, completa e rapidamente, oxidar um material orgânico. É frequente utilizar combinações de ácidos: nítrico, sulfúrico/peróxido de hidrogénio, perclórico. São usadas diferentes combinações para diferentes tipos de amostra. Como o ácido perclórico, embora muito eficaz, é de utilização mais perigosa, existe uma tendência para substituí-lo. Quer o método das cinzas secas, quer o das cinzas húmidas podem ser realizados em aparelhos de micro-ondas, reduzindo o tempo de preparação de amostra a alguns minutos. A obtenção de cinzas húmidas pode ser feita em recipiente aberto ou fechado, sendo que neste último podem ser aplicadas 88

93 pressão e temperatura elevadas, o que aumenta a eficácia do sistema. Concretamente, pode ser utilizado apenas ácido nítrico para a digestão, tornando o processo mais seguro. As muflas por micro-ondas, usadas para obtenção de cinzas secas, são muito mais rápidas que as muflas convencionais (até 97% mais rápidas) já que conseguem operar a temperaturas até 1200 ºC. Para além das cinzas secas e húmidas, existem outros tipos de métodos com cinzas aplicáveis à análise de alimentos: cinzas solúveis e insolúveis, aplicadas a frutos; cinzas insolúveis em ácido, para determinação de contaminantes insolúveis em ácido; alcalinidade das cinzas, para distinguir entre cinzas de frutos e legumes (alcalinas) e de carnes e alguns cereais (ácidas); cinzas sulfatadas, aplicadas a açúcares, xaropes e corantes. 89

94 Capítulo 12 Aditivos Alimentares Aditivos alimentares são substâncias adicionadas, em pequenas quantidades, aos alimentos, intervindo na sua produção, processamento, embalagem e/ou armazenamento. Habitualmente, os aditivos ou as substâncias resultantes da sua degradação permanecem nos alimentos, embora por vezes sejam removidos durante o processamento. Podem usar-se aditivos para: alterar o valor nutritivo de um alimento vitaminas, minerais, aminoácidos e seus derivados, mas também espessantes, emulsificantes, edulcorantes, etc. para certos tipos de dietas; alterar as propriedades sensoriais de um alimento corantes, aromatizantes e potenciadores de sabor são usados para corrigir percas sensoriais durante o processamento e armazenamento dos alimentos. Estabilizantes, antioxidantes e outros compostos também podem ser usados para impedir essas percas; aumentar o tempo de prateleira de um alimento aditivos para proteger contra a degradação microbiana e agentes que impedem ou retardam alterações químicas ou físicas, tais como reguladores de ph e espessantes; alterar o valor prático de um alimento compostos usados para permitir a produção de alimentos de preparação culinária mais fácil e mais rápida. Os aditivos alimentares e os seus produtos de degradação não poderão ser tóxicos nas concentrações em que são utilizados. A sua utilização é regulamentada, embora essa regulamentação varie um pouco de país para país. No entanto, há correntemente um esforço de harmonização internacional, baseada simultaneamente nos conhecimentos de toxicologia e nas necessidades tecnológicas modernas. Na Europa, é atribuído um nº E aos aditivos alimentares aprovados. Essa aprovação é atribuída apenas após uma avaliação da segurança do aditivo nas condições de utilização pretendidas. 90

95 São apresentadas de seguida algumas das principais propriedades dos aditivos alimentares Potenciadores de sabor São compostos que intensificam o aroma de um alimento, embora eles próprios não exibam aroma nem gosto, nas concentrações utilizadas. O seu efeito é intensificar e acelerar a percepção do aroma. Encontram-se neste grupo aditivos como o glutamato monosódico e o maltol Substitutos do açúcar Encontram-se neste grupo as substâncias que são usadas como edulcorantes, mas que são metabolizados sem a influência da insulina. Alguns exemplos são os álcoois de açúcar ou polióis, sorbitol, xilitol e manitol Edulcorantes São compostos naturais ou sintéticos que transmitem uma sensação de doçura, possuindo pouco ou nenhum valor nutricional. Não se incluem neste grupo os hidratos de carbono Conservantes São sobretudo compostos com actividade antimicrobiana, cujo uso se destina a substituir ou complementar processos físicos de eliminação da microflora contaminante dos alimentos. Tem havido pouca evolução nas substâncias utilizadas, pois é difícil encontrar compostos simultaneamente com largo espectro antimicrobiano, baixa toxicidade e custo razoável. A maioria destes são ácidos fracos, como os ácidos sórbico, benzóico, propiónico e acético e seus derivados. Também utilizados para este efeito são o SO 2 e os sulfitos, nitritos e nitratos Antioxidantes A oxidação lipídica pode ser retardada pela remoção do oxigénio ou pela adição de antioxidantes. Estes são, na maioria, compostos fenólicos (naturais ou sintéticos) e são mais eficazes se usados em simultâneo com um agente quelante. Os antioxidantes mais importantes são os tocoferóis, ésteres do ácido ascórbico, ésteres do ácido gálico, BHT (butilhidroxitolueno) e BHA (butilhidroxianisole). Os agentes quelantes contribuem para a estabilização das 91

96 cores, aromas e texturas, devido à sua capacidade para se ligarem a iões metálicos, os quais actuam como catalisadores da oxidação de gorduras. Diversos constituintes dos alimentos possuem essa capacidade, tais como os ácidos carboxílicos e polifosfóricos, os aminoácidos, péptidos, proteínas e porfirinas Agentes tensioactivos Os agentes tensioactivos, naturais e sintéticos, são usados no processamento de alimentos quando é necessária a redução da sua tensão superficial, como por exemplo na produção e estabilização de dispersões. Estas dispersões incluem emulsões, espumas, aerossóis e suspensões. Em todos os casos existem duas fases distintas, uma externa e contínua e outra interna e descontínua, a fase dispersa Substitutos de gorduras Compostos que se destinam a substituir as gorduras tradicionais, devido ao elevado valor energético destas. No entanto, nenhum dos substitutos consegue preencher todas as funções das gorduras. Os substitutos podem ser divididos em dois grupos, os naturais (miméticos das gorduras) e os sintéticos (substitutos das gorduras). Reduzindo o tamanho de partícula das proteínas a m dá-lhes uma textura cremosa, permitindo a sua utilização na substituição de gorduras em alimentos que não requeiram exposição a temperaturas elevadas (gelados, sobremesas, etc.). Alguns oligossacáridos, que se dissolvem completamente em água quente, podem ser obtidos a partir do amido. Após arrefecimento destas soluções, obtém-se um gel, cuja textura é semelhante à dos óleos alimentares, podendo ser usados como substitutos da gordura em margarinas, por exemplo Espessantes, gelificantes e estabilizantes Diversos polissacáridos e seus derivados provocam um aumento de viscosidade, a formação de géis e a estabilização de emulsões, espumas e suspensões. Estes compostos também são inibidores da cristalização (produtos de confeitaria, gelados, etc.) e são usados para encapsular aromas, em alimentos desidratados. A gelatina é uma proteína com actividade gelificante, usada em diversos alimentos. 92

97 12.9 Humectantes Alguns polióis, como o glicerol e o sorbitol, possuem propriedades higroscópicas específicas, o que possibilita a sua utilização como humectantes, isto é agentes que retêm a textura e suavidade de um alimento, impedindo também a cristalização. 93

98 Capítulo 13 Contaminantes Alimentares Os alimentos podem sofrer contaminação por compostos tóxicos de diversas proveniências: Poluentes derivados da queima de combustíveis fósseis, de radionuclídeos ou de emissões originadas em processos industriais (microelementos tóxicos, PAHs, dioxinas, etc.). Componentes do material de embalagem, detergentes, desinfectantes, etc. Metabolitos tóxicos produzidos por microrganismos. Resíduos de produtos usados na protecção de culturas. Resíduos originados na criação de aves e de gado (medicamentos e aditivos usados em rações). Outros contaminantes podem ser formados no próprio alimento ou no aparelho digestivo, devido a reacções de alguns ingredientes e aditivos alimentares, caso das nitrosaminas. Entre os contaminantes mais relevantes contam-se os microelementos arsénico, mercúrio, chumbo e cádmio. Relativamente aos radionuclídeos, os radioisótopos 137 Cs e 90 Sr contam-se entre os mais perigosos. A actividade tóxica microbiana é atribuída às enterotoxinas produzidas por bactérias. Estes compostos são maioritariamente proteínas com actividade antigénica e muito venenosas. Contam-se entre estas as toxinas produzidas por Clostridium botulinum, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus. Também os fungos produzem toxinas alimentares, designadas por micotoxinas. As mais estudadas e tóxicas são as aflatoxinas produzidas pelo género Aspergillu spp. A aflatoxina B 1 é o mais forte carcinogénico conhecido. Estas toxinas provêm principalmente dos frutos e frutos secos, sendo os pistachios uma das fontes mais importantes. Os produtos utilizados na protecção de culturas compreendem os herbicidas, fungicidas e insecticidas, mas também outros pesticidas menos frequentemente utilizados e ainda os reguladores do crescimento das plantas. 94

99 Os alimentos de origem vegetal podem ser directamente contaminados devido ao tratamento das plantas ou por absorção a partir do solo, a partir da atmosfera ou a partir de locais de armazenamento previamente tratados. Os alimentos de origem animal são contaminados devido a ingestão, por parte do animal, de alimentos contendo agentes de limpeza ou por contacto dos animais com materiais tratados, com medicamentos ou por ingestão de rações contendo material vegetal desinfectado. Fig Estrutura da aflatoxina B1, produzida por Aspergillus spp. Diversos medicamentos, como antibióticos, antihelmínticos e coccidiostáticos são habitualmente usados no tratamento de animais, podendo esse uso resultar em contaminação alimentar. Os bifenilos policlorados (PCBs) são misturas complexas de substâncias usadas em diversas indústrias que, devido à sua ampla utilização, entram em contacto com os alimentos. Sendo muito persistentes e lipossolúveis tendem a acumular em alimentos gordos. Acresce que estes compostos podem produzir, por combustão, dioxinas fortemente tóxicas. Devido a estes factos, a sua produção e aplicação encontram-se interditas. A queima de matéria orgânica como madeira, óleo ou carvão resulta em reacções de pirólise e na formação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs), com efeito carcinogénico. Estes compostos podem contaminar os alimentos, quer através dos processos de preparação dos mesmos, quer através de transporte pela atmosfera. Sendo compostos lipossolúveis, tendem a acumular em tecidos gordos. O nitrato provém principalmente dos alimentos de origem vegetal, mas também de alguma carne e peixe, enquanto que o nitrito é originário, sobretudo, de carne e produtos cárneos curados. A toxicidade do nitrato deriva da sua oxidação a nitrito, causada por bactérias. As nitrosaminas e nitrosamidas são potentes carcinogénicos, provenientes de alimentos curados ou sujeitos a temperaturas elevadas. 95

100 As dioxinas, dibenzo-p-dioxinas policloradas e dibenzofuranos policlorados, ocorrem associados a diversos produtos clorados e bromados. Também podem ser formadas por processos térmicos, na presença de compostos halogenados. São compostos que se concentram na fase gorda dos alimentos (ex. leite) e de toxicidade variável. Existem diversos métodos analíticos para determinação de resíduos de pesticidas, podendo ser quantitativos (resíduo único ou multi-resíduos), semi- -quantitativos ou ainda qualitativos (Tabela 13.1). Tabela 13.1 Quantitativo Multi-resíduos Resíduo único GC HPLC GC HPLC Ensaios imunológicos Semi-quantitativo ou qualitativo TLC Inibição enzimática Os métodos multi-resíduos são usados para detectar e medir diversos resíduos numa variedade de alimentos. São suficientemente rigorosos para permitir boas estimativas de teores de resíduos para muitos pesticidas, aos níveis (ou mesmo abaixo) legalmente permitidos. Estes métodos utilizam passos de preparação da amostra, extracção, eliminação de interferentes (cleanup), separação cromatográfica e quantificação com a ajuda de detectores muito selectivos. Nenhum destes métodos é capaz de detectar todos os resíduos de pesticidas em todos os tipos de plantas. Na prática, representam um compromisso entre o número de resíduos que podem ser detectados, a gama de alimentos em que podem ser empregues e os níveis de resíduos que podem ser medidos. Os métodos de resíduo único envolvem os mesmos passos que os para multi-resíduos, mas com cada passo optimizado para o resíduo de interesse. O seu objectivo é medir um único analito e, frequentemente, os seus principais metabolitos e produtos de transformação com importância toxicológica. Os métodos quantitativos seguem os passos gerais de preparação da amostra, extracção, eliminação de impurezas, separação, detecção e quantificação. A escolha do método a utilizar depende das propriedades da amostra e do analito de interesse e dos equipamentos analíticos disponíveis. É conveniente dividir os alimentos em quatro grupos, segundo os seus teores em gordura e humidade: 1) humidade elevada, gordura baixa (frutos e legumes); 96

101 2) humidade e gordura elevadas (carnes); 3) humidade e gordura baixas (frutos secos); 4) humidade baixa, gordura elevada (grãos de cacau). Os pesticidas encontram-se distribuídos à superfície das plantas, de um modo não uniforme. Os frutos e legumes frescos não devem ser lavados antes da análise e apenas deverão ser removidas as partes externas danificadas. Quando as partes externas dos vegetais não são habitualmente consumidas, estas são removidas antes da análise. Deve ter-se cuidado com alguns pesticidas que podem ser degradados pela trituração ou pela maceração da amostra, durante a sua preparação. A extracção é habitualmente feita com um solvente orgânico (acetonitrilo ou acetona) sendo adicionado um sal anidro (NaCl ou Na 2 SO 4 ) para absorver água. Noutros casos, pode ser adicionada uma pequena quantidade de água para facilitar a purificação do extracto numa subsequente partição contra outro solvente orgânico. No final, o solvente é separado da fracção sólida por filtração. O extracto obtido é, frequentemente, submetido a uma purificação parcial (cleanup) antes dos passos de separação e quantificação. Neste passo tenta eliminar-se os interferentes, podendo usar-se métodos cromatográficos (adsorção ou exclusão molecular). Mais recentemente, foram introduzidas técnicas alternativas, com menor consumo de solventes e uma maior rapidez de execução. A extracção em fase sólida (SPE) usa uma pequena quantidade de um material de empacotamento, contido em pequenas colunas ou em discos, o qual permite purificar, concentrar ou derivatizar os analitos antes do passo de separação cromatográfica. A microextracção em fase sólida (SPME) envolve a utilização de uma fibra revestida com um polímero adsorvente, a qual é imersa num extracto aquoso ou colocada no espaço de cabeça de um recipiente contendo a amostra, de modo que os analitos difundem para o revestimento da fibra. Após atingir o equilíbrio, a fibra é transferida para o injector de um GC e os analitos sofrem uma desorção térmica para o interior da coluna. A extracção com solvente assistida por micro-ondas também permite reduzir o tempo de extracção e a quantidade de solvente utilizada. Tal deve-se à utilização de temperaturas superiores aos pontos de ebulição dos solventes. A extracção acelerada com solventes utiliza pequenas quantidades de solventes convencionais a temperatura e/ou pressão elevadas. Por vezes é útil ou necessário derivatizar os analitos para facilitar a sua separação e detecção. Esta derivatização é habitualmente efectuada antes da entrada na coluna cromatográfica (derivatização pré-coluna) mas pode também ser feita após saída da coluna (derivatização pós-coluna). Esta técnica tem 97

102 aplicação limitada aos métodos de resíduo único ou àqueles que determinam um pequeno grupo de resíduos com estrutura química semelhante. A cromatografia gasosa é a técnica mais utilizada para separação e determinação de pesticidas. Existem processos descritos para colunas de empacotamento e capilares, bem como para colunas megabore, as quais possuem características intermédias entre as de empacotamento e as capilares. A maioria dos pesticidas contém heteroátomos (outros que não C, H e O) na sua estrutura, o que é explorado pelos detectores que respondem a esses átomos: de chama (FID) para detecção de S e P, de captura electrónica (ECD) e de condutividade para halogéneos, S e N, térmiónico (TID) para N e P. A espectrometria de massa (MS) é um método fortemente selectivo para identificação e quantificação de pesticidas. Os componentes separados em GC são comparados com padrões, com base nos respectivos tempos de retenção e frequentemente os seus tempos de retenção são referidos relativamente ao do padrão interno, clorpirifos. Este composto contém átomos de P, S, N e Cl, para além de C, H e O, o que permite a sua detecção em todos os detectores usados em GC. Fig Estrutura do pesticida clorpirifos. A aplicação de cromatografia HPLC à análise de pesticidas restringe-se aos analitos que não são suficientemente voláteis ou não possuem estabilidade térmica que lhes permita ser analisados por GC. Uma vantagem desta técnica é a não necessidade de um passo de eliminação de interferentes tão extenso. A detecção é normalmente feita por absorção electrónica ou por fluorescência. Os compostos que não são naturalmente fluorescentes, são derivatizados, quer pré quer pós-coluna. Os ensaios imunológicos utilizam anticorpos com elevadas afinidade e especificidade para o pesticida a analisar. Estes métodos são simples, rápidos e relativamente baratos e têm aplicação analítica se a interacção entre o anticorpo e o pesticida puder ser detectada e, preferivelmente, quantificada. Uma das principais desvantagens dos ensaios imunológicos relaciona-se com o carácter não polar dos pesticidas, que os tornam pouco solúveis nos tampões aquosos habitualmente enpregues nestes ensaios. 98

103 As análises semi-quantitativas e qualitativas são, em geral, capazes de detectar um número limitado de resíduos de pesticidas semelhantes entre si. São também designados por métodos de varrimento, já que são capazes de analisar um grande número de amostras, num tempo relativamente curto. Enquanto os métodos semi-quantitativos permitem uma estimativa de uma gama de concentrações para um resíduo, os métodos qualitativos detectam a presença de um resíduo acima de determinado valor. Estes são métodos rápidos, simples e baratos, que utilizam sobretudo as técnicas de TLC, inibição enzimática e ensaios imunológicos. Apesar das suas limitações, a cromatografia em camada fina (TLC) é usada como método semi-quantitativo de varrimento para um grupo limitado de pesticidas. Uma melhoria na capacidade de resolução pode ser conseguida por HPTLC. A obtenção de uma amostra representativa da distribuição de micotoxinas num alimento é particularmente difícil. Os métodos analíticos empregues para a sua análise podem ser quantitativos ou de varrimento. Os métodos não quantitativos incluem o uso de mini-colunas e de TLC. As mini-colunas tiram partido da fluorescência natural das aflatoxinas zearalenona e ocratoxina A. São usadas pequenas colunas cromatográficas em vidro (diâmetro interno de 4 6 mm) contendo diversas substâncias adsorventes, disponíveis comercialmente, capazes de detectar as citadas micotoxinas. Após um passo inicial de cleanup, o extracto é adicionado ao topo da coluna e depois eluído com diversos solventes. No passo final, o analito é eluído da camada superior do adsorvente para um nível inferior contendo Florisil. Quando submetido a uma luz de 365 nm, o analito exibe fluorescência. A utilização preliminar de placas de TLC permite a análise simultânea de várias amostras. A utilização de TLC em duas dimensões permite a obtenção de resultados de maior confiança, mas com uma redução na quantidade de amostras analisadas por placa. Os métodos quantitativos para análise de micotoxinas seguem os mesmos passos gerais que os indicados para os pesticidas, com pequenas diferenças. A técnica mais popular para separação de micotoxinas é o HPLC e a maioria destes compostos é detectada por espectroscopia de absorção electrónica ou de fluorescência. Os métodos bioquímicos usados para determinação de micotoxinas têm sofrido grandes desenvolvimentos, existindo actualmente processos de análise 99

104 para diversos destes contaminantes que recorrem a ensaios rádio-imunológicos (RIA) e a ensaios imunoenzimáticos (ELISA). Fig Análise de aflatoxinas por TLC. Uma técnica mais recente, para o isolamento de aflatoxinas a partir de matrizes biológicas, faz uso de anticorpos ligados covalentemente a uma matriz de agarose, contida numa coluna descartável de plástico. O material de empacotamento da coluna adsorve selectivamente as aflatoxinas, sendo estas depois libertadas da coluna com a ajuda de um solvente orgânico polar. Este método de cromatografia de imunoafinidade com anticorpos monoclonais permite um cleanup mais eficaz que os métodos mais tradicionais. Fig Esquema ilustrativo de um ensaio rádio-imunológico. 100

105 Fig Cromatograia de imunoafinidade com anticorpos monoclonais, aplicada ao isolamento de micotoxinas. O crescimento de microrganismos, num meio de cultura transparente, pode ser seguido pelo aumento da turvação do meio ou, em alternativa, se colocado num meio de cultura sólido, forma-se uma zona de inibição de crescimento ao redor do agente inibidor de crescimento. Esta é uma forma comum de detecção de agentes inibidores em alimentos. Fig Ensaio de inibição de crescimento microbiano. As determinações quantitativas de resíduos de medicamentos seguem também os passos de preparação de amostra e isolamento dos analitos de interesse indicados para os outros contaminantes atrás mencionados. O método mais utilizado para a separação e quantificação de resíduos de medicamentos é a cromatografia em HPLC. Este método tem a vantagem de não exigir uma preparação de amostra muito complexa. Actualmente, existem alguns procedimentos capazes de analisar resíduos múltiplos de antibióticos. 101

106 Capítulo 14 Aromas As substâncias com aroma são compostos voláteis reconhecidos pelos receptores olfactivos. Estão referenciados mais de 7000 compostos voláteis em cerca de 450 alimentos, mas apenas um pequeno número destes (5%) é relevante para o aroma. Aqueles cuja concentração está abaixo do limiar sensorial de percepção não são reconhecidos como aromas. Podem existir alterações aos aromas dos alimentos causadas por reacções enzimáticas ou não enzimáticas. Alterações não enzimáticas de aromas, à temperatura ambiente, apenas se verificam após armazenamento prolongado do alimento. Essa alteração deve-se à peroxidação lipídica, à reacção de Maillard e à degradação de aminoácidos (degradação de Strecker) com ela relacionada. Estes processos são acelerados durante o processamento térmico dos alimentos. Os compostos voláteis mais relevantes formados por reacções não enzimáticas são carbonilos, piranonas, furanonas, tióis, tioéteres, dissulfuretos e trissulfuretos, tiazóis, pirróis, piridinas, pirazinas, aminas e fenóis. 1 2 Fig Estruturas de uma piranona (1) e de uma furanona (2), compostos formados por reacções não enzimáticas. Outros aromas podem ser formados a partir de reacções enzimáticas originadas na alteração dos tecidos do alimento (corte ou trituração de frutos e vegetais, por exemplo). Também existem aromas formados por intervenção indirecta de proteínas, como nos casos de formação de aminoácidos por hidrólise de proteínas ou formação de açúcares a partir de polissacáridos. Estes compostos são depois convertidos em voláteis por reacções não enzimáticas. O 102

107 pão, a cerveja e o chá são exemplos de alimentos em que ocorre este fenómeno. 1 2 Fig Estruturas de um tiazole (1) e de uma pirazina (2), compostos formados por reacções não enzimáticas. Entre os compostos mais importantes formados por via enzimática contam-se os carbonilos, álcoois, hidrocarbonetos, ésteres, lactonas, terpenos, compostos sulfurados, pirazinas, escatol e p-cresol. 1 2 Fig Estruturas de um terpeno (1) e do escatol (2), compostos formados por reacções enzimáticas. Aromas defeituosos podem provir de susbtâncias estranhas ao alimento, por perca de compostos voléteis relevantes, ou alterações nas concentrações relativas dos compostos voláteis. A intensidade e qualidade dos aromas depende também da interacção com outros constituintes dos alimentos, nomeadamente lípidos, proteínas e hidratos de carbono. Aditivos aromatizantes, naturais e sintéticos, têm sido utilizados com os objectivos de substituir aromas naturais caros ou pouco intensos e de compensar as percas de aromas verificadas durante o processamento dos alimentos. Entre os aditivos naturais, a larga maioria provém de material vegetal, nas formas de óleos essenciais, extractos e destilados. Os compostos sintéticos podem ser idênticos aos naturais, derivados dos naturais ou estritamente sintéticos. 103

108 104 Introdução à Química Alimentar 2009

109 Capítulo 15 Técnicas de Separação Para analisar compostos individuais numa mistura complexa é necessário isolá-los e concentrá-los. Para esse efeito existem diversas técnicas, ditas separativas. Estas técnicas exploram diferenças nas propriedades físico- -químicas entre os diferentes componentes de uma mistura. As propriedades mais úteis para essa finalidade são a volatilidade, solubilidade, carga, tamanho da molécula, forma e polaridade. A maioria das técnicas de separação depende da transferência selectiva de materiais entre duas fases imiscíveis. As técnicas mais utilizadas e os sistemas de fases a elas associados estão resumidos na tabela Tabela 15.1 Técnica Extracção por solventes Extracção em fase sólida Cromatografia gasosa Cromatografia líquida Cromatografia em camada fina Cromatografia de permuta iónica Cromatografia de exclusão molecular Cromatografia com fluidos supercríticos Electroforese Electrocromatografia capilar Sistema de fases Líquido-líquido Líquido-sólido Gás-líquido Gás-sólido Líquido-líquido Líquido-sólido Líquido-sólido Líquido-líquido Líquido-sólido Líquido-líquido Fluido supercrítico-líquido ou sólido Líquido Líquido-sólido A extracção por solventes permite a transferência selectiva de materiais em pequenas quantidades ( g g) entre duas fases líquidas imiscíveis, baseada na diferença de solubilidades. A separação pode ser efectuada em regime descontínuo, em âmpolas de decantação, mas também em contínuo, utilizando um sistema de refluxo. O primeiro é o método mais simples, em que as duas fases são agitadas na âmpola, até se alcançar um equilíbrio e depois deixa-se em repouso até 105

110 separação das fases. O soluto pode ser quantitativamente transferido numa única extracção ou serem necessárias várias extracções. Fig Âmpola de decantação utilizada em extracção descontínua por solventes. Na extracção em contínuo, destila-se o solvente orgânico contido num balão, seguindo-se a sua condensação e passagem através da fase aquosa, regressando ao balão para ser reciclado. Fig Montagens para extracção em contínuo por solventes. (a) Solvente mais leve que a água; (b) Solvente mais pesado que a água. A extracção por solventes é habitualmente utilizada para isolar uma determinada espécie química, antes da sua quantificação e, menos 106

111 frequentemente, para concentração de muito pequenas quantidades. A aplicação mais vulgar é a concentração e determinação de metais e compostos orgânicos. Outra das suas vantagens é a aplicabilidade a uma vasta gama de amostras e concentrações. Uma das principais desvantagens é a necessidade de utilizar elevadas quantidades de solventes orgânicos; outra desvantagem é uma fraca resolução de misturas de substâncias orgânicas. A extracção em fase sólida (SPE) é utilizada para transferir selectivamente materiais em muito pequenas quantidades ( sub- g mg) entre um sorvente sólido e uma fase líquida. A eficiência da separação depende das diferentes afinidades relativas para as duas fases, baseadas na adsorção, no tamanho ou na carga do composto. Esta técnica tem aplicação crescente numa purificação prévia da amostra antes de uma análise cromatográfica e em pré-concentração de quantidades diminutas de analitos. Tende a substituir, com vantagem, a extracção por solventes. A principal desvantagem da extracção em fase sólida prende-se com a reduzida eficiência de algumas fases sólidas. O método alternativo, microextracção em fase sólida, apresenta dificuldades de calibração e replicabilidade. A extracção em fase sólida pode ser executada em diversos suportes. Entre os mais frequentemente utilizados contam-se os tubos de seringa de polipropileno, nos quais o sorvente é retido por discos de polietileno. Fig Extracção em fase sólida, usando como suporte tubos de seringa. 107

112 Em alternativa podem usar-se discos de fibra de vidro ou PTFE, nos quais estão embebidas as partículas de sorvente, ou ainda pontas de pipetas de plástico, cheias com pequenas esferas de sorvente. A extracção em fase sólida pode ser completa ou parcialmente automatizada, de modo a aumentar a quantidade de amostras processadas, mas também a precisão e o rigor. Fig Sistema automatizado para extracção em fase sólida. A microextracção em fase sólida (SPME) é uma variante que permite a determinação de quantidades reduzidas de analitos em amostras líquidas ou gasosas, através da concentração destas em fibras ópticas revestidas com uma camada de uma substância polimérica, usada como fase estacionária em cromatografia gasosa. Deste modo, a fibra pode ser directamente inserida num cromatógrafo gasoso. Todas as técnicas cromatográficas têm por base o mesmo princípio: a variação na velocidade de migração de diferentes componentes de uma amostra, através de uma fase estacionária, sob a influência de uma fase móvel. A velocidade de migração varia devido a diferenças nas razões de distribuição entre as fases. Durante uma separação cromatográfica, as moléculas do soluto movem-se continuamente entre as fases móvel e estacionária. Enquanto permanecem na fase móvel, são empurradas por esta, mas permanecem quase estacionárias enquanto estão na fase estacionária. A velocidade de migração de cada soluto é assim determinada pela proporção de tempo em que permanece na fase móvel. As separações cromatográficas podem ser classificadas segundo quatro diferentes mecanismos de sorção: adsorção à superfície, partição, permuta iónica e exclusão. 108

113 Fig Princípio de funcionamento da microextracção em fase sólida. No mecanismo de adsorção à superfície, as polaridades relativas do soluto e da fase estacionária sólida determinam a velocidade do movimento do soluto através de uma coluna ou de uma superfície. Se a fase estacionária for constituída por um suporte sólido inerte revestido à superfície por um líquido, o movimento do soluto será determinado apenas pela sua solubilidade relativa nas duas fases, ou pela sua volatilidade, se a fase móvel fôr um gás. Este mecanismo é designado por partição. Fig Diagramas dos mecanismos de separação cromatográfica por adsorção e por partição. 109

114 Os mecanismos de adsorção e partição podem ocorrer em simultâneo, sendo a contribuição de cada um deles determinada pelas naturezas das fases estacionária e móvel, do suporte sólido e do soluto. Na separação por permuta iónica, a fase estacionária é um polímero sólido permeável, ao qual estão ligados grupos carregados e contra-iões móveis, os quais podem permutar com os iões do soluto, transportados pela fase móvel. O processo de exclusão não é um verdadeiro processo de sorção, pois os solutos ficam permanentemente na fase móvel. A separação dá-se devido à diferente difusão dos solutos através de uma fase estacionária inerte mas porosa. Esta é habitualmente um gel, com pequenos poros, através dos quais apenas moléculas pequenas conseguem passar, sendo retardadas no atravessamento da coluna. Moléculas maiores são excluídas e atravessam livremente a coluna. Fig Diagramas dos mecanismos de separação cromatográfica por permuta iónica e por exclusão. Um gráfico da concentração do soluto na fase móvel em função da sua concentração na fase estacionária, a temperatura constante, deveria ser linear e o perfil de concentração simétrico. Em sistemas não ideais ocorrem distorções, designadas por tailing e fronting. A ocorrência destes efeitos é indesejável, pois conduz a más separações e quantificações imprecisas. O fenómeno de tailing tem tendênccia a ocorrer em processos de adsorção, enquanto que o de fronting ocorre mais frequentemente em mecanismos de partição. A causa mais frequente de ambos é uma sobrecarga da coluna com amostra em excesso. A velocidade de um soluto é dada pelo seu coeficiente de distribuição. D C C fase estacionária (15.1) fase móvel 110

115 Este indica que, quanto maior D, mais lento será o progresso do soluto através do sistema cromatográfico. Fig Isotermas de sorção e perfis de concentração em cromatografia. (a) Isoterma linear; perfil Gaussiano. (b) Isoterma curva; tailing. (c) Isoterma curva; fronting. Em cromatografia em coluna, mede-se o volume de retenção (V R ) definido como o volume que atravessa a coluna entre o momento de aplicação da amostra no seu topo e a saída do soluto no outro extremo. V M é o volume de fase móvel na coluna (designado por volume morto) e k é o factor de retenção, directamente proporcional a D. VR VM kvm (15.2) Para um fluxo F constante de fase móvel V R Ft (15.3) R No caso de o fluxo ser conhecido, o tempo de retenção t R pode ser usado como medida de V R. Nas cromatografias em papel e em camada fina, o processo de separação é parado numa fase em que os componentes separados ficam no suporte, sob a forma de manchas. A velocidade do soluto pode ser medida pelo factor de retenção, R f. distância percorrida pelo centro da mancha do soluto Rf (15.4) distância percorrida pela frente da fase móvel 111

116 As distâncias são medidas a partir do ponto de aplicação da amostra. R f tem uma relação inversa com D. Numa análise cromatográfica ideal, os componentes de uma mistura deveriam estar completamente separados uns dos outros no mais curto período de tempo possível. O desempenho de um processo cromatográfico pode ser avaliado pela sua eficiência e resolução e pela assimetria dos picos. A largura de uma banda ou pico é uma medida da eficiência do processo, e a resolução é determinada pela capacidade de resolver picos de componentes com valores de t R ou R f semelhantes. Fig Exemplo de um cromatograma e respectivos parâmetros. A eficiência da separação, numa coluna, está relacionada com o tempo de retenção e a largura do pico e é dada pelo número de pratos teóricos, N. O modelo dos pratos teóricos considera transferências sucessivas entre as quais se estabelece um equilíbrio termodinâmico. Cada volume assim definido é um prato teórico. N L H (15.5) 112

117 Fig Diagrama ilustrativo do modelo dos pratos teóricos. Nesta equação, L é o comprimento da coluna e H a altura equivalente de cada prato teórico. Considerando que um pico representa uma distribuição aproximadamente Gaussiana, a eficiência pode ser dada por N 16 tr l 2 (15.6) em que l representa a largura do pico na base. Alternativamente, como é frequentemente mais fácil medir a largura a meio do pico, l h/2, pode usar-se a equação 15.7 para determinar a eficiência. N t 5.54 r lh 2 2 (15.7) A resolução, R S, de uma coluna mede a capacidade de separar dois solutos e é medida a partir do cromatograma, relacionando a separação entre dois picos adjacentes com a média da sua largura. R s 2 tr tr l A B l B A (15.8) Fig Ilustração do conceito de resolução. W A e W B são as larguras dos picos, correspondentes às notações l A e l B. 113

118 É aceite que um valor de R S 1.5 é indicativo de uma boa separação. A resolução de uma coluna pode também ser dada pela expressão 15.9, em que N é o número de pratos teóricos para o segundo soluto, k B o seu factor de retenção e o factor de separação, ou selectividade. R S N 1 k B 4 1 kb (15.9) t k t k (15.10) ' rb ' ra ' B ' A A largura de um pico é determinada pela difusão total do soluto, durante o seu movimento através do sistema cromatográfico e pela velocidade de transferência de massa entre as duas fases. Os dois efeitos são interdependentes e complexos. Tratando-se de efeitos cinéticos, a sua influência na eficiência é determinada pela velocidade da fase móvel através do sistema. Fig Efeitos da difusão e transferência de massa na largura do pico. (a) Perfis de concentração do soluto no início da separação. (b) Perfis de concentração do soluto após atravessar parte do sistema. A chamada equação de van Deemter é usada para definir eficiência em termos cinéticos. A é o termo anisotrópico, que traduz a existência de vários trajectos possíveis e reflecte a homogeneidade da fase estacionária. O seu efeito é minimizado pela redução do tamanho da partícula, mas aumenta com o comprimento da coluna. u representa a velocidade linear da fase móvel. O termo B/u representa a difusão longitudinal e reflecte a difusão das moléculas de soluto na fase móvel, causada por gradientes locais de concentração. A difusão através da fase estacionária também contribui para este termo, o qual apenas é significativo para fluxos reduzidos e aumenta com o comprimento da coluna. É um termo inversamente proporcional ao fluxo. C.u é o termo que representa a transferência de massa e resulta do tempo que as moléculas de 114

119 soluto demoram a deslocar-se entre as duas fases. Tem em conta os factos de que: moléculas colocadas no centro do fluxo avançam mais rapidamente que as restantes; a fase estacionária não tem uma forma regular, o que provoca diferenças na retenção das moléculas. O efeito deste termo é mínimo para pequenos diâmetros de partícula e aumenta com o fluxo e o comprimento da coluna. B H A C. u (15.11) u Fig Eficiência como função da velocidade da fase móvel e efeito de cada termo da equação de van Deemter. Da análise do gráfico da Fig pode concluir-se que: a separação é máxima para H mínimo; B domina para u baixos e C domina para u elevados; a difusão é muito menos significativa em cromatografia líquida (HPLC); A é menor em cromatografia líquida, pelo que H min é cerca de 10 vezes menor que em cromatografia gasosa e obtém-se para valores de u cerca de 10 vezes inferiores; os picos tendem a alargar mais em cromatografia gasosa que em cromatografia líquida. O coeficiente de distribuição dos solutos, D, depende da temperatura, pelo que a escolha da temperatura de operação tem um enorme efeito sobre a separação cromatográfica. Um aumento na temperatura causa uma diminuição em D e um correspondente decréscimo no tempo de retenção. Assim, um aumento de temperatura torna a cromatografia mais rápida mas tal pode ter como consequência uma pior resolução, pelo que terá sempre que se procurar um compromisso entre ambos. A eluição com gradiente é um procedimento em que as condições de eluição da amostra variam progressivamente, de modo a acelerar o processo. Para tal pode alterar-se a composição da fase móvel, aumentar a temperatura 115

120 ou o fluxo. O efeito é uma mais rápida eluição dos componentes no final da cromatografia e uma melhoria no perfil de eluição. Na cromatografia em fase gasosa (GC), a separação dos componentes é conseguida por vaporização da amostra numa fase móvel gasosa, através de uma coluna contendo uma fase estacionária líquida (cromatografia gás-líquido) ou sólida (cromatografia gás-sólido). Os componentes da amostra migram com velocidades dependentes do ponto de ebulição, da solubilidade ou da adsorção. Na cromatografia gás-líquido (GLC) o processo dominante é a partição, enquanto na cromatografia gás-sólido, a adsorção é o principal processo de separação. Em ambos os casos, as amostras terão que ser voláteis e termicamente estáveis à temperatura de trabalho. Fig Diagrama de um cromatógrafo gasoso. Os gases mais frequentemente utilizados na fase móvel são o azoto, hélio e hidrogénio, sendo a escolha feita em função do tipo de coluna (empacotamento ou capilar) utilizada, do preço e do detector utilizado. Hélio e hidrogénio são preferidos para colunas capilares, já que se adaptam melhor a fluxos mais elevados. A introdução da amostra no cromatógrafo pode ser realizada por diversas técnicas: injecção em split uma válvula desvia a maior parte da amostra injectada para a atmosfera, passando apenas 2% ou menos para a coluna. No caso de amostras com componentes tendo pontos de ebulição muito diferentes, estes tendem a ser separados em 116

121 diferentes proporções, o que constitui uma limitação da técnica. Esta técnica de injecção só é aplicável quando não se pretende uma sensibilidade elevada, já que a maioria da amostra não é analisada. injecção em splitless amostra colocada no injector a uma temperatura inferior ao ponto de ebulição do componente mais volátil, sendo depois aquecida de modo a eluir sequencialmente os componentes. A técnica só se aplica no caso de todos os componentes da amostra possuirem pontos de ebulição relativamente elevados. injecção on-column permite a introdução directa de amostras líquidas muito pequenas no topo da coluna fria. Esta técnica reduz o risco da decomposição de compostos termo-sensíveis. Fig Diagrama de um injector em split para coluna capilar. A coluna pode ser feita de aço inoxidável, vidro ou quartzo, tendo de 1 m a 100 m de comprimento e um diâmetro interno entre 0.1 mm e 3 mm. A coluna é colocada num forno, cuja temperatura pode ser controlada, operando em condições isotérmicas (temperatura constante durante a separação) ou de gradiente (temperatura sobe durante a separação). As colunas de empacotamento são mais curtas e mais grossas e fabricadas em aço inoxidável ou vidro. Em GLC são preenchidas com um sólido 117

122 inerte e poroso, que serve de suporte a uma fase estacionária líquida ou semi- -líquida. Para utilização em GSC, as colunas têm uma fase estacionária sólida. Estas colunas são mais baratas que as capilares, mas possuem menor eficiência de resolução. Fig Diagrama de um injector on-column. Nas colunas capilares a fase estacionária líquida reveste ou está ligada à parede interior do tubo de quartzo. O exterior da coluna pode ser revestido com alumínio ou um polímero plástico, para protecção. A sua maior resolução é fruto de um muito maior número de pratos teóricos. O detector deverá responder a modificações na composição do gás que emerge da coluna, à medida que os solutos vão eluindo. Um detector ideal deveria: responder rapidamente à presença de um soluto; dar uma resposta linear numa vasta gama de concentrações; possuir uma elevada sensibilidade; ser estável. Apesar de existirem mais de doze tipos de detectores disponíveis para GC, apenas aqueles que usam a condutividade térmica, ionização de chama e captura electrónica são frequentemente usados. Compostos não voláteis ou termo-sensíveis podem ser derivatizados para aumentar a sua volatilidade ou estabilidade. Compostos com grupos funcionais 118

123 hidroxilo, carbonilo e amino podem ser feitos reagir com reagentes adequados, de modo a converter esses grupos polares em derivados menos polares e mais voláteis (metilo, trimetilsililo ou trifluoroacetilo). Entre os compostos mais frequentemente sujeitos a derivatização para análise em GC contam-se os ácidos gordos, hidratos de carbono, fenóis e aminoácidos. A identificação dos compostos separados em cromatografia gasosa pode ser efectuada por comparação dos seus tempos de retenção com padrões, por recolha e posterior análise com outras técnicas ou hifenando outros métodos com o GC, através de uma interface. Uma dessas técnicas hifenadas é a espectrometria de massa. A principal dificuldade em juntar estes dois métodos é o facto de que o espectrómetro de massa trabalha a baixa pressão enquanto o gás saído do cromatógrafo vem à pressão atmosférica. No entanto, a evolução tecnológica permite que hoje em dia esta seja uma das técnicas mais relevantes para identificação de compostos em GC. Uma outra é a junção da espectroscopia de Infra-vermelho com a cromatografia gasosa, embora a sua menor sensibilidade contribua para um reduzido sucesso da técnica. A quantificação dos compostos é conseguida por integração dos picos no cromatograma, sendo que a área do pico é directamente proporcional à concentração do soluto. Para que tal método possa ser utilizado, é necessário que as condições de operação sejam padronizadas e que sejam conhecidos os factores de resposta dos detectores. Se os componentes de uma mistura forem todos idênticos e forem todos detectados, pode determinar-se o teor em percentagem de cada um deles área do componente x % x (15.12) área total de todos os componentes Esta fórmula só será válida se a sensibilidade do detector for a mesma para todos os componentes. Caso contrário, a resposta para cada componente terá que ser determinada com o recurso a padrões. Neste caso, as áreas determinadas serão multiplicadas pelos factores de correcção obtidos. Podem usar-se dois métodos de quantificação por adição de padrão: padrão interno adiciona-se uma quantidade conhecida do padrão à amostra, antes de esta ser cromatografada. Calcula-se a razão das áreas do pico do padrão sobre a do pico do componente e converte-se esta razão no peso do componente através de uma 119

124 curva de calibração previamente preparada. O padrão interno deverá ter um tempo de retenção próximo do dos componentes a determinar, mas com uma boa separação. Deverá ainda estar presente na mesma gama de concentrações. adição de padrão se estiver disponível uma amostra pura do componente a determinar, essa amostra poderá ser cromatografada antes e após a adição de uma quantidade conhecida do componente puro. O seu teor na amostra é obtido a partir da razão das áreas dos picos nos dois cromatogramas. Em cromatografia líquida (LC) e mais em particular em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é possível separar componentes de misturas em quantidades entre g e g por passagem da mesma através de uma coluna contendo uma fase estacionária sólida. A fase móvel é um líquido a pressão elevada. A separação dos componentes é baseada nas diferenças de afinidade para as fases móvel e estacionária devido a propriedades de adsorção, tamanho e carga. Em cromatografia líquida clássica são utilizadas colunas à pressão atmosférica, com as desvantagens de más separações e longo tempo de operação. Uma melhor separação pode ser conseguida usando fases estacionárias com menor diâmetro de partícula e uma redução no tempo de análise é conseguida usando fluxos mais elevados e trabalhando a pressões superiores. A técnica de HPLC é mais versátil que GC, já que não se limita a compostos voláteis e termo-estáveis e também as fases móveis e estacionárias são mais diversificadas. Fig Diagrama de um cromatógrafo HPLC. 120

125 Em HPLC, a injecção é quase sempre realizada através de uma válvula, a qual permite uma elevada reprodutibilidade. As colunas mais vulgares são fabricadas em aço inoxidável. A grande versatilidade de fases estacionárias disponíveis permite tirar partido de todos os mecanismos cromatográficos de separação. Em HPLC, a escolha de uma fase móvel adequada é crucial para a eficiência da separação. Quando o sistema funciona em fase normal (fase estacionária polar fase móvel não polar) a capacidade de eluição aumenta com o aumento da polaridade do solvente, enquanto que em fase reversa (fase estacionária não polar fase móvel polar) a capacidade de eluição diminui com o aumento de polaridade do solvente. É frequente que a utilização de misturas de mais que um solvente produza melhores resultados que a utilização de um único solvente. Quando se trabalha com um único solvente ou uma mistura de solventes com composição fixa, diz-se que se trata de operação em condições isocráticas e quando essas condições variam designa-se por eluição com gradientes. O detector ideal em HPLC deverá apresentar as mesmas características que para GC, nomeadamente resposta rápida e reprodutível para os solutos, resposta linear para uma ampla gama de concentrações, elevada sensibilidade e estabilidade. Os detectores mais vulgares são os de absorção electrónica e de índice de refracção. Outros detectores mais sensíveis, mas mais específicos são os de fluorescência e condutividade eléctrica. Existem outros ainda, mas com aplicação mais limitada. De modo semelhante à GC, a análise qualitativa em HPLC é feita por comparação dos dados de retenção. A recolha de componentes isolados para posterior análise por outras técnicas (IV, MS, NMR) é fácil de realizar, mas os métodos hifenados tendem a sobrepor-se a essa prática. A análise quantitativa também é efectuada de modo semelhante à indicada para GC. A interface entre um HPLC e um detector de espectrometria de massa também coloca algumas dificuldades, existindo diversas soluções possíveis e também diversos processos de ionização dos componentes separados em HPLC. Uma variante de HPLC, designada por cromatografia iónica, foi desenvolvida para a separação de iões inorgânicos e também de alguns orgânicos. Para tal, são utilizadas colunas de permuta iónica e os iões são detectados através da sua condutividade ou, em alternativa, por espectroscopia de absorção electrónica. 121

126 Para separar aniões, a coluna tem uma fase estacionária de permuta aniónica, com iões HCO. Para a análise de catiões, utilizam-se resinas catiónicas na forma de H +. A cromatografia com fluidos supercríticos é uma técnica mais recente, a qual utiliza um fluido supercrítico como fase móvel. Para atingir o estado supercrítico, o solvente é sujeito a elevadas temperatura e pressão, o que provoca alterações na sua densidade, viscosidade e coeficiente de difusão. O solvente mais utilizado é o CO 2. A aparelhagem utilizada tem por base elementos usados em GC e HPLC. Para optimizar a separação é frequente utilizar gradientes de pressão. Podem ser utilizados detectores típicos de GC, como os de ionização de chama, ou de HPLC, como os de UV ou de fluorescência. Em cromatografia com fluidos supercríticos também são utilizados detectores hifenados, tais como IV e MS. A cromatografia em camada fina (TLC) utiliza camadas finas de uma fase estacionária aplicadas sobre suportes de vidro, plástico ou alumínio. Quando um solvente atravessa essa superfície, por capilaridade, provoca o arrastamento dos componentes de uma dada mistura com diferentes velocidades, dependendo das suas propriedades de solubilidade, adsorção, tamanho ou carga. A distância percorrida é medida ou as manchas produzidas são removidas para posterior análise por métodos espectrométricos. Fig Exemplo de um cromatograma em TLC. Os materiais utilizados para fase estacionária em cromatografia em coluna, de permuta iónica ou de exclusão, também podem ser usados em TLC. A fase móvel é escolhida, sobretudo, com base em experiência prévia. 122

127 A identificação de componentes pode ser feita apenas com base nos valores de R f, comparando-os com os de padrões, analisados em condições idênticas. Em alternativa, as manchas podem ser removidas da placa e analisadas por métodos qualitativos. A análise quantitativa só pode ser efectuada em circunstâncias particulares e nunca é muito rigorosa. Um processo semelhante à cromatografia é a separação por exclusão molecular. Utiliza-se um gel que separa os componentes segundo o seu peso molecular e a sua forma. Os poros do gel excluem moléculas maiores que um certo tamanho crítico, permitindo a difusão através do gel das menores. As moléculas maiores saem mais rapidamente, enquanto as restantes eluem a velocidades dependentes do seu grau de permeação através do gel. Existem géis hidrofílicos e hidrofóbicos, permitindo a separação de uma vasta gama de compostos. Um outro método de separação com crescente aplicação na química alimentar é a electroforese. O mecanismo de separação baseia-se na migração diferencial de substâncias com carga, através de uma superfície ou de uma coluna, devido à acção de um gradiente de potencial. A velocidade de migração depende do tamanho, carga e forma da molécula. A electroforese tradicional é realizada sobre suporte de papel, acetato de celulose ou géis poliméricos. Mais recentemente foi introduzida a electroforese capilar que se efectua em tubos capilares de sílica. Na electroforese tradicional, a amostra é colocada no centro do suporte e os componentes são separados em manchas individuais. A detecção é efectuada através de reagentes reveladores, os quais permitem visualizar o electroferograma obtido. Fig Princípio de operação da separação por electroforese. 123

128 A mobilidade das substãncias é afectada pela temperatura, ph e força iónica, pelo que é necessário controlar estes parâmetros, de modo a obter resultados reprodutíveis e comparáveis. Duas variantes desta técnica são a focagem isoeléctrica e a imuno- -electroforese. A primeira complementa a separação por gradiente de potencial com gradientes de ph e de densidades; a segunda utiliza interacções específicas antigene-anticorpo. Na electroforese capilar, aplica-se uma tensão de corrente mais elevada e detectores semelhantes aos usados em HPLC (absorção electrónica, fluorescência,...), o que origina a obtenção de perfis semelhantes aos picos cromatográficos, embora mais estreitos. Nesta versão da electroforese, a introdução da amostra faz-se pelo extremo do tubo oposto ao do detector, por via hidrodinâmica ou electrocinética. No primeiro caso, a amostra é introduzida no tubo por gravidade, pressão positiva ou vácuo; no segundo, a amostra entra por efeito de uma diferença de potencial aplicada. Fig Métodos de operação em electroforese capilar. (a), (b) e (c) Hidrodinâmica. (d) Electrocinética. A electrocromatografia capilar é uma técnica híbrida entre a electroforese capilar e HPLC. Utiliza colunas de elctroforese capilar empacotadas com fase estacionária típica de HPLC e um tampão de ph > 4. Estabelece-se um fluxo electroosmótico do tampão, devido à aplicação de uma corrente eléctrica, em direcção ao extremo catódico do capilar. Esta técnica apresenta as vantagens 124

129 de uma maior eficiência e menor consumo de solvente que HPLC e maior facilidade em ligar um detector de espectrometria de massa. 125

130 Capítulo 16 Métodos Espectrométricos Todas as técnicas espectrométricas dependem da absorção ou emissão de radiação electromagnética e das variações de energia associadas, em sistemas atómicos ou moleculares. As variações de energia estão associadas aos níveis discretos de energia atribuídos a átomos e moléculas. As transições entre esses níveis energéticos permitem obter informação quantitativa e qualitativa sobre as espécies químicas. A radiação electromagnética tem carácter ondulatório, mas as suas absorção e emissão possuem uma natureza quântica. Uma onda pode ser caracterizada em termos de frequência ( ), comprimento ( ) e amplitude (A). A energia é proporcional à frequência da radiação e inversamente proporcional ao comprimento de onda. Fig Representação esquemática de uma onda electromagnética. A frequência e o comprimento de onda estão relacionados pela expressão c (16.1) em que c é a velocidade de propagação da onda no vácuo (2.998x10 8 ms -1 ). A teoria quântica considera a radiação como um fluxo de fotões (ou quanta) que se deslocam no espaço a velocidade constante (c). A energia de um fotão é dada por 126

131 E h (16.2) em que h é a constante de Planck (6.6x10-34 Js). A energia total de um átomo ou de uma molécula inclui diversas contribuições: do interior do núcleo (energia nuclear), de interacções entre electrões e o núcleo (energia electrónica), dos spins electrónico e nuclear, dos movimentos rotacionais e vibracionais das moléculas e da translacção de átomos ou moléculas através do espaço. Todas estas formas de energia, excepto a translaccional, são descontínuas. Para cada forma de energia, um átomo ou molécula podem existir em níveis discretos de energia, definidos por números quânticos e de acordo com uma formulação matemática. A dimensão das várias formas de energia e as diferenças entre os níveis adjacentes são muito diferentes. Os níveis energéticos que um átomo ou uma molécula podem ocupar, em condições ambientes, são determinados pelas regras da teoria quântica e pela equação de Maxwell-Boltzmann (16.4). Estes são designados por níveis do estado fundamental, os de maior energia são chamados níveis do estado excitado. Fig Níveis energéticos electrónico, vibracional e rotacional (escala não real). Quando uma substância é irradiada com radiação electromagnética, a energia dos fotões incidentes pode ser transferida para os seus átomos e moléculas, obrigando-os a passar do estado fundamental para um estado excitado. Este processo de absorção pode ser traduzido pela equação E2 E1 E h (16.3) 127

132 em que E 1 e E 2 são os dois níveis de energia. A energia absorvida é rapidamente perdida por colisões, permitindo que o sistema reverta para o estado fundamental. Se, em alternativa, a energia for reemitida, o processo designa-se por fluorescência. Fig Ilustração dos processos de absorção (esquerda) e de emissão de fluorescência (direita). A informação que pode ser obtida sobre estas transições de energia, é apresentada sob a forma de espectros, representações gráficas do grau de absorção ou da intensidade de emissão da radiação, em função da frequência, comprimento de onda ou número de onda. As riscas espectrais resultantes de transições em átomos ou moléculas no estado gasoso são estreitas, tal como aquelas originadas em transições de spin nuclear ou electrónico. Já os espectros de absorção molecular nas regiões do ultra-violeta, vísivel e infravermelho apresentam conjuntos de riscas não completamente resolvidas (bandas) devido às colisões entre as moléculas do soluto e do solvente e a limitações instrumentais. As populações relativas de cada nível energético, ou seja as proporções do analito que os ocupam, têm uma influência directa nas intensidades das riscas e são determinadas pelo espaçamento dos níveis e pela temperatura. Estas relações são definidas pela equação de Maxwell-Boltzmann. n2 g2 E exp n g kt 1 1 (16.4) n 1 e n 2 são o número de espécies nos estados de energia E 1 e E 2, separados por E, g 1 e g 2 são factores estatísticos, k é a constante de Boltzmann (1.38x10-23 JK -1 ) e T é a temperatura. 128

133 A partir desta equação, verifica-se que os espectros de absorção nas regiões do UV, visível e IV resultam sempre e unicamente de transições a partir do estado fundamental. A análise quantitativa em espectrometria é possível devido à existência de uma proporcionalidade directa entre a intensidade de uma risca ou banda e o número de átomos ou moléculas envolvidos na transição. Informação qualitativa sobre a composição e estrutura de uma amostra é obtida através da posição e intensidades relativas das riscas ou bandas do espectro. Apesar de bastante diferentes entre si, os aparelhos usados em espectrometria possuem três elementos característicos: gerador de radiação com frequência apropriada às variações de energia pretendidas na amostra; análise do espectro produzido por essa radiação, de modo a obter informação qualitativa; medição da intensidade da radiação nas frequências seleccionadas, para obtenção de informação quantitativa. As técnicas de espectrometria atómica permitem análise quantitativa e qualitativa, dado que produzem espectros caracterizados por riscas estreitas, cujos comprimentos de onda são característicos de cada elemento e cujas intensidades são proporcionais ao número de átomos associados à transição. Tratando-se de técnicas muito sensíveis, a sua principal utilização é na análise elementar de compostos em baixas concentrações. De acordo com a teoria quântica, os electrões de um átomo ocupam orbitais segundo um conjunto de quatro números quânticos, cujos valores permitidos (Tabela 16.1) são determinados por regras matemáticas. Os electrões tendem a ocupar as orbitais com a mais baixa energia possível, seguindo o princípio de exclusão de Pauli, o qual diz que num átomo não existem dois electrões que possam ser definidos pelo mesmo conjunto de valores para os quatro números quânticos n, l, m l e s. As formas e energias dos orbitais são determinadas pelos valores dos números quânticos e por efeitos interelectrónicos. A espectrometria de emissão atómica baseia-se na emissão de radiação electromagnética nas regiões do UV e do vísivel a partir de átomos e de iões, após excitação electrónica. É utilizada para a detecção de minerais em pequenas quantidades e para análise quantitativa de metais, sobretudo em 129

134 amostras sólidas. Embora a precisão seja moderada, esta técnica é bastante usada devido à rapidez de processamento dos resultados obtidos. Tabela 16.1 Número quântico Símbolo Parâmetro Valores permitidos principal n distância radial inteiro de 1 a secundário l ângulo inteiro de 0 a (n-1) magnético m l ângulo inteiro de 0 a ±1 spin s spin ±½ Uma alternativa mais recente a esta técnica faz uso de plasma gasoso a alta temperatura ou de um laser como fontes de excitação, o que permite uma maior precisão quer na análise quantitativa quer na qualitativa. As principais desvantagens da espectrometria de emissão por plasma são a necessidade de dissolução da amostra e o preço elevado do equipamento. Fig Diagrama de níveis de energia para o átomo de sódio. Os níveis estão identificados pelo número quântico principal n, pelo número quântico de orbital l e pelo número quântico de spin s. A excitação por plasma induzido também pode ser acoplada à espectrometria de massa, dando origem a uma técnica designada por ICP-MS (Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry), com a qual se pode obter informação qualitativa por separação dos iões atómicos formados e quantitativa por medição da corrente iónica gerada. A amostra é introduzida por um 130

135 nebulizador, vaporização com laser ou aquecimento eléctrico e os iões produzidos são analizados no espectrómetro de massa. É utilizada na análise de elementos em baixas concentrações (ppb), embora sofra de uma precisão nem sempre elevada e seja uma técnica cara. Fig Esquema de um espectrómetro de emissão atómica. A espectrometria de absorção atómica baseia-se na absorção de radiação electromagnética, nas regiões do UV e do vísivel, por átomos. As resultantes alterações na estrutura electrónica são medidas, de modo a obter informação quantitativa. A detecção faz-se a partir da passagem de radiação característica de um dado elemento através do vapor atómico da amostra. Este vapor é produzido por aspiração de uma solução para uma chama ou por evaporação a partir de uma superfície aquecida por corrente eléctrica. É uma técnica muito utilizada para determinação quantitativa de metais em baixas concentrações ( ppm) e com uma razoável precisão. A absorção medida é proporcional à concentração do elemento na amostra. Fig Esquema de um sistema ICP-MS. As principais limitações desta técnica são a necessidade de uma amostra líquida e a necessidade de uma lâmpada de detecção para cada elemento. 131

136 Fig Esquema de um espectrómetro de absorção atómica. As medidas quantitativas podem ser realizadas com o recurso a curvas de calibração previamente preparadas ou através da adição de padrão, sendo necessário que a resposta instrumental seja linear na gama de concentrações considerada. Na espectrometria de fluorescência atómica detecta-se a radiação de fluorescência característica emitida pelo vapor atómico de um analito, após a sua irradiação com radiação UV/vísivel. Na prática, esta técnica está limitada ao elemento volátil Hg e a outros que podem ser tornados voláteis (As, Se, Te, Bi, Cd). Tem uma sensibilidade na gama das ppb e é razoavelmente precisa. A intensidade da emissão de fluorescência é directamente proporcional à concentração dos átomos, mas é reduzida devido a colisões entre os átomos excitados e outras espécies (extinção de fluorescência). Na espectroscopia de emissão de raios X, observa-se radiação emitida por transições envolvendo electrões K e L. Fazem-se medidas qualitativas a partir dos comprimentos de onda e quantitativas a partir das intensidades das emissões. É uma técnica que permite a análise não destrutiva de amostras sólidas ou líquidas, mas com uma sensibilidade e precisão não muito elevadas. As transições electrónicas nas camadas internas de um átomo envolvem variações de energia consistentes com a absorção ou emissão de radiação com elevada energia (baixo comprimento de onda). Tal conduz à obtenção de espectros simples e característicos dos elementos presentes. 132

137 Fig Um electrão da esfera K é ejectado do átomo por uma fonte externa de excitação (raios X) criando uma vaga. Um electrão das camadas L ou M salta para preencher a vaga. Ao fazê-lo emite um raio X característico do elemento, produzindo uma vaga nas camadas L ou M e assim sucessivamente. As técnicas de espectrometria molecular são mais variadas e completas quanto à informação analítica que proporcionam. Incluem contribuições de movimentos translaccionais, rotacionais e vibracionais a partir de electrões que ocupam os orbitais moleculares e de spins nucleares. A separação entre os níveis quânticos de energia varia na ordem Eelectrónica Evibracional Erotacional Espin nuclear os níveis translaccionais não estão incluidos, pois são demasiado próximos, não permitindo a sua quantização. 133

138 Em análise, existem três técnicas com maior relevo: espectrometria no ultra-violeta e vísivel (electrónica), espectrometria no infra-vermelho (vibracional) e espectrometria de ressonância magnética nuclear (spin nuclear). A espectrometria de massa fornece informação estrutural semelhante, mas é uma técnica destrutiva que funciona segundo princípios diferentes. Os métodos quantitativos baseados na absorção de radiação electromagnética envolvem a medida da radiação transmitida pela amostra, a qual é proporcional à concentração da espécie que absorve a radiação, na amostra. Esta relação é descrita pela lei de Beer-Lambert. I 0 log I A cl (16.5) I 0 e I são, respectivamente, as intensidades das radiações incidente e transmitida, A a absorvância, c a concentração da espécie que absorve a radiação, l é a espessura do meio que absorve a radiação (na prática, o trajecto óptico da cuvette) e é uma constante designada por coeficiente de absorção molar. O valor de depende da natureza da espécie e do comprimento de onda da radiação incidente. A absorvância está relacionada com a fracção de radiação transmitida (transmitância, T) pela espécie, de acordo com 1 A log (16.6) T A absorvância é uma propriedade aditiva, pelo que, a um dado comprimento de onda, a absorção total de uma solução contendo vários componentes que absorvem radiação é dada por A c l c l (16.7) total considerando que não existem interacções entre as espécies. Para aplicar a lei de Beer-Lambert, deve preparar-se previamente uma recta de calibração da absorvância de diversos padrões em função da sua concentração. Esta recta deverá passar pela origem e ter um declive igual a l. As medidas de absorvância são habitualmente feitas no valor máximo da curva, de modo a minorar erros. A lei de Beer-Lambert é aplicável apenas a soluções diluídas e a radiação monocromática. Para concentrações elevadas (~>0.01 M) ocorrem desvios. Se se quiser analisar apenas uma substância, obtêm-se bons resulatados com um simples fotómetro. Quando aplicada na zona do vísivel, esta técnica é 134

139 denominada colorimetria. Nesta técnica simples não é válida a lei de Lambert- Beer e não existe compatibilidade entre equipamentos diferentes. Devido a estas limitações é mais frequente a utilização da espectrofotometria. A espectrometria no ultra-violeta e vísivel resulta da absorção de radiação nessas regiões do espectro, a qual origina alterações na estrutura electrónica de iões e moléculas. É uma técnica apenas válida para amostras em solução e com dificuldades de aplicação em misturas não previamente separadas. A absorção de radiação nas regiões vísivel e ultra-violeta origina transições electrónicas entre os orbitais moleculares e, devido às relativamente elevadas variações de energia, ocorrem simultaneamente variações nas energias vibracional e rotacional. À temperatura ambiente, todas as moléculas estarão no estado electrónico fundamental e, provavelmente, no nível vibracional mais baixo. A absorção de energia provoca transições para qualquer nível vibracional no primeiro estado excitado. Devido às interacções entre as moléculas do soluto e as do solvente, não são observadas riscas, mas sim bandas largas. Estas bandas são caracterizadas pela posição do seu máximo de absorvância ( max ) e correspondente absorptividade molar. Para moléculas poliatómicas e complexos metálicos, o espectro pode ter diversas bandas, resultantes de diversas transições electrónicas e estruturas vibracionais e rotacionais associadas. De acordo com a teoria dos orbitais moleculares, a interacção entre orbitais atómicos conduz à formação de orbitais moleculares ligantes e anti- -ligantes. Estes podem ser dos tipos ou. Existem ainda orbitais moleculares não ligantes n, ocupados por electrões que não participam na ligação. Fig Formas, energias relativas dos orbitais moleculares e transições possíveis entre eles. 135

140 Na maioria dos compostos orgânicos, os orbitais ligantes e não ligantes estão preenchidos e os anti-ligantes desocupados. As transições de menor energia (bandas no vísivel e UV próximo) são aquelas entre orbitais não ligantes e orbitais anti-ligantes, n *. As transições n * e * possuem energias semelhantes entre si e dão origem a bandas a comprimentos de onda superiores. As transições * ocorrem a menos de 200 nm e têm pouca utilidade analítica. Os hidrocarbonetos saturados que são transparentes nas zonas do vísivel e UV próximo são bons solventes para esta técnica. As bandas mais intensas são produzidas pelas transições * e *, enquanto as resultantes de transições n * e n * são mais fracas. Moléculas não saturadas (cromóforos) são responsáveis pelas absorções n * e * adequadas a análise quantitativa, já que produzem bandas nas zonas do vísivel e UV próximo. A espectrometria no ultra-violeta e vísivel é usada em análise quantitativa, por comparação das absorvâncias de padrões com as das amostras, a um dado comprimento de onda. Esta é a principal aplicação desta técnica, podendo mesmo ser aplicada a misturas não muito complexas, devido à propriedade aditiva das absorvâncias. Outras aplicações desta espectrometria incluem a determinação da estabilidade termodinâmica ou cinética de compostos, para estudos fundamentais ou com objectivos analíticos. A absorção de radiação electromagnética na zona do UV/vísivel é seguida pela relaxação dos estados excitados para o estado fundamental, maioritariamente através de diversos processos não radiativos (relaxação vibracional, conversão interna e cruzamento inter-sistemas). A fotoluminescência é um outro tipo de relaxação em que radiação de menor energia que aquela originalmente absorvida é reemitida após a relaxação vibracional. A fluorescência e a fosforescência são duas formas de fotoluminescência, com aplicação analítica. Um espectro de emissão de fluorescência resulta de transições entre o nível vibracional de menor energia do primeiro estado excitado e diversos níveis vibracionais do estado fundamental (Fig ). O espectro resultante é aproximadamente uma imagem reflectida do espectro de absorção, mas deslocado para um comprimento de onda superior devido à perca inicial de energia, causada pela relaxação vibracional. Poucos compostos são capazes de relaxar por fluorescência. Quase só as moléculas orgânicas rígidas e estruturas aromáticas o fazem. A intensidade da emissão de fluorescência depende do rendimento quântico ( F ) o qual varia entre zero (não há fluorescência) e um 136

141 (todas as moléculas no estado excitado relaxam por fluorescência). O rendimento quântico é influenciado por factores estruturais da molécula e pela natureza do solvente usado. Fig Processos de relaxação a partir dos estados excitados. Existe uma relação linear entre a concentração C de um composto fluorescente e a intensidade da emissão I F, IF FI0 Cl (16.8) Se a intensidade da radiação incidente I 0 e l forem constantes e a absorvância baixa (i. e. concentração do analito reduzida) tem-se IF kc (16.9) 137

142 A fluorimetria é menos usada que a espectroscopia de absorção devido ao limitado número de compostos naturalmente fluorescentes. No entanto, muitos destes compostos podem ser derivatizados de modo a obter substâncias fluorescentes, permitindo a sua análise. A sua utilização predominante é em análise quantitativa, sendo mais sensível que a espectroscopia de absorção. A espectrometria no infravermelho (IV) baseia-se na absorção de radiação electromagnética na região do infravermelho, o que provoca alterações na energia vibracional das moléculas. Pode ser aplicada à identificação e análise estrutural de moléculas orgânicas, sendo menos usada que as duas técnicas anteriores para fins quantitativos. Aplica-se quer a amostras sólidas, quer a líquidas. Uma molécula é capaz de absorver energia apenas se não existir variação no momento dipolar durante uma vibração. A quase totalidade das moléculas poliatómicas preenche este requisito. A espectrometria no IV apresenta dificuldades na análise de misturas e requer cuvettes especiais para análise de amostras aquosas. A complexidade dos espectros de infravermelho permite a sua utilização na identificação de compostos desconhecidos e na investigação de pormenores estruturais. Os espectros são utilizados de modo empírico, por comparação com padrões e com valores encontrados na literatura. Fig Espectro de IV do formaldeído, H 2 C=O, mostrando as absorções características. A absorção de radiação electromagnética na região das frequências de rádio dá origem a variações na orientação do spin nuclear num campo magnético, dando origem à espectrometria de ressonância magnética nuclear 138

143 (NMR). Esta técnica permite a identificação e análise estrutural de compostos orgânicos e estudos cinéticos, sobretudo a partir da análise de núcleos de 1 H e 13 C. Também apresenta potencial para estudos quantitativos, embora seja raramente utilizada para tal fim. As suas principais limitações são a complexidade da técnica, o elevado custo do equipamento e a necessidade de utilizar solventes deuterados para a apalicação mais vulgar dos núcleos de 1 H. Fig Esquema geral de um espectrómetro de NMR. As variações de energia estão associadas à orientação do eixo nuclear no espaço, relativamente a um campo magnético externo aplicado. Todos os núcleos atómicos possuem um número atómico de spin I, o qual pode ser 0, ½ ou 1. Apenas aqueles com valor diferente de zero originam um espectro de NMR. Como o núcleo possui uma carga, ao girar sobre o seu eixo produz um dipolo magnético ao longo do eixo. O núcleo também possui um momento angular I e, em cada isótopo, os valores relativos de I e determinam a frequência de absorção de energia. A sensibilidade da técnica também é determinada pelo valor de. 1 H possui a mais elevada sensibilidade relativa e 12 C e 16 O são inactivos devido possuirem I=0. Na presença de um campo magnético aplicado, o vector do momento pode apenas assumir um número limitado de orientações espaciais. Isto é, a sua componente na direcção desse campo será um integral ou um semi-integral h I z mi (16.10) 2π I z representa a dimensão do componente do momento angular na direcção do campo z, m I = 0, ±½, ±1, ±,... e h é a constante de Planck. O número total de valores para m I, o número quântico magnético, é dado por 2I

144 A energia de interacção entre um núcleo e o campo magnético aplicado B é dada por h E mi γ B (16.11) 2π em que é a razão giromagnética. μ z γ (16.12) I z Num núcleo 1 H ou 13 C I é ½, portanto m I só pode ter valores ±½ o que origina dois níveis de energia ou estados de spin. Fig Níveis de energia para 1 H ou 13 C. Pode demonstrar-se que a frequência de absorção é directamente proporcional à força do campo magnético aplicado. Na prática, os espectros são obtidos fazendo variar a frequência da radiação com um campo magnético constante ou vice-versa. Quando os núcleos dissipam energia, voltando para um nível inferior, emitem um sinal que é tratado pelo equipamento, originando bandas estreitas (mais largas no caso de sólidos). Os espectros de NMR de 1 H e 13 C exibem habitualmente vários sinais de absorvância, cada qual correspondente a um núcleo ou grupo de núcleos, cuja posição no espectro depende do ambiente químico que rodeia o núcleo. Esta característica é medida pelo desvio químico. Cada um dos sinais produzidos pode sofrer desdobramentos, causados por interacções com núcleos vizinhos. Outra informação que se pode tirar de um espectro está relacionada com o facto de que a área de cada pico é directamente proporcional ao número de núcleos responsáveis pelo sinal, permitindo a utilização desta técnica em análise quantitativa. De acordo com a teoria, todos os protões (núcleos 1 H) absorvem energia com o mesmo valor do campo magnético aplicado. No entanto, o campo sentido por um dado núcleo difere em grandeza do campo aplicado, devido ao efeito de blindagem dos electrões vizinhos. Devido às diferenças de blindagem que os protões sofrem em diferentes ambientes químicos, estes absorvem a 140

145 valores diferentes do campo aplicado. Estas diferenças de absorção são designadas desvios químicos. Os electrões que rodeiam um núcleo criam um pequeno campo magnético localizado, oposto ao campo aplicado. A dimensão do campo oposto é proporcional à densidade electrónica, a qual é determinada, por sua vez, pelas electronegatividades dos núcleos vizinhos. Quanto mais electronegativo for o átomo ao qual está ligado o protão, menor a blindagem e menor será o campo magnético aplicado necessário para alcançar a condição de ressonância. Os desvios químicos são medidos em unidades de frequência (Hz) relativamente a um padrão, sendo o tetrametilsilano (TMS) o mais usado para este efeito. Na prática, o desvio químico é expresso em unidades adimensionais, resultantes da divisão da frequência do sinal pela frequência de operação do aparelho. Multiplicando o valor de por 10 6, obtêm-se valores entre 0 e 15 para a maioria dos protões orgânicos, vindo assim os desvios químicos expressos em ppm. O efeito de desdobramento de sinal pode ser explicado a partir do exemplo simples da molécula C 2 H 6. Considerando dois protões H A e H X ligados a átomos de carbono adjacentes, possuindo diferentes desvios químicos. O campo sentido por H A aumenta ou diminui ligeiramente devido aos dois spins permitidos de H X (up e down ). Deste modo, o pico de H A divide-se num dobleto, com intensidades 1:1. O efeito é recíproco e os dois estados de spin de H A causam a divisão do pico de H X num dobleto. O espaço entre cada dobleto é designado por constante de acoplamento J AX, medido em Hz. Esta constante é independente do campo aplicado. De uma forma mais geral, o número de picos num multipleto é determinado pelo número de protões no grupo adjacente n e é igual a n+1. Geralmente, protões ligados ao mesmo átomo de carbono e aqueles ligados a átomos adjacentes mas possuindo o mesmo desvio químico, são considerados equivalentes e não sofrem desdobramento de sinal. As excepções a esta regra não serão aqui consideradas. Fig Exemplo do desdobramento de sinais em 1 H-NMR de C 2 H 6. As intensidades dos picos num multipleto seguem o triângulo de Pascal e são resultado da distribuição estatística das várias combinações possíveis dos dois estados de spin para os protões do grupo adjacente. 141

146 Fig Desdobramento de sinais em NMR, segundo triângulo de Pascal. Os espectros de 13 C são mais simples que os de 1 H por dois motivos: a) os desvios químicos entre núcleos de 13 C em diferentes ambientes químicos podem diferir até 200 ppm, enquanto que em 1 H são raramente superiores a 10 ppm; b) sendo um isótopo muito menos abundante, não se observam acoplamentos entre si. No entanto, ocorre acoplamento entre núcleos de 13 C e 1 H, embora possam ser eliminados pelo equipamento, obtendo-se assim espectros mais simples. Este procedimento não é sempre aplicado, já que em certas situações, este acoplamento pode fornecer informação útil. Fig Espectro de 13 C do butano-2-ol. Aplicando o tratamento das transformadas de Fourier (FT) à espectrometria de NMR é possível obter uma maior sensibilidade e uma maior qualidade de informação estrutural. A espectrometria de 1 H-NMR é muito útil para identificação e análise estrutural de compostos orgânicos, sendo a interpretação dos espectros feita por comparação com espectros de referência e através da utilização de tabelas 142

147 de desvios químicos. Esta técnica é menos utilizada em análise quantitativa, apesar de existir uma proporcionalidade directa entre as áreas dos picos e a concentração do composto. A espectrometria de massa (MS) baseia-se na ionização e fragmentação de materiais, através de diversos processos. A análise dos fragmentos produzidos permite obter dados estruturais e quantitativos. As moléculas são caracterizadas segundo o seu padrão de ionização e fragmentação quando bombardeadas com electrões de elevada energia, ou ionizadas com menor fragmentação se forem utilizadas as chamadas técnicas suaves. Não é um verdadeiro método espectrométrico, pois a radiação electromagnética não é absorvida nem emitida, mas os dados são obtidos em forma de espectro, com a abundância relativa dos fragmentos representada como linhas. O processo de bombardeamento produz geralmente fragmentos com carga +1, facilitando a sua separação e detecção por processos eléctricos e magnéticos. Os espectros devem ser registados em condições de vácuo, de modo a impedir a perca de fragmentos por colisão com moléculas componentes da atmosfera. Fig Esquema de um espectrómetro de massa com ionização por impacto de electrões. Existem diversos métodos de ionização, adequados a diversos tipos de moléculas, das mais simples às mais complexas e com diversas gamas de sensibilidade. Após ionização e fragmentação da amostra, os fragmentos iónicos são acelerados para o analisador. Os fragmentos são separados, fazendo-os deslocar-se através de um campo magnético e/ou electrostático ou medindo o tempo que demoram a chegar ao detector. 143

148 Um avanço que veio permitir maior fragmentação e estudo de iões seleccionados foi a espectrometria de massa sequencial (MS/MS), a qual envolve processos secundários de fragmentação, geralmente induzidos por colisões com moléculas de um gás inerte, contido numa célula colocada entre dois analisadores. Se houver reciclagem de iões no sistema ou forem adicionados mais analisadores, o processo é estendido e passa a ser designado por (MS) n. O princípio da separação através de um analisador magnético pode ser racionalizado em termos da energia cinética dos iões fragmentados, da voltagem de aceleração V e do campo magnético B. A equação mostra que, para iões com carga (z) +1, a massa m é directamente proporcional ao quadrado do raio da curvatura r. 2 2 m B r (16.13) z 2V Num espectro de massa, o padrão de fragmentação é característico de cada substância e pode ser usado para identificação da mesma. O pico derivado do ião mais abundante é designado pico base. Uma ferramenta útil para a identificação de um composto é a capacidade de determinar a massa molecular relativa e estabelecer uma fórmula molecular empírica. A massa molecular relativa depende da identificação do pico do ião molecular M, produzido quando um electrão é ejectado da molécula (M + e - ɹ M + + 2e - ). A fórmula empírica pode ser obtida calculando as intensidades dos picos dos isótopos M+1, M+2, etc. relativamente ao pico do ião molecular. Um outro auxiliar de interpretação é a regra do azoto, a qual diz que uma molécula com peso molecular par deve conter um número par de átomos de azoto ou nenhum átomo de azoto. Fig Espectro de massa típico de um hidrocarboneto. 144

149 145 Introdução à Química Alimentar 2009

150 Capítulo 17 Ensaios Imunológicos Diversos procedimentos para análise de alimentos recorrem à utilização de ensaios imunológicos, devido às suas especificidade, sensibilidade e simplicidade. São empregues na análise de resíduos, identificação de bactérias e vírus e detecção de proteínas. A detecção de proteínas é importante no contexto da determinação de alergénios, autenticação de espécies de carne e detecção de plantas geneticamente modificadas. Os antigénios e os anticorpos são as duas componentes fundamentais de qualquer ensaio imunológico. Um antigénio é uma molécula que induz a formação de anticorpos. Anticorpos são proteínas produzidas por animais em resposta a um antigénio. Estas proteínas ligam-se, com uma elevada afinidade, ao antigénio responsável pela sua indução. Um anticorpo é uma molécula em forma de Y, constituída por quatro cadeias de polipeptídeos, ligadas entre si por pontes dissulfito. Duas das cadeias de polipeptídeos são idênticas e aproximadamente duas vezes maiores que as outras duas, também idênticas entre si. O antigénio liga-se em dois sítios de ligação idênticos. Fig Regiões estruturais de um anticorpo. 146

151 O anticorpo liga-se à parte externa do antigénio numa região específica (epítopo). A ligação do anticorpo ao antigénio não envolve ligações covalentes, mas sim interacções electrostáticas e de van der Waals e pontes de H. Fig Representação da ligação antigénio-anticorpo. Qualquer ensaio imunológico requer duas condições: 1) tem que existir um método para separar ou diferenciar um antigénio livre de um antigénio ligado; 2) ou o antigénio ou o anticorpo têm que ser quantificáveis em baixas concentrações. A detecção em muito baixas concentrações requer marcadores muito activos. Um dos primeiros a ser desenvolvido utiliza iodo radioactivo ( 131 I) e designa-se ensaio radioimunológico (RIA). Nos ensaios imunológicos utilizam-se recipientes de plástico, tirando partido da existência de interacções hidrofóbicas entre as proteínas e as suas superfícies. São habitualmente utilizadas microplacas com 96 cavidades, sendo colocada uma amostra em cada cavidade. Fig Microplaca usada em ensaios imunológicos. 147

152 Devido aos perigos associados aos marcadores radioactivos, foram desenvolvidos marcadores enzimáticos para os substituir. O mais popular é o ensaio imunoenzimático ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), no qual se usa uma enzima que deve ser muito estável, ligar-se facilmente a antigénios ou anticorpos e catalisar rapidamente uma alteração visível num substrato simples. Existem três variantes deste ensaio: sandwich, competitivo e indirecto. Um ensaio indirecto pode ser efectuado tanto na variante sandwich como na competitiva. No ensaio sandwich, o antigénio fica entre dois anticorpos. Este é o ensaio imunológico mais utilizado para a identificação de proteínas. Na análise de alimentos, este tipo de ensaios pode ser utilizado para identificar adulterantes ou alergénios. O anticorpo de captura é imobilizado num suporte e a solução do alimento a ser analisada é-lhe adicionada. Esta solução contém uma proteína que se comporta como um antigénio específico para o anticorpo de captura. Após formado o complexo anticorpo de captura-antigénio, a restante solução é removida. Após este passo de lavagem, adiciona-se outro anticorpo ligado a uma enzima. Este anticorpo, denominado anticorpo de detecção, também reconhece o antigénio. O excesso desta solução de detecção é removido e adiciona-se um substrato incolor, que irá mudar de cor ao ligar-se à enzima. Quanto mais intensa a cor, maior o teor de antigénio presente. Para analisar componentes mais pequenos que as proteínas, como resíduos de toxinas, antibióticos e pesticidas, é mais adequado utilizar um ensaio competitivo. Neste formato, o primeiro passo é a imobilização da pequena molécula, covalentemente ligada a uma molécula maior. Esta molécula, geralmente uma proteína, funciona como transportadora e o conjunto é designado por hapteno. Em alternativa, pode imobilizar-se o anticorpo. Após a imobilização, remove-se o material em excesso. De seguida, adiciona-se um extracto de alimento e passa a existir uma competição, entre o hapteno e a molécula livre existente no extracto, para ligação a um anticorpo marcado com uma enzima. Após um passo de lavagem, o anticorpo ligado ao hapteno imobilizado permanece no meio. Quanto mais moléculas alvo existirem no extracto do alimento, mais anticorpos se ligam às pequenas moléculas livres, sendo este complexo removido no próximo passo de lavagem, pois não se encontra imobilizado. O anticorpo ligado será quantificado por adição do substrato da enzima e observação da alteração de cor produzida. Neste caso, haverá uma relação inversamente proporcional entre a quantidade de analito no extracto e a intensidade de cor. Numa variante do ensaio competitivo, mais sensível, liga-se uma quantidade limitada de anticorpo à placa e é criada uma competição entre o hapteno ligado à enzima e a molécula livre no extracto de alimento. O passo 148

153 final, após remoção do excesso da amostra, passa pela determinação da quantidade de hapteno ligado à enzima, através da medição da cor produzida. Fig Ensaio imunológico de tipo sandwich. No ensaio imunológico indirecto, mede-se a quantidade de anticorpo ou hapteno indirectamente, utilizando frequentemente anticorpos anti-espécie. Nesta variante, podem realizar-se ensaios sandwich ou competitivos. Os anticorpos anti-espécie são obtidos a partir de anticorpos de um animal posteriormente injectados num animal de outra espécie, estimulado o sistema imunitário deste de modo a produzir anticorpos que se liguem aos epítopos dos anticorpos do primeiro animal. Depois do passo competitivo, o material em excesso é removido e adiciona-se o anticorpo anti-espécie, marcado com uma enzima, para detectar a presença do anticorpo do primeiro animal. Este método possui elevada sensibilidade, o que em conjunto com a existência no mercado de diversos anticorpos anti-espécie com vários marcadores, torna esta variante muito útil em diversos ensaios. 149

154 Existe uma tendência para a automação dos ensaios imunológicos, de modo a melhorar a sua produtividade. Fig Ensaio imunológico competitivo. A especificidade de ligação dos anticorpos também permite o seu uso em técnicas de purificação. Na purificação por imunoafinidade, o anticorpo é imobilizado sobre um suporte (agarose ou gel de sílica), servindo de fase estacionária para separações cromatográficas. Estas fases podem ser regeneradas e reutilizadas. Fig Exemplo de ensaio imunológico indirecto. A separação por imunoafinidade tem sido utilizada para separar pequenas moléculas, como as aflatoxinas, mas também materiais de maiores dimensões como células. 150