CARLOS FABIÁN MENDIBURU ESTUDO DAS TALASSEMIAS DO TIPO ALFA EM DOIS ESTADOS DAS REGIÕES NORDESTE E SUDESTE DO BRASIL

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1 Programa de Pós-Graduação em Genética CARLOS FABIÁN MENDIBURU ESTUDO DAS TALASSEMIAS DO TIPO ALFA EM DOIS ESTADOS DAS REGIÕES NORDESTE E SUDESTE DO BRASIL Dissertação apresentada para obtenção do Título de Mestre em Genética. Orientadora: Profa. Dra. Claudia Regina Bonini-Domingos São José do Rio Preto 2005

2 Dedico este trabalho: A minha mãe, meu exemplo de vida, por todooamoreapoio. A minha esposa e companheira Luceia, pela paciência, amor e carinho. Ao meu filho Lucas, luz da minha vida, por aquecer meu coração com cada sorriso.

3 Meu mais sincero agradecimento as seguintes pessoas: ADra. Claudia Bonini Domingos obrigado pela sua dedicação, paciência; pelas criticas e conselhos, pelo apoio e confiança neste projeto; e por sobre todas as coisas... obrigado pela liberdade de errar e a oportunidade de crescer...e, por sobre todo obrigado pela amizade generosa que só uma coração grande como o seu é capaz. A meus colegas de laboratório, de ontem e de hoje, Fátima, Paula, Claudia Hidalgo, Ana Regina, Luciane, Vivi, Wanessa e Carol, pelo companheirismo, pela paciência, por atender minhas inquietudes e, por me ensinar suportando minha infinita ignorância. Um agradecimento especial a Gislaine pela sua dedicação na confecção das tabelas, essenciais na realização deste trabalho. Um agradecimento especial também para Luciana e Fabrício, pelas sugestões e auxilio na análise estatística e na impressão deste trabalho. A minha família... a Mamá, Jorge, Marcelo, Claudia e Emmanuel, que apesar das distancias sempre estiveram do meu lado, me deram forças para continuar o caminho empreendido sem importar as dificuldades...a minha mulher Luceia, pelo amor, paciência e compreensão e, a meu filho Lucas, por alegrar meus momentos de repouso. A meus Amigos, (a ordem é casual a importância es única) Bicho, Nolo, Andrés, Tono,Waldino,Walter,Calora,Luis( elnegro ),Ñato,Carola,Nidia,Selva, Ulises, Carlos e a todos aqueles aos quais minha memória tenha traio, obrigado por compartilhar, através das distancias, os momentos mais importantes da minha vida...e a todas as pessoas que anonimamente contribuíram para o meu crescimento como professional e, mais importante, como pessoa. A todos um infinito MUCHAS GRACIAS.

4 "Prefiro os erros do entusiasmo a indiferença da sabedoria." Anatole France.

5 SUMÁRIO 1 Introdução Resenha Histórica Localização e Estrutura do Cluster alfa Estrutura e Expressão dos Genes de Tipo Alfa Base Molecular das Talassemias Alfa Fisiopatologia das Talassemias Alfa Classificação das Talassemias Alfa Portador Silencioso Traço de Talassemia Alfa Doença de Hb H Síndrome de Hidropsia Fetal por Hb Bart s Métodos de Estudo Índices Eritrocitários Eletroforese de Hemoglobinas Pesquisa Intraeritrocitária de Hb H Cromatografia Liquida de Alta Pressão (HPLC) Diagnostico Molecular das Talassemia Alfa Distribuição Geográfica das Talassemias Alfa 43 2 Objetivos 47 3 Material e Métodos Casuística Detalhamento Técnico Preparação de Hemolisados Testes de Triagem Resistência Globular Osmótica em Solução Cloreto de Sódio a 0,36% Análise da Morfologia Eritrocitária Eletroforese em Acetato de Celulose ph Alcalino Provas Complementares para Talassemia Alfa 56

6 Eletroforese em Acetato de Celulose ph Neutro Pesquisa de Corpúsculos de Inclusão de Hb H Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC) Extração de DNA Extração Fenólica por Meio de Sangue Periférico Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) PCR Convencional para a Detecção da Deleção -α Multiplex-PCR para a Identificação da Deleção -α Analise Estatística 70 4 Resultados Resultados das Análises Eletroforéticas e Citológicas HPLC Resultados da Análise Molecular Correlação dos Achados Moleculares com os Laboratoriais 77 5 Discussão 85 6 Conclusões 93 7 Referencias Bibliográficas 95 8 Apêndices 112 9Resumo Abstract 123

7 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Molécula de Hemoglobina...13 Figura 2. Localização e estrutura do cluster de globina alfa ; e estrutura de um gene alfa...17 Figura 3. Ontogenia das cadeias globínicas. Síntese das cadeias globínicas ao longo do desenvolvimento...20 Figura 4. A) Representação simplificada do cluster alfa. Representação esquemática da recombinação homóloga desigual proposta para origem da deleção -α 3.7 e-α Figura 5. Representação das principais deleções que provocam a perda de dois genes alfa ligados ou do cluster alfa completo...24 Figura 6. Esquema representando os efeitos fisiopatológicos e eritropatológicos causados pela diminuição na síntese de cadeias de globina alfa na Doença de Hb H Figura 7. Fisiopatologia produzida pela ausência dos genes de globina alfa...36 Figura 8. Distribuição Mundial de α + Talassemia...45 Figura 9. Resistência globular osmótica em solução de cloreto de sódio a 0,36%...54 Figura 10. Esfregaço sangüíneo apresentando discretas alterações dos eritrócitos...54 Figura 11. Mapa de interpretação dos padrões eletroforéticos em ph alcalino...58 Figura 12. Representação esquemática do padrão de migração de hemoglobinas humanas em ph neutro...58 Figura 13. Corpúsculos de inclusão de Hb H (seta) observados após coloração vital com Azul de Cresil brilhante...62 Figura 14. Cromatograma de um indivíduo normal e;. de um com talassemia alfa...62 Figura 15. Localização dos primers A, B e C para a detecção da deleção -α Figura 16. Localizações dos primers específicos para a identificação da deleção -α 3.7 por multiplex-pcr...69

8 Figura 17. Identificação de Hb H na eletroforese alcalina...73 Figura 18. Identificação de Hb H na eletroforese neutra...73 Figura 19. Corpúsculos de inclusão de Hb H, após coloração com ACB...73 Figura 20. Amostras amplificadas com PCR convencional...75 Figura 21. Amostras amplificadas com Multiplex-PCR...75 Figura 22. Comparação dos níveis de VCM entre os grupos genotípicos...81 Figura 23. Comparação dos níveis de VCM entre os grupos genotípicos...81 Figura 24.Comparação dos níveis de Hb A 2 entre os grupos genotípicos...84

9 LISTA DE TABELAS E QUADROS Tabela 1. Constituição de hemoglobinas normais de acordo com o período de desenvolvimento...19 Tabela 2. Resultados possíveis da amplificação utilizando os primers A, B e C Tabela 3. Distribuição dos diferentes genótipos nas duas regiões estudadas...76 Tabela 4. Freqüências genotípicas...76 Tabela 5. Valores médios de VCM e HCM para cada genótipo das regiões estudadas Tabela 6. Comparação dos valores médios de VCM e HCM de cada grupo genotípico pertencentes às duas regiões estudadas...78 Tabela 7. Valores médios de VCM e HCM para cada genótipo...78 Tabela 8. Valores médios de VCM e HCM...80 Tabela 9. Comparação dos valores médios de HCM e VCM entre o grupo αα/?eosgrupos heterozigoto e homozigoto...80 Tabela 10. Comparação dos valores médios de HCM e VCM entre os grupos genotípicos Tabela 11. Resultado de pesquisa de corpúsculos de inclusão de Hb H...83 Tabela 12. Valores médios de Hb A 2 e F para cada grupo genotípico...84 Tabela 13. Resultados laboratoriais de homens e mulheres do nordeste normais para a deleção Tabela 14. Resultados laboratoriais de homens e mulheres do nordeste heterozigotos para a deleção Tabela 15. Resultados laboratoriais de homens e mulheres do nordeste homozigotos para a deleção Tabela 16. Resultados laboratoriais de homens e mulheres do sudeste normais para a deleção Tabela 17. Resultados laboratoriais de homens e mulheres do sudeste hetorozigotas para a deleção Tabela 18. Resultados laboratoriais de homens e mulheres do sudeste homozigotas para a deleção Quadro 1. Alterações laboratoriais dos diferentes fenótipos de talassemias alfa comparadas com o fenótipo normal

10 Introdução 12 A função principal dos eritrócitos é o transporte de oxigênio desde os pulmões aos tecidos periféricos. Esta função depende da hemoglobina a qual constitui mais do 90% da proteína solúvel nos glóbulos vermelhos. A molécula de hemoglobina (Hb) é formada por duas cadeias de tipos alfa (α ou ζ) e duas cadeias de tipo beta (ε, γ, δ ou β), cada uma contendo um grupo prostético heme-(fe ++ ) que pode-se ligar forma reversível ao oxigênio (Figura 1). Portanto, a função do eritrócito depende da síntese balanceada das cadeias globínicas α e e, de seu arranjo em um tetrâmero de hemoglobina funcional (LIEBHABER, 1989). O desequilíbrio na síntese destas cadeias globínicas origina as talassemias alfa ou talassemias beta, dependendo da diminuição na síntese de cadeias globínicas alfa ou beta, respectivamente (HONIG; ADAMS, 1986). Uma definição ampla para as talassemias alfa foi dada por Liebhaber (1989): A talassemia alfa é uma anemia hereditária que resulta da síntese deficiente de globina alfa. A falta de globinas alfa decorre na produção insuficiente de hemoglobina normal, e ao acúmulo de tetrâmeros instáveis γ 4 (Hb Bart s) ou β 4 (Hb H) com a conseqüente destruição acelerada de glóbulos vermelhos. A talassemia alfa pode ser herdada ou adquirida e, pode ser originada por defeitos em um ou mais dos quatro genes de globina alfa.

11 Figura 1. Molécula de Hemoglobina; vermelho: cadeias beta; amarelo: cadeias alfa; verde: grupos heme (PUTKEY, 2000). Introdução 13

12 Introdução Resenha Histórica. Os primeiros relatos científicos das formas mais graves de talassemia alfa (Doenças de Hb H e Hidropsia Fetal por Hb Bart s), foram realizados em meados de 1950 e início de 1960, a partir da associação entre hemoglobinas anormais (Hb H e Hb Bart s) com anemia microcítica hipocrômica em ausência de deficiência de ferro 1. Nessa época, a introdução da eletroforese nos laboratórios de pesquisa de hemoglobinopatias permitiu identificar uma hemoglobina mais rápida que a Hb A, posteriormente denominada Hb H. No mesmo paciente, foram observados precipitados intra-eritrocitários nos esfregaços de sangue corados com Azul Cresil Brilhante, coloração utilizada rotineiramente na contagem de reticulócitos. Associou-se, portanto, a Hb H presente na eletroforese com os precipitados intra-eritrocitarios. Estudos posteriores mostraram que a Hb H era um tetrâmero instável, formado por cadeias globínicas beta (β 4 ), com uma afinidade pelo oxigênio dez vezes maior que a Hb A (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1998). Mais tarde, em estudos com sangue de cordão umbilical, identificou-se uma nova Hb anormal, eletroforéticamente mais rápida que a Hb A e mais lenta que a Hb H. Esta nova hemoglobina foi chamada de Hb Bart s por ter sido descoberta no Hospital São Bartolomeu de Londres. A Hb Bart s, formada unicamente por cadeias gama (γ 4 ), apresentava problemas fisiológicos similares aos da Hb H (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1998). A identificação dos tetrâmeros formados pelas cadeias de tipo beta (Hb H e Hb Bart s), nas formas mais graves de talassemia alfa, proporcionaram a primeira evidência de que esta condição era provocada pela síntese deficiente de cadeias globínicas alfa 2. Sugerindo que se tratava de uma doença 1 MINNICH et al., 1954; RIGAS et al., 1955; GOUTTAS et al., 1955; LIE-INJO et al., 1960 apud HIGGS, JONES et al., 1959; KEKWICK; LEHMANN, 1960; HUEHNS et al., 1960; RAMOT et al., 1959; DANCE et al., 1963 apud HIGGS et al., 1989.

13 Introdução 15 causada por defeitos nos genes alfa. No entanto, foi mais complicado entender a base genética desta doença que das outras hemoglobinopatias, principalmente devido ao fato de que, os parentes de indivíduos com Doença de Hb H e Hidropsia Fetal por Hb Bart s, também portadores de talassemias alfa, apresentavam uma expressão fenotípica variável. Isto levou a diferenciar os portadores nos tipos moderado (αtalassemia 2) e grave (α-talassemia 1), segundo o nível de Hb Bart s presente ao nascimento ou ao grau de anormalidade nos índices hematológicos (HIGGS et al., 1989). Em 1965, foi possível medir a taxa de síntese das cadeias alfa e beta, observando-se uma progressiva diminuição das cadeias alfa nos indivíduos portadores de Doença de Hb H e Hidropisia Fetal por Hb Bart s, respectivamente 3. A análise molecular das talassemias alfa foi inicialmente difícil de ser realizada, pelo desconhecimento do número de genes alfa. Baseados na observação de mutantes estruturais sugeriu-se que o individuo normal possuía quatro genes alfa 4. Estudos moleculares confirmaram efetivamente a presença de quatro genes alfa no individuo normal (αα/αα), dois em cada um dos cromossomos 16, e a falta de um (-α/αα), dois (-α/-α ou --/αα), três (-α/--) ou quatro (--/--) genes alfa nas formas talassêmicas 5. 3 KAN et al., 1968; POOTRAKUL et al., 1975; WEATHERALL et al., 1965; WEATHERALL et al., 1970 apud HIGGS et al., HOLLAN et al., 1972; MELONI et al., 1980 apud HIGGS et al., OLTTOLENGHI et al., 1974; TAYLOR et al., 1974; KAN et al., 1975; OLD et al., 1983 apud HIGGS et al., 1989.

14 Introdução Localização e estrutura do Cluster alfa O agrupamento dos genes globínicos do tipo alfa ou Cluster alfa, com aproximadamente 29 Kb, localiza-se na porção distal (13p13.3) do braço curto do cromossomo 16. Este inclui um gene de expressão embrionária (ζ), três pseudogenes (ψζ, ψα1, ψα2), dois genes idênticos de expressão fetal e adulta (α 2 e α 1 ), e um gene (θ 1 ) de função desconhecida; arranjados na seqüência 5 ζ 2 -ψζ 1 -ψα 2 -ψα 1 -α 2 -α 1 -θ 1 3 (Figura 2) (HONIG; ADAMS, 1986; SHAW et al., 1987; HIGGS, 1989). Vários segmentos de DNA repetidos em tandem (minisatélites) encontram-se distribuídos dentro e adjacentes ao cluster alfa. Estes foram inicialmente identificados como regiões hiper-variáveis (HVRs: Hypervariable regions), localizadas no extremo 3 do cluster (α-globina 3 HVR); entre o gene ζ 2 e pseudogene ψζ 1 (interzeta-hvr); dentro dos introns (IVS1 e IVS2) dos genes de tipo ζ e a 70 Kb acima do gene ζ (5 HVR) (Figura 2) (HIGGS et al., 1981; JARMAN et al., 1986; JARMAN; HIGGS, 1988; HIGGS, 1990). Aproximadamente a 40 Kb acima do cluster alfa existe uma região conhecida como HS-40, contendo vários sítios hipersensíveis a ação da enzima DNAse (HS: Hight Sensibility) e de ligação a fatores de transcrição (Figura 2). Deleções naturais nesta região silenciam a expressão dos genes alfa, demonstrando que sua integridade é essencialparaaexpressãoreguladadosgenesdo cluster. Os indivíduos portadores destas mutações apresentam um fenótipo alfa talassêmico (HIGGS et al., 1990; JARMAN et al., 1991; WAYE; CHUI, 2001).

15 Introdução 17 Figura 2. Localização e estrutura do cluster de globina alfa (parte superior da figura); e estrutura de um gene alfa (parte inferior direita) (Adaptado de VOGEL; MOTULSKY, 1997).

16 Introdução Estrutura e expressão dos genes de tipo alfa Os genes tipo alfa possuem a mesma estrutura, comum a todos os genes globínicos, de três exon separados por dois introns. Nos genes alfa, o exon 1 codifica os primeiros 31 aminoácidos, enquanto que o exon 2 codifica os seguintes 67 aminoácidos e o exon 3 os 42 aminoácidos finais da cadeia polipeptídica de 141 aminoácidos (LAUER; SHEN; MANIATIS, 1980). Os genes de tipo alfa evoluíram por meio de duplicações e divergência de seqüência e, apesar de, os genes α e ζ mostrarem uma homologia de só 58%, os genes α 2 e α 1 são altamente homólogos. As divergências entre os genes alfa limitam-se as regiões não codificantes (IVS I e região 3 não codificante), como conseqüência produzem cadeias polipeptídicas idênticas. Um mecanismo de evolução concertada, por meio da qual, genes alfa seriam trocados de um cromossomo para outro por um processo de conversão gênica ou recombinação homóloga desigual, tem sido proposto como o responsável pela manutenção da homologia entre os genes alfa (LIEBHABER; GOOSSENS; KAN, 1981; HIGGS et al., 1984; HONIG; ADAMS, 1986). Apesar dos genes alfa produzirem polipeptídios idênticos, estudos com os transcritos, demonstraram que o gene α 2 codifica de duas a três vezes mais proteína que o gene α 1. Conseqüentemente, mutações no gene α 2 estão associadas a fenótipos mais graves de talassemia alfa (ORKIN; GOFF, 1981; LIEBHABER; KAN, 1981; LIEBHABER; CASH; BALLAS, 1986). Durante a ontogenia das hemoglobinas, os genes do tipo alfa são expressos na mesma seqüência em que estão localizados ao longo do cluster. O gene ζ se expressa nas primeiras cinco semanas de desenvolvimento embrionário, nos eritroblástos primitivos do saco vitelino. As globinas ζ associam-se com as globinas de tipo beta épsilon (ε) para formar a Hb Gower-I (ζ 2 ε 2 ), primeiro tetrâmero de hemoglobina detectado no embrião. Em seguida forma-se a Hb

17 Introdução 19 Portland-I (ζ 2 γ 2 ) ao aumentar a síntese das cadeias globínicas γ (LIEBHABER, 1989). A partir da sexta semana de desenvolvimento, a eritropoese começa a ter lugar principalmente no fígado fetal. A transcrição dos genes ζ decresce, ao mesmo tempo em que a transcrição dos genes alfa (α 1 e α 2 ) é ativada, funcionando desde a vida fetal até adulta. As globinas alfa combinam-se com as globinas do tipo beta e dão origem a Hb Gower-II (α 2 ε 2 ) ainda no período embrionário, a Hb Fetal (α 2 γ 2 )no período com o mesmo nome, e as hemoglobinas A e A 2 (α 2 β 2 e α 2 δ 2 ) características do período adulto (WEATHERALL; CLEGG, 1981). Na Tabela 1, detalha-se as hemoglobinas presentes nos diferentes períodos do desenvolvimento e suas respectivas porcentagens e, a Figura 3 ilustra a ontogenia das cadeias globinicas em cada uma das fases do desenvolvimento Tabela 1- Constituição de hemoglobinas normais de acordo com o período de desenvolvimento (HONIG; ADAMS, 1986). Embrionário Fetal Adulto Gower I (ζ 2 ε 2 ) % Portland (ζ 2 γ 2 )5-20% Gower II (α 2 ε 2 ) % Fetal (α 2 γ 2 ) % A(α 2 β 2 )5-10% A 2 (α 2 δ 2 )0 A(α 2 β 2 ) % A 2 (α 2 δ 2 ) 2,5-3,5 % Fetal (α 2 γ 2 )0-1,0%

18 Introdução 20 Figura 3. Ontogenia das cadeias globínicas. Síntese das cadeias globínicas ao longo do desenvolvimento (FUCHAROEN; WINICHAGOON, 2002)

19 Introdução Base Molecular das Talassemias alfa As lesões moleculares, responsáveis pelas talassemias alfa, podem ser caracterizadas como defeitos α + ou α 0, se afetam parcial ou completamente a produção de cadeias alfa, respectivamente 6. Mais de 95% dos fenótipos de talassemia alfa são resultado de grandes deleções (3-100Kb), as quais removem de um a quatro genes alfa. Porém, ao menos 48 mutações não delecionais, a maioria localizada no gene α 2, têm sido relatadas causando talassemia α + (ORON-KARNI et al., 2000) 7. Entre as deleções podemos distinguir três grupos, aquelas que eliminam um único gene alfa (α-talassemia-2 ou α + -talassemia), aquelas que eliminam os dois genes alfa ou até o cluster por completo (α-talassemia- 1ouα 0 -talassemia) e as deleções afetando o HS-40 (KATTAMIS et al., 1996). As deleções α-talassemia-2 (α + ) são as mais comuns das α-talassemias, com duas formas predominantes (-α 3.7 e-α 4.2 ) distribuídas ao redor do mundo (EMBURY et al.,1980; KATTAMIS et al., 1996; BAYSAL; HUISMAN, 1994). Os genes α 2 e α 1 estão localizados dentro de dois segmentos duplicados altamente homólogos, de 4 Kb de longitude, cuja identidade de seqüência foi mantida ao longo da evolução por eventos de conversão gênica e recombinação homóloga desigual. Estes segmentos foram subdivididos em três subsegmentos homólogos (X, Y e Z) separados por regiões não homólogas (I, II e III). Estando as regiões duplicadas Z separadas por 3.7 Kb e, as regiões duplicadas X por 4.2 Kb (Figura 4, A) (LAUER; SHEN; MANIATIS, 1980; ZIMMER et al., 1980; HIGGS et al., 1984; HESS; SCHIMID; CHEN, 1984). 6 KATTAMIS et al, 1996; PROVAN; GRIBBEN; 2000 apud NEISHABURY et al.,

20 Introdução 22 A deleção de 3.7 Kb, conhecida como deleção direita (rigthward deletion), é causada pelo pareamento errôneo e recombinação homóloga desigual entre regiões homólogas Z não correspondentes. Como resultado deste evento, gera-se um cromossomo com um gene alfa a menos (-α), responsável pela talassemia, e outro com três genes alfa (ααα anti 3.7 ) (Figura 4, B, i) (HIGGS et al., 1980; GOOSSENS et al., 1980; HIGGS et al., 1984). Existem três tipos de rearranjos -α 3.7 (-α 3.7I,-α 3.7II e-α 3.7III ) dependendo do ponto exato do segmento Z onde ocorre à recombinação (LIEBHABER, 1989). Esta deleção é comum em todas as áreas talassêmicas do mundo, sendo mais prevalente entre indivíduos africanos, mediterrâneos e asiáticos (EMBURY, 1980; FOGLIETTA, 1996; OLD 2003). O alinhamento errôneo e, a recombinação homologa desigual entre as regiões homólogas X, separadas por 4.2 Kb, dá origem ao alelo -α 4.2. Esta deleção, também conhecida como deleção esquerda (leftward deletion), origina um cromossomo portando a deleção de um gene alfa (-α 4.2 ) e outro com três genes alfa (ααα anti4.2 ) (Figura 4, B, ii) (HIGGS et al., 1984). A deleção -α 4.2 é encontrada principalmente no Sudoeste da Ásia, mas também foi relatada em outras populações como nas ilhas do pacifico, em negros, mediterrâneos, dentre outros (EMBURY, 1980; LIEBHABER 1989; OLD, 2003) Além das deleções -α 3.7 e-α 4.2, uma variedade mais extensa, porém menos freqüente de deleções, ocorre dentro do cluster alfa, afetando adversamente a expressão dos genes. Algumas deleções provocam a perda de ambos dos genes α deixando o gene ζ intacto (Ex SEA,-(α) 20.5,-- MED ), enquanto que outras deleções maiores, eliminam o cluster alfa por inteiro (Ex. -- FIL,-- THAI,-- HW ) (WINICHAGOON et al., 1984; FISCHEL-GHODSTAN et al., 1988; FORTINA et al., 1988). Na Figura 5 estão representadas estas e outras deleções. As responsáveis pela α-talassemia-1 são de limitada distribuição geográfica e, excetuando -- SEA de origem asiática, -(α) 20.5 e-- MED encontradas no Mediterrâneo, esporádicas e identificadas em famílias isoladas (WINICHAGOON et al., 1984;

21 Introdução 23 FISCHEL-GHODSIAN et al., 1988; FORTINA et al.,1988, KATTAMIS et al., 1996). Os mecanismos responsáveis pelas grandes deleções não estão claramente definidos. Análises realizadas nos pontos de ruptura sugerem que algumas destas deleções podem ser produzidas por recombinação entre regiões curtas de seqüências homólogas dentro e ao redor do cluster (NICHOLLS et al. 1985; NICHOLLS; FISCHEL-GHODSIAN; HIGGS, 1987). Análises de seqüências mostraram que membros da família de repetições Alu estão presentes dentro ou próximos aos pontos de quebra (W.H.O., 1987). Além das deleções que afetam diretamente os genes do tipo alfa, foram descritas quatro deleções (RA, TI, IJ e MM) que removem a região reguladora HS-40, deixando os genes estruturalmente intactos (HATTON et al., 1990; LIEBHABER et al., 1990; WILKIE et al., 1990; ROMAO et al., 1991). Os portadores destas deleções possuem um fenótipo similar ao dos portadores de α 0 talassemia, sugerindo que ambos os genes alfa, no mesmo cromossomo, estão subregulados ou completamente inativos, confirmando a importância crítica desta região na expressão dos genes do tipo alfa in vivo (SILVESTRONI-BIANCO, 1998; WAYE; CHUI, 2001).

22 Introdução 24 Figura 4. A) Representação simplificada do cluster alfa, destacando com barras os segmentos homólogos X, Y e Z. B). Representação esquemática da recombinação homóloga desigual proposta para origem da deleção -α 3.7 (i) e - α 4.2 (ii) (Adaptado de KAZAZIAN,1990) Figura 5. Representação das principais deleções que provocam a perda de dois genes alfa ligados ou do cluster alfa completo (SILVESTRONI-BIANCO, 1998).

23 Introdução 25 As formas não delecionais de talassemias alfa envolvem mutações de ponto e pequenas deleções ou inserções, e são indicadas genericamente como α T. Mais de 30 destas mutações são citadas na base de dados de mutações no gene de globina humano ( As mutações afetam principalmente o gene alfa 2. Essa distribuição diferencial pode ser explicada pelo fato de que, mutações neste gene são fenotipicamente mais graves que mutações no gene alfa 1, permitindo seu rápido reconhecimento e estudo (LIEBHABER, 1989; CHUI; FUCHAROEN; CHAN, 2003). A maioria das mutações não delecionais afetam etapas críticas da expressão gênica, como o processamento e tradução do RNA mensageiro, levando, em alguns casos, como na Hb Constant Spring (transição T>C no códon 142 TAA>CAA do gene α 2 ) e Hb Pakse (transversão A>T no códon 142 TAA>TAT do gene α 2 ) à produção de cadeias alfa anormalmente alongadas. A mutação Constant Spring é a forma não delecional mais freqüente, com prevalência no sudeste da Ásia. Outras mutações produzem hemoglobinas ou cadeias alfa altamente instáveis, tais como Hb Arginio, Hb Suan-Dok, Hb Quong Sze, e Hb Pak Num Pó, e levam a um fenótipo alfa talassêmico (LIEBHABER, 1989; KANAVAKIS, 2000; CHUI; FUCHAROEN; CHAN, 2003).

24 Introdução Fisiopatologia das Talassemias Alfa A síntese balanceada de cadeias do tipo alfa e beta é essencial para a formação dos diferentes tipos de hemoglobinas em cada período do desenvolvimento. Com a diminuição da síntese de globinas alfa, as cadeias de tipo beta, que deveriam parear com estas para formar o tetrâmero de hemoglobina, ficam em excesso. Neste estado, as cadeias do tipo beta pareiam-se formando homo-tetrâmeros. Durante o desenvolvimento fetal, as cadeias de globina γ formam tetrâmeros γ 4 (Hb Bart s), enquanto que, nos adultos, as cadeias β excedentes formam tetrâmeros β 4 (Hb H). Estas hemoglobinas possuem uma elevada afinidade pelo oxigênio, carecem de interação heme-heme e de efeito Bohr, sendo incapazes de liberar eficientemente oxigênio nos tecidos, provocando hipóxia (CHUI; FUCHAROEN; CHAN, 2003). Além da elevada afinidade pelo oxigênio, estas hemoglobinas são relativamente instáveis, podendo precipitar na membrana celular eritrocitária. A presença de subunidades hemoglobínicas dispara uma reação oxidativa em cadeia que gera espécies reativas de oxigênio, assim como radicais superóxido e hidroxila. Os radicais livres provocam danos nos componentes da membrana celular, principalmente em proteínas do citoesqueleto, essenciais para a sustentação da membrana, e nos fosfolipídios (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1998; RUND; RACHMILEWITZ, 2001). A proteína banda 3 é a principal afetada. Lesões nesta proteína, que funciona como bomba aniônica e sítio de ancoragem para proteínas do esqueleto celular, afetam a estrutura do citoesqueleto tornando os eritrócitos mais rígidos que os normais, o que dificulta sua passagem através da microvasculatura (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1998; DONDORP et al., 1999). Em algumas situações, as lesões também podem afetar a função de bomba aniônica desta proteína, levando a uma hiperhidratação e conseqüente aumento do volume eritrocitário (BUNYARATVEJ et al., 1994; KANAVAKIS et al., 2000).

25 Introdução 27 O estresse oxidativo, produzido pelos radicais livres na membrana celular, pode afetar a distribuição dos fosfolipídios na membrana (KUYPERS et al., 1998). A perda da assimetria normal da membrana citoplasmática, particularmente a exposição de fosfatidilserina na superfície externa das células talassêmicas, provavelmente media a apoptose eritroblástica intramedular e a fagocitose dos eritrócitos anormais ou envelhecidos pelos, macrófagos do Sistema Reticulo Endotelial, provocando a destruição precoce dos eritrócitos e hiperesplenismo (CHUI; FUCHAROEN; CHAN, 2003). A diminuição da concentração de hemoglobina, produzida pela síntese deficiente de globina alfa, a incapacidade de liberar oxigênio no tecidos das hemoglobinas H e Bart s, e a destruição prematura dos eritrócitos (hemólise) provocada pela formação dos tetrâmeros instáveis (Hb H e Bart s) levam a anemia. A hipóxia tecidual provocada pela anemia induz a síntese de eritropoetina com o objetivo de estimular a produção de novos eritrócitos e sanar a anemia. Porém, como a talassemia alfa é uma desordem genética, os novos eritrócitos produzidos carregam os mesmos problemas que os anteriores. A medula óssea, sob o estímulo constante da eritropoetina pode, nos casos mais graves de talassemia alfa, levar a expansão medular e deformidades ósseas (CHUI; FUCHAROEN; CHAN, 2003). Na Figura 6 representa-se a fisiopatologia das talassemias alfa, tomando como exemplo a Doença de Hb H.

26 Introdução 28 Figura 6. Esquema representando os efeitos fisiopatológicos e eritropatológicos causados pela diminuição na síntese de cadeias de globina alfa na Doença de Hb H. (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1998).

27 Introdução Classificação das Talassemias Alfa É possível dividir as talassemias alfa em quatro categorias fenotípicas: Portador silencioso (três genes alfa funcionais); Traços de talassemia alfa (dois genes alfa funcionais); Doença de Hb H (um gene alfa funcional) e Hidropisia fetal por Hb Bart s (nenhum gene alfa funcional). No entanto, pode existir superposição entre estes grupos, devido a gama de expressão clínica de cada grupo, decorrente da variabilidade genética. A expressão clínica pode variar de mudanças sutis, apenas distinguíveis do normal, a formas graves e incompatíveis com a vida como, no caso da Síndrome de Hidropsia fetal por Hb Bart s (W.H.O., 1987; HIGGS et al., 1989; KAZAZIAN, 1990). A expressão fenotípica das talassemias alfa está diretamente relacionada ao grau de redução da síntese de globina alfa, sendo que três grandes fatores estão envolvidos na determinação do fenótipo: 1) número de genes afetados, 2) grau de diminuição na expressão (parcial o total) e, 3) quanto o gene afetado contribui para a síntese de globina alfa. Como a expressão do gene alfa 2 é maior que a do gene alfa 1, alterações neste gene produzirão um efeito fenotípico mais grave. De forma geral, a perda de um único gene pode resultar em, uma diminuição leve, moderada ou grave, da síntese de globina alfa, dependendo de como ocorre esta perda (deleção ou não deleção) e que loci está envolvido (alfa 1 ou. alfa 2) (LIEBHABER, 1989; HIGGS et al., 1989; KAZAZIAN, 1990). No Quadro 1, encontram-se resumidas as alterações laboratoriais da cada categoria fenotípica em comparação ao normal.

28 Introdução 30 Quadro 1. Alterações laboratoriais dos diferentes fenótipos de talassemias alfa comparadas com o fenótipo normal (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1998) 0: ausente; +: presente em grau discreto; ++: moderado; +++: acentuado.

29 Introdução Portador Silencioso É originado pela perda de um único gene alfa (- α/αα), sendo a deleção -α 3.7 a principal responsável por esta condição. O portador silencioso é assintomático e, apesar dos parâmetros hematológicos, tais como a concentração de hemoglobina, índices eritrocitários e número de glóbulos vermelhos estarem dentro dos limites de normalidade, é possível observar uma discreta microcitose e hipocromia (LIEBHABER, 1989). Na eletroforese de hemoglobinas, podem ser observados traços de Hb H nos indivíduos adultos e de Hb Bart s nos recém-nascidos. A pesquisa intraeritrocitária dos corpúsculos de inclusão de Hb H, após incubação com Azul Cresil Brilhante pode revelar em média 1 a 3 células positivas para cada cinco mil células avaliadas (LIEBHABER, 1989, NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1998). Porém, nem sempre é possível detectar um número de células tão baixo (CLARKE; HIGGINS, 2000) Traço de Talassemia Alfa Esta condição resulta da heterozigose para um determinante de alfa talassemia 0 (--/ αα) ou, como homozigoto (-α/-α) ou duplo heterozigoto (-α/α-) para determinantes de alfa talassemia +, originados por deleção ou não. O homozigoto para a deleção de 3.7 Kb (-α 3.7 /-α 3.7 ) é a forma mais freqüente para este tipo de alteração (W.H.O., 1987; LIEBABHER, 1989). Os indivíduos com traço talassêmico são freqüentemente normais do ponto de vista clínico. No entanto, podem apresentar discretas alterações hematológicas e clínicas, como modificação na morfologia eritrocitária, leve grau de anemia e microcitose (VCM entre 72-80fl) (LIEBAHBER,

30 Introdução ). Alguns indivíduos com traço talassêmico, especialmente crianças, apresentam anemia moderada, que junto com uma microcitose moderada, podem levar a um diagnóstico errôneo de anemia por deficiência de ferro (KAZAZIAN, 1990). Na eletroforese de hemoglobinas, a Hb H pode ser observada em concentrações baixas, de 2 a 5 %, ou estar ausente nos indivíduos adultos, enquanto que a Hb Bart s pode estar presente em concentrações de 2 a 10% nas amostras de recém-nascidos (EMBURY, 1980 apud LIEBHABER, 1989; NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1998). Em aproximadamente 60% dos indivíduos com traço de talassemia alfa pode-se observar, em número bastante reduzido (1-10 em cada 5000 células analisadas), células contendo corpúsculos de inclusão de Hb H (GALANELLO et al, 1984; HIGGS et al, 1989). Os portadores de traço talassêmico, apesar de serem normais do ponto de vista clínico, podem apresentar: fraqueza, cansaço, dores nas pernas e palidez. (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1998) Doença de Hb H A doença de Hb H é a forma mais grave de talassemia alfa compatível com a vida. As Doenças de Hb H produzidas por duas deleções, uma α + e outra α 0 (ex, -α 3.7 /-- MED ou -α 4.2 /-- SEA ) são conhecidas como Doenças de Hb H delecionais, enquanto que, aquelas produzidas pela combinação de uma deleção α 0 e uma mutação não delecional (ex. -- MED /α CS α), são conhecidas como Doenças de Hb H não delecionais (KANAVAKIS et al., 2000; WAYE et al., 2001). A gravidade da doença está diretamente relacionada com o nível de supressão da síntese de cadeias de globina alfa, que varia com as diferentes combinações de mutantes. Tem-se observado que, em geral, pacientes com defeitos não delecionais, afetando predominantemente o gene alfa 2,

31 Introdução 33 interagindo com um determinante de talassemia α 0 (--/αα T ou --/α CS α) possuem maior nível de Hb H, com hemoglobinas totais diminuídas e um quadro clínico mais grave que os pacientes com genótipo --/-α (W.H.O., 1987; LIEBABHER, 1989). Em alguns casos, indivíduos com a mesma base molecular podem ter diferente curso clínico, indicando que outros fatores genéticos e mesmo ambientais podem ser importantes na variação clínica e hematológica (MIRABILE et al., 2000; WEATHERALL; CLEGG, 2001). O quadro clínico dos pacientes com Doença de Hb H varia de uma anemia moderada até uma anemia dependente de transfusões. Porem o quadro mais comum é de uma talassemia intermédia, com anemia microcítica hipocrômica, icterícia e hepato-esplenomegalia. Uma vez que o principal mecanismo da anemia é a hemólise, muito mais que a eritropoese ineficaz, unicamente 35% dos pacientes apresentam marcada expansão medular (W.H.O., 1987). Nas análises eletroforéticas de sangue de indivíduos adultos, a Hb H pode ser observada em concentrações que chegam a até 20%. Entretanto, em amostras de recém-nascidos, a Hb Bart s está presente em concentrações que variam de 10 a 40%. Os precipitados intra-eritrocitários de Hb H são facilmente visíveis, podendo-se observar várias células com precipitado em um mesmo campo microscópico (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1998). Pode haver uma redução nos níveis de hemoglobina total, hemoglobina corpuscular media (HCM) e volume corpuscular médio (VCM); acompanhados, em alguns casos, de reticulocitóse, policromasia e moderada anisopoiquilocitóse (W.H.O., 1987; KATTAMIS et al., 1988; HIGGS et al., 1989, NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1998). Algumas complicações que podem ocorrer nos portadores desta doença são: esplenomegalia grave com hiperesplenismo; anemia aguda devido a episódios hemolíticos, em resposta a drogas, infecções, febre ou

32 Introdução 34 ingestão de componentes oxidativos; presença de úlcera nas pernas; cálculos biliares; deficiência de folatos; alterações ósseas ou de crescimento; retinopatias; tumores hematopoéticos extramedulares; risco de processos tromboembólicos 8 (W.H.O., 1987; HIGGS et al., 1989). Na gravidez usualmente há um aumento na intensidade da anemia, possivelmente relacionado ao aumento do volume sangüíneo. Em determinadas ocasiões, o nível de Hb pode diminuir consideravelmente fazendo necessário o uso de transfusões para manter a saúde da mãe e do feto em desenvolvimento. Outras complicações como pré-eclampsia, falha cardíaca congestiva, aborto e morte perinatal em prematuros têm sido observadas (VAEUSORN; FUCHAROEN; WASI, 1988; GALANELLO et al., 1992) Síndrome de Hidropisia Fetal por Hb Bart s A forma mais grave de talassemia alfa é a Síndrome de Hidropisia Fetal por Hb Bart s. O fetos afetados herdam deleções que removem todos os genes alfa (--/--). Nestes indivíduos, as cadeias de globina formam homo-tetrâmeros 4 (Hb Bart s) incapazes de liberar oxigênio nos tecidos. Os fetos homozigotos para deleções que eliminam o gene embrionário ζ junto com os genes alfa (ex. FIL /-- FIL ) são incapazes de produzir qualquer tipo de hemoglobina funcional e, portanto sucumbem por hipóxia grave ainda no início da gestação. Por outro lado, os fetos portando ao menos um gene embrionário ζ (ex. -- SEA /-- FIL ou -- EA / -- SEA ) sintetizam pequenas quantidades de Hb Portland 1, a qual é suficiente para mantê-los vivos ao longo do segundo e terceiro trimestre de gestação. Porém, a quantidade desta hemoglobina é insuficiente para acompanhar o rápido crescimento e desenvolvimento do feto, especialmente no terceiro trimestre. Finalmente, os fetos 8 DANESHMEND, 1978; DANESHMEND; PEACHEY, 1979 apud CHUI; FUCHAROEN; CHAN, 2003.

33 Introdução 35 afetados falecem por hipóxia e falha cardíaca no útero ou logo após o nascimento (CHUI; WAYE, 1998). Como conseqüência dos danos provocados pela hipóxia durante a embriogênese e da eritropoese extramedular, os fetos afetados freqüentemente apresentam problemas de desenvolvimento em vários sistemas e órgãos, incluindo o sistema nervoso central (CHEN et al., 2000). A eritropoese extramedular é amplamente observada em muitos órgãos, sendo a causa da extensa hepatomegalia (CHUI; WAYE, 1998). Ao nascimento, os fetos apresentam-se pálidos, grandes e edematosos, com sinais de problemas cardíacos, tais como cardiomegalia, efusão pericárdica, efusão pleural e ascite e, de anemia intra-uterina prolongada (LIANG et al., 1985). Além dos problemas observados nos fetos, existe um aumento das complicações maternas, tais como hipertensão, pré-eclampsia, eclampsia e hemorragias. Outras complicações menos freqüentes incluem, coagulação intravascular disseminada, falha renal, e efusão pleural. Também foram relatados: diminuição no liquido amniótico, trabalho de parto prematuro e falha cardíaca (GUY et al, 1985; ABUELO; FORMAN; RUBIN, 1997) 9. No pós-parto foram relatados: retenção da placenta, hemorragia, hipertensão, pirexia puerperia e anemia (GUY et al., 1985; BOWMAN et al, 1987) 10.Nafigura7,resume-seafisiopatologiadaSíndromede Hidropsia Fetal por Hb Bart s. 9 KAKAYAMA et al., 1986 apud CHUI; WAYE, TAN et al., 1989 apud CHUI; WAYE, 1998

34 Introdução 36 Figura 7. Fisiopatologia produzida pela ausência dos genes de globina alfa (CHUI; WAYE, 1998).

35 Introdução Métodos de estudo Índices eritrocitários As talassemias alfa são caracterizadas por uma redução no conteúdo de hemoglobina dos eritrócitos, a qual se manifesta nos dados laboratoriais como uma redução nos índices eritrocitários (SKOGERBOE et al., 1992). A microcitose (Volume Corpuscular Médio: VCM<80fl) ou a hipocromia (Hemoglobina Corpuscular Média: HCM<27pg) são os critérios de diagnóstico mais importantes para detectar portadores de talassemias (CHUI; WAYE, 1998). A redução dos índices eritrocitários pode ser produzida por defeitos na síntese do grupo heme, por deficiência de ferro ou por alterações na síntese de globina, nas talassemias alfa e beta (STEIN et al., 1984). O HCM e VCM variam muito pouco entre indivíduos normais e heterozigotos para talassemia alfa 2 (-α/αα), portanto não podem ser utilizados para o diagnóstico deste genótipo talassêmico. Para os genótipos mais graves existe uma correlação entre o número de genes de globina alfa afetados e a microcitose, fazendo do VCM e HCM indicadores úteis do provável genótipo (WILLIAMS et al.,1996). No entanto, existe uma considerável superposição dos índices eritrocitários entre os vários genótipos, que não permite sua utilização como único parâmetro para sugerir um determinado genótipo (SKOGERBOE et al., 1992; SONATI; KIMURA; FERREIRA, 1992; WILLIAMS et al., 1996). Lafferty (1996) considera o uso de um VCM < 72fl, como um critério laboratorial para a seleção de amostras para testes de talassemia, com sensibilidade e especificidade similar, independente da população. Estratégias de triagem atuais se baseiam unicamente em VCM< 80fl ou HCM < 27pg como critérios para identificar indivíduos com mutações clinicamente relevantes (CHAN et al., 2001).

36 Introdução Eletroforese de hemoglobinas Além da utilização dos índices eritrocitários na avaliação da anemia, metodologias destinadas a identificação das hemoglobinas H e Bart s, têm sido amplamente difundidas como ferramentas de diagnóstico das talassemias alfa. Tradicionalmente a eletroforese em acetato de celulose ph alcalino (ph 8.6) tem sido o método de eleição para a identificação e quantificação de hemoglobinas variantes. Este método é rápido, reprodutível e capaz de separar as hemoglobinas variantes mais comuns (CLARKE; HIGGINS, 2000; Ou; ROGNERUD, 2001). Na eletroforese em ph alcalino a Hb Bart s migra mais rápido que a Hb A, e a Hb H migra ainda mais rápido, acima da Hb Bart s (NAOUM, 1997). Quando identificadas inicialmente na eletroforese alcalina, as hemoglobinas H e Bart s podem ser confirmadas em eletroforese em ph neutro. Este ph corresponde ao ponto isoelétrico da maioria das hemoglobinas, as quais não migram nestas condições, permitindo a separação das hemoglobinas H e Bart s que migram em direção ao pólo positivo (WEATHERALL; CLEGG, 1981; DACIE; LEWIS, 1995). Como para os índices eritrocitários, existe uma relação direta entre o número de genes inativos e os níveis de hemoglobinas H e Bart s, os níveis destas hemoglobinas podem ser utilizados para sugerir o possível genótipo (Quadro 1). No entanto, como a eletroforese ph 8.6 é a metodologia mais utilizadas na análise de hemoglobinas, diagnósticos incorretos ou inconclusos podem ocorrer devido à sua limitada resolução, especialmente na detecção de baixas concentrações de Hb H e Bart s presentes quando 1 ou 2 genes alfa estão afetados (JONES et al., 1981; STEINBERG, 1991; HIGGS, 1993; CLARKE; HIGGINS, 2000; Ou; ROGNERUD, 2001). Por essas hemoglobinas serem altamente instáveis, as amostras de sangue utilizadas devem ser o mais frescas possíveis, dado que em poucos dias a concentração de Hb H diminui significativamente (RIBEIRO; ARAÚJO, 1992).

37 Introdução PesquisaIntraeritrocitáriadeHbH Um método, simples fácil e econômico de triagem e diagnóstico de talassemias alfa é a coloração com Azul Cresil Brilhante (ACB). Após a coloração supravital dos eritrócitos com o corante ACB, a Hb H, altamente instável, precipita e agrega, formando inclusões intracelulares, dando aos eritrócitos um aspecto de bola de golfe (CLARKE; HIGGINS, 2000; PAN et al., 2005). O número de células com inclusões de Hb H é influenciado pelo genótipo talassêmico, aumentando nas formas mais graves de talassemias alfa, onde existe maior número de cadeias beta em excesso (Quadro 1) (NAOUM; BONINI- DOMINGOS, 1998, WINICHAGOON; ADIROJNANON; WASI, 1980, SKOGERBOE et al, 1992). Este método é muito sensível e específico para a detecção de portadores de genótipos de risco (--/αα ou --/-α), capazes de gerar descendência com Síndrome de Hidropisia Fetal por Hb Bart s (THOMPSON et al., 1989; SKOGERBOE et al., 1992; SABATH et al., 2003; PAN et al., 2005). Vários trabalhos relatam melhoras na técnica que aumentam sua eficiência na identificação dos corpúsculos de inclusão de Hb H (JONES et al., 1981; LIN et al., 1990; LIN et al, 1991; SABATH et al., 2003; PAN et al., 2005). No entanto, não deve ser utilizado no diagnóstico de portadores dos genótipos -α/αα ou -α/-α (THOMPSON et al., 1989). Nestes pacientes, o número de células contendo inclusões de Hb H é muito baixo, sendo difíceis de detectar. Por esse motivo, a ausência de inclusões de Hb H não é um critério de exclusão (CLARKE; HIGGINS, 2000).

38 Introdução Cromatografia Liquida de Alta Pressão (HPLC) A HPLC de troça iônica tem emergido como um método de eleição para o rastreamento inicial de hemoglobinas variantes e quantificação das hemoglobinas A, A 2 e Fetal (EASTMAN et al., 1996). Vários estudos demonstraram a utilidade deste sistema na triagem pré-natal e pós-natal de hemoglobinopatias e talassemias (VAN DER DIJS et al., 1992; LOREY et al., 1994; EASTMAN et al., 1996; WINICHAGOON et al., 2002). Adicionalmente, estudos realizados no Colégio de Patologia Americano, mostraram uma equivalência ou superioridade da HPLC sobre os métodos eletroforéticos (CLARKE; HIGGINS, 2000). O sistema automatizado de HPLC VARIANT (Bio-Rad), com o programa BTS (Beta Thalassemia Short), foi desenvolvido inicialmente para a separação e quantificação das hemoglobinas F e A 2, que auxiliam no diagnóstico de talassemia beta, e na detecção de outras hemoglobinas anormais (JONES; CLARK, 1994). No entanto, mesmo este sistema sendo incapaz de quantificar as hemoglobinas H e Bart s, ele pode identificar qualitativamente estas hemoglobinas auxiliando no diagnóstico das talassemias alfa (FUCHAROEN et al., 1998). Papassotiriou (1999), realizando modificações no programa BTS, conseguiu quantificar as hemoglobinas H e Bart s e, obter uma correlação entre os genótipos e o nível destas hemoglobinas em indivíduos com Doença de Hb H. Dada a incapacidade do BTS em quantificar as hemoglobinas H e Bart s, foi desenvolvido o programa ATS (Alpha Thalassemia Short) para identificar e quantificar a Hb Bart s nas talassemias alfa. Este sistema permite o diagnóstico neonatal de Doença de Hb H (FUCHAROEN et al., 1998), porem não comercializado no Brasil.

39 Introdução Diagnostico molecular das talassemia alfa Mesmo com a utilização das metodologias, anteriormente descritas, como testes de triagem, e a correlação dos achados laboratoriais aos possíveis genótipos, um diagnóstico definitivo só será possível por meio da identificação molecular do defeito genético. Uma ampla revisão e uma breve descrição das metodologias utilizadas na detecção dos mutantes responsáveis pelas talassemias alfa, foram realizadas por Kattamis et al (1996) e Old (2003), respectivamente. A caracterização dos defeitos moleculares, nas talassemias alfa foi realizada por muitos anos usando as análises de restrição enzimática do DNA genômico, seguida por Southern blotting e hibridação com sondas radioativas para os genes alfa. O advento da reação em cadeia da polimerase (PCR) revolucionou a biologia molecular, e simplificou a detecção das mutações mais comuns de talassemia alfa por ser esta uma técnica simples, mais segura, rápida, e prática que a convencional análise de restrição enzimática (KATTAMIS et al., 1996). Para a detecção de mutações não delecionais foram desenvolvidas várias estratégias utilizando a amplificação seletiva dos genes α 2 ou α 1. Os produtos de PCR podem ser ligados em membranas de nylon e hibridizados com sondas oligonucleotídicas alelo especificas (ASO), ou ser digeridos com endonucleases de restrição, quando a mutação cria ou elimina um sítio de clivagem (LEBO et al, 1990). Quando estas metodologias não permitem identificação da alteração molecular, a caracterização direta da mutação pode ser realizada pelas análises da seqüência de DNA, empregando estratégias de seqüênciamento manual ou automático (KATTAMIS et al., 1996).

40 Introdução 42 Uma metodologia envolvendo a aplicação combinada de métodos de detecção indiretos, eletroforese em gradiente desnaturante (DGGE) e análise da conformação do DNA de fita simples (SSCA), seguida de seqüênciamento direto do DNA tem sido descrita por Harteveld et al. (1996) para a análise de mutações de ponto e polimorfismos nos genes alfa. Para a detecção das formas delecionais, tem sido utilizada a amplificação seletiva dos alelos mutante e normal, por meio de primers específicos; em alguns casos seguidos pela digestão enzimática para a determinação de haplótipos (DODÉ et al, 1992; BOWDEN et al., 1992; BAYSAL; HUISMAN, 1994, FOGLIETTA, et al 1996, ORON-KARNI, et al 1998). Nos últimos anos, a PCR múltipla (Multiplex- PCR), a qual permite a amplificação e identificação do alelo normal e vários alelos mutantes em uma mesma reação de amplificação, tem sido aplicada nos programas de rastreamento para a identificação das mutações de ponto e deleções gênicas (SHAJI et al, 2000; CHONG, et al 2000; LIU et al.,2000; LIU et al, 2004; TAN et al, 2001; WANG et al., 2003). Estratégias utilizando PCR em tempo real (Real Time PCR), HPLC desnaturante (DHPLC) e microarrays têm sido desenvolvidas recentemente para o rastreamento das principais mutações responsáveis pelas talassemias alfa (SUN et al., 2001; GUIDA et al., 2004; BANG-CE et al., 2004).

41 Introdução Distribuição Geográfica das Talassemias Alfa As anemias hereditárias representam uma das principais doenças genéticas que contribuem de forma expressiva para à morbidade e mortalidade infantil em diversos países em desenvolvimento (W.H.O.,1982). Em geral, a elevada prevalência das hemoglobinopatias pode ser conseqüência de dois mecanismos principais: as mutações foram favorecidas nas populações autóctones, como conseqüência do efeito seletivo da malária, onde os indivíduos afetados são mais resistentes; ou alternativamente, foram inseridas por migração de indivíduos de uma população previamente afetada. O primeiro mecanismo, explica as altas freqüências de hemoglobinopatias nos países da região Mediterrânea, no Oriente Médio, Sudeste da Ásia e na África (FLINT et al., 1986). Como resultado da vantagem dos heterozigotos contra a malária, as desordens hereditárias de hemoglobinas são a doenças monogênicas mais comuns 11. Tem sido estimado que aproximadamente 7% da população mundial é portadora de algum tipo de hemoglobinopatia e que, crianças com formas graves dessa doença nascem a cada ano (W.H.O., 1989). Porém, estas condições ocorram com maior freqüência nas regiões tropicais, a migração populacional tem garantido que agora sejam encontradas na maioria dos países (WETHERALL; CLEGG, 2001). Nas talassemias alfa, as formas mais brandas (alfa + talassemia) são extremamente comuns, oscilando entre 10 a 20% em partes do Saara Africano, chegando a 40% ou mais em algumas populações Indianas e do Oriente Médio, alcançando 80% no norte de Papua Nova Guinea e em grupos isolados do Nordeste da Índia (Figura 8). As formas α 0 possuem uma distribuição mais restrita, ocorrendo em alta freqüência unicamente no Sudeste da Ásia e na bacia do mar Mediterrâneo (FLINT et al., 1993; WEATHERALL; CLEGG, 2001). 11 STEINBER et al., 2001; WEATHERALL; CLEGG, 2001 apud WEATHERALL; CLEGG, 2001.

42 Introdução 44 No Brasil, estudos feitos na região sudeste relatam uma freqüência de 20 a 25% de talassemias alfa devido a deleção -α 3.7 na população negra (SONATI et al., 1991), e de aproximadamente 48% em pacientes adultos com microcitose e hipocromia sem anemia (BORGES et al., 2001). Na região nordeste, estudos feitos em um grupo de mulheres grávidas heterozigotas para Hb C, mostraram uma freqüência de 22,6% da deleção -α 3.7 (COUTO et al., 2003). Uma freqüência similar para esta deleção (22.2 %) foi encontrada em recém nascidos da mesma região (ADORNO et al.,2005). Em outros estudos, por meio da identificação de Hb Bart s, foi calculada uma freqüência de 2,5%, 3,67% e 7.77% para talassema alfa em neonatos das regiões, Rio de Janeiro-RJ, Porto Alegre-RS e São José do Rio Preto-SP, respectivamente (PEDROLLO, 1990; FLEURY, 1994; MENDEZ- SIQUEIRA, 2000). Trabalhando com amostras de bancos de sangue e escolares do Triangulo Minero-MG, Alves de Melo (1993) encontrou uma freqüência de 5,5% de talassema alfa. Pode-se estimar uma freqüência de 10% na população selecionada ao acaso, e entre % em grupos específicos, como por exemplo, indivíduos com anemia não ferropriva (BONINI-DOMINGOS, 1993).

43 Introdução 45 Figura 8. Distribuição Mundial de α + Talassemia (adaptado de W.H.O., 1987).

44 Introdução 46 A elevada freqüência de talassemias alfa no Brasil, relatadas na literatura e em estudos realizados no Laboratório de Hemoglobina e Genética das Doenças Hematológicas (LHGDH), demonstra a expressiva contribuição das talassemias alfa nas anemias e, destaca a necessidade de seu diagnóstico. Como destacado por Leoneli (2000), o correto diagnóstico laboratorial das talassemias alfa requer a associação de diferentes metodologias laboratoriais que, apesar de simples, precisam de pessoas treinadas para a interpretação dos resultados, o que, nem sempre é possível em todos os laboratórios de análises. O diagnóstico definitivo só é possível por meio da análise por biologia molecular, metodologia ainda pouco difundida nos laboratórios de análises. Em virtude da dificuldade diagnóstica das talassemias alfa e da elevada freqüência com que esta patologia foi encontrada em estudos realizados no Brasil, elaborou-se o presente projeto, com a finalidade de contribuir para o conhecimento desta alteração, sua expressão nos métodos de diagnóstico tradicionais e relação como os mutantes teoricamente mais freqüentes no Brasil.

45 Objetivos 48 Os objetivos do presente estudo foram: 1. Caracterizar laboratorialmente as talassemias alfa por procedimentos de rotina, incluindo a HPLC. 2. Identificar portadores da deleção -α 3.7 por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). 3. Correlacionar os achados moleculares e laboratoriais clássicos.

46 Material e Métodos Casuística Após a coleta de sangue periféric em tubos contendo anticoagulante (EDTA 5%), nos locais de origem, as amostras foram encaminhadas ao LHGDH (IBILCE-UNESP). Ao chegarem ao laboratório, foram codificadas para preservar a identidade dos indivíduos. O grupo de amostras inseridas neste trabalho foi selecionado a partir de amostras com resultados sugestivos de talassemia alfa nos testes laboratoriais, sendo incluídas apenas aquelas que possuíam valores para os índices eritrocitários. Todas as amostras pertenceram a indivíduos adultos de ambos sexos, sem distinção étnica provenientes de dois estados das regiões nordeste e sudeste do Brasil, totalizando 399 amostras. O presente estudo é parte integrante de amplo estudo sobre essa alteração genética desenvolvido no LHGDH desde 2000, com aprovação pelo CONEP no parecer Nº 1153/2000 e processo Nº /

47 Material e Métodos Detalhamento Técnico Preparação de Hemolisados Para que as amostras fossem submetidas à procedimentos eletroforéticos e testes bioquímicos para caracterizar as frações de hemoglobinas, foi necessário lisar as células para a obtenção da solução de hemoglobinas pelo seguinte procedimento: Hemolisado Rápido:- com saponina (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 1998) Esse procedimento é o mais indicado para a realização da triagem e o recomendado para observação de interações com outras hemoglobinas. Não é aconselhável utilizá-lo para dosagens bioquímicas de hemoglobinas, especialmente de Hb Fetal. Reativo hemolisante: Saponina P.A. Água destilada 1 g 100 ml Procedimento: - Em placa de Kline misturar 1 volume de sangue com 1 volume de reativo hemolisante; - A homogeneização deve se processar até a hemólise completa da mistura; - Utilizar o hemolisado após 5 minutos e até, no máximo, 24 horas após sua preparação.

48 Material e Métodos Testes de Triagem Resistência Globular Osmótica em Solução Cloreto de Sódio a 0,36% (SILVESTRONI; BIANCO, 1975) Princípio: Técnica utilizada para detectar talassemia beta, principalmente na forma heterozigota, pois, nesses casos, os eritrócitos microcíticos são mais resistentes à hemólise nesta solução. A resistência globular não é específica para talassemia beta heterozigota, já que resultados positivos são encontrados também em anemias carenciais e outras hemoglobinopatias, como os heterozigotos para hemoglobina C. Cerca de 97% dos portadores de talassemia beta heterozigota apresentam positividade para esse teste. É uma metodologia utilizada para triagem de todas as hemoglobinas anormais, preconizada no LHGDH- IBILCE/UNESP. Reagentes: Solução estoque - NaCl a 10% - ph 7,4 NaCl 9,0 g Na 2 HPO 4 1,36g NaH 2 PO 4.H 2 O 0,28g Água destilada q.s.p Solução trabalho NaCl 10% Água destilada q.s.p 100mL 36mL 1000mL Procedimento: Em tubo de hemólise colocar 1,5 ml de solução de NaCl a 0,36% e 10 µl de sangue total. Agitar, suavemente por inversão, e aguardar 10 minutos para leitura.

49 Material e Métodos 53 Interpretação: Colocar o tubo de hemólise com a amostra na solução de NaCl a 0,36% à 2,0 cm de uma folha branca com linhas negras. A resistência aumentada à hemólise do eritrócito torna a amostra opaca e não visualizase as linhas negras. Em amostras com resistência normal à hemólise, visualiza-se facilmente as linhas através da solução, como ilustrado na figura 9. Submeter as amostras com resistência aumentada a exames posteriores para o diagnóstico da talassemia beta heterozigota Análise da Morfologia Eritrocitária (BONINI-DOMINGOS, 1993) Em esfregaço sangüíneo à fresco analisa-se o tamanho, a forma e a coloração dos eritrócitos como ilustrado na figura 10. Os resultados padronizados no LHGDH- IBILCE/UNESP podem ser expressos da seguinte maneira: - alterações discretas: (+) - alterações moderadas: (++) - alterações acentuadas: (+++) - células normais: (N)

50 Material e Métodos 54 Figura 9: Resistência globular osmótica em solução de cloreto de sódio a 0,36%. O tubo 1 ilustra um teste negativo e o tubo 2 um teste positivo. Figura 10: Esfregaço sangüíneo apresentando discretas alterações dos eritrócitos.

51 Material e Métodos Eletroforese em Acetato de Celulose ph Alcalino (MARENGO; ROWE,1965) Princípio: É uma técnica utilizada para qualificação e quantificação de hemoglobinas normais e anormais. As diferentes mobilidades eletroforéticas das hemoglobinas anormais são originadas por alteração de carga elétrica, causada por substituições de aminoácidos nas cadeias formadoras das moléculas. As hemoglobinas anormais que se originam de mutações onde não ocorre mudança de carga elétrica, migram na posição de hemoglobina A. Nestes casos para a caracterização dessas hemoglobinas, utilizam-se outros processos eletroforéticos. Separa todas as hemoglobinas normais e parte das anormais. Reagentes: Tampão TRIS-EDTA-BORATO, ph 8,5 Tris hidroximetil aminometano 10,2g Ácido etilenodiaminotetracético 0,6g Ácido Bórico 3,2g Água destilada q.s.p 1000mL Corante: Negro de amido 10B 0,5g Álcool metílico 45,0mL Ácido acético glacial 5,0mL Água destilada 45,0mL

52 Material e Métodos 56 Procedimento: - Embeber as fitas de acetato de celulose por 15 minutos no mínimo e no máximo por seis horas, em tampão TEB ph 8,5; - Secar as fitas entre duas folhas de papel absorvente e colocá-las na cuba de eletroforese, conectando-as com os compartimentos eletrolíticos através de tiras de papel mata-borrão; - Aplicar as amostras de hemoglobinas a 1,0 cm da extremidade da fita que está em contato com o pólo negativo; - Passar 300 volts por 40 minutos. Analisar as frações sem coloração e posteriormente corar com negro de amido, embebendo as fitas em um dos corantes por cinco minutos, e posteriormente em solução descorante de ácido acético a 5%. A interpretação das hemoglobinas deverá ser feita seguindo o mapa de migração ilustrado da figura 11. Após os procedimentos de triagem e direcionamento das frações anormais, as amostras foram submetidas à metodologias específicas visando a sua caracterização Provas complementares para Talassemia Alfa Eletroforese em Acetato de Celulose ph Neutro (DACIE; LEWIS, 1985): Princípio: Técnica utilizada para qualificação e quantificação da hemoglobina H e Bart s. Reagentes: KH 2 PO 4 Na 2 HPO 4 Água destilada q.s.p. 3,11 g 1,66 g 1000 ml

53 Material e Métodos 57 Procedimento: - Embeber as fitas de acetato de celulose por quinze minutos no mínimo em tampão ph neutro. Colocar o mesmo tampão nos compartimentos eletrolíticos da cuba de eletroforese; - Secar as fitas entre duas folhas de papel absorvente e colocá-las na cuba de eletroforese conectando-as com os compartimentos eletrolíticos por meio de tiras de papel mata borrão; - Aplicar as amostras de hemoglobina a 1,0 cm da extremidade da fita que está em contato com o pólo negativo; - Passar 300 Volts por 30 minutos; - Analisar as frações sem coloração. Interpretação: a visualização da hemoglobina H deverá ser feita sem coloração como ilustrado no esquema da figura 12, destacando-se a presença (+) ou ausência (-) da fraca de Hb H.

54 Material e Métodos 58 Figura 11: Mapa de interpretação dos padrões eletroforéticos em ph alcalino (ph 8.5). Figura 12: Representação esquemática do padrão de migração de hemoglobinas humanas em ph neutro.

55 Material e Métodos Pesquisa de Corpúsculos de Inclução de Hemoglobina H (PAYANNOPOULOS; STAMATAYANNOPOULOS, 1974) Princípio: Os corpúsculos de inclusão de hemoglobina H são formados por precipitação do tetrâmero de cadeias beta oriundos da desnaturação. Após coloração esses corpúsculos apresentam-se dispostos homogeneamente no interior dos eritrócitos como pequenos pontos azulados. Reagentes: Solução salina: Cloreto de sódio 0,9g Água destilada q.s.p. 100 ml Solução citrato: Citrato de sódio 2,2g Água destilada q.s.p. 100 ml Solução de Azul Cresil Brilhante: Azul Cresil brilhante 1,0g Solução salina 100 ml Solução citrato 25 ml Procedimento: - Colocar 50 µl de sangue total em tubo de ensaio pequeno e adicionar 50 µl de solução de azul Cresil brilhante. Agitar o tubo suavemente; - Incubar o material a 37ºC por 30 minutos; - Fazer esfregaços finos e examinar ao microscópio em objetiva de imersão.

56 Material e Métodos 60 Interpretação: A presença de hemoglobina H nos eritrócitos aparece como fina granulação distribuída homogeneamente, caracterizando um portador de alfa talassemia como ilustrado na figura Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC) Princípio: O equipamento utilizado foi o VARIANT da BIO-RAD com Kit de análise Beta Talassemia Heterozigota. A Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC), neste equipamento, consiste da cromatografia de troca iônica em um sistema fechado, no qual duas bombas de êmbolo duplo e uma mistura de tampões de diluição com controles de gradientes pré-programados passam através de uma coluna analítica em alta pressão. Um fotômetro de filtro de comprimento de onda duplo (415 e 690 nm) monitora a eluição da hemoglobina na coluna, detectando as alterações de absorbância a 415 nm. O filtro secundário corrige a linha de base para efeitos provocados pela mistura dos tampões com forças iônicas diferentes. As mudanças na absorbância são monitoradas e exibidas como um cromatograma da absorbância versus tempo. Os dados de análise provenientes do detector são processados por um integrador embutido e impressos no relatório da amostra de acordo com o tempo de retenção, é o tempo transcorrido entre a injeção da amostra até o ápice do pico da hemoglobina. Cada hemoglobina tem um tempo de retenção característico. No final da análise da amostra, uma cópia do cromatograma e os dados do relatório são automaticamente impressos.

57 Material e Métodos 61 Procedimento: Misturar, em um tubo, 5µL de sangue total com 1 ml de solução hemolisante fornecida no kit de análise. Após hemólise total, acondicioná-los nos recipientes adequados e alojá-los no equipamento, que irá realizar os procedimentos pré-programados de leitura das amostras. Interpretação: Permite a quantificação das diferentes frações de hemoglobina em uma amostra e a identificação do perfil de variantes, comparando os valores obtidos com padrões de calibração. A figura 14 ilustra o cromatograma de um indivíduo normal e um com talassemia alfa, donde se destaca um pico em forma de agulha, com tempo de retenção próximo a zero, correspondente a Hb H.

58 Material e Métodos 62 Figura 13: Corpúsculos de inclusão de Hb H (seta) observados após coloração vital com Azul de Cresil brilhante. Figura 14. Cromatograma de um indivíduo normal (A),onde pode ser observados os picos de Hb F e Hb A a (setas)e;. de um com talassemia alfa (B) apresentando um pico com tempo de retenção próximo de zero (seta).

59 Material e Métodos Extração de DNA Para a obtenção do DNA genômico utilizado nos procedimentos moleculares foram realizadas metodologias de extração conforme segue: Extração Fenólica por Meio de Sangue Periférico (PENA, et al. 1991) Princípio: Técnica utilizada para extrair DNA genômico a partir de sangue total. Os tampões de lise rompem os eritrócito e glóbulos brancos. O fenol é utilizado para a remoção de proteínas e enzimas contaminantes. O DNA é precipitado com etanol. Reagentes: 1. Solução de lise 1 ( utilizado na lise de células vermelhas) Sacarose 0,32M Tris HCl 10mM MgCl 2 5mM Triton 1% 100x Água mili-q autoclavada q.s.p. 10,95 g 1 ml 0,5 ml 1 ml 100 ml 2. Solução de lise 2 (utilizado na lise de células brancas) NaCl 0,075 M EDTA 0,02 M Água mili-q q. s. p. 2,19 g 20 ml 500 ml

60 Material e Métodos Proteinase K (20 mg/ml) Proteinase K Água mili-q q.s.p. Conservar em freezer. 20 mg 1 ml 4. Fenol 5. Clorofórmio : álcool isoamílico (24:1) 6. Etanol 70% 7. KCl 2M Procedimento: De 300 a 1000 ul de amostras de sangue periférico, colhidas com EDTA foram colocadas em tubos eppendorf (1,5ml) completando para um volume de 1.5 ml com solução de lise 1. Após homogeneização, foi centrifugado por 5 minutos a 6500 rpm. Após descartar o sobrenadante se completou o volume para 1,5ml com solução de Lise 1 e, após homogeneizar, se deixou descansar por 10 minutos. Depois deste tempo foi centrifugado por 5 minutos a 6500rpm. Esta etapa foi repetida uma vez mais e logo após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado. Ao pellet foram acrescentados 450ul de solução de Lise 2, 25µl de SDS a 10% e 5µL de proteinase K 20 mg/ml. Após homogeneização, o tubo foi colocado em banho-maria por 3 horas ou overnight, a37 o C. Após três horas ou no dia seguinte, foram adicionados 500ul de fenol, em cada tubo e, após homogeneização e centrifugação por 5 minutos a 7000rpm, a fase superior foi transferida para outro tubo sendo adicionados 500ul da solução de clorofórmio e álcool isoamílico. O material foi homogeneizado e novamente centrifugado por 5 minutos a 7000 rpm. Esse último passo foi repetido por mais uma

61 Material e Métodos 65 vez. O sobrenadante foi colocado em tubo, acondicionado em um recipiente com gelo, contendo 50µl de solução de KCl 2M, logo após foram acrescentados 500ul de etanol 100% (bem gelado). O tubo foi invertido várias vezes até a precipitação do DNA. O material foi novamente centrifugado por 30 segundos a 13000rpm e o sobrenadante desprezado. O DNA no fundo do tubo foi lavado com 200ul de etanol 70% (gelado), e após nova centrifugação por 30 segundos a 13000rpm o sobrenadante foi desprezado deixando secar o DNA a temperatura ambiente por 15 minutos. Depois de seco, o DNA foi re-hidratado em ul de água MilliQ em temperatura ambiente por 24hs,.e conservado em freezer 20 o C Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (SAIKI, 1992) A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica para amplificação, in vitro, que sintetiza, enzimaticamente, seqüências específicas de DNA. A reação utiliza dois primers que se hibridizam em fitas opostas e flanqueiam a seqüência de DNA a ser amplificada. O elongamento dos primers é catalisado pela Taq polimerase. Os ciclos são séries repetidas de desnaturação do DNA, anelamento e extensão dos primers, pelataq polimerase, resultando em um acúmulo exponencial de um fragmento específico de DNA PCR convencional para a detecção da deleção -α 3.7 (BAYSAL; HUISMAN, 1994, com modificações) Esta metodologia permite a identificação da deleção -α 3.7 por meio da amplificação específica da região onde acontece a deleção.

62 Material e Métodos 66 São realizadas duas amplificações em separado, utilizando primers específicos, uma para o alelo normal (gene α 2 ) e outra para o alelo -α 3.7 (figura 15). O primer A, 5 CCCTCCCCCTCGCCAAGTCCACCCC 3, localiza-se 5 do gene α 2 (nt , GI do GenBank), enquanto que o primer B, 5 GGGGGGAGGCCCAAGGGGCAAGAA 3, está localizado a 3 do gene α 1 (nt , GI GenBank) e o primer C, 5 GGGAGGCCCATCGGGCAGGAGGAAC 3, anela a 3 do gene α 2 (nt , GI GenBank). Amplificação in vitro: Cada reação de PCR (25ul) contém aproximadamente 250ng de DNA; 100mM (A+T) e 200mM (G+G) de dntps; 12,5 picomols dos primers A+C ou A+B; 8% dimetiosulfoxido (DMSO); 10 mm de β- mercaptoetanol; 1,25 unidades de Taq DNA polimereas (Biotools) em um tampão contendo 75 mm de Tris-HCl ph 8.0; 50 mm KCl; 20mM de (NH 4 ) 2 SO 2,e4mMde MgCl 2. A amplificação foi realizada utilizando o termociclador I Cycler (Bio-Rad) com um passo de desnaturação inicial de 5 minutos a 95 C seguida de 35 ciclos de 95 C por 40 segundos, 63 C por 60 segundos e 72 C por 2 minutos, incluindo um ciclo adicional de extensão a 72 C por 5 minutos.

63 Material e Métodos 67 Análise dos produtos de PCR Dez microlitros dos produtos de PCR foram separados eletroforeticamente em géis de agarose 1% com brometo de etídeo, em tampão TEB (Tris Borato EDTA) 1X, durante minutos a 80 volts. A bandas específicas foram visualizadas usando um transiluminador UV. Figura 15. Localização dos primers A, B e C para a detecção da deleção -α 3.7. Interpretação: Ambas as combinações de primers (A+B ou A+C) geram fragmentos de 1.8 Kb quando o alelo correspondente está presente. A interpretação se deu seguindo as combinações listadas na Tabela 2. Tabela 2. Resultados possíveis da amplificação utilizando os primers A, B e C.

64 Material e Métodos Multiplex-PCR para a identificação da deleção -α 3.7 O desenho da estratégia molecular, utilizado para a analise da deleção -α 3.7, foi baseado no trabalho publicado por Chong (2000). No entanto os primers foram redesenhados e o protocolo de amplificação sofreu modificações para adaptá-lo às nossas condições. O desenho dos novos primers foi realizado com ajuda do programa primer3 12. Esta nova estratégia permitiu a identificação do alelo normal (gene α 2 ) e da deleção -α 3.7 em uma mesma reação de amplificação. Foi realizada a amplificação utilizando primers específicos (figura 16). O primer α 2 /3.7F, 5 CTGGCCAAACCATCACTTTT 3, localiza-se a 5 do gene α 2 (nt , GI do GenBank), enquanto que o primer α 2 R, 5 GTGCAAGGAGGGGAGGAG 3, esta localizado a 3 do gene α 2 (nt , GI GenBank) e o primer 3.7R, 5 CTCCACTTTCCCTCCTCCAT 3, anela no extremo 3 do gene α 1 (nt , GI GenBank). Na presença do alelo normal (gene α 2 )osprimers α 2 /3.7F e α 2 R geram um fragmento de 1.8Kb, enquanto que na presença do alelo -α 3.7 os primers α 2 /3.7F e 3.7R geram um fragmento de 2.1kb. 12

65 Material e Métodos 69 Amplificação in vitro: Cada reação de PCR (25ul) contém aproximadamente 250ng de DNA; 100mM (A+T) e 200mM (G+G) de dntps; 1,2 um do primer α 2 /3.7F; 0,6uM dos primers α 2 R e 3.7R; 8% de dimetiosulfoxido (DMSO); 10 mm de β-mercaptoetanol; 1,25 unidades de Taq DNA polimerase (Biotools) em um tampão contendo 75mM de Tris-HCl ph 8.0; 50mM KCl; 20mM de (NH 4 ) 2 SO 2, e 4mM de MgCl 2. A amplificação foi realizada utilizando o termociclador I Cycler (Bio-Rad) com um passo de desnaturação inicial de 5 minutos a 95 C seguido de 35 ciclos de 95 C por 40 segundos, 63 C por 60 segundos e 72 C por 2 minutos, incluindo um ciclo adicional de extensão a 72 C por 5 minutos. Análise dos produtos de PCR Dez microlitros de produtos de PCR foram separados eletroforeticamente em géis de agarose 1% com brometo de etídeo, em tampão TEB (Tris Borato EDTA) 1X, durante minutos a 80 volts. A bandas especificas foram visualizadas usando um transiluminador UV. Figura 16. Localizações dos primers específicos para a identificação da deleção -α 3.7 por Multiplex- PCR.

66 Material e Métodos 70 Interpretação: A presença de duas bandas, uma de 1.8Kb e outra de 2.1Kb no gel de agarose indica um resultado heterozigoto para a deleção - α 3.7, enquanto que a presença de uma única banda, de 1.8kb ou 2.1Kb, indica um genótipo normal ou a homozigose para a deleção -α 3.7, respectivamente Analise estatística Para a análise das freqüências genotípicas foi utilizado o teste de Qui-quadrado segundo Callegari-Jacques (2003), por meio da construção de uma tabela de contingência. Este teste também foi utilizado na análise dos resultados da pesquisa de corpos de inclusão de Hb H obtidos para cada grupo genotípico. As restantes análises estatísticas foram realizadas como o auxílio do software BioEstat (AYRES et al, 2003). Antes de realizar qualquer teste foram calculados os valores extremos (outlier) positivos (média mais duas vezes o desvio padrão) e negativos (média menos duas vezes o desvio padrão). Os valores localizados fora dos outliers foram substituídos pelo valor da média aritmética calculada na ausência de tais valores. Após a eliminação destes valores foi testada a normalidade e a homocedasticidade dos dados, utilizando o teste Shapiro-Wilk eo teste F, respectivamente. As amostras com distribuição normal e com resultado positivo para o teste de homocedasticidade foram comparados usando o teste paramétrio t. Enquanto que as amostras que não apresentaram distribuição normal e/ou resultados negativos no teste F, foram comparadas utilizando o teste não paramétrico de Mann-Whitney. Em todas as análises estatísticas foi utilizado um nível de significância de 0,05 (α= 0,05).

67 Resultados 72 Neste trabalho foram analisadas 399 amostras de sangue, sendo 127 provenientes do estado de Sergipe, região nordeste e, 272 do estado de São Paulo, região sudeste. Os resultados globais obtidos para cada amostra encontram-se nas Tabelas de N 13, 14, 15, 16, 17 e 18 do Apêndice, não foram incluídas aquelas amostras cujo genótipo não foi possível determinar. 4.1 Resultados das análises eletroforéticas e citológicas Todas a amostras apresentaram resultados laboratoriais que em conjunto foram sugestivos de talassemia alfa, isto é: resistência osmótica em NaCl 0,36% negativa, alterações na morfologia eritrocitária, Hb H na eletroforese em ph alcalino, nos testes de triagem e, nas provas complementares para talassemias alfa, foi identificada uma banda correspondente a Hb H na eletroforese em ph neutro e, observados corpúsculos de inclusão de Hb H na maioria dos casos. As Figuras 17, 18 e 19, mostram a Hb H identificada pelos métodos eletroforéticos e, células contento corpúsculos de inclusão de Hb H após a coloração com ACB, de amostras que apresentaram resultados laboratoriais expressivos. No entanto, na maioria dos casos, esses achados foram menos evidentes; nos testes eletroforéticos foram observados traços, às vezes muito fracos, de Hb H e, os corpos de inclusão, quando observados, estiveram presentes em um número reduzido de células, sendo difícil confirmar sua presença, considerandose a análise inconclusiva para esse teste HPLC Por meio da cromatografia foram quantificadas as hemoglobinas A 2 e Fetal. A Hb A 2 foi quantificada em 98% (116) das amostras provenientes da região NE e, em 65,4% (178) das amostras provenientes da região SE.

68 Resultados 73 Figura 17. Identificação de Hb H na eletroforese alcalina. Figura 18. Identificação de Hb H na eletroforese neutra. Figura 19. Corpúsculos de inclusão de Hb H, após coloração com ACB.

69 Resultados 74 A maioria das amostras analisadas apresentou valores normais para Hb A 2 (2,5-3,5%) e Hb F (< 1%). No entanto, foram identificados 44 indivíduos com Hb A 2 diminuída (Hb A 2 < 2,5%), sendo 14 (12 mulheres e 2 homens) da região NE e, 31 (19 mulheres e 12 homens) da região SE. Também foi identificado um único individuo (mulher do NE) com Hb F aumentada (2,1%). Estes valores permitiram descartar a talassemia betaeapersistênciahereditáriadehemoglobinafetal,nasquaisashemoglobinasa 2 e F encontram-se aumentadas, respectivamente Resultados da Análise Molecular As metodologias de análise molecular precisaram ser otimizadas. Para este propósito foram utilizadas sete amostras, três normais e 4 heterozigotos para a deleção -α 3.7, previamente genotipadas por médio da utilização do kit comercial InstaGene Alpha Gene I (Bio-Rad). Após extensa revisão bibliográfica e diversos testes otimizou-se as duas metodologias de análise molecular apresentadas neste trabalho. Como a metodologia convencional foi otimizada em primeiro lugar, a genotipagem das primeiras quarenta amostras foi realizada por esta e, as demais foram analisadas por Multiplex-PCR. Nas figuras 20 e 21 são mostradas fotos dos géis de agarose onde os produtos de PCR foram separados eletroforeticamente. Todas as amostras foram analisadas, sendo possível genotipar a maioria delas, 367 de 399 (92%). Os resultados da análise molecular se resumem na tabela 3. A análise estatística não mostrou diferenças significativas entre as freqüências dos genótipos nas duas áreas estudadas (p=0,4267). Portanto, os resultados foram agrupados e as freqüências genotípicas calculadas (Tabela 4). A partir destas foi obtida a freqüência gênica de 0,1 para o alelo -α 3.7.

70 Resultados PM N M N M N M N M 2000pb 1650pb Resultados: 2 normal;1 e 3 heterozigotos -α 3.7 ; 4 homozigoto -α pb 1650pb Resultados: 1, 2, 3, 5, e 6 normais; 4 heterozigoto -α 3.7. Figura 20. Amostras amplificadas com PCR convencional. PM pb 1650pb Resultados: 1,3 e 6 normais; 2, 5 e 7 heterozigotos -α 3.7 ; 4 homozigoto -α 3.7. PM pb 1650pb Resultados: 1, 3, 6, 7, 12 e 13 homozigotos -α 3.7. normais; 2, 5, 9, 11 e 14 heterozigotos -α 3.7 ;4,8e10 Figura 21. Amostras amplificadas com Multiplex-PCR.

71 Resultados 76 Tabela 3. Distribuição dos diferentes genótipos nas duas regiões estudadas. Tabela 4. Freqüências genotípicas.

72 Resultados Correlação dos achados moleculares com os laboratoriais A presença de Hb H na eletroforese em acetato de celulose é o critério mais utilizado para encaminhar as amostras para os teste confirmatórios de talassemia alfa. No grupo analisado, todas as amostras apresentaram a banda de Hb H, às vezes muito fraca. No entanto, só 16,62 % apresentaram a deleção -α 3.7. Resultado similar foi obtido quando comparou-se os dados da eletroforese neutra e da análise molecular. Neste caso só 16,99% dos indivíduos com resultado positivo na eletroforese neutra apresentaram a deleção. Após a genotipagem, os indivíduos foram agrupados por região e origem. Uma vez agrupados foram analisados estatisticamente os índices eritrocitários (VCM e HCM) de cada genótipo em cada grupo. Os resultados da análise estatística inicial, que incluíram Media e Desvio Padrão, estão resumidos na Tabela 5. Comparou-se estatisticamente os valores médios de VCM e HCM entre os grupos genotípicos de cada região (Tabela 6). Como não se observaram diferenças, estatisticamente significativas, reuniu-se os dados em um único grupo (NE-SE) (Tabela 7).

73 Resultados 78 Tabela 5. Valores médios de VCM e HCM para cada genótipo das regiões estudadas. X : média, DP: desvio padrão. Tabela 6. Comparação dos valores médios de VCM e HCM de cada grupo genotípico pertencentes às duas regiões estudadas. Tabela 7. Valores médios de VCM e HCM para cada genótipo. NE-SE= grupo total avaliado.

74 Resultados 79 Merece destaque o fato de que as amostras identificadas como normais (genótipo αα/αα), são normais para a deleção -α 3.7, porém, não se elimina a possibilidade de outras mutações estarem presentes. Devido a este fato não foi possível comparar estatisticamente os valores de HCM e VCM deste grupo fenotípico com os outros. Com o intuito de realizar comparações separouse o grupo normal em dois: um (αα/αα) incluindo indivíduos sem microcitose (VCM 80fl) e/ou hipocrômica (HCM 27pg), com poucas probabilidades de portar alguma mutação e; um outro (αα/?) contendo indivíduos com microcitose (VCM < 80fl) e/ou hipocrômica (HCM < 27pg), com maior probabilidade de possuir alguma alteração molecular diferente da investigada. Estabelecidos os dois grupos, foram calculados os valores médios e desvio padrão para Hb A 2,HbF,VCMeHCM.NaTabela8, apresentam-se os valores médios e o desvio padrão de VCM e HCM para cada grupo. Como os indivíduos com genótipo αα/αα apresentaram valores médios para VCM e HCM dentro dos parâmetros de normalidade, segundo valores previamente estabelecidos para o Brasil, listados no Quadro 1, foram utilizados como grupo normal nas comparações estatísticas. O grupo com genótipo αα/? apresentou valores médios para VCM e HCM significativamente menores que os do grupo com genótipo heterozigoto (-α 3.7 /αα), sugerindo a presença de outras alterações moleculares com expressão fenotípica similar a apresentada pelo o grupo homozigoto (-α 3.7 /-α 3.7 ), com o qual não apresentou diferenças significativas (Tabela 9). Por outro lado, observaram-se diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) para os valores de VCM e HCM entre os grupos normal, heterozigoto e homozigoto (Tabela 10 e Figuras 22 e 23).

75 Resultados 80 Tabela 8. Valores médios de VCM e HCM. Tabela 9.Comparação dos valores médios de HCM e VCM entre o grupo αα/? e os grupos heterozigoto e homozigoto. Tabela 10.Comparação dos valores médios de HCM e VCM entre os grupos genotípicos avaliados.

76 Resultados 81 Figura 22. Comparação dos níveis de VCM entre os grupos genotípicos Figura 23. Comparação dos níveis de HCM entre os grupos genotípicos

77 Resultados 82 Na pesquisa de corpúsculos de inclusão de Hb H foram obtidos três tipos de resultados: positivo, negativo e inconclusivo.células contento corpúsculos de inclusão de Hb H foram observadas tanto em indivíduos com a deleção como também em indivíduos sem a deleção (tabela 11). Não foram observadas diferenças significativas (p=0,4497) na comparação dos resultados obtidos entre os três grupos genotípicos. O mesmo resultado foi obtido quando a comparação foi feita entre indivíduos com e sem a deleção (p=0,1952). Os resultados mantiveram-se após do reagrupamento do grupo com genótipo normal, descrito anteriormente, p= 0,2883 para comparação entre genotípicos e, p= 0,1157 para comparação entre indivíduos com e sem deleção. Estes dados mostram que não existem diferenças estatisticamente significativas para a presença de corpúsculos de inclusão de Hb H entre os grupos genotípicos ou entre indivíduos com ou sem a deleção. Quando comparamos os valores de Hb A 2 ef entre os diferentes genótipos, observamos valores de Hb A 2 significativamente menores no grupo homozigoto em relação aos grupos normal e heterozigoto (p<0,05) (Figura 24). No entanto, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas para os valores médios de Hb F entre os grupos genotípicos (p>0,05). Estes achados estatísticos se mantiveram após o reagrupamento das amostras com genótipo normal. Na Tabela 12 apresentam-se os valores médios e o desvio padrão das Hb A 2 e F para cada grupo genotípico.

78 Resultados 83 Tabela 11. Resultado de pesquisa de corpúsculos de inclusão de Hb H. += resultado positivo, -=resultado negativo.

79 Resultados 84 Tabela 12. Valores médios de Hb A 2 efparacadagrupo genotípico X : média, DP: desvio padrão. Figura 24.Comparação dos níveis de Hb A 2 entre os grupos genotípicos.