UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

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1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Dissertação Caracterização molecular e sensibilidade a antimicrobianos de Listeria monocytogenes isoladas em carcaças bovinas no sul do Brasil MARIANA ALMEIDA IGLESIAS Pelotas, 2014

2 2 MARIANA ALMEIDA IGLESIAS Caracterização molecular e sensibilidade a antimicrobianos de Listeria monocytogenes isoladas em carcaças bovinas no sul do Brasil Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências. Orientador: Wladimir Padilha da Silva Co orientador: Marcelo Mendonça Pelotas, 2014

3 3 Dados de catalogação na fonte: Maria Beatriz Vaghetti Vieira CRB-10/1032 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel I24c Iglesias, Mariana Almeida Caracterização molecular e sensibilidade a antimicrobianos de Listeria monocytogenes isoladas em carcaças bovinas no sul do Brasil / Mariana Almeida Iglesias. 64f. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Área de concentração: Microbiologia. Universidade Federal de Pelotas. Centro de Desenvolvimento Tecnológico. Pelotas, Orientador Wladimir Padilha da Silva; co-orientador Marcelo Mendonça. 1.Biotecnologia. 2. Listeria monocytogenes. 3. Fatores de virulência. 4. Potencial patogênico. 5.Suscetibilidade a antibióticos. I.Silva, Wladimir Padilha da. II. Mendonça, Marcelo. III. Título. CDD: 636.2

4 4 Banca Examinadora: Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva (Presidente) Prof. Dr. Fábio Pereira Leivas Leite Dra. Karla Sequeira Mendonça

5 5 DEDICATÓRIA Dedico aos meus pais.

6 6 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus pela minha vida e por ter colocado pessoas tão especiais ao meu lado durante esta caminhada, todos indispensáveis e fundamentais para que eu chegasse até aqui. Aos meus pais, Alexandre e Grazielle, pelo apoio e incentivo nos momentos felizes, pelo consolo e segurança que me ofereceram nos momentos complicados e por jamais medirem esforços para que eu chegasse até esta etapa de minha vida. A minha irmã Aline, pela amizade, companheirismo e alegrias que me proporcionou incansavelmente. A minha irmã Alexandra, simplesmente por fazer parte da minha vida e por ser para mim um exemplo de que com esforço e determinação sempre conquistamos o que queremos. A minha madrinha Cristina que mesmo longe, sempre esteve presente na minha caminhada. Ao meu orientador Wladimir Padilha da Silva, pela amizade, confiança em mim depositada, pela orientação, ensinamentos e constantes incentivos os quais foram de suma importância para o meu crescimento profissional e para que eu chegasse até aqui. Ao meu co orientador Dr. Marcelo Mendonça, pela orientação e ajuda indispensável para realização deste trabalho e por sempre me receber de forma atenciosa disponibilizando parte do seu tempo para que pudéssemos da melhor maneira executar este trabalho. Aos amigos do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, tanto aqueles que já passaram (Luana, Melina, Paulo, Michelle, Joline, Karla e Greici), como aqueles que ainda estão por aqui (Professora Ângela, professor Celso, Andréia, Júlia, Louise, Simone, Tatiane, Juliana, Isabela, Graci, Ana Rita, Fabio, Flávia, Guilherme, Cristiane e Darla) por todo apoio, incentivo, carinho e amizade.

7 7 Aos amigos e colegas de pesquisa Luana Decol, Guilherme Dannenberg, Isabela Schneid e Simone Würfel pelo apoio e incentivo, sugestões ao trabalho e por não medirem esforços em auxiliar, sempre que necessário. A amiga Elita Silveira pela amizade, palavras de incentivo e por compartilhar comigo todos os momentos vividos. Obrigada por estar sempre comigo, me escutando, me aturando e tentando ajudar sempre! Obrigada por me lembrar de que a cada dia podemos recomeçar e que a gente sempre chega aonde quer com esforço e dedicação. Aos professores do Programa de Pós- Graduação em Biotecnologia por todos os ensinamentos transmitidos durante o decorrer do curso. Aos membros da banca Prof. Dr. Fábio Pereira Leivas Leite e Dra. Karla Sequeira Mendonça por se disporem a participar da banca examinadora desta dissertação. Ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro. A todos que colaboraram direta ou indiretamente para realização deste trabalho. Obrigada.

8 8 RESUMO Iglesias, Mariana Almeida. Caracterização molecular e sensibilidade a antimicrobianos de Listeria monocytogenes isoladas de carcaças bovinas no sul do Brasil f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Centro de Desenvolvimento Tecnológico. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Listeria monocytogenes é um patógeno de origem alimentar capaz de causar listeriose, tanto em humanos como em animais. A contaminação por este microorganismo é de difícil controle, tendo em vista sua ampla disseminação e capacidade fisiológica de adaptação, as quais permitem seu desenvolvimento sob condições que usualmente são desfavoráveis a outras bactérias patogênicas. Assim sendo, esse patógeno tornou-se motivo de preocupação para a indústria de alimentos bem como para os consumidores, uma vez que é altamente patogênica, principalmente em relação ao grupo de risco, podendo ser fatal em até 30% dos casos de listeriose. Embora qualquer isolado de L. monocytogenes possa ser considerado potencialmente patogênico para humanos, vários estudos sugerem que este micro-organismo apresenta patogenicidade heterogênea, o que torna essencial a caracterização molecular de cada isolado, bem como o conhecimento de sua expressão gênica, para que possam ser entendidas as diferenças nos seus mecanismos de patogenicidade.. Em vista do exposto, o presente estudo objetivou verificar a ocorrência de L. monocytogenes em carcaças bovinas abatidas em dois frigoríficos-matadouros do sul do Rio Grande do Sul e, a partir dos isolados, avaliar sua sensibilidade a antimicrobianos, e realizar a caracterização genotípica, através da verificação da presença de genes de virulência e da expressão da internalina A. A ocorrência de L. monocytogenes nas carcaças foi de 6%, a qual foi detectada no Ponto 1 (após a sangria) e no Ponto 4 (após a lavagem pré-resfriamento). Foram obtidos 12 isolados, os quais foram avaliados quanto a sensibilidade a 15 antimicrobianos, dos quais 100% mostraram-se sensíveis a maioria dos antibióticos testados. Resistência à gentamicina (8%), ampicilina (8%), canamicina (8%) e a sulfonamida (83%) foram observadas em parte dos isolados. Suscetibilidade intermediária foi observada para clindamicina (60%) e eritromicina (8%). Quanto aos isolados multirresistentes, dois deles apresentaram resistência a mais de um agente antimicrobiano. Procedeu-se à avaliação da presença de genes de virulência (prfa, plca, plcb, hlya, iap, acta, mpl, inla, inlc e inlj) e, através dos resultados da PCR, foi possível observar que todos os isolados possuíam os genes avaliados, sendo também confirmada a expressão do gene da internalina A através da técnica de RT- PCR, evidenciando o potencial patogênico das cepas de L. monocytogenes isoladas de alimentos no sul do Brasil. Palavras-chave: L. monocytogenes; fatores de virulência; potencial patogênico, susceptibilidade a antibióticos

9 9 ABSTRACT Iglesias, Mariana Almeida. Molecular characterization and antimicrobial susceptibility of Listeria monocytogenes isolated from cattle carcasses in southern Brazil f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Centro de Desenvolvimento Tecnológico. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen that can cause listeriosis, both in humans and in animals. The contamination by this microorganism is difficult to control, given its wide dissemination and physiological adaptability, which allow its development under conditions which are usually unfavorable to other pathogenic bacteria. Therefore, this pathogen has become of concern to the food industry as well as consumers, since it is highly pathogenic, especially in relation to risk group and may be fatal in 30% of cases of listeriosis. Although any isolate of L. monocytogenes can be considered potentially pathogenic for humans, several studies suggest that this micro-organism has a heterogeneous pathogenicity of the strains, which makes it essential to know the gene expression of the pathogen can be understood that the differences in their virulence mechanisms, and how different potential pathogenicity. The present study aimed to verify the occurrence of. L. monocytogenes in slaughterhouses in southern Rio Grande do Sul, and through the isolates, assess their sensitivity to antibiotics, and perform a genotypic characterization by verifying the presence of virulence genes. L. monocytogenes occured in 6% of the samples, detected after bleeding at the point where the collect was held in the leather of the animal, and point 4 (pre-cooling after washing).twelve isolates were obtained, which were evaluated for sensibility to 15 antimicrobials, of which 100% were susceptible to most antibiotics tested. Resistance to gentamycin (8%), ampicilin (8%), kanamycin (8%) and sulfonamide (83%) were observed in some isolated of L. monocytogenes. Intermediate susceptibility to clindamycin (60%) and erythromycin (8%) was observed, and multidrug-resistant strains were also observed. Proceeded to evaluate the presence of virulence genes (hlya, plca, inla, inlb, inlc, inlj, plcb, iap, acta, mpl and PrfA) and, through the results of PCR, it was observed that all isolates possessed the evaluated genes, also confirmed the expression of the gene of internalin A by RT-PCR, showing the potential pathogenic strains of L. monocytogenes isolated from food in southern Brazil. Key-words: L. monocytogenes; virulence factors; pathogenicity potential; antimicrobial susceptibility

10 10 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Proteínas envolvidas no ciclo de infecção de L. monocytogenes: (a) poteínas responsáveis pela entrada da bactéria na célula eucariótica (genes envolvidos: inla e inlb); (b) mecanismo utilizado para a lise do primeiro vacúolo (genes envolvidos: hly e plca); (c) divisão bacteriana e inicio da formação da cauda de actina (gene acta); (d) movimento bacteriano promovido pela cauda de actina e difusão para célula adjacente; (e) proteínas envolvidas na lise do segundo vacuolo (genes hly e plcb) Figura 2 Organização dos principais genes de virulência de L. monocytogenes Figura 3 Esquema representativo da carcaça bovina (lado externo e lado interno), com indicação dos pontos (*) onde se realizou o esfregaço em superfície na carcaça inteira e meia-carcaça Figura 4 Produtos da amplificação do gene prfa (467pb). Colunas 1: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: L. monocytogenes ATCC 7644, Colunaa 3: S. Typhimurium ATCC 14028, Colunas 4 a 15: L.monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Coluna 16: controle negativo da reação Figura 5 Produtos da amplificação do gene plcb (261pb). Colunas 1 e 17: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: S. Typhimurium ATCC 14028, Colunas 3 a 14: L. monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Coluna 15: L. monocytogenes ATCC 7644, Coluna 16: controle negativo da reação... 39

11 11 Figura 6 Produtos da amplificação do gene plca (326pb). Colunas 1 e 17: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: L. monocytogenes ATCC 7644, Coluna 3: S. Typhimurium ATCC 14028, Colunas 4 a 15: L. monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Coluna 16: controle negativo da reação Figura 7 Produtos da amplificação do gene iap (131pb). Coluna 1: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: L. monocytogenes ATCC 7644, Coluna 3: S. Typhimurium ATCC 14028, Colunas 4 a 15: L. monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Coluna 16: controle negativo da reação Figura 8 Produtos da amplificação do gene hlya (456 pb). Coluna1: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: L. monocytogenes ATCC 7644, Coluna 3: S. Typhimurium ATCC 14028, Colunas 4 a 15: L. monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Coluna 16: controle negativo da reação Figura 9 Produtos da amplificação do gene acta (650 pb). Coluna 1: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: L. monocytogenes ATCC 7644, Coluna 3: S. Typhimurium ATCC 14028, Colunas 4 a 15: L. monocytogenes isoladas de carcaça bovina Figura 10 Produtos da amplificação do gene mpl (502pb). Coluna 1: marcador de peso molecular 100pb; Colunas 2 a 13: L.monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Canaleta 14: L. monocytogenes ATCC 7644, Coluna 15: S. Typhimurium ATCC

12 12 Figura 11 Produtos da amplificação dos genes inla (800 pb), inlc (517pb) e inlj (238 pb). Coluna 1: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: S. Typhimurium ATCC 14028, Coluna 3: L. monocytogenes ATCC 7644, Colunas 4 a 15: L.monocytogenes isoladas de carcaça bovina Figura 12 Produtos da amplificação dos genes inlb (884 pb). Coluna 1: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2 a 13: L.monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Coluna 14: S. Typhimurium ATCC 14028, Coluna 15: L. monocytogenes ATCC Figura 13 Eletroforese em gel de agarose demostrando a expressão do gene da internalina A (800pb) por RT-PCR de isolados de L. monocytogenes provenientes de carcaça bovina e de isolados clínicos de L. monocytogenes. Coluna 1: marcador de peso molecular 100pb. Coluna 2 a 12: L.monocytogenes isoladas de carcaça bovina. Coluna 13, 14 e 15: isolados clínicos de L. monocytogenes. Ccoluna 16: controle negativo da reação e Coluna 17: L. monocytogenes ATCC

13 13 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Caracterização fenotípica de seis espécies do gênero Listeria Tabela 2 Linhagens de L. monocytogenes Tabela 3 Sequência dos primers iniciadores utilizados para pesquisa de genes de virulência nos isolados de L. monocytogenes Tabela 4 Sequência do primer utilizados para quantificação da expressão dos genes de interesse relacionados com fatores de virulência Tabela 5 Identificação dos isolados de L. monocytogenes provenientes de carcaças bovinas em frigoríficos-matadouros da região sul do Brasil Tabela 6 Perfil de suscetibilidade à antimicrobianos de isolados de L. monocytogenes de origem clínica e carcaças bovinas provenientes do Sul do Brasil... 38

14 14 SUMÁRIO 1 Introdução Revisão de literatura Listeria monocytogenes Fontes de Contaminação Patogenicidade e genes de virulência Internalinas Fosfolipases PrfA Listeriolisina ActA Metaloprotease., Proteína p Sensibilidade a antimicrobianos Metodologia Isolamento Sorotipificação Suscetibilidade a antimicrobianos Extração de DNA bacteriano PCR Condições da PCR Extração de RNA genômico e síntese de cdna Condições da RT-PCR (Transcriptase Reverse PCR) Resultados Ocorrência de L. monocytogenes Sorotipificação Suscetibilidade a antimicrobianos Presença dos genes de virulência Expressão do gene da Internalina A (inla)... 38

15 15 5 Discussão Ocorrência de L. monocytogenes Suscetibilidade a antimicrobianos Presença dos genes de virulência Presença dos genes das Internalinas (InlA, InlB,InlC e InlJ) Presença dos genes prfa, plca, hlya, mpl, iap, acta e plc Expressão da Internalina A Conclusões Referências... 47

16 16 1 INTRODUÇÃO Listeria monocytogenes é uma bactéria Gram positiva, intracelular facultativa, responsável pela listeriose, uma doença de origem alimentar relativamente incomum, que pode evoluir para casos graves, como meningite, meningoencefalite ou septicemia, muitas vezes levando a morte em idosos, recém-nascidos ou pacientes imunocomprometidos (MCLAUCHLIN et al., 2004; LUBER et al., 2011). A contaminação por este micro-organismo é de difícil controle, tendo em vista sua ampla disseminação e capacidade fisiológica de adaptação, as quais permitem seu desenvolvimento sob condições que geralmente são desfavoráveis a outras bactérias patogênicas (UHITIL et al., 2004; TASARA et al., 2006). Assim sendo, esse patógeno tornou-se motivo de preocupação para a saúde pública, uma vez que é altamente virulento, principalmente em relação ao grupo de risco, podendo ser fatal em até 30% dos casos de listeriose (CDC, 2005) Sabe-se que a patogênese de L. monocytogenes é facilitada pela ação de um conjunto de genes de virulência, que inclui prfa, plca, hly, mpl, acta e plcb, todos localizados na Ilha de Patogenicidade 1 de Listeria (LIPI-1) (VAZQUEZ-BOLAND et al., 2001), além de outros fatores localizados fora da LIPI-1 como as internalinas, LAP e vip (MILOHANIC et al., 2003; DE LAS et al., 2011). Embora qualquer isolado de L. monocytogenes possa ser considerado potencialmente patogênico para humanos, vários estudos sugerem que este microorganismo apresenta patogenicidade heterogênea entre as cepas, o que torna essencial o conhecimento da expressão dos genes associados a virulência deste patógeno, para que possam ser entendidas as diferenças nos seus mecanismos de patogenicidade, bem como os diferentes potenciais patogênicos (JALLEWAR et al., 2007; KAUR et al., 2007; RAWOOL et al., 2007; NEVES et al., 2008; ;MAKLON et al., 2010; INDRAWATTANA et al., 2011; GELBICO e KA PI KO, 2012).

17 17 No entanto, pouco ainda se sabe com relação a patogenicidade de cepas de L. monocytogenes isoladas de alimentos no Brasil. Desta maneira, objetivou-se verificar a ocorrência de L. monocytogenes em dois frigoríficos-matadouros do sul do Rio Grande do Sul e, a partir dos isolados, avaliar sua sensibilidade a antimicrobianos e realizar a caracterização molecular, através da verificação da presença e expressão de genes de virulência.

18 18 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Listeria monocytogenes O gênero Listeria é, atualmente, composto por dez espécies: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. innocua, L. welshimeri, L. grayi, L. marthii, L. rocourtiae, L. fleischmannii, e L. weihenstephanensis (ZHANG et al., 2007; HALTER, NEUHAUS & SCHERER, 2013). Dentre estas espécies, somente duas, são potencialmente patogênicas: L. monocytogenes para humanos e animais e L. ivanovii para animais (SCHMID et al., 2005). Bactérias do gênero Listeria apresentem-se na forma de bastonetes curtos, possuindo aproximadamente 0,4-0,5μm de diâmetro e 1-2μm de comprimento. São bactérias Gram-positivas, não formadoras de esporos e com ausência de cápsula celular (VAZQUEZ-BOLAND et al., 2001). Contudo, esse gênero é extremamente resistente a fatores adversos (CHEN; GUAN; HOOVER, 2006; SIMPSON et al., 2010), tolerando altas concentrações de sal (10%) e amplas variações de ph (4,1 a 9,6), o que torna esse gênero bacteriano extremamente resistente no ambiente e de difícil controle (HAIN et al., 2007). L. monocytogenes é capaz de se multiplicar em uma ampla faixa de temperatura, entre 4 ºC e 50 ºC, possuindo temperatura ótima de desenvolvimento entre 30 a 37º C (WING; GREGORY, 2002). São bactérias anaeróbias facultativas, móveis por flagelos peritríquios, intracelular facultativa, capaz de invadir e replicar-se em fagócitos, células epiteliais intestinais e hepatócitos (DUSSURGET; PIZARRO-CERDA; COSSART, 2004). Quanto à identificação bioquímica de L. monocytogenes, é classificada como oxidase negativa, catalase positiva e fermentadora de glicose (SCHMID et al., 2009). Para sua diferenciação das demais espécies de Listeria, testes fenotípicos são realizados, como o teste de motilidade in vitro, fermentação de açucares (dextrose, ramnose, manitol e xilose), produção de beta-hemólise em ágar sangue e CAMP-

19 19 test (FARBER; PETERKIN, 1991). Estas e outras características estão melhores descritas na tabela 1. Tabela 1- Caracterização fenotípica de seis espécies do gênero Listeria Teste fenotípico L. monocytogenes L. innocua L. seeligeri L. ivanovii L. welshimeri L. grayi Motilidade rotatória (20-25ºC) Motilidade guardachuva Camp-test S.aureus R. equi Catalase Oxidase Urease Crescimento em A/A A/A A/A A/A A/A A/A TSI a H 2 S (TSI) Teste vermelho de metila Teste Voges- Proskauer Teste de Nitrato β-hemólise Fermentação Manitol Xilose Ramnose Dextrose V + a Reações em TSI (ágar tríplice açúcar ferro) rampa/fundo: A= ácido e K= alcalino; V: variável. Fonte: Adaptado de HOLT et al., 1994; GASANOV; HUGHES E HANSBRO, V V +

20 20 L. monocytogenes pode causar a doença chamada listeriose, onde os principais grupos de risco são indivíduos imunocomprometidos, como pacientes com câncer, AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida), transplantados, gestantes, crianças e idosos. Listeriose é considerada uma doença de origem alimentar desde 1980, quando surtos desta enfermidade foram comprovadamente associados ao consumo de alimentos contaminados (SCHLECH et al., 1983; MCLAUCHLIN et al., 2004; LUBER et al., 2011). Sua importância em saúde pública está relacionada à severidade dessa infecção (ARRUDA et al., 2007), cuja taxa de letalidade pode atingir 30% (CDC, 2005). Ainda que a transmissão de listeriose por alimentos seja, em sua maioria, subdiagnosticada, essa é considerada a principal via de transmissão da doença ao homem (MANTILLA, 2006). Embora a listeriose possa ser causada por todos os 13 sorotipos de L. monocytogenes, os sorotipos 1/2a, 1/2b e 4b têm sido os mais frequentemente isolados de alimentos (VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001). Apesar disto, a maioria dos casos de listeriose em humanos está associada ao sorotipo 4b sendo responsável por mais de 50% dos casos de epidemia em humanos (TORRES et al., 2005). Este patógeno é agrupado em quatro linhagens com base em sua ribotipagem e associação com surtos (Tabela 2). A linhagem I tem o maior potencial patogênico e os sorotipos pertencentes a este grupo estão mais envolvidos em surtos. A linhagem II tem potencial patogênico intermediário e, é possivelmente, responsável por surtos esporádicos, enquanto as linhagens III e IV apresentam baixa patogenicidade e raramente causam infecção em humanos (BHUNIA, 2008; ORSI; BAKKER E WIEDMANN 2011).

21 21 Tabela 2 - Linhagens de L. monocytogenes Linhagem Sorotipos Características Distribuição I 1/2b, 3b, 3c, 4b Menor diversidade e níveis de recombinação entre as linhagens Encontrado em várias fontes, sobretudo isolados de humanos. II 1/2a, 1/2c, 3a Maior diversidade e baixo nível de recombinação entre linhagens Encontrado em várias fontes, sobretudo isolados de alimentos e ambiente. III 4a, 4b atípico e 4c Níveis de recombinação entre as linhagens I e II A maioria dos isolados obtidos a partir de Ruminantes. IV 4a, 4b atípico e 4c Poucos isolados identificados até o momento A maioria dos isolados obtidos a partir de Ruminantes. FONTE: Adaptado de ORSI; BAKKER E WIEDMANN, A dose mínima necessária para a bactéria causar infecção clínica em seres humanos ainda não foi determinada, no entanto, o número de L. monocytogenes detectada em alimentos responsáveis por surtos e casos esporádicos de listeriose (em torno de 10 6 UFC ml -1 ), sugere que seja elevada (TORRES et al., 2005). Além disso, a dose infectante necessária para causar a doença pode variar dependendo de diversos fatores, dos quais os mais importantes são as diferenças entre a virulência das cepas bacterianas e suscetibilidade do hospedeiro (VÁZQUEZ- BOLAND et al., 2001). Surtos de listeriose devido ao consumo de alimentos contaminados têm sido descritos desde Recentemente, o Center for Disease Control and Prevention, dos Estados Unidos da América, reportou que o número de mortes associadas a surtos de listeriose triplicou desde Dezembro de 2011, totalizando 33 mortes (CDC, 2013a). No ano de 2012, um surto envolvendo 22 pessoas infectadas por L. monocytogenes foi relatado por 13 estados Americanos e pelo Distrito de Columbia, neste caso quatro mortes foram relatadas, incluindo uma morte fetal (CDC, 2013b).

22 Fontes de Contaminação L. monocytogenes é um micro-organismo ubíquo na natureza, que pode sobreviver e desenvolver-se em diversas condições ambientais e ser encontrado em várias fontes, incluindo solo, água, vegetação, silagem, e o trato intestinal de animais domésticos, principalmente ruminantes (ovinos, bovinos, caprinos) (VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001; MONTVILLE; MATTHEWS, 2005; NIGHTINGALE WINDHAM; WIEDMANN, 2005; TAKARASHI et al, 2007;). Os alimentos são as principais e primeiras fontes de infecção por L. monocytogenes para humanos. Este patógeno pode contaminar uma grande variedade de alimentos crus ou processados, incluindo produtos cárneos, lácteos e seus derivados, peixes e frutos do mar, além de alimentos minimamente processados como legumes e frutas (MCLAUCHLIN et al., 2004; RAMASWAMY et al., 2007). A contaminação por L. monocytogenes é de difícil controle, tendo em vista sua ampla disseminação e capacidade fisiológica de adaptação, as quais permitem seu desenvolvimento sob condições que usualmente são desfavoráveis a outras bactérias patogênicas (UHITIL et al., 2004; TASARA et al., 2006). A presença deste L. monocytogenes no trato intestinal de animais possibilita a contaminação dos criatórios e abatedouros, podendo atuar como uma fonte de introdução deste patógeno na linha de abate o que reforça a possibilidade de contaminação de alimentos de origem animal (NALÉRIO et. al, 2009; ZHU et al., 2012). A rápida capacidade de adesão em superfícies faz com que L. monocytogenes seja um risco para indústrias de alimentos, uma vez presente na matéria-prima este patógeno pode ser transferido à superfície de equipamentos e utensílios, sendo capaz de se multiplicar, formar biofilmes e, assim, favorecer a contaminação do produto final (OLIVEIRA et al., 2010). A contaminação da carne bovina por L. monocytogenes se dá pela facilidade durante o seu processamento (ZHU et al., 2012). Estudos realizados em diferentes países evidenciam a presença deste patógeno no couro do animal, nas carcaças antes e após a evisceração, bem como após a lavagem antes do pré-resfriamento (PECCIO et al., 2003; GUERINI et al., 2007; WIECZORECK et al., 2012), além de observarem a presença do patógeno em uma variedade de produtos cárneos (ROCHA et al., 2012; WHANG et al., 2013).

23 23 No Brasil, pesquisas indicam que há ocorrência de L. monocytogenes em plantas de processamento e em cortes de carne bovina (BARROS, et al., 2007; MANTILLA et al., 2007). Demonstrando que há disseminação deste patógeno no ambiente de processamento de alimentos, podendo chegar até o produto final através da contaminação cruzada (CAMARGO, 2013). 2.3 Patogenicidade e genes de virulência Para sobreviver a situações adversas, os micro-organismos devem responder de forma rápida e eficiente às mudanças ambientais. Em bactérias, essas respostas são frequentemente realizadas em nível transcricional (KIMURA, 2006). E a virulência e adaptação diferencial são controladas tanto pela expressão gênica como pela presença de genes específicos em determinadas cepas (CALL et al.,2003). No processo infeccioso de L. monocytogenes, a sobrevivência e multiplicação intracelular envolvem a expressão de genes associados à patogenicidade, resposta ao estresse, divisão celular, modificações na estrutura da membrana, incluindo ainda genes com funções desconhecidas, no intuito de garantir a sobrevivência do patógeno (DANCZ et al., 2002; CHATTERJEE et al., 2006). Uma grande variedade de proteínas de superfície e proteínas secretadas por esse patógeno tem sido reconhecida como importantes fatores na sua virulência (BIERNE; COSSART, 2007). Essas proteínas representam um ponto crítico na persistência deste patógeno no trato intestinal, na aderência e entrada na célula do hospedeiro, na movimentação de célula para célula, e no escape do sistema imune do hospedeiro (SCHUPPLER; LOESSNER, 2010). L. monocytogenes possui um conjunto de genes, chamado região central de virulência, que codificam seis proteínas. Essa região é denominada como LIPI-1(Ilha de Patogenicidade de Listeria 1) que inclui os genes prfa, plca, hlya, mpl, acta e plcb. Esses genes, juntamente com os genes das internalinas A e B (inla e inlb), são diretamente regulados e controlados pelo gene prfa, que codifica a proteína PrfA (fator positivo de regulação) (MILOHANIC et al., 2003; DE LAS et al., 2011). Uma das características importantes relacionadas à sua patogenicidade é que L. monocytogenes tem a capacidade de atravessar inúmeras barreiras do

24 24 hospedeiro. A sua capacidade de invadir células não fagocíticas, como células epiteliais, e replicar-se no seu interior (LECUIT, 2005; COSSART, 2008) através da interação com receptores de superfície celular (PIZARRO-CERDA E COSSART, 2006; SILVA et al., 2012) e da expressão de determinados genes de virulência é um fator essencial para que a doença se estabeleça. Após L. monocytogenes ser ingerida e passar pelo estômago, o aumento da temperatura e a exposição ao baixo ph estimulam a expressão de proteínas relacionadas ao estresse, iniciando o estágio de virulência desse micro-organismo (RAENGPRADUB; WIEDMANN; BOOR, 2008). Estas proteínas promovem a internalização da bactéria em células não fagocíticas, e este processo tem início com a adesão do micro-organismo a superfície celular. Posteriormente, ocorre a interação entre os ligantes da superfície bacteriana com os respectivos receptores celulares, mecanismo conhecido como zíper (zipper mechanism) (COSSART; TOLEDO- ARADIA, 2008). As bactérias são então rapidamente incorporadas em um vacúolo ligado a membrana, chamado de fagossoma. As baixas concentrações de ferro e carboidratos reprimem a expressão das internalinas e fazem com que as proteínas listeriolisina O (LLO) e fosfatidilinositol fosfolipase C (PI-PLC) sejam expressas pela ativação dos genes hlya e plca, respectivamente, os quais induzem a lise do vacúolo liberando a bactéria no citoplasma celular (GRAY; FREITAG; BOOR, 2006). No citoplasma, as bactérias se multiplicam e associam-se com os filamentos de actina, os quais são expressos pela ativação do gene acta (GAILLARD, 1987). Esses filamentos são, então, reorganizados em um polo da bactéria em caudas que medeiam o movimento da bactéria no citosol (COSSART, 2006). Na passagem de L. monocytogenes de uma célula para outra, ocorre a formação de um novo vacúolo, neste momento são expressas, pela ativação do gene plcb e clivagem por uma metaloprotease (mpl), as fosfatodilcolinas (PC-PLC), com isto o escape da dupla membrana é realizado pela proteína LLO com o auxílio de PC-PLC, iniciando-se assim, a multiplicação intracelular na nova célula (CABANES et al., 2002). Esses passos podem ser visualizados na Figura1.

25 25 Figura 1. Proteínas envolvidas no ciclo de infecção de L. monocytogenes: (a) proteínas responsáveis pela entrada da bactéria na célula eucariótica (genes envolvidos: inla e inlb); (b) mecanismo utilizado para a lise do primeiro vacúolo (genes envolvidos: hly e plca); (c) divisão bacteriana e inicio da formação da cauda de actina (gene acta); (d) movimento bacteriano promovido pela cauda de actina e difusão para célula adjacente; (e) proteínas envolvidas na lise do segundo vacúolo (genes hly e plcb). Fonte: ERMOLAEVA, Internalinas As internalinas são proteínas de superfície que possuem como principal função mediar a aderência e internalização da bactéria na célula hospedeira, principalmente em células não fagocíticas (VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001). Tratam-se de proteínas que apresentam repetidos resíduos ricos em leucina (Leucine-Rich-Repeats - LRR) (COSSART et al., 2003), pertencentes a uma família multigênica, a qual consiste nos genes inla, inlb, inlc, inlc2, inld, inle, inlf, inlg, inlh, inli e inlj (TSAI et al., 2006; BIERNE et al., 2007; BUBLITZ et al., 2008; TSAI et al., 2011). A internalina A (InlA) é uma proteína de 88 kda, composta por 800 aminoácidos, que interage com a E-caderina, uma glicoproteína que atravessa transversalmente a membrana plasmática das células epiteliais (TAKEICHI e CADHERINS, 1990; YAP, NIESSEN e GUMBINER, 1998). Tem papel indispensável na patogênese de L. monocytogenes, sendo responsável pela indução da fagocitose passiva pela célula hospedeira, o que caracteriza a fase de internalização do ciclo da infecção (LIU et al., 2007).

26 26 Análises de diferentes cepas de L. monocytogenes de várias origens têm demonstrado que InlA é geneticamente conservada (POYART; TRIEU-CUOT E BERCHE, 1995). Porém, essa proteína nem sempre é expressa na superfície celular da bactéria e esta mutação resulta na proteína truncada (BRAUN E COSSART, 2000). Ao invés de ficar ancorada à superfície celular, esta proteína truncada é secretada, ao invés de ficar ancorada à superfície celular o que consequentemente, reduz a capacidade de invasão celular (NIGHTINGALE et al., 2005). Além da InlA, outras proteínas da família possuem importante papel na patogênese de L. monocytogenes, porém não apresentam atividade de invasinas (BIERNE et al., 2007; LIU et al., 2007). A inlb é uma proteína de 65 kda, composta por 630 aminoácidos e que ao contrario da inla, se liga fracamente a superfície da bactéria. A inlb é responsável pela internalização de L. mnocytogenes em células não epiteliais, como os hepatócitos (CAMPOS et al., 2004). A interação com os receptores das células hospedeiras, como por exemplo, com o fator de crescimento dos hepatócitos (Met), induz o processo de rearranjo dos filamentos de actina, resultando na motilidade da bactéria (BIERNE e COSSART, 2002). Além das internalinas A e B, outras internalinas tem papel importante nos estágios pós-intestinais da infecção (BIERNE, et al.,2007). Dentre as demais internalinas, destacam-se a inlc e a inlj. A InlC é uma proteína pequena, de 30 kda, composta por 297 aminoácidos, codificada pelo gene inlc. Esta proteína esta envolvida na movimentação intracelular (BIERNE et al., 2007), promovendo a difusão do patógeno a partir da regulação das protusões da memebrana celular (RAJABIAN et al., 2009). Ela também é consierada um dos alvos da resposta imune humoral humana contra L. monocytogenes (GRENNINGLOH et al., 1997), porém não interfere na fase de invasão e replicação da bactéria no interior da célula (RAJABIAN et. al., 2009). A InlJ é uma proteína de 851 aminoácidos detectada exclusivamente nas cepas virulentas de L. monocytogenes (LIU et al., 2003). Difere das demais proteínas da família por possuir resíduos de cisteína nas regiões ricas em leucina- (Leucine-Rich-Repeats - LRR) (BIERNE et al., 2007). É codificada pelo gene inlj, conservado no genoma de L. monocytogenes e ausente no restante das espécies do gênero (DOUMITH et al., 2004). Embora sua função seja desconhecida, por ser um

27 27 determinante de virulência, é bastante utilizada para caracterização molecular de diversos isolados (LIU et al., 2003; 2007) Fosfolipases L. monocytogenes produz dois tipos de enzimas com atividade de fosfolipase, a fosfolipase A (plca) e a fosfolipase B (plcb). Ambas atuam como fatores de virulência, juntamente com a listeriolisina O (LLO), com a função de lisar a membrana do fagossoma primário e secundário durante o ciclo da listeriose (VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001). A plca, denominada como fosfatidilinositol fosfolipase C (PI-PLC), é uma proteína de 33 kda, composta por 317 aminoácidos, e secretada na forma ativa por L. monocytogenes, apresentando atividade proteolítica nas membranas que contém fosfatidilinositol (GOLDFINE e KNOB, 1992; VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001; LIU et al., 2007). A plcb, denominada como fosfatidilcolina fosfolipase C (PC-PLC), é uma proteína de 29 kda, composta por 289 aminoácidos, porém não possui especificidade como a plca, sendo proteolítica em diversos componentes de membrana (GOLDFINE e KNOB, 1992). É considerada um fator de virulência, uma vez que participa da lise do fagossoma primário e secundário, juntamente com LLO e plca. No entanto, ao contrário de plca, é secretada na forma de pró-enzima inativa para evitar danos à própria célula bacteriana, uma vez que pode vir a degradar os fosfolipídios da bactéria, necessitando de ativação pela enzima metaloprotease (mpl) (VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001) PrfA PfrA é uma proteína de 27 kda, composta por 237 aminoácidos, codificada pelo gene prfa, o qual encontra-se na LIPI-1. É um regulador positivo, envolvido no controle da expressão gênica em L. monocytogenes. Alguns dos genes regulados por pfra também situam-se na LIPI-1, como, vários genes da família das internalinas. Além disso, o operon inlab é parcialmente regulado por prfa, assim como esse regulador controla a própria expressão por um sistema de retroalimentação negativa

28 28 (Figura 2). A expressão de prfa é ativada apenas durante a infecção na célula hospedeira, evitando assim expressão desnecessária do gene (VÁZQUEZ- BOLLAND et al., 2001; LIU et al., 2006; HERAS et al., 2011). Variações ambientais promovem a ativação de prfa, anteriormente inativo ou com baixa atividade, ocasionando a transcrição dos genes de virulência. Dessa forma, esta ativação transforma L. monocytogenes de um micro-organismo saprófita em um patógeno intracelular (CRUZ; MARTINEZ e DESTRO, 2008, FREITAG et al., 2009). inlc inlj Figura 2. Organização dos principais genes de virulência de L. monocytogenes Fonte: PAGOTTO, CORNEAU E FARBER, Listeriolisina A listeriolisina O (LLO) pertence à família das proteínas formadoras de poros colesterol dependentes, com aproximadamente 58 kda, sendo composta por 527 aminoácidos, codificada pelo gene hly. É ativada em baixos valores de ph e determina a capacidade hemolítica da bactéria (LIU et al., 2007). É considerada como principal determinante de patogenicidade de L. monocytogenes, possuindo como função a lise do fagossoma primário e secundário juntamente com as fosfolipases A e B, ocasionando a liberação e multiplicação do patógeno na célula hospedeira (VÁZQUEZ-BOLLAND et al., 2001).

29 Act A ActA é uma proteína de superfície, codificada pelo gene acta, responsável pela mobilidade e disseminação de L. monocytogenes célula -a célula, através da polimerização da actina do citoesqueleto da célula do hospedeiro. Essa polimerizaçãp resulta em caudas que propulsionam a bactéria para a membrana citoplasmática, proporcionando sua disseminação para célula vizinha (HAIN et al., 2006) Metaloprotease A metaloprotease (Mpl) é uma proteína de 55 kda, composta de um própeptideo de 20 kda e um domínio catalítico de 35 kda. Assim como a PC-PLC, é uma proteína associada a membrana e segregada, de aproximadamente 510 aminoácidos. É codificada pelo gene mpl, possui um papel indireto na virulência, estando envolvida na ativação de PC-PLC para o início de um novo ciclo de infecção (VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2000; LIU et al., 2006; BAKKER et al., 2010) Proteína p60 A p60 é uma proteína extracelular de L. monocytogenes de 60 kda, associada à adesão e invasão, codificada pelo gene iap (invasion - associated protein), comum a todos os membros do gênero Listeria. O papel principal da proteína p60 é a separação do septo, através da hidrolise da mureína, na última etapa da divisão celular, ou seja, é uma proteína essencial para a viabilidade da célula. Além disso, apresenta um papel na aderência às células do hospedeiro (BUBERT et al., 1999; RODRIGUEZ- LAZARO, et al., 2004). 2.4 Sensibilidade a antimicrobianos Populações bacterianas sensíveis à ação dos antimicrobianos podem se tornar resistentes através de dois processos: mutação espontânea e seleção. Bactérias que transportam mutação no material genético, o qual confere resistência,

30 30 sobrevivem ao uso de antimicrobianos, e as sensíveis são eliminadas. Assim, as células resistentes transferem essa característica às células-filhas, caracterizando a evolução ou transmissão vertical. Além disso, pode ocorrer a aquisição de genes transportados por bactérias que são resistentes, caracterizando também uma evolução ou transferência horizontal (TENOVER, 2006). A terapia de escolha para o tratamento da listeriose consiste na administração de ampicilina ou penicilina, combinados com um aminoglicosideo, classicamente a gentamicina. A associação de trimetoprim com uma sulfonamida, como o sulfametoxazole com co-trimoxazole, é considerada como a segunda escolha de terapia, geralmente administrada no caso de doentes alérgicos aos antibióticos da classe β-lactâmicos (CHARPENTIER E COURVALIN, 1999; CONTER et al., 2009). Apesar da suscetibilidade de L. monocytogenes a vários antimicrobianos, alguns isolados provenientes de alimentos envolvidos em surtos alimentares têm apresentado perfil de multirresistência (MARIAN et al., 2012; SAFDAR; ARMSTRONG, 2003; LI et al., 2006; CONTER et al., 2007; REIS et al., 2011; ALTUNTAS et al., 2012), o que se deve, principalmente, ao uso indiscriminado e/ou errôneo dos agentes antimicrobianos. Além do aumento na resistência bacteriana, o mau uso dos antimicrobianos é um problema de saúde pública, tendo em vista que pode dificultar o tratamento de pacientes que necessitem de antibioticoterapia, bem como, conduzir à seleção de isolados resistentes que chegam à população através dos alimentos de origem animal (MOTA et al., 2005). Por este motivo, é necessário o monitoramento de cepas de L. monocytogenes quanto ao perfil de resistência e suscetibilidade a antimicrobianos para que, se necessário, sejam implementadas medidas pró-ativas para o controle do uso dos agentes antimicrobianos e prevenção da disseminação de cepas multirresistentes que podem levar a consequências indesejáveis.

31 31 3 METODOLOGIA Para o desenvolvimento deste estudo, foram analisados doze isolados de L. monocytogenes, provenientes de quatro pontos da linha de abate de bovinos (sangria, esfola, evisceração e lavagem antes do pré-resfriamento) de frigoríficosmatadouros do sul do Brasil, entre os anos de 2010 a Como controle negativo dos ensaios foram utilizadas as cepas padrão Staphylococcus aureus ATCC e Salmonella Tiphymurium ATCC Para melhor se avaliar o potencial de patogenicidade dos isolados provenientes de carcaças bovinas, foram utilizados, concomitantemente, três isolados clínicos de L. monocytogenes comprovadamente patogênicos, pertencentes à bacterioteca do Laboratório de Microbiologia do DCTA- FAEM da UFPel. 3.1 Isolamento Foram amostradas 200 carcaças bovinas em quatro pontos da linha de abate (1 o Ponto após sangria; 2 o Ponto após a esfola; 3 o Ponto após a evisceração e; 4 o Ponto após a lavagem pré-resfriamento), em frigoríficos-matadouros da região sul do Brasil, totalizando 800 amostras. A amostragem das carcaças foi realizada de acordo com as recomendações vigentes na Comunidade Européia - Commission Regulation CE (2007), utilizandose a técnica de esfregaço em superfície (couro 1º Ponto de Coleta, e carcaças 2º, 3º e 4º Pontos de Coleta). Cada carcaça foi amostrada com um conjunto de quatro Esponjas 3M TM, previamente umedecidas com APS (Água Peptonada 0,1 % (Oxoid ) Salina 0,85 % (Synth ), aplicadas em uma área de 100cm 2, totalizando 400cm 2, segundo Andrews e Hammack (1998). O esfregaço foi realizado na região

32 32 do peito do animal, nas respectivas carcaças (1º e 2º Pontos de Coleta) e meiascarcaças (3º e 4º Pontos de Coleta), conforme representado na Figura 3. Figura 3. Esquema representativo da carcaça bovina (lado externo e lado interno), com indicação dos pontos (*) onde se realizou o esfregaço em superfície na carcaça inteira e meia-carcaça. Fonte: SILVA, Após, a cada conjunto de esponjas foram adicionados 200mL de APS (Água Peptonada 0,1 % (Oxoid ) Salina 0,85 % (Synth ), e uma alíquota de 40mL de cada amostra das superfícies das carcaças foi transferida para tubos tipo Falcon, os quais foram centrifugados a 1000 x g por 15min a 5 ºC. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e os pellets foram ressuspendidos em 10mL de Caldo Half Fraser (Oxoid ), que foi homogeneizado em vórtex, e incubado a 30 ºC por 24h. Após a incubação, uma alíquota do caldo Half Fraser foi inoculadas em caldo Fraser (Oxoid ) e incubou-se a 37 ºC por 48 horas. Após este período, realizou-se a semeadura nos ágares Oxford (Oxoid ) e Cromogênio (Oxoid ), sendo incubados a 37 ºC por 48 horas. Após este período as colônias características de Listeria spp. foram selecionadas e semeadas em ágar Soja Triptona (Merck ) enriquecido com 0,6% de extrato de levedura (Merck ) (TSA-YE) e incubadas a 37 ºC por 24 horas. Após a incubação, realizou-se a identificação fenotípica das colônias isoladas, através da avaliação da capacidade de produção de catalase, verificação da

33 33 motilidade, fermentação de carboidratos (dextrose, xilose, ramnose e manitol) e produção de β-hemólise. 3.2 Sorotipificação Todos os isolados de L. monocytogenes previamente caracterizados fenotipicamente foram enviados ao Laboratório de Zoonoses Bacterianas do Departamento de Bacteriologia do Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) para realização da sorotipificação. 3.3 Suscetibilidade a antimicrobianos A análise de suscetibilidade aos antimicrobianos foi realizada pelo método de difusão em ágar, de acordo com as normas do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2005). Os isolados foram testados quanto a suscetibilidade a 15 antimicrobianos: ampicilina 10µg (Laborclin ), vancomicina 30µg (Laborclin ), canamicina 30µg (Laborclin ), gentamicina 10µg (Laborclin ), estreptomicina 10µg (Laborclin ), tobramicina 10µg (Laborclin ), eritromicina 15µg (Laborclin ), tetraciclina 30µg (Laborclin ), minociclina 30µg (Laborclin ), ciprofloxacina 5µg (Laborclin ), cloranfenicol 30µg (Laborclin ), clindamicina 2µg (Laborclin ), rifampicina 5µg (Laborclin ), trimetoprima 5µg (Laborclin ) e sulfonamida 300µg (Laborclin ). Utilizou-se como controle nos testes, a cepa padrão S. aureus ATCC Extração de DNA bacteriano As extrações de DNA dos isolados de L. monocytogenes, bem como das cepas padrão L. monocytogenes ATCC 7644 e Salmonella Tiphymurium ATCC foi realizada de acordo com o protocolo de Extração por Pérolas de Vidro proposto por Sambrook e Russell (2001), com modificações. Primeiramente, realizou-se o cultivo dos isolados de L. monocytogenes e das cepas padrão em TSA com 0,6% de extrato de levedura e incubou-se a 37ºC. Após

34 34 24h, os cultivos foram transferidos para 5mL de caldo Triptona de Soja (TSB) com 0,6% de extrato de levedura e incubou-se a 37ºC, overnight. Após este período, transferiu-se 1mL de cada cultivo para microtubos, os quais foram centrifugados a rpm por 3 minutos. Em seguida, o pellet foi suspendido com 100µL de STES, acrescido de pérolas de vidro, e de 150µL de fenol-clorofórmio e agitou-se em vortex por um minuto. O material intracelular foi separado por centrifugação a rpm por 15 minutos e transferiu-se o sobrenadante para um novo microtubo. A precipitação do DNA foi realizada com etanol absoluto a 4 ºC e cloreto de sódio 5M, com manutenção a -20ºC por uma hora. Após este período, foi realizada nova centrifugação, a rpm por 20 minutos. Para aumentar a pureza do material extraído lavou-se o pellet com álcool etílico 70%, descartou-se o sobrenadante, e colocou-se para secar em estufa a temperatura de 37 ºC até evaporação completa do álcool. Após, suspendeu-se o pellet em 35µL de água ultrapura estéril e 1µL de RNAse. Todas as amostras de DNA foram submetidas à quantificação em NanoVue TM Plus, seguida da amplificação pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). 3.5 PCR Oligonucleotídeos inicidores (primers) foram adquiridos visando a detecção dos genes de L. monocytogenes a seguir: hemolisina (hlya), regulatório (prfa), fosfolipases (plca -PI-PLC; plcb PC-PLC), polimerização da actina (acta), proteína p60 (iap), metaloprotease (mpl), internalina A (inla), internalina B (inlb) internalina C (inlc) e internalina J (inlj). Os mesmos foram sintetizados pela Eurofins, e os detalhes das sequências dos pares de bases estão descritos na Tabela 3.

35 35 Tabela 3- Sequência dos primers utilizados para pesquisa de genes de virulência nos isolados de L. monocytogenes Genes Sequência (5-3 ) Tamanho do fragmento amplificado (pb) Referência InlA-F InlA-R InlB-F InlB-R InlC-F InlC-R InlJ-F InlJ-R hly-f hly-r mpl-f mpl-r plca-f plca-r plcb-f plcb-r acta-f acta-r prfa-f prfa-r iap-f iap-r ACGAGTAACGGGACAAATGC CCCGACAGTGGTGCTAGATT TGGGAGAGTAACCCAACCAC GTTGACCTTCGATGGTTGCT TGGGAGAGTAACCCAACCAC GTTGACCTTCGATGGTTGCT TGTAACCCCGCTTACACAGTT AGCGGCTTGGCAGTCTAATA GCAGTTGCAAGCCTTGGAGTGTGAA- GCAACGTATCCTTCCAGAGTGATCG TTG TTC TGG AAT TGA GGA TG TTA AAA AGG AGC GGT GAA AT CTC GGA CCA TTG TAG TCATCTT CACTTTCAGGCGTATTAGAAACGA GGG AAA TTT GAC ACA GCG TT ATT TTC GGG TAG TCC GCT TT CCAAGCGAGGTAAATACGGGA GTCCGAAGCATTTACCTCTTC ACCAATGGGATCCACAAGA CAGCTGAGCTATGTGCGAT ACAAGCTGCACCTGTTGCAG TGACAGCGTGTGTAGTAGCA 800 Liu et al., Liu et al., Liu et al., Liu et al., Kaur et al., Conter et al., Lomonaco et al., Vazquez-Boland et al., Lomonaco et al., Bubert et al., Kaur et al., Condições da PCR A amplificação por PCR foi realizada em um volume de 25μL utilizando-se 12,5μL de Go taq Green Master Mix (Promega ), 25 pmol de cada primer e 10ng

36 36 (2 μl) de DNA molde. Uma mistura de reação sem DNA molde foi incluída como controle negativo. O programa para PCR foi realizado em termociclador (Bioer ) e consistiu para os genes das internalinas (inla, inlb inlc e inlj) de 1 x 94ºC por 2 minutos, 30 x 94ºC por 20 segundos, 55ºC por 20 segundos e 72ºC por 50 segundos, e 1 x 72ºC por 2 minutos. Para os genes prfa, plca, hlya, iap e acta o programa constitui-se de 95ºC por 2 minutos, 35x 95ºC por 15 segundos, 60ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto e 30 segundos, e 1 x 72ºC por 10 minutos. Para os genes mpl e plcb o programa constituiu-se de 1x 94ºC por 3 minutos, 35 x 94ºC por 1 minuto, 60ºC por 2 minutos e 72ºC por 1 minuto, e 1 x 72ºC por 5 minutos. Depois de completados todos os ciclos, os produtos gerados na PCR foram submetidos a eletroforese a 80V por uma hora em gel de agarose 1,5%. O produto amplificado foi corado com GelRed TM e visualizado em transiluminador (Loccus ). 3.6 Extração de RNA genômico e síntese de cdna de L. monocytogenes Para extração do RNA total, as células bacterianas foram inoculadas em ágar TSA-YE 0,6% e incubadas à 37 C. Após 24 horas, uma alíquota da cultura em TSA- YE 0,6% foi retirada, transferida para caldo TSB-YE 0,6% e incubada a 37ºC por 24 horas. Posteriormente, o RNA foi extraído e purificado pelo RiboPure -Bacteria Kit (Ambion ), de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. A qualidade dos RNAs foi verificada através da quantificação em NanoVue TM Plus. A síntese de cdna foi realizada pelo High Capacity cdna Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems ), de acordo com as instruções do fabricante. 3.7 Condições da RT-PCR (Transcriptase Reverse- PCR) A amplificação por RT-PCR foi realizada em um volume de 25μL utilizandose 12,5μL de Go taq Green Master Mix (Promega ), 25 pmol do primer para internalina A (Tabela 2) e 10ng (2 μl) de RNA. Uma mistura de reação sem RNA foi incluída como controle negativo. O programa para RT-PCR foi realizado em termociclador (Bioer ) e constituiu-se 1 x 94ºC por 2 minutos, 30 x 94ºC por 20 segundos, 55ºC por 20 segundos e 72ºC por 50 segundos, e 1 x 72ºC por 2 minutos.

37 37 Depois de completados todos os ciclos, os produtos gerados na RT-PCR foram submetidos a eletroforese a 80V por uma hora em gel de agarose 1,5%. A visualização do produto amplificado foi realizada por meio de coloração com GelRed TM e visualizado em transiluminador (Loccus ). Tabela 4 - Sequência do primer utilizado para quantificação da expressão do gene inla Primer Sequência (5-3 ) Referência inla F inla R ACGAGTAACGGGACAAATGC CCCGACAGTGGTGCTAGATT Liu et al., 2007

38 38 4 RESULTADOS 4.1 Ocorrência de L. monocytogenes Observou-se que das 200 carcaças avaliadas, 12 (6%) apresentaram contaminação por L. monocytogenes, sendo 11 (92%) pertencentes ao frigorífico A, isoladas do Ponto 1 (após a sangria) e Ponto 4 (após a lavagem pré-resfriamento) e uma (8%) proveniente do frigorífico B, isolada no Ponto 1, como pode ser visualizado na Tabela 5. Embora se tenha avaliado 4 pontos da linha de abate de bovinos (após sangria, após a esfola, após a evisceração e após a lavagem préresfriamento), nos demais pontos não foi detectada a presença deste patógeno. 4.2 Sorotipificação Os 12 isolados de L. monocytogenes provenientes de carcaças bovinas avaliados neste estudo distribuíram-se em dois sorotipos, 1/2a (80%) e 4b (20%). Tabela 5 - Identificação dos isolados de L. monocytogenes provenientes de carcaças bovinas em frigoríficos-matadouros da região sul do Brasil. Coleta Frigorífico* Amostra Carcaça Ponto Sorotipo 3ª A ** 1/2a 3ª A b 13ª A /2a 13ª A *** 1/2a 13ª A /2a 13ª A /2a 13ª A /2a 13ª A /2a 15ª B /2a 17ª A /2a 17ª A /2a 17ª A /2a **Ponto 4: após a lavagem antes do pré resfriamento; ***Ponto1: após a sangria

39 Suscetibilidade a antimicrobianos Os resultados da análise de suscetibilidade dos isolados de L. monocytogenes aos 15 agentes antimicrobianos testados podem ser visualizados na Tabela 6. Todos os isolados foram suscetíveis à vancomicina, ampicilina, estreptomicina, tobramicina, tetraciclina, minociclina, ciprofloxacina, cloranfenicol e rifampicina. Resistência à ampicilina (8%), gentamicina (8%), canamicina (8%) e a sulfonamida (83%) foram observadas em parte dos isolados. Suscetibilidade intermediaria foi observada para clindamicina (60%) e eritromicina (8%). Quanto aos isolados multiresistentes, dois deles apresentaram resistência a mais de um agente antimicrobiano. Tabela 6 - Perfil de suscetibilidade a antimicrobianos de isolados de L. monocytogenes de origem clínica e carcaças bovinas provenientes do sul do Brasil. Porcentagem de Isolados (%) Antibióticos* Sensíveis Resistência intermediária Resistentes AMP GEN EST TOB VAN CAN TET MIN ERI CLO CLI CIP TRI RIF SUL * AMP: ampicilina 10 µg, VAN: vancomicina 30 µg, CAN: canamicina 30 µg, GEN: gentamicina 10 µg, EST:estreptomicina 10 µg, TOB: tobramicina 10 µg, ERI: eritromicina 15 µg, TET: tetraciclina 30 µg, MIN: minociclina 30 µg, CIP: ciprofloxacina 5 µg, CLO: cloranfenicol 30 µg, CLI: clindamicina 2 µg, RIF: rifampicina 5 µg, TRI: trimetoprina 5 µg, SUL: sulfonamida 300 µg.

40 Presença dos genes de virulência Produtos da amplificação de tamanhos esperados para os genes associados à virulência (prfa, plca, plcb, hlya, iap, acta e mpl) de L. monocytogenes, foram amplificados em todos os isolados. Os genes associados à adesão e invasão celular (inla, inlb, inlc e inlj), também foram confirmados em todos os isolados. Os resultados podem ser visualizados nas Figuras 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e pb Figura 4 - Produtos da amplificação do gene prfa (467pb). Colunas 1: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: L. monocytogenes ATCC 7644, Colunaa 3: S. Typhimurium ATCC 14028, Colunas 4 a 15: L.monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Coluna 16: controle negativo da reação pb Figura 5 - Produtos da amplificação do gene plcb (261pb). Colunas 1 e 17: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: S. Typhimurium ATCC 14028, Colunas 3 a 14: L. monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Coluna 15: L. monocytogenes ATCC 7644, Coluna 16: controle negativo da reação.

41 pb Figura 6 - Produtos da amplificação do gene plca (326pb). Colunas 1 e 17: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: L. monocytogenes ATCC 7644, Coluna 3: S. Typhimurium ATCC 14028, Colunas 4 a 15: L. monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Coluna 16: controle negativo da reação pb Figura 7- Produtos da amplificação do gene iap (131pb). Coluna 1: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: L. monocytogenes ATCC 7644, Coluna 3: S. Typhimurium ATCC 14028, Colunas 4 a 15: L. monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Coluna 16: controle negativo da reação pb Figura 8- Produtos da amplificação do gene hlya (456 pb). Coluna1: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: L. monocytogenes ATCC 7644, Coluna 3: S. Typhimurium ATCC 14028, Colunas 4 a 15: L. monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Coluna 16: controle negativo da reação.

42 pb Figura 9 - Produtos da amplificação do gene acta (650 pb). Coluna 1: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: L. monocytogenes ATCC 7644, Coluna 3: S. Typhimurium ATCC 14028, Colunas 4 a 15: L. monocytogenes isoladas de carcaça bovina pb Figura 10 - Produtos da amplificação do gene mpl (502pb). Coluna 1: marcador de peso molecular 100pb; Colunas 2 a 13: L.monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Canaleta 14: L. monocytogenes ATCC 7644, Coluna 15: S. Typhimurium ATCC pb 517 pb 238 pb Figura 11 - Produtos da amplificação dos genes inla (800 pb), inlc (517pb) e inlj (238 pb). Coluna 1: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2: S. Typhimurium ATCC 14028, Coluna 3: L. monocytogenes ATCC 7644, Colunas 4 a 15: L.monocytogenes isoladas de carcaça bovina.

43 pb Figura 12 - Produtos da amplificação dos genes inlb (884 pb). Coluna 1: marcador de peso molecular 100pb; Coluna 2 a 13: L.monocytogenes isoladas de carcaça bovina, Coluna 14: S. Typhimurium ATCC 14028, Coluna 15: L. monocytogenes ATCC Expressão do gene da Internalina A (inla) Os resultados da RT-PCR demonstram que todos os isolados de L. monocytogenes provenientes de carcaça bovina expressam o gene da internalina A (inla), como pode ser visualizado na Figura pb Figura 13 - Eletroforese em gel de agarose demostrando a expressão do gene da internalina A (800pb) por RT-PCR de isolados de L. monocytogenes provenientes de carcaça bovina e de isolados clínicos de L. monocytogenes. Coluna 1: marcador de peso molecular 100pb. Coluna 2 a 12: L.monocytogenes isoladas de carcaça bovina. Coluna 13, 14 e 15: isolados clínicos de L. monocytogenes. Coluna 16: controle negativo da reação e Coluna 17: L. monocytogenes ATCC 7644.