FELIPE PEREIRA VIANNA EFICIÊNCIA DOS TESTES DE TERMORESISTÊNCIA (LENTO E RÁPIDO) EM RELAÇÃO A FERTILIDADE DE SÊMEN CONGELADO NA ESPÉCIE BOVINA

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1 FELIPE PEREIRA VIANNA EFICIÊNCIA DOS TESTES DE TERMORESISTÊNCIA (LENTO E RÁPIDO) EM RELAÇÃO A FERTILIDADE DE SÊMEN CONGELADO NA ESPÉCIE BOVINA Botucatu SP 2005

2 FELIPE PEREIRA VIANNA EFICIÊNCIA DOS TESTES DE TERMORESISTÊNCIA (LENTO E RÁPIDO) EM RELAÇÃO A FERTILIDADE DE SÊMEN CONGELADO NA ESPÉCIE BOVINA Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista UNESP, Campus de Botucatu para a obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária. Área de concentração em Reprodução Animal. Orientador: Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa Botucatu SP 2005

3 Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Vianna, Felipe Pereira. Eficiência dos testes de termoresistência (lento e rápido) em relação a fertilidade de sêmen congelado na espécie bovina). Botucatu : [s.n.], Dissertação (mestrado) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Orientador: Prof. Titular Frederico Ozanam Papa. Assunto CAPES: Reprodução animal. CDD Palavras chave: Bovino, Congelação Espermatozóide; Termoresistência.

4 DEDICO... A DEUS. Que, sem a sua ajuda e presença nos momentos difíceis, esse trabalho não se concretizaria. Aos meus pais. José Cláudio Alves Vianna e Maria do Carmo Pereira Vianna. Pessoas que se sacrificaram e renunciaram alguns de seus interesses em função dos meus. Seres humanos de imenso caráter e coração, aos quais, devo minha criação, moldada em valores concretos da vida. Que acreditaram sempre no meu potencial e me deram forças para que alcançasse os meus objetivos. As minhas irmãs e minha sobrinha As quais me deram muito carinho e tiveram compreensão em todos momentos da minha vida, sendo estes felizes ou tristes. Aos meus amigos Rubão, Pituca, Thiago, Betão, Gala, Mazzaia, Senhor, Abe, Nazo, GÔ, Mi, Déia e outros, os quais, me refiro por apelido em função da grande amizade que nos une. Agradeço pela compreensão, paciência e apoio durante o desenvolvimento deste projeto.

5 AGRADECIMENTOS Ao meu amigo Prof. Titular Frederico Ozanam Papa, profissional de grande competência. Pessoa de imenso caráter que me estendeu a mão no momento em que precisei e depositou toda sua confiança durante a execução deste trabalho. A Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Unesp Botucatu pela oportunidade e ensinamentos. Ao meu amigo Márcio Theoro do Carmo, pelo apoio e as conversas nos momentos difíceis durante a pós-graduação. Ao meu amigo José Antonio Dell Aqua Jr., pela grande contribuição prestada para execução deste trabalho. Ao Prof. Dr. Sony Dimas Bicudo pela orientação e sugestões durante a pós-graduação. Ao Prof. Dr. Nereu Carlos Prestes pela amizade e conselhos desde os tempos da residência. Aos amigos de pós-graduação Vítor, Danilas, Antônio, Luciana, Karen, Bigu, Letícia, Cely, pela amizade.

6 Aos Professores João Carlos Pinheiro Ferreira, Maria Denise Lopes, Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga, Marco Antônio Alvarenga, Cezinande de Meira pelas aulas ministradas e dúvidas solucionadas durante o curso de mestrado Ao Prof. Paulo Curi, pessoa extremamente competente e prestativa, que me ajudou na análise estatística do experimento. Aos Funcionários do Departamento de Reprodução, Valter, Edílson, Marquinho pelas ajudas durante o trabalho e momentos de descontração. As funcionárias da pós-graduação, Denise e Maria, pela paciência e ajuda durante o curso de mestrado. A Clínica Veterinária Santa Clara, representada, pelo seu proprietário, Jairo Frare, pelo aprendizado nos primeiros passos de minha vida profissional e pelo fornecimento do material utilizado no trabalho. A Agropecuária Jacarezinho Ltda, na pessoa do Médico Veterinário, Luís Fernando C. Boveda, grande amigo e fundamental para o desenvolvimento deste projeto.

7 Ninguém ignora tudo, ninguém sabe tudo. Por isso, aprendemos sempre Paulo Freire

8 LISTA DE ABREVIATURAS µg micrograma µl microlitro µm/s micrômetro por segundo µm micrômetro µmsq ASBIA CASA CFDA cm d DLC DMSO DNA FBF FMVZ g h HTMA Hz IR L micrômetro quadrado Associação Brasileira de Inseminação Artificial Computer Analise Sperm Automated diacetato de carboxifluoresceína centímetro diferença média deslocamento lateral de cabeça dimetisulfóxido ácido desoxirribonucléico freqüência de batimentos flagelares Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia grama hora Hamilton Thorne Research hertz índice retilíneo litro

9 LIN VCL mg ml p PIB PI PNA qsp sd sptz Tris TTRR TTRL UNESP VAP VCL VSL linearidade calculada através da relação matemática entre e VSL miligrama mililitro nível de significância Produto Interno Bruto iodeto de propídeo corante fluorescente Peanut aglutinina quantidade de suficiente para desvio padrão médio espermatozóide hidroximetilaminometano teste de termoresistência rápido teste de termoresistência lento Universidade Estadual Paulista velocidade espermática ao longo de uma trajetória média velocidade espermática ao longo de uma trajetória real velocidade espermática considerando-se uma trajetória retilínea com origem no primeiro ponto analisado e final no último

10 LISTA DE SÍMBOLOS % porcentagem ºC graus Celsius < menor que > maior que maior ou igual menor ou igual = igual x vezes 10 6 milhões - menos x 2 r Qui-quadrado coeficiente de correlação

11 LISTA DE TABELA Tabela.1. Ajuste do HTMA IVOS 10 para a realização das análises...47 Tabela.2. Valores percentuais da Motilidade espermática avaliada de forma computadorizada e convencional para as seguintes variáveis: motilidade total pósdescongelação (Descong), motilidade total pós-teste de termoresistência rápido (TTRR) e motilidade total pós-teste de termoresistência lento (TTRL)...55 Tabela.3. Avaliações computadorizadas da motilidade espermática; motilidade total (Mot. T) e motilidade progressiva (Mot. P); e integridade de membrana plasmática espermática pela técnica do Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína (PI/CFDA) no sêmen bovino após os testes de termoresistência rápido (TTRR) e lento (TTRL)...57 Tabela.4. Avaliações convencionais da motilidade espermática; motilidade total (Mot. C) e Vigor; e integridade de membrana plasmática espermática pela técnica do Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína (PI/CFDA) no sêmen bovino após os testes de termoresistência rápido (TTRR) e lento (TTRL)...59

12 Tabela.5. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação Artificial (IA), agrupada de acordo com o escore de Motilidade computadorizada e convencional (Mot. T/C) do sêmen congelado bovino após teste de termoresistência rápido (TTRR 46ºC/30min)...61 Tabela.6. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação Artificial (IA), agrupada de acordo com o escore de Motilidade computadorizada e convencional (Mot. T/C) do sêmen congelado bovino após teste de termoresistência lento (TTRL 38ºC/5 h)...61 Tabela.7. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação Artificial (IA), agrupada de acordo com o escore de Motilidade computadorizada e convencional (Mot. T/C) do sêmen congelado bovino para comparar a eficiência do teste de termoresistência rápido (TTRR 46ºC/30min) com o teste de termoresistência lento (TTRL 38ºC/5 h)...62 Tabela.8. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação Artificial (IA), agrupada de acordo com o escore de Motilidade Total computadorizada e convencional (Mot. T/C) do sêmen congelado bovino após a descongelação...62

13 Tabela.9. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação Artificial (IA), agrupada de acordo com o índice de integridade de membrana plasmática avaliada pela técnica com Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína (PI/CFDA) no sêmen bovino após a descongelação...63 Tabela.10. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação Artificial (IA), agrupada de acordo com o número de espermatozóides com motilidade progressiva (Nº Spz/Mot.P) no sêmen bovino após a descongelação...63 Tabela.11. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação Artificial (IA), agrupada de acordo com o número de espermatozóides viáveis avaliados pelo índice de integridade de membrana plasmática (Nº Sptz/Viáveis/PI/CFDA) pela técnica do Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína (PI/CFDA) no sêmen bovino após a descongelação...64 Tabela.12. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação Artificial (IA), agrupada de acordo com escore de Motilidade Total computadorizada (Mot. T) e o índice de integridade de membrana plasmática (Integridade de Membrana PI/CFDA) avaliados pela técnica de fluorescência com Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína (PI/CFDA) no sêmen bovino após a descongelação...65

14 Tabela.13. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação Artificial (IA), agrupada de acordo com escore de Motilidade Total computadorizada (Mot. T) e o número de espermatozóides com a membrana plasmática íntegra (Nº Sptz/Viáveis/PI/CFDA) avaliados pela técnica fluorescência com Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína (PI/CFDA) no sêmen bovino após a descongelação...65 Tabela.14. Correlação entre a Motilidade Total computadorizada pósdescongelação (Mot. T), pós-teste de termoresistência rápido (Mot. TTRR), pósteste de termoresistência lento (Mot. TTRL); índice de integridade de membrana pós-descongelação avaliada pela técnica de fluorescência com Iodeto de propídio/carboxifluoresceína(pi/cfda); número de espermatozóide com motilidade progressiva (CASA) e o número de espermatozóides com a membrana plasmática íntegra (Nº Sptz/Viáveis/PI/CFDA) avaliados pela técnica fluorescência com Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína (PI/CFDA) no sêmen bovino após a descongelação e a fertilidade (número de prenhez)...66

15 RESUMO Com objetivo de correlacionar e associar a eficiência do teste de termoresistência (rápido e lento) de sêmen congelado na espécie bovina com a fertilidade a campo após a Inseminação Artificial foram utilizados 64 ejaculados de 39 touros da raça Nelore com idades entre 2 e 10 anos pertencentes a central de inseminação artificial Jacarezinho Genetics. Após as colheitas as amostras de sêmen foram avaliadas macro e microscopicamente quanto ao volume, aspecto, turbilhonamento, motilidade total, vigor, concentração e patologia espermática. Posteriormente os ejaculados foram congelados com diluente (TRIS) a uma altura de 3 cm do nitrogênio líquido (-140ºC) em um tanque de congelação durante 15 minutos. Para análise das partidas congeladas foram utilizados os parâmetros de motilidade total subjetiva, vigor, análise computadorizada do movimento espermático (HTMA IVOS 10), análise de fluorescência para avaliar a integridade de membrana pós-descongelação, após as provas rápidas (46ºC/30`) e lenta (38ºC/5h) de termoresistência. Os valores de motilidade total após as provas de termoresistência foram subdivididos em 4 grupos (0= 0% de motilidade, 1= 1-20% de motilidade, 2= 21-40% de motilidade e 3= > 40% de motilidade). O teste de fertilidade foi realizado através da inseminação artificial de 3161 fêmeas da raça Nelore, com idade entre 2 e 16 anos em uma mesma propriedade, sendo a fertilidade avaliada através do índice de prenhez a 1ª inseminação artificial. Para verificar a associação entre as ocorrências de interesse e a

16 fertilidade foi utilizada a prova de Qui-quadrado, com o cálculo das estatísticas x 2 e p e o coeficiente de correlação (r). As estatísticas calculadas foram consideradas significativas quando p< 0,05 e nos casos em que 0,05 < p < 0,10 foi referida a tendência a significância, onde p é a probabilidade de erroneamente concluir pela significância. Os resultados mostraram que não houve diferença significativa entre as categorias de motilidade total após testes de termoresistência (rápido e lento) influenciando nas taxas de prenhez (72,8% para o grupo 0 e 70,14% para o grupo 3) a 1ª inseminação artificial. Houve uma tendência a significância para motilidade total e a taxa de prenhez (63,44% para motilidade total < 40% e 68,88% para motilidade entre 70-80%). Para o parâmetro de integridade de membrana e a fertilidade não foi observado relação. A partir dos resultados obtidos foi possível concluir que as provas de termoresistência não têm relação direta com a fertilidade e que talvez mais importante do que muita prova laboratorial, seja a experiência do técnico que trabalhando rotineiramente na congelação de sêmen de touros e conhecendo as características seminais e a fertilidade de determinados animais, possa contorna situações antagônicas entre os valores de provas laboratoriais e a fertilidade, utilizando estratégias para compensar determinados problemas seminais e maximizar a produção, lembrando sempre da individualidade de cada animal.

17 ABSTRACT With the aim of correlating the efficiency of the thermoresistance test (fast and slow) of the frozen sperm in the bovine species with the fertility 64 were used ejaculated of 39 bulls of the race Nelore with age between 2 and 10 years belonging to a Headquarter of Artificial Insemination. After the crops the sperm samples were appraised macro and microscopical as for the volume, aspect, turbine, total motility, energy, concentration and spermatic pathology.later the ejaculated were frozen in diluent (TRIS) to a height of 3 cm of the liquid nitrogen (-140º C) in a freezing tank for 15 minutes. For analysis of the frozen departures the parameters of subjective total motility, energy, computerized analysis of the spermatic movement (HTMA IVOS 10) were used. Fluorescence test was also used to evaluate the integrity of the membrane post-defrosting after the proofs fast (46 C/30 ) and slow (38 C/5h) of thermoresistance. The total motility values after the thermoresistance proofs they were subdivided into 4 categories denominated of adaptation (0=0% of motility, 1= 0-20% of motility, 2= 20-40% of motility and 3= >40% of motility).the fertility test was accomplished through the artificial insemination of 3161 females of the race Nelore, with age between 2 and 16 years in a same property and the fertility was appraised through the pregnancy index after the first artificial insemination. In order to verify the association between the occurrences of interest and the fertility it was used the proof of Qui-square, with the calculation of statistics X 2 and P. The statistics were considered significant when p<0,05 and in the cases which 0,05<p<0,10 the tendency was referred to significance, where p is the probability of erroneously concluding for the significance.the results showed that there were no significant differences among the categories of total motility after the thermoresistance tests (fast and slow) having an effect on the taxes of pregnancy after the first artificial insemination. There was a tendency for significance concerning the total motility and the fertility. For the parameter of membrane integrity and the fertility was not observed any relation. Starting from the obtained results it was possible to end that the proofs of thermoresistance do not have direct relation with the fertility and the more important than a lot of laboratorial proof, maybe it is the experience of the routine, from the crop to the liberation of the sperm doses for the artificial insemination proceeding from the technicians because the individuality of the bull can provide situations totally antagonistic between laboratory and fertility.

18 SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS... LISTA DE SÍMBOLOS... LISTA DE TABELA... RESUMO... ABSTRACT... vi viii ix xii xiv 1 INTRODUÇÃO OBJETIVO E HIPÓTESE REVISÃO DE LITERATURA Criopreservação dos Espermatozóides Integridade da Membrana Plasmática do Espermatozóide Motilidade Convencional e Computadorizada do Sêmen Congelado Número de Espermatozóides Viáveis (membrana plasmática intacta) na Dose Inseminante Teste de Termoresistência para avaliação do sêmen congelado MATERIAL E MÉTODOS Local da Pesquisa Animais Avaliação Inicial do Sêmen a Fresco Congelação do Sêmen Avaliação do Sêmen Congelado Avaliação do Sêmen Congelado Avaliação do Movimento Espermático Pós-Descongelação Avaliação do Movimento Espermático e do Vigor Pós-Teste de

19 Termoresistência Teste de Integridade da Membrana Plasmática Pós- Descongelação Teste da Integridade de Membrana Pós-Teste de Termoresistência Cálculo do Número de Espermatozóides com Motilidade Progressiva e Integridade de Membrana Plasmática na Dose Inseminante Teste de Fertilidade Análise Estatística RESULTADOS Comparação entre Motilidade Computadorizada e Convencional DISCUSSÃO Relação entre a Motilidade Total e a Fertilidade Avaliação da Integridade da Membrana Plasmática Relação entre o Número de Espermatozóides com a Membrana Plasmática Íntegra, Motilidade Progressiva (CASA) e a Fertilidade Relação entre os Valores do Teste de Termoresistência e a Fertilidade 72 7 CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 76

20 18 1 INTRODUÇÃO A pecuária é uma atividade de grande importância social e econômica no Brasil. Os cenários tanto interno, quanto externo, apontam na direção do fortalecimento da atividade, seja como produtora de alimento de alta qualidade, seja como geradora de divisas. As vantagens do setor pecuário nacional são caracterizadas pela competitividade econômica, pela produção de carne sob condições de ambientes naturais, e pela tendência de demanda dos mercados mais exigentes, cenário esse que coloca o Brasil em posição de destaque no plano mundial. Atualmente o setor agropecuário tem-se mostrado imprescindível para a economia do país, contribuindo com uma grande parcela do PIB (produto interno bruto) brasileiro. Em conjunto com o crescimento desse setor está a preocupação do ser humano quanto ao seu destino. É nítido que a população mundial vem crescendo em ritmo acelerado e como conseqüência há um aumento na demanda por alimentos. A procura por alimentos não está apenas sustentada pela quantidade, mas também qualidade, pois são inúmeras as preocupações do homem em relação à saúde. Há também o surgimento de novas economias e mercados mundiais, os quais impulsionam essa demanda. A atual tendência mundial por demanda de alimentos, com específicos atributos de qualidade, como a sustentabilidade ambiental, segurança alimentar, saúde humana e responsabilidade social, representa um dos requisitos fundamentais para o credenciamento e inserção de agentes do agronegócio nesse mercado.

21 19 Em resposta a esses fatores, há necessidade de se buscar cada vez mais um aumento na produção de carne, o qual vem sendo conseguido através da melhoria genética dos rebanhos, conseqüência da utilização de diversas biotecnologias (inseminação artificial, transferência de embriões e a fertilização in vitro), desenvolvimento de programas de avaliação dos animais e disponibilidade de alimentos. Uma das biotecnologias mais utilizada é a inseminação artificial que apresentou um crescimento considerável nos últimos anos subindo de 1.520,739 doses comercializadas em 1981 para em 2000, ASBIA, (2003). As Centrais de Inseminação Artificial reconhecem a responsabilidade na produção de sêmen de alta qualidade e mantém um rigoroso controle em todas as etapas de produção e industrialização do sêmen. Apesar de uma série de trabalhos publicados (DIMITROPOULOS, 1967; ARRUDA, 1988) mostrando uma relação positiva das características seminais, mensuradas em laboratório e a fertilidade, está claro que ainda temos uma deficiência em conhecer e predizer como será o comportamento e resultado final de fertilidade de uma amostra in vitro. A origem do problema inclui repetibilidade de nossos testes laboratoriais, nossa dificuldade ainda para mensurar fertilidade, assim como, estabelecer que existem diferenças entre as amostras de sêmen. Um outro aspecto do problema é a tendência de sempre simplificar a natureza biológica da subfertilidade culpando o macho ou inseminador, muitas vezes assumindo que um simples ou um conjunto de testes englobará a maioria dos fatores importantes para a fertilidade (SAACKE et al., 2000) Existe essa preocupação quanto à qualidade do sêmen produzido, mas ainda não se descobriu nenhuma prova laboratorial capaz de avaliar o processo de

22 20 criopreservação imposto ao sêmen e correlacioná-lo com fertilidade, sendo ainda o teste mais fidedigno a fertilidade a campo, que é demorada e onerosa. O processo de criopreservação das células espermáticas resulta em uma diminuição da fertilidade comparada com sêmen a fresco, em função da morte celular e dos danos na capacidade funcional dos espermatozóides sobreviventes (GONZALEZ, 2004). Diversas avaliações têm sido utilizadas, tais como: verificação da motilidade total através do método subjetivo ou computadorizado (Hamilton Thorne Research - HTMA); a padronização das concentrações das doses inseminantes e das patologias espermáticas; utilização de fluorocromos para verificação da integridade das membranas espermáticas e a capacidade funcional de algumas organelas; testes de estresse térmico; fertilização in vitro e outros mais caros, dispendiosos e de difícil aplicabilidade na rotina. As provas de exaustão dos espermatozóides a diversas temperaturas ainda são muito utilizadas para correlacionar a capacidade dos espermatozóides em suportar longos períodos de tempo a uma determinada temperatura com a fertilidade (DIMITROPOULOS, 1972; BARNABÉ, 1980; ARRUDA, 1988). Mediante constatações de rotina e discussões que surgem em função da aplicabilidade das provas de termoresistência, esse trabalho foi realizado para avaliar a eficiência dos testes de termoresistência lento (TTRL, DIMITROPOULOS, 1967) e o teste de termoresistência rápido (TTRR, MIES FILHO, 1987) em relação a fertilidade para o sêmen congelado bovino. 2 OBJETIVO E HIPÓTESE

23 21 Os objetivos deste trabalho foram correlacionar e associar a eficiência dos testes de termoresistência (rápido e lento), da motilidade total pós-descongelação, do índice de integridade da membrana plasmática, do número de espermatozóides com movimento progressivo e do número de espermatozóides viáveis avaliados pelo índice de integridade de membrana plasmática de sêmen congelado na espécie bovina com a fertilidade. A primeira hipótese testada foi de que partidas de sêmen que não se encontravam dentro dos padrões mínimos preconizados pelo teste de termoresistência, teriam fertilidade semelhante às partidas que estavam dentro dos padrões mínimos estabelecidos, pois acredita-se que o teste não reflita as mesmas condições encontradas no trato genital da fêmea, apesar do sêmen se encontrar em temperaturas semelhantes nos dois locais (útero e frasco). Com relação a motilidade total pós-descongelação a hipótese foi de que partidas de sêmen que apresentassem maiores índices de motilidade total, proporcionariam uma melhor taxa de prenhez. Melhores taxas de prenhez seriam verificadas em partidas de sêmen que apresentassem maiores índices de integridade de membrana plasmática e um maior número de espermatozóides viáveis avaliados pelo índice de espermatozóides com membrana plasmática intacta. Com relação ao número de espermatozóides com movimento progressivo a hipótese testada foi de que partidas de sêmen que apresentassem um maior número progressivo, proporcionariam maiores índices de prenhez. 3 REVISÃO DE LITERATURA

24 Criopreservação dos Espermatozóides Mies Filho (1987) relatou que as primeiras evidências sobre a ação do frio na preservação dos espermatozóides foram verificadas por Ivanov, que observou que as células espermáticas colhidas do epidídimo de um carneiro morto na neve após várias horas, ainda mantinham-se vivas. Spallanzani (1776) apud Mies Filho (1987), constatou o fato biológico de anabiose (suspensão das funções vitais de forma reversível do organismo (vegetal oy animal) por congelação ou ressecamento). Relatou que os espermatozóides permaneciam imóveis temporariamente induzindo-se a um estado de letargia do qual poder-se-iam recuperar quando expostos a temperaturas mais elevadas. O sucesso da criopreservação do sêmen de mamíferos foi atribuído em grande parte a Polge, (1949) apud Zavós & Correa, (1995), que observou que o glicerol proporcionava uma proteção às células. Entretanto os protocolos de criopreservação expõem as células espermáticas à inúmeras situações de estresse como as variações de temperaturas e exposição à temperaturas não fisiológicas, estresse osmótico pelos elevados gradientes de concentração de solutos do meio diluidor de congelação e pela formação e dissolução de cristais de gelo no meio extracelular, os quais comprometem sua viabilidade (WATSON & MARTIN, 2000). A exposição das células espermáticas à temperaturas abaixo das fisiológicas, mesmo antes de ocorrer a congelação (processo de estabilização e redução do metabolismo das células espermáticas) é responsável por mudanças na organização bi-dimensional dos lipídios da membrana e alteração das propriedades de enzimas encontradas entre a membrana, diminuindo a longevidade dos

25 23 espermatozóides pós-descongelação, pela antecipação da capacitação espermática (HOLT, 2000). O estresse sofrido pelos espermatozóides durante o processo de refrigeração é conhecido como choque frio, sendo sua sensibilidade variável entre espécies. Estudos correlacionaram a suscetibilidade aos danos da refrigeração com a composição de lipídios da membrana entre as espécies, ou seja, espécies (bovinos e eqüinos) que contém concentrações de esteróides baixa e concentrações de ácidos graxos poliinsaturados elevados, são mais predispostos aos danos do choque térmico (DARIN-BENNETT et al., 1973). Parks & Lynch (1992) determinaram a composição e comportamento na fase termotrófica dos lipídios de membrana dos espermatozóides de cachaço, touro, garanhão e galo, de acordo com uma classificação baseada no grau de sensibilidade ao choque frio. Lipídios do sêmen total e da membrana plasmática foram divididos em lipídios neutros, glicolipídios e fração de fosfolipídios, além de esteróides livres e fosfolipídios ligados a ácidos graxos. O colesterol foi o esteróide encontrado em maior quantidade dentre os lipídios espermáticos nas espécies estudadas. Dos fosfolipídios encontrados em maior freqüência tem-se: esfingomielina, fosfatidilcolina e fosfatidil-etanolamina. Dos ácidos graxos ligados a fosfolipídios foi caracterizada uma alta proporção de grupos docosapentóicos e de docosahexanóicos nos espermatozóides das espécies mamíferas e de ácidos graxos de cadeia menor com maior número de saturações no espermatozóide de galo. Os glicolipídios correspondem a menos de 10,0% do total de lipídios polares das membranas espermáticas nas espécies estudadas, observando-se que o maior glicolipídio encontrado no espermatozóide do galo é diferente do encontrado nos espermatozóides mamíferos, demonstrando as diferenças de tolerância entre os espermatozóides ao rápido resfriamento.

26 24 Existem três membranas no espermatozóide: plasmática, acrossomal e mitocondrial. Com exceção da última, as outras apresentam diferenças em domínios na sua estrutura e comportamento (WATSON, 1995). As membranas espermáticas em condições normais apresentam-se num estado fluido, sendo esta característica um pré-requisito para o desempenho de suas funções com plena eficiência. Os principais fatores que afetam esta fluidez são sua composição relativa entre fosfolipídios e colesterol e a temperatura na qual a membrana é exposta. Com a queda da temperatura, os lipídios passam por uma transição de estado fluido para um estado gel, no qual as cadeias de ácidos graxos tornam-se desordenadas e com a contínua queda de temperatura, essas se organizam em um modelo paralelo, produzindo uma estrutura rígida, tornando estas áreas fracas, sujeita a rupturas, fusões e permeáveis a íons (HAMMERSTED et al., 1990). As membranas ancoram-se no citoesqueleto que é uma complexa rede de filamentos de proteínas que se estende pelo citoplasma e coordena a estrutura, organização e o movimento da célula. É uma estrutura altamente dinâmica que dá a célula uma forma tridimensional. Reorganiza-se continuamente controlando a forma, movimento intracelular, transporte de organelas e segregação cromossomal. Este é formado por três tipos de filamentos de proteínas: actino filamentos (microfilamentos), microtúbulos e filamentos intermediários. Estes tipos de filamentos são formados por diferentes sub-unidades de proteínas: actina para microfilamentos, tubulinas para microtúbulos e fibras de proteínas para filamentos intermediários. Os filamentos de actina e tubulinas se ligam a umas variedades de proteínas acessórias que tem a capacidade de participar de distintas funções em diferentes regiões da célula, incluindo a membrana plasmática. Estes filamentos promovem uma

27 25 comunicação dentro da célula e capacitam a localização espacial do complexo de proteínas e organelas (DOBRINSKI, 1996). Essas proteínas apresentam despolimerização e repolimeração de acordo com a temperatura a que são submetidas, o que traz importantes implicações na criopreservação dos espermatozóides (WATSON, 1995). Spungin et al. (1995) propuseram que a despolimeralização da F-actina do citoesqueleto é um passo necessário para permitir a aproximação do plasmalema à membrana do folheto externo acrossomal para produzir a exocitose, portanto, a despolimerização e repolimerização de acordo com a temperatura do resfriamento e criopreservação poderia contribuir com uma fusão desorganizada. 3.2 Integridade da Membrana Plasmática do Espermatozóide A integridade da membrana plasmática tem sido um dos parâmetros mais estudados no processo de avaliação das injúrias sofridas pela célula durante o processo de criopreservação (DELL AQUA, 2000). A integridade da membrana plasmática exerce um papel fundamental na sobrevivência do espermatozóide no trato genital da fêmea e na manutenção de sua capacidade fertilizante (PARKS & GRAHAN, 1992). O uso de fluorocromos (isolados ou associados) tem promovido uma boa metodologia de avaliação da integridade de vários compartimentos subcelulares, como a função mitocondrial e a integridade da membrana plasmática (MARTINEZ, 2000).

28 26 As sondas fluorescentes têm sido muito utilizadas, pois têm a capacidade de se difundir pelas células íntegras ou lesadas, mesmo na presença de algum crioprotetor (ZÚCCARI, 1998). As células espermáticas coradas com as sondas fluorescentes podem ser avaliadas tanto no aspecto morfológico quanto no funcional, sem a interferência do meio extracelular (ERICSSON et al., 1989). Os corantes fluorescentes podem ser divididos em dois grupos; os que não são capazes de penetrar através de uma membrana íntegra, caso do brometo de etídeo, iodeto de propídeo e hidroetidine, entre outros (EVENSON et al., 1982; ERICSON et al., 1989) e os compostos não polares, onde se encontram os ésteres de fluoresceína, que têm característica de se difundirem através de uma membrana intacta e serem hidrolisados por esterases, produzindo fluoresceína (ROTMAN & PAPERMASTER, 1966). O Iodeto de Propídeo se liga e fluoresce o DNA celular de vermelho, é impermeável a membrana celular íntegra, penetrando na célula e desempenhando sua função somente em células com a membrana lesada. O Diacetato de Carboxifluoresceína por outro lado é permeável a célula, sendo deestereficado por esterases não específicas resultando em Carboxifluoresceína livre que se liga a membrana intacta, causando uma fluorescência verde (HARRISON & VICKERS, 1990). A princípio, a técnica com sonda fluorescente foi realizada com a utilização de um citômetro de fluxo, pois este tem a capacidade de avaliar um número maior de células, em um tempo mais reduzido, além de determinar muitas variáveis e ser altamente correlacionado com a fertilidade (ERICSON et al., 1989; MARTINEZ, 2000)

29 27 Harrison & Vickers (1990) adicionaram à solução de trabalho, o formaldeído, numa diluição de 1:80, o que proporcionou a avaliação através de preparação úmida em microscópio de epifluorescência. Brito et al. (2003) verificaram que quando utilizaram os corantes Diacetato de Carboxifluoresceína (CFDA) e Iodeto de Propídeo que os espermatozóides com danos na membrana apresentam variados graus de coloração verde e vermelha, indicando diferenças na susceptibilidade da membrana de acordo com a região ou devida uma menor condensação do DNA. Observaram que em alguns casos a região da peça intermediária de espermatozóides lesados, apresentavam diferentes tonalidades de verde, indicando que o Diacetato de Carboxifluoresceína pode ser produzido e retido dentro da mitocôndria intacta. Os mesmos autores observaram uma alta correlação entre os valores de integridade de membrana obtido através dos corantes CFDA e a taxa de fertilização in vitro. Januskauskas et al. (1999) não observaram correlação entre o teste de integridade de membrana e a taxa de não retorno ao cio aos 56 dias na espécie bovina. Zúccari & Papa. (1995) relataram que em relação ao sêmen congelado eqüino, uma queda concomitante do número médio de espermatozóides íntegros e da motilidade progressiva ocorre no teste de termoresistência. Zúccari (1998) trabalhando com espermatozóides eqüinos, verificou correlações existentes entre as variáveis motilidade, vigor e integridade da membrana plasmática pela utilização das sondas fluorescentes, Iodeto de Propídeo e Diacetato de Carboxifluoresceína, após a descongelação e durante o teste de termoresistência.

30 28 Januskauskas et al. (2003) trabalharam com os corantes Anexina-V e Iodeto de propídeo para avaliar a viabilidade dos espermatozóides bovinos pósdescongelação e verificaram que o número de células vivas e viáveis nas doses inseminantes estavam significativamente correlacionadas com a fertilidade. Brito et al. (2003) compararam métodos de avaliação da membrana dos espermatozóides bovinos e verificaram que os valores de espermatozóides com a membrana intacta determinada pelas colorações de Carboxifluoresceína/Iodeto de propídeo e SYBR-14 1 /Iodeto de propídeo foram maiores do que a proporção de espermatozóides com membrana íntegra ao teste hiposmótico durante a incubação pós-descongelação. Demonstraram que a proporção de espermatozóides intactos determinadas pela coloração com Iodeto de propídio diminuiu constantemente durante a incubação a 37ºC. Coelho et al. (1995) comparando a integridade da membrana plasmática dos espermatozóides bovinos e sua relação com a motilidade progressiva a uma temperatura de 38,5ºC durante 2-4 horas, observaram o efeito significativo do reprodutor para as variáveis: motilidade progressiva e percentual de células espermáticas com membranas plasmáticas danificadas, nos diferentes tempos de incubação. Os pesquisadores correlacionaram positivamente o declínio da motilidade progressiva com relação ao percentual de células íntegras em função do tempo de incubação, sugerindo que a perda da motilidade está associada às lesões da membrana plasmática. Os mesmos autores observaram a presença de formas intermediárias de membranas danificadas sugerindo que a resistência da membrana plasmática ao longo das distintas regiões dos espermatozóides, parece ser diferente, provavelmente devido à diferenciação regional na composição da superfície da 1 Molecular probes, Eugene, OR, USA

31 29 célula espermática, resultando em componentes associados com funções especializadas, localizados em domínios específicos. Mclaughlin et al. (1992) não encontraram qualquer relação entre motilidade e integridade de membrana, quando avaliaram à integridade da membrana do espermatozóide humano por dois métodos independentes: intumescimento celular em condições hiposmóticas e coloração com Hoechest Esses métodos não identificam células que apresentam formas intermediárias de membranas danificadas, as quais podem ainda conservar sua motilidade. Chalah & Brillard (1998) utilizaram a coloração de SYBR-14/Iodeto de propídio para avaliar a integridade de membrana em espermatozóides bovinos criopreservados e incubados à 4ºC durante 0,5 ; 2 ; 4 ; 24 horas e observaram que a integridade de membrana diminui em função do tempo. Congelado 3.3 Motilidade Convencional e Computadorizada do Sêmen A avaliação subjetiva da motilidade espermática tem sido utilizada correntemente como meio de qualificar o sêmen após a descongelação, face sua correlação com a fertilidade (LASLEY, 1944 apud FERREIRA, 2000). Pickett et al. (1965) avaliaram temperaturas de descongelação em sêmen congelado bovino e obtiveram uma correlação positiva entre a motilidade pósdescongelação e a fertilidade. Casagrande et al. (1980) trabalharam com um material pré-selecionado de Centrais de Inseminação e verificaram que existe uma forte correlação tanto da

32 30 motilidade como da velocidade espermática avaliadas subjetivamente com a fertilidade. Os mesmos autores observaram que o limite mínimo de motilidade após descongelação para sêmen de fertilidade normal é de 20% e que o coeficiente de correlação da velocidade espermática com fertilidade é bem mais alto do que a motilidade propriamente dita. Kjaestad et al. (1993) trabalharam com sêmen congelado de 18 touros e verificaram uma correlação entre motilidade e velocidade, mas não entre motilidade e integridade de acrossomo. Os mesmos autores constaram que motilidade e velocidade estão relacionadas com a fertilidade. Jondet & Rabadeux (1974) relataram que descartavam as partidas de sêmen criopreservados que não descongelassem com no mínimo de 60,0% de motilidade. Dois autores avaliaram e correlacionaram a motilidade pósdescongelação de espermatozóides bovinos congelados na forma de pellets com a taxa de não retorno ao cio aos dias (GIBSON & GRAHAM, 1969). Papa (1982) trabalhou com duas temperaturas (40ºC e 70ºC) de descongelação em sêmen congelado bovino e verificou que quanto maior a temperatura de descongelação maior o valor da motilidade total, sendo esta correlacionada com a fertilidade (77,09% taxa de prenhez em 8441 inseminações). O uso da análise computadorizada vem sendo cada vez mais difundida na avaliação do sêmen de diversas espécies, como por exemplo, humanos (MARCK et al., 1988), eqüino (FERREIRA et al., 1997) e ovino (SOUSA et al., 1999), pois é uma alternativa à avaliação microscópica tradicional de motilidade e concentração espermática. A técnica permite a identificação precisa das células móveis e imóveis de uma amostra de sêmen e o registro das trajetórias espermáticas individuais. A

33 31 partir destes dados, com o auxílio de um microcomputador, é possível calcular o percentual de motilidade, reconstituir as trajetórias espermáticas e através de suas medidas determinar os valores médios para a velocidade espermática, linearidade, índice retilíneo e deslocamento lateral da cabeça dos espermatozóides, sendo os valores de suma importância para discriminar pacientes férteis ou inférteis (AMANN, 1987). Januskauskas et al. (2001) correlacionaram a motilidade pósdescongelação de sêmen congelado bovino e a porcentagem de linearidade avaliado pelo método subjetivo e computadorizado. Os autores verificaram que os valores de motilidade avaliados pelo método subjetivo são menores do que pelo método computadorizado, mas não são estatisticamente diferentes. A motilidade pós-descongelação avaliada pelo método subjetivo, foi significativamente correlacionada com a fertilidade (taxa de não retorno ao cio aos 56 dias). Quando utilizaram touros de boa fertilidade, tanto a avaliação da motilidade subjetiva quanto computadorizada foram significativamente correlacionadas com fertilidade. Januskauskas et al. (1996) trabalharam com palhetas de sêmen bovino utilizando as concentrações de 10,0 e 15,0 x 10 6 de espermatozóides totais e verificaram que nas doses de 15,0 x 10 6 a motilidade pós-descongelação não foi correlacionada com a fertilidade, em contrapartida, essa foi significativamente importante nas doses com 10,0 x Brahmkshtri et al. (1999) relataram que a porcentagem de motilidade, viabilidade e integridade de acrossomo não foram correlacionadas com a taxa de concepção. Todavia existiu uma alta correlação entre motilidade pós-descongelação e viabilidade. Os mesmos autores relataram que a baixa correlação entre motilidade pós-descongelação, viabilidade e taxa de concepção refletem a habilidade do

34 32 espermatozóide em atingir o oócito, mas não indica a capacidade para realizar a reação acrossômica com a membrana vitelínica e formar o pró-núcleo. Farrel et al. (1998) verificaram uma alta correlação (r = 0,89 a 0,98), entre a associação alguns parâmetros de movimento espermático de bovinos avaliados pelo método computadorizado (CASA) e a fertilidade. Zhang et al. (1998) estudaram algumas características espermáticas na espécie bovina e sua relação com a fertilidade e verificaram uma correlação significativa entre a motilidade linear pós-descongelação e a fertilidade. Hansen 2 et al. (2004) obtiveram uma pequena correlação (r = 0,06, P>0,05) entre motilidade pós-descongelação de sêmen bovino e a taxa de não retorno ao estro aos dias no primeiro serviço em inseminações. 3.4 Número de Espermatozóides Viáveis (membrana plasmática intacta) na Dose Inseminante Um dos objetivos da técnica de inseminação artificial é maximizar o uso do sêmen de touros geneticamente superiores com um índice de fertilidade compatível. Dessa forma tem-se procurado reduzir o número de espermatozóides na dose inseminante (FOULKES & STEWART, 1977). Os mesmos autores não observaram diferença significativa na taxa de não retorno ao cio aos dias, utilizando-se 5,0 ; 7,0 e 9,0 x 10 6 espermatozóides totais por dose em palhetas de 0,25 ml, em contrapartida, as doses com 12,0 e 20,0 x 10 6 apresentaram uma maior taxa de não retorno. Verificaram que o decréscimo de 1,0 x 10 6 espermatozóides inseminados refletia em uma redução de 0,5% na taxa de não retorno ao cio. 2 Hansen, D. (IMV, Technologies França). Comunicação pessoal, 2004).

35 33 Jondet (1972) relatou que para palhetas com volume variando entre 0,20 ; 0,40 e 0,60 ml, com o número de 3,0 x 10 6 espermatozóides viáveis pósdescongelação, avaliado apenas pela motilidade progressiva, as taxas de não retorno permanecem constantes (65,3% ; 70,4% e 62,8%) respectivamente. Com poucas exceções a fertilidade diminuiu com a redução do número de espermatozóides viáveis por dose (< 3,0 x 10 6 ). Doses com até 0,375 x 10 6 espermatozóides viáveis são passíveis de atingir taxas de concepção médias (57,2% ; 46,7% e 44,6% para volumes entre 0,20, 0,40 e 0,60 ml) sendo influenciada pelo volume da dose e a fertilidade do touro. Den Daas et al. (1998) utilizaram palhetas de 0,25 ml com sêmen de 20 touros adultos com a concentração de espermatozóides viáveis por dose entre 1,1 a 11,8 x Os autores constataram que não houve correlação entre o número máximo de espermatozóides viáveis com uma maior taxa de não retorno ao cio aos 56 dias e que o número de espermatozóide necessário para se obter um valor máximo na taxa de concepção (95%) está ao redor de 1,0 e 11,0 x Stewart & Bennett (1968) utilizaram 5,0 ; 10,0 ; 20,0 e 30,0 x 10 6 espermatozóides totais por dose inseminante e não observaram diferença estatística significativa na taxa de não retorno ao cio aos dias. Shannon & Vishwanath (1995) comparando a ótima e sub-ótima concentração espermática compatível com fertilidade entre sêmen a fresco e congelado bovino, verificaram que a interação touro versus concentração por dose foi significativa para sêmen congelado, mas não para sêmen a fresco, sugerindo que o efeito da congelação não é uniforme entre os touros. Os autores relataram que comparativamente é necessário 2,0 x 10 6 espermatozóides vivos no sêmen a fresco e 8,0 x 10 6 no congelado para se obter a mesma taxa de não retorno ao cio,

36 34 indicando que o processo de congelação alterou a probabilidade de fertilização pelos espermatozóides vivos ou o seu modelo de sobrevivência. Seidel et al. (1997) relataram taxas de prenhez de 41,0 e 50,0% utilizando doses de 1,0 x 10 5 e 2,5 x 10 5 de espermatozóides totais em palhetas de 0,1 ml de sêmen sexado no corpo e corno uterino, contra 61,0% do grupo controle (2,5 x 10 6 ) congelados em palhetas de 0,21 ml. Hansen 2 et al. (2004) obtiveram uma pequena correlação entre o número de espermatozóides com movimento progressivo e a fertilidade,estando esse número por volta de 4,5 a 5,0 x Nesse mesmo estudo os autores verificaram uma correlação ainda maior entre o número de espermatozóides viáveis na dose (4,5 a 5,0 x 10 6 por dose) avaliados pela técnica de citometria de fluxo, com as sondas fluorescentes SYBR 14/Iodeto de propídio e a fertilidade. 3.5 Teste de Termoresistência para avaliação do sêmen congelado Pickett et al. (1961) verificaram maior resistência dos espermatozóides bovinos à incubação de 38ºC, avaliando a porcentagem de espermatozóides móveis, quando congelados em nitrogênio líquido do que em gelo seco e álcool, após 90 e 180 dias de estocagem. Dimitropoulos (1967) denominou de T.T.R.L (Teste de Termoresistência Lento) a prova que consiste na incubação de uma amostra de sêmen à 38ºC durante 5 horas, após o que se verifica a porcentagem de motilidade progressiva, apresentando correlação positiva e altamente significativa com a fertilidade real, medida pelo índice de não retorno ao cio aos dias. 2 Hansen, D. (IMV, Technologies França). Comunicação pessoal, 2004).

37 35 Jondet & Rabadeux. (1974) relataram que utilizam o T.T.R.L. há vários anos e eliminam sistematicamente todo sêmen descongelado que não apresente pelo menos 20,0% de espermatozóides ativos após a prova. Esses mesmos autores verificaram que quanto melhor a classificação inicial da amostra logo após o descongelamento, menor é a diferença na queda percentual dos espermatozóides exibindo movimentos progressivos. Eles enunciaram essa assertiva separando-as em grupos de 65,0 a 70,0% ; 60,0 a 65,0 % e abaixo de 60,0 % de motilidade progressiva após a descongelação. A utilização rotineira do teste apresenta as vantagens de: possibilidade de retenção de partidas que, pela avaliação convencional, seriam eliminadas por apresentarem índice de motilidade inferior a 60% após a descongelação (no Brasil atualmente considera-se como padrão mínimo 30%) e eliminação de certas partidas que, aparentemente, estariam aptas a serem distribuídas por apresentarem o índice de motilidade mínimo exigido às descongelações, mas que não correspondem ao T.T.R.L Saacke & White (1972) relataram que o edema, a deterioração e a perda da membrana acrossomal no sêmen incubado a 37ºC ocorre de maneira gradual, sendo difícil quantificar. Verificaram que a retenção de acrossomo às 2 ; 4 e 8 horas à temperatura de 37ºC foi relacionada com a fertilidade. Pursel et al. (1972) observaram que a incubação por 2,5 e 4,5 horas foram prejudiciais para porcentagem de espermatozóides móveis nas temperaturas de 15 ; 20 e 30ºC. Coulter & Foote (1974) incubaram sêmen congelado de bovino a 37ºC durante 0 ; 3 e 6 horas e verificaram uma queda acentuada na motilidade total e na retenção de acrossomo.

38 36 Barnabe et al. (1980) trabalharam com as ampolas de sêmen produzido em uma central de inseminação artificial para avaliar o teste de termoresistência e verificaram que em média a motilidade progressiva pós-descongelação foi de 46,15%, sofrendo uma queda para 19,77% depois do teste rápido e para apenas 6,12% após o teste lento. Diante de tais resultados e considerando que o material fora previamente selecionado quanto à qualidade e liberado para comercialização sem que se tenha tido conhecimento de reclamações por parte dos compradores, é de se supor que o critério de eliminação sistemática de todo sêmen congelado que não apresente pelo menos 20% de espermatozóides ativos após o teste lento de termoresistência poderia não ser aplicado nas amostras em questão. Os pesquisadores relataram que talvez a prova lenta seja demasiadamente rígida para a avaliação das amostras de sêmen. Assim, os valores para a prova rápida foram correlacionados com os obtidos após a prova lenta, verificando-se um coeficiente de correlação (r=0,38) que embora de média intensidade, revelou-se positivo e altamente significante. Dessa forma, o teste de termoresistência rápido seria mais aconselhável de ser executado, mesmo porque, o sêmen de determinados touros pode apresentar fertilidade, apesar dos valores baixos acusados pela prova. Arruda (1988) verificou taxas de prenhez semelhantes (teste de quiquadrado) ao primeiro, segundo e terceiro estro para os tratamentos do teste de termoresistência rápido e lento. Relatou que pela análise de variância também não detectou diferença significativa do tratamento sobre a taxa de prenhez assim com os efeitos de touro e da interação touro versus tratamento. O autor dividiu em duas classes de motilidade (baixa = 25,0 a 35,0% e alta 40,0 e 50,0%) as palhetas utilizadas no teste de termoresistência rápido com a finalidade de verificar a existência de diferenças na taxa de prenhez o que não se apresentou. O

39 37 pesquisador concluiu que como as taxas de prenhez acumuladas para ambos os testes se mostraram próximas é possível utilizar o teste de termoresistência rápido, para avaliar com maior rapidez o poder fecundante do sêmen congelado, desde de que sejam obedecidas às normas fixadas para congelação do sêmen bovino no Brasil, a prova rápida de termo-resistência poderá substituir a prova lenta. Monterroso et al. (1995) incubaram partidas de sêmen congelado durante 1 a 3 horas à temperatura de 39,41, 42 e 43ºC e verificaram que a motilidade teve uma tendência de diminuir com o tempo de incubação, sendo maior à 39ºC do que a 42 e 43ºC. A capacidade de suportar o swim-up também diminuiu com o tempo de incubação. Relataram que a porcentagem de motilidade foi afetada pelo tempo e existiu uma interação tempo-temperatura de incubação. Os mesmos autores relataram que os espermatozóides incubados a 39, 41 ou 42ºC tiveram uma leve diminuição na taxa de clivagem e na porcentagem de embriões clivados que desenvolveram até o estágio de 4 células, em relação aos espermatozóides não incubados. Verificaram um aumento na produção de superóxido em todas as temperaturas de incubação mas uma maior quantidade a temperatura de 42ºC. Demonstraram que a integridade da fita de DNA não foi alterada pela temperatura, utilizando-se a coloração de laranja-acridina. O aumento na produção de radicais livres poderia causar danos ao DNA, desde que os radicais livres pudessem reagir com o DNA para produzir nucleosídeos oxidados. O sistema de cultura utilizado para avaliar o efeito do estresse térmico calórico nos espermatozóides não simula as condições in vivo as quais podem ser comprometidas pelo calor. Rota et al. (1996) incubaram sêmen de cão por 3 horas a uma temperatura de 38ºC para verificar a eficácia da introdução do Equex STM Paste no diluente em relação à viabilidade e longevidade dos espermatozóides e