Semina: Ciências Agrárias ISSN: X Universidade Estadual de Londrina Brasil

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1 Semin: Ciêncis Agráris ISSN: X Universidde Estdul de Londrin Brsil Mendes Milnesi, Pol; Blume, Elen; Brião Muniz, Mrlove Fátim; Rejne Silveir Reiniger, Li; Antoniolli, Zid Ines; Junges, Emnuele; Luptini, Mnoeli Detecção de Fusrium spp. e Trichoderm spp. e ntgonismo de Trichoderm sp. em soj so plntio direto Semin: Ciêncis Agráris, vol. 1, núm. 34, 2013, pp Universidde Estdul de Londrin Londrin, Brsil Disponível em: Como citr este rtigo Número completo Mis rtigos Home d revist no Redlyc Sistem de Informção Científic Rede de Revists Científics d Améric Ltin, Crie, Espnh e Portugl Projeto cdêmico sem fins lucrtivos desenvolvido no âmito d inicitiv Acesso Aerto

2 DOI / v34n6Supl1p3219 Detecção de Fusrium spp. e Trichoderm spp. e ntgonismo de Trichoderm sp. em soj so plntio direto Detection of Fusrium spp. nd Trichoderm spp. nd ntgonism of Trichoderm sp. in soyen under no-tillge Pol Mendes Milnesi 1* ; Elen Blume 2 ; Mrlove Fátim Brião Muniz 2 ; Li Rejne Silveir Reiniger 3 ; Zid Ines Antoniolli 4 ; Emnuele Junges 5 ; Mnoeli Luptini 6 Resumo Este trlho ojetivou i) qunti cr ocorrênci de Fusrium spp. e Trichoderm spp. em solo rizosférico, com e sem sintoms de Síndrome d Morte Súit (SMS), em oito genótipos de soj; ii) identi cr morfologicmente Fusrium spp. de rízes; iii) vlir relções ntgônics entre Trichoderm e Fusrium, isoldos de solo rizosférico e rízes de plnts com e sem sintoms de SMS, respectivmente e iv) crcterizr, trvés d região ITS1-5.8S-ITS2 do rdna, os isoldos de Trichoderm spp. com melhor desempenho no teste de confrontção diret. As colets de solo e rízes form relizds em um áre experimentl loclizd em Cruz Alt, RS, Brsil. Em lortório, form relizds diluições seriis ds mostrs de solo, contgem do número de Uniddes Formdors de Colônis (UFCs/g -1 de solo rizosférico) e isolmento pr identi cção de isoldos de Fusrium spp. e Trichoderm spp. e teste de confrontção diret. Houve diferenç signi ctiv entre s populções de Trichoderm spp. em solo rizosférico de plnts com e sem sintoms de SMS. Pr populção de Fusrium spp., foi consttd diferenç signi ctiv pens em solo rizosférico de plnts sem sintoms d doenç. Em rízes doentes, form identi cds s espécies F. solni, F. venceum, F. grminerum, F. oxysporum e F. verticillioides. No teste de confrontção diret, oito isoldos de Trichoderm spp. presentrm o melhor desempenho no ntgonismo Fusrium spp. Os isoldos de Trichoderm spp. provenientes de plnts com sintoms de SMS mostrrm mior e ciênci de controle in vitro. Esses isoldos presentrm lt similridde com espécies do gregdo T. koningii. Plvrs-chve: Glycine mx (L.) Merrill, fungos, populção, podridão rdiculr, controle iológico Astrct This study imed i) to quntify the occurrence of Fusrium spp. nd Trichoderm spp. in rhizospheric soil, with nd without symptoms of Sudden Deth Syndrome (SDS) in eight soyen genotypes; 1 Engª Agrª, Pós-Doutornd em Ciênci do Solo, PDJ/CNPq, Deptº de Solos, Lortório de Biotrnsformções do Crono e do Nitrogênio, Universidde Federl de Snt Mri, UFSM, Centro de Ciêncis Ruris, CCR, Snt Mri, RS. E-mil: pol. milnesi@gmil.com 2 Profª s Associd de Fitoptologi, Deptº de Defes Fitossnitári, UFSM/CCR, Snt Mri, RS. E-mil: elenlu@gmil.com; mrlovemuniz@yhoo.com.r 3 Profª Associd de Melhormento Vegetl, Deptº de Fitotecni, UFSM/CCR, Snt Mri, RS. E-mil: lirejnesilveirreiniger@ yhoo.com.r 4 Profª Associd de Biologi do Solo, Deptº de Solos, Lortório de Biologi do Solo e do Amiente, UFSM/CCR, Snt Mri, RS. E-mil:. zntoniolli@gmil.com 5 Engª Agrª, Discente de Doutordo em Agronomi, Deptº de Defes Fitossnitári, Lortório de Fitoptologi, UFSM/CCR, Snt Mri, RS. E-mil: mnujunges@yhoo.com.r 6 Engª Agrª, Discente de Doutordo em Ciênci do Solo, Bolsist CAPES. Deptº de Solos, Lortório de Biologi do Solo e do Amiente, UFSM/CCR, Snt Mri, RS. E-mil: mluptini@gmil.com * Autor pr correspondênci Receido pr pulicção 20/05/12 Aprovdo em 12/06/13 Semin i nci A r ri ondrin v. 34 n. 6 uplemen o 1 p

3 ilne i.. e l. ii) morphologiclly identify isoltes of Fusrium spp. from plnts roots with SDS; iii) evlute the ntgonism etween Trichoderm spp. nd Fusrium spp. isoltes from rhizospheric soil nd roots from with nd without SDS, respectively; nd iv) chrcterize through the ITS1-5.8S-ITS2 region of rdna the isoltes of Trichoderm spp. with etter performnce in the direct confronttion. The smpling of soil nd roots ws performed in n experimentl re locted in Cruz Alt, RS, Brzil. In the lortory, seril dilutions of soil smples, counting of the numer of Colony Forming Units (UFCs/g -1 of rhizospheric soil) were performed s well s isoltion for identi ction of isoltes of Fusrium spp. nd Trichoderm spp. nd testing of direct confronttion. There were signi cnt differences etween the popultion of Trichoderm spp. in the rhizosphere of plnts with nd without symptoms of SDS. For the popultion of Fusrium spp., signi cnt difference ws oserved only in the rhizosphere of plnts without symptoms of SDS. In disesed roots the following species were identi ed: F. solni, F. venceum, F. grminerum, F. oxysporum nd F. verticillioides. In the test of direct confronttion, eight isoltes of Trichoderm spp. chieved the est performnce in the ntgonism to Fusrium spp. nd Trichoderm spp. from res with symptoms of SDS hd higher control ef ciency in vitro. These isoltes showed high similrity to the species of T. koningii gregte. Key words: Glycine mx (L.) Merril, fungi, popultion, root rot, iologicl control 3220 Introdução Entre s doençs que podem estr ssocids à soj (Glycine mx (L.) Merrill), Podridão Vermelh d Riz (PVR) ou Síndrome d Morte Súit (SMS), cusd pelo complexo Fusrium solni (Mrt.) Scc. (AOKI; O DONNELL; SCANDIANI, 2005), é um ds mis importntes em função do difícil controle. A SMS se crcteriz por mnchs vermelhds, mis visíveis n riz principl e, gerlmente, loclizds 1 ou 2 cm ixo do nível do solo. Com evolução d infecção, é oservd um expnsão d lesão, que pss circundr riz, ssumindo colorção cstnho-vermelhd escur e, à medid que s lesões evoluem, pode ser oservd um mss zuld formd por conídios do ptógeno (FREITAS; MENEGHETTI; BALARDIN, 2004). Perds cusds pel SMS dependem de vários ftores, incluindo o estádio de desenvolvimento d plnt no momento d infecção pelo ptógeno, genótipo utilizdo e condições mientis existentes (ROY et l., 1997). N rizosfer existe um comunidde microin complex n qul um grnde vriedde de interções é desenvolvid. Ess região possui crcterístics de composição e estrutur in uencids pelo ciclo vegettivo e umidde do solo (PEREIRA, 2000). Nesse miente, lém dos micro-orgnismos ptogênicos, tmém existem fungos, ctéris e ctinoctéris que possuem tividde contr toptógenos, prtir d produção de metólitos ntimicroinos secundários (ntiiose), enzims lítics, entre outros (RAAIJMAKERS et l., 2009). Nesse sentido, um método que pode ser empregdo contr ptógenos de solo é o controle iológico, sendo o gênero Trichoderm um dos mis utilizdos, representndo fungos não-ptogênicos que exercem ntgonismo vários toptógenos trvés do prsitismo e/ou ntiiose. Esses fungos têm sido utilizdos com stnte sucesso como gentes de iocontrole, promotores de crescimento e n melhori d germinção e snidde de sementes (ETHUR et l., 2006). De cordo com Howel (2003), espécies de Trichoderm são cpzes de suprimir o desenvolvimento de vários orgnismos toptogênicos, tis como Pythium ultimum Trow 1901, Rhizoctoni solni J.G. Kühn 1858 e Phytophthor spp. e seus mecnismos ntgonists podem ser in uencidos pelo tipo de solo, condições de tempertur e umidde, lém d microiot ssocid. Fungos do gênero Trichoderm tmém são reltdos como ntivos n rizosfer de lgums culturs, como de citros (GESHEVA, 2002), de tt, de lgodão (SIVAN; CHET, 1989) e de tomte (LARKIN; FRAVEL, 1998). A cpcidde deste fungo em colonizr esse miente foi comprovd (COOK, 1993; ETHUR et l., 2008), ssim como su correlção negtiv com incidênci de Semin i nci A r ri ondrin v. 34 n. 6 uplemen o 1 p

4 De ecção de Fusrium pp. e Trichoderm pp. e n oni mo de Trichoderm p. em o o pln io dire o doençs rdiculres em crisântemo (MENEZES, 2007). No entnto, há crênci de informções sore su crcterizção e interção com Fusrium spp. em áres cultivds com soj, ssim como potencilidde de isoldos desse ntgonist, otidos de solo de tis áres, no controle de SMS. O presente estudo teve por ojetivos qunti cr s populções de Fusrium spp. e Trichoderm spp. em solo rizosférico de plnts com e sem sintoms de SMS; identi cr morfologicmente os isoldos de Fusrium otidos; selecionr e crcterizr, trvés d região ITS1-5.8S-ITS2 do rdna, isoldos de Trichoderm com cpcidde ntgônic Fusrium spp. com potencil pr uso futuro no mnejo de SMS. Mteril e Métodos Amostrs de solo rizosférico e rízes de soj (Glycine mx (L.) Merrill) (sfr 2008/2009) form coletds em um áre experimentl d Fundção Centro de Experimentção e Pesquis Fecotrigo (FUNDACEP CCGL), em Cruz Alt RS, conduzid so sistem plntio direto há, proximdmente, 23 nos. O solo d áre onde form relizds s colets está clssi cdo como um Ltossolo Vermelho distró co típico rgiloso (EMBRAPA, 1999). A clssi cção climátic, segundo Köeppen, é Cflg2, ou sej, sutropicl úmido sem estigem típic. A tempertur médi do mês mis quente é superior 22 C e do mês mis frio é superior 3 C e inferior 18 C. A precipitção médi nul é mior do que 1600 mm, com tendênci de miores precipitções n primver e no verão (MORENO, 1961). Form coletds mostrs de solo n profundidde de 0-0,10 m, ns prcels experimentis, pr su crcterizção químic e físic. Esss determinções form relizds no Lortório de Análise de Solos d Universidde Federl de Snt Mri. O solo d áre experimentl presentou em médi 500 g kg -1 de rgil, portnto, pertencente à Clsse Texturl 2 (CQFS RS/SC, 2004). As crcterístics químics do solo n mesm cmd form: ph: 5,0; mtéri orgânic do solo (MOS): 3,8%; P: 1,72 mg dm -3 ; K: 0,414 cmolc dm -3 ; Al: 0,2 cmolc dm -3 ; C: 5,1 cmolc dm -3 ; Mg: 2,1 cmolc dm -3 ; e CTC: 12,0%. Ness áre, rotção de culturs incluí soj/ milho durnte o verão e zevém ou trigo nos meses de inverno. Durnte o estádio de pleno enchimento ds vgens d soj (R 5 ) (FEHR; CAVINESS, 1977), form coletds ns prcels experimentis (cd um com áre de 25 m 2 ) letorimente, qutro plnts com sintoms e qutro sem sintoms de SMS, dos seguintes genótipos oriundos de progrms de melhormento genético: CEPS RR, CEPS RR, FUNDACEP 53 RR, CEPS RR, CEPS RR, CEPS RR, FUNDACEP 55 RR e CEPS RR, totlizndo oito trtmentos. Pr colet ds mostrs foi utilizd um pá de corte que foi lvd com águ e desinfestd com hipoclorito de sódio 1% e etnol 70%, entre s repetições. Pr o isolmento de Fusrium spp., s rízes principis form primeirmente lvds em águ corrente e desinfestds em hipoclorito de sódio 1% por 1 min, etnol 70% por 1 min e lvds em águ destild esterilizd por três vezes seguids. Posteriormente, s rízes form colocds em cixs do tipo Gerox, com ppel ltro esterilizdo e umedecido, e incuds durnte 48 h 25 C, so fotoperíodo de 12 h, em incudor do tipo BOD. Pr o isolmento, estruturs reprodutivs de Fusrium spp. form removids com uxílio de lçs esterilizds pr meio de cultur Btt- Dextrose-Ágr (BDA, extrto de 200 g de tt, 20 g de dextrose, 20 g de ágr e 1000 ml águ destild), pr otenção de culturs purs e posterior identi cção. Além disso, form feits diluições seriis do solo rizosférico pr qunti cção de Uniddes Formdors de Colôni (UFCs) de Fusrium spp. e Trichoderm spp. As mostrs de solo ds qutro plnts coletds form reunids, formndo um mostr compost, e 5 g de solo de cd trtmento Semin i nci A r ri ondrin v. 34 n. 6 uplemen o 1 p

5 ilne i.. e l. form diluídos em 95 ml de águ destild esterilizd, crescid de dus gots de Tween 80 (Merck, Germny). Os frscos contendo suspensão form colocdos em gitdor do tipo Fisher Flex Mix (USA) por 10 minutos e, prtir dess, form feits diluições seriis té o ftor Em seguid, 0,5 ml desss diluições form inoculdos, em qutro plcs de Petri, contendo 15 ml de meio BDA, crescido de 0,05 mg de estreptomicin/100 ml de meio de cultur, e incuds por 5 dis 25 C e fotoperíodo de 12 h em incudor do tipo BOD. A contgem ds colônis de Fusrium spp. e Trichoderm spp. foi feit sore o ftor de diluição seril 10-3, por meio de oservção visul ds colônis com se em iliogr especilizd (BARNETT; HUNTER, 1999). O número de UFCs de Fusrium spp. e Trichoderm spp. foi determindo de cordo com equções proposts por Crter (1993). Após contgem de UFCs, foi relizd identi cção dos gêneros Fusrium e Trichoderm trvés d visulizção de estruturs reprodutivs em microscópio ótico. As colônis de Trichoderm morfologicmente diferentes form repicds pr meio de cultur BDA pr posterior identi cção sed em métodos moleculres e utilizção no teste de confrontção diret, no qul su ção ntgônic foi vlid contr isoldos de Fusrium. Culturs monospórics form otids pr Trichoderm conforme técnic de cultur monospóric descrit por Fernndes (1993) e, em seguid, form cultivds em meio BDA. Pr su mnutenção, discos de micélio (5 mm de diâmetro) form colocdos em microtuos esterilizdos e rmzendos so refrigerção (4 C) té o momento de su utilizção. Pr identi cção de Fusrium spp. por meio de crcteres morfológicos, s colônis do fungo otids prtir de diluições de solo form puri cds conforme técnic de cultur monospóric descrit por Fernndes (1993), em que frgmentos do micélio dos fungos form colocdos em 5 ml de águ destild e esterilizd, gitdos e plquedos em plcs de Petri contendo meio de cultur Ágr- Águ (AA, 20 g de ágr e 1000 ml águ destild). Após 24 h de incução em tempertur miente, foi relizd oservção dos conídios germindos em meio AA, trvés de microscópio ótico. Os conídios que germinrm isoldmente form repicdos pr tuos de ensio contendo meio de cultur BDA (pr oservção d cor e mensurção d colôni), e pr plcs de Petri contendo meio de cultur Folh de Crvo-Ágr (CLA, 20 g de ágr, 1000 ml de águ destild e 3 pedços de folhs de crvo, Dinthus cryophyllus L., esterilizds à 60 C/72 h), que permitiu melhor crcterizção de mcroconídios, microconídios e clmidósporos. O mteril foi incudo 25 C e fotoperíodo de 12 h durnte dis. Após esse período, relizouse oservção ds microestruturs do fungo em microscópio estereoscópico e ótico e procedeu-se identi cção ds espécies de cordo com chves de clssi cção proposts por Gerlch e Nirenerg (1982), Nelson, Tousson e Mrss (1983) e Leslie e Summerell (2006). Pr vlir o possível ntgonismo de Trichoderm, foi relizdo o teste de confrontção diret in vitro. Pr isso, form utilizdos 12 isoldos de Trichoderm e nove isoldos de Fusrium otidos n etp cim descrit. Um disco de meio de cultur BDA com 12 mm de diâmetro, contendo micélio de Fusrium, foi trnsferido pr plcs de Petri (9,0 cm de diâmetro), tmém contendo 15 ml de meio BDA, e colocdo 0,5 cm d ord d plc. As plcs form incuds por 48 h 25 ± 2 C com fotoperíodo de 12 h em incudor do tipo BOD. Após esse período, um disco de meio de cultur BDA, tmém com 12 mm de diâmetro, contendo micélio de Trichoderm, foi trnsferido pr posição opost o disco de micélio de Fusrium ns plcs de Petri ( 0,5 cm d ord d plc). As plcs form incuds durnte 7 dis 25 ± 2 C com fotoperíodo de 12 h (CARVALHO et l., 2011). Decorrido esse tempo, s plcs form vlids de cordo com o critério de Bell, Wells e Mrkhm (1982), sedo em um escl de nots vrindo 3222 Semin i nci A r ri ondrin v. 34 n. 6 uplemen o 1 p

6 De ecção de Fusrium pp. e Trichoderm pp. e n oni mo de Trichoderm p. em o o pln io dire o de 1 5, n qul em 1 Trichoderm cresce e ocup tod plc; 2 Trichoderm cresce e ocup um prte do ptógeno (Fusrium) (2/3 d plc); 3 Trichoderm e Fusrium crescem té metde d plc (nenhum domin o outro); 4 Fusrium cresce e ocup um prte do Trichoderm (2/3 d plc); e em 5 Fusrium cresce e ocup tod plc de Petri. Em seguid, s nots do ntgonist form grupds em clsses (CARVALHO et l., 2011). Os isoldos de Trichoderm otidos de solo rizosférico de soj com e sem sintoms de SMS, cujo desempenho foi mis e ciente em teste de confrontção diret, form crcterizdos por métodos moleculres. Tis isoldos receerm os seguintes códigos de identi cção: T53d, T55d, T002dA, T002dB, T031d, T006s, T005s e T002sB, em que: d represent isoldo de plnt doente e s isoldo de plnt sdi; A e B indicm isoldos morfologicmente diferentes otidos de um mesmo genótipo de soj. Pr o estudo moleculr desses isoldos, os mesmos form cultivdos em meio de cultur Cldo Btt (extrto de 200 g de tt, 20 g de dextrose e 1000 ml águ destild) por 10 dis, 25 C com fotoperíodo de 12 h. A extrção de DNA foi relizd prtir do micélio, de cordo com o protocolo de Doyle e Doyle (1990). Ns reções de PCR, form utilizdos os oligonucleotídeos inicidores ITS 1 e ITS 4 (WHITE et l., 1990). A reção totlizou 25 µl contendo proximdmente 30 ηg de DNA, tmpão 10X (10 mm Tris-HCl, ph 8,3; 50 mm KCl; 0,1% de tween 10; 2,5 mm MgCl 2 ), 2,5 µm de cd dntp, 20 nm de MgCl 2, 25 ηmoles de cd um dos oligonucleotídeos inicidores (Biogen), 5 U d enzim Tq DNA polimerse (Invitrogen Life Technologies) e águ ultrpur pr completr o volume d reção. As reções form relizds em termocicldor MJ Reserch, INC. PTC 100MT, so s seguintes condições térmics: 94 C por 2 min; 30 ciclos de 94 C por 45 s; 55 C por 30 s; 72 C por 35 s e 72 C por 10 min. Ao nl d reção, o produto foi mntido 4 C. Um controle negtivo, sem DNA, foi incluído ns mpli cções do PCR. Os produtos d PCR form puri cdos com PEG % e, ns reções de sequencimento, utilizrm-se os oligonucleotídeos ITS1 e ITS4. Pr ests reções, foi seguido o protocolo fornecido pelo fricnte (Biogen). Os frgmentos sequencidos form nlisdos e comprdos com sequêncis já existentes trvés d ferrment BLAST, contr se de ddos do GenBnk, sedido no Ntionl Center for Biotechnology Informtion (NCBI) ( nci.nlm.nih.gov/) (ALTSCHUL et l., 1997), m de comprr similriddes com outrs espécies de Trichoderm. As sequêncis do GenBnk que presentrm s melhores coerturs e os miores escores de similridde form selecionds e linhds juntmente com s sequêncis otids no sequencimento pelo lgoritmo CLUSTAL W (THOMPSON; HIGGINS; GIBSON, 1994). A nálise logenétic foi conduzid utilizndose o método de Máxim Verossimilhnç com 5000 replicts pelo progrm MEGA versão 5 (TAMURA et l., 2007). Pr construção dos dendrogrms, form utilizds s sequêncis de Trichoderm spp. presentds n Tel 1. O delinemento experimentl utilizdo foi o inteirmente csulizdo com qutro repetições por trtmento. Devido o fto dos ddos não seguirem um distriuição norml, form empregdos testes não-prmétricos. Assim, os vlores estimdos em Uniddes Formdors de Colônis (UFCs) por grm de solo rizosférico form sumetidos à nálise d vriânci pelo teste de comprções múltipls de Kruskl-Wllis (SIEGEL; CASTELLAN, 2006). Pr o teste de confrontção diret, comprção entre s nots triuíds cd isoldo foi feit trvés do Teste U de Mnn-Whitney. Esss nálises form feits com uxílio do progrm esttístico STATISTICA 7.0. Semin i nci A r ri ondrin v. 34 n. 6 uplemen o 1 p

7 ilne i.. e l. Tel 1. Códigos de cesso no GenBnk pr os isoldos de Trichoderm spp. (região ITS) utilizdos neste estudo. Snt Mri, RS, Origem Isoldo Código de cesso Referênci Nov Zelândi T. dorothee GJS DQ Smuels et l. (2005) Brsil Trichoderm sp.t002db KC Milnesi et l. (2013) Nov Zelândi T. dorothee GJS DQ Smuels et l. (2006) Nov Zelândi T. dorothee GJS DQ Smuels et l. (2006) Austráli T. dorothee GJS DQ Smuels et l. (2006) Equdor T. ovlisporum Dis 70 AY Holmes et l. (2004) Brsil T. ovlisporum Dis 172h AY Holmes et l. (2004) Chin T. koningii CCRC33566 AF Lee; Hseu (2002) Chin T. koningii CCRC33563 AF Lee; Hseu (2002) Nov Zelândi T. koningii AF Dodd et l. (2000) Índi T. koningiopsis IBSD-GF6 KC Devi (2012) Brsil T. koningiopsis UFSM-Tr3s KC Milnesi et l. (2012) Brsil Trichoderm sp.t53d KC Milnesi et l. (2013) Brsil Trichoderm sp.t005s KC Milnesi et l. (2013) Brsil Trichoderm sp.t002sb KC Milnesi et l. (2013) Brsil Trichoderm sp.t006s KC Milnesi et l. (2013) Brsil Trichoderm sp.t002da KC Milnesi et l. (2013) Chin Hypocre koningii PKU F2 KC Singh et l. (2012) Índi T. koningiopsis NBAII(N)KA 8A-Tk GU Roop et l. (2010) Chin T. hrzinum A14 KC Yo (2012) Chin T. hrzinum A12 KC Yo (2012) Brsil T. hrzinum UFMGCB 3518 JQ de Fri et l. (2011) Brsil T. hrzinum UFMGCB 3517 JQ de Fri et l. (2011) Estdos Unidos Fusrium oxysporum 0531 EF Zhng et l. (2007) Fonte: Elorção dos utores. Adptdo de: Ntionl Center for Biotechnology Informtion. Disponível em: < nlm.nih.gov/>. Resultdos e Discussão A nálise comprtiv d ocorrênci de fungos do gênero Fusrium e Trichoderm entre genótipos de soj foi relizd seprdmente pr plnts com e sem sintoms de Síndrome d Morte Súit. Houve diferenç signi ctiv no número de uniddes formdors de colônis de Trichoderm entre genótipos, tnto em plnts com sintoms como sem sintoms de SMS. Entretnto, pr Fusrium veri cou-se diferenç signi ctiv pens em plnts sem sintoms d doenç (Figur 1). As miores médis pr populção de Fusrium, em plnts sem sintoms, form encontrds nos genótipos CEPS RR, CEPS RR e CEPS RR. O menor número de uniddes formdors de colônis de Fusrium foi oservdo prtir de mostrs do genótipo CEPS RR em solo rizosférico Semin i nci A r ri ondrin v. 34 n. 6 uplemen o 1 p

8 De ecção de Fusrium pp. e Trichoderm pp. e n oni mo de Trichoderm p. em o o pln io dire o Figur 1. Populção de Fusrium spp. em solo rizosférico de genótipos de soj,com e sem sintoms de Síndrome d Morte Súit (SMS), em sistem plntio direto. Médis seguids pel mesm letr não diferem esttisticmente pelo teste de Kruskl-Wllis. Snt Mri, RS ,2e+7 1,0e+7 COM SMS SEM SMS UFCs g -1 solo 8,0e+6 6,0e+6 4,0e+6 2,0e+6 0,0 CEPSRR CEPSRR CEPSRR CEPSRR FUNDACEP 55RR CEPSRR FUNDACEP 53RR CEPSRR Genótipos de soj Fonte: Elorção dos utores. As vrições que ocorrem n comunidde microin d rizosfer são dependentes do tipo de solo, espécie vegetl e cultivr utilizd, visto que ests produzem exsudtos ricos em determindos compostos mis fvoráveis lguns grupos de micro-orgnismos rizosféricos. Algums sustâncis presentes n rizosfer podem tur como lelopátics, iniindo ou estimulndo esses indivíduos, entre outrs cuj ção pode ser de sinlizção moleculr m de esteleceremse simioses mutulístics ou prsítics entre os micro-orgnismos e s plnts. Ests relções in uencim tmém s populções de ntgonists existentes nesse miente (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Nesse sentido, diferenç ns populções de Fusrium entre os genótipos de soj sem sintoms de SMS pode estr relciond à produção desses exsudtos que serim mis fvoráveis à multiplicção de lgums espécies do ptógeno do que pr outrs, ms sem cpcidde de infecção. Além disso, tmém pode ter hvido um pressão de seleção entre espécies melhor dptds e com mior competênci em rizosfer pr se estelecer e colonizr porção rdiculr de determindos genótipos. Pr supressão do ptógeno, ftores como teor de mtéri orgânic do solo, processos de decomposição e ciclgem de nutrientes, tipo de solo e de gente ptogênico, estção de cultivo e tipo de plnt cultivd possuem interferênci diret (TERMORSHUIZEN et l., 2006). Com relção à Trichoderm, oservou-se que o mior número de isoldos foi otido prtir do genótipo CEPS RR, seguido do genótipo CEPS RR, independentemente d presenç Semin i nci A r ri ondrin v. 34 n. 6 uplemen o 1 p

9 ilne i.. e l. ou não de sintoms de SMS ns plnts (Figur 2). Nos genótipos CEPS RR e FUNDACEP 55 RR tmém foi oservdo mior número de uniddes formdors de colônis de Trichoderm em mostrs de solo coletds em plnts com SMS. Por outro ldo, o genótipo FUNDACEP 55 RR não presentou isoldos de Fusrium spp. proveniente de rízes (Tel 2), o que poderi estr relciondo à elevd densidde populcionl de Trichoderm spp. n rizosfer ds plnts de soj com sintoms de Síndrome d Morte Súit. As mostrs oriunds do genótipo FUNDACEP 53 RR, com SMS, mostrrm diminuição signi ctiv do número de uniddes formdors de colônis de Trichoderm. Neste trlho, fungos do gênero Trichoderm estiverm ssocidos o solo rizosférico de soj, tnto em plnts com e sem sintoms de SMS, sendo cpzes de se estelecerem tmém em um miente em que ocorre predominânci do ptógeno. Tel 2. Espécies de Fusrium ssocids o sistem rdiculr de genótipos de soj, com sintoms de Síndrome d Morte Súit (SMS), em sistem plntio direto. Snt Mri, RS, Código de identi cção Genótipo de soj Espécies e descritores F001d FUNDACEP 53 RR F. venceum (Fr.) Scc F002d CEPS RR F. solni (Mrt.) Scc F010dA CEPS RR F. oxysporum Schlecht. F010dB CEPS RR F. solni (Mrt.) Scc F031d CEPS RR F. grminerum Schwe 1839 F005d CEPS RR F. verticillioides J. Sheld F006dA CEPS RR F. solni (Mrt.) Scc F006dB CEPS RR F. solni (Mrt.) Scc F015d CEPS RR F. solni (Mrt.) Scc (1) F: Fusrium spp.; F : nome do genótipo de soj do qul o isoldo foi otido; d: isoldo de solo rizosférico de plnts com sintoms d doenç; A ou B: isoldos morfologicmente diferentes de um mesmo genótipo. Fonte: Elorção dos utores. Qundo plnt de soj é tcd por Fusrium solni f. sp. glycines, s rízes produzem quntiddes su cientes de gliceolin, um tolexin que tu em respost à infecção pelo ptógeno. Este pode ser um ftor importnte no fornecimento de resistênci prcil esse fungo e vri conforme o genótipo de soj (LOZOVAYA et l., 2006). Diferençs n composição dos exsudtos rdiculres lierdos pels plnts condicionrim, ene cindo ou prejudicndo, composição microin d rizosfer (AIRA et l., 2010). N áre em que form relizds s colets ds mostrs utilizds no presente trlho, rotção de culturs incluí soj/milho durnte o verão, e zevém ou trigo nos meses de inverno. Esss rotções, ou lgums dels, podem ter in uencido s populções do ptógeno e do ntgonist, ene cindo-s ou prejudicndo-s Semin i nci A r ri ondrin v. 34 n. 6 uplemen o 1 p

10 De ecção de Fusrium pp. e Trichoderm pp. e n oni mo de Trichoderm p. em o o pln io dire o Figur 2. Populção de Trichoderm spp. em solo rizosférico de genótipos de soj, com e sem sintoms de Síndrome d Morte Súit (SMS), em sistem plntio direto. Médis seguids pel mesm letr não diferem esttisticmente pelo teste de Kruskl-Wllis. Snt Mri, RS SEM SMS COM SMS 5 UFCs g -1 solo (10 6 ) CEPSRR c c FUNDACEP 55RR CEPSRR CEPSRR CEPSRR FUNDACEP 53RR CEPSRR CEPSRR Genótipos de soj Fonte: Elorção dos utores. Entre os isoldos de Fusrium, form identi cds morfologicmente nove espécies otids de rízes de plnts com SMS e os resultdos encontrm-se n Tel 2. Emor outrs espécies tenhm sido identi cds, F. solni foi mis evidente, o que indicri grnde possiilidde de ocorrênci de SMS, em sfrs seguintes, n áre em que s mostrs form coletds. As espécies F. venceum e F. grminerum, poderim ser remnescentes d cultur nterior (restos culturis), já que ess áre foi cultivd com trigo e/ou zevém durnte o inverno. Com relção à seleção de isoldos de Trichoderm com potencil ntgônico Fusrium houve diferenç signi ctiv entre os dvindos de plnts com e sem SMS, somente pr qutro isoldos do ptógeno (Tel 3). Os isoldos F010dA e F005d de Fusrium, confrontdos com Trichoderm de plnts sem sintoms de SMS, e os isoldos F010dB e F006dA, confrontdos com Trichoderm de plnts com SMS, form mis sensíveis o ntgonist, com nots no teste de confrontção diret mis próxims 1. Os reltos de que hveri um pressão de seleção do meio (plnt doente) sore e ciênci do ntgonismo se comprovrm neste trlho, pois os ntgonists mis e czes form queles ssocidos à rizosfer de plnts com sintoms d doenç, controlndo três (T53d, T55d) ou qutro (T002dA, T002dB e T031d) isoldos de Fusrium (Tel 4). Esses seis isoldos de Trichoderm form sumetidos à nálise d região ITS1-5.8S-ITS2 e, Semin i nci A r ri ondrin v. 34 n. 6 uplemen o 1 p

11 ilne i.. e l. pós comprção com sequêncis depositds no GenBnk, veri cou-se que todos tiverm similridde com espécies do gregdo T. koningii, fornecendo indícios de que os isoldos sequencidos possm pertencer lgum desss espécies (Tel 1 e Figur 3). Isso pode ser oservdo trvés de um elevdo suporte de ootstrp (igul 100) entre o cldo formdo pelo gregdo T. koningii e o cldo T. hrzinum. Tel 3. Clsses de ntgonismo (médis ds nots) do teste de confrontção diret otids pelos isoldos de Trichoderm sp., oriundos de solo rizosférico de soj com e sem sintoms de Síndrome d Morte Súit (SMS), em função de isoldos de Fusrium spp. Snt Mri, RS, Clsses de ntgonismo de Trichoderm sp. Fusrium spp. (2) (1) Plnts com SMS Plnts sem SMS Nível de p ** F001d 1,78 2,00 0,16 ns F002d 1,65 1,62 0,76 ns F010dA 2,06 1,08 0,00 * F010dB 1,50 2,75 0,00 * F031d 2,93 3,12 0,67 ns F005d 2,34 1,75 0,04 * F006dA 1,62 2,00 0,03 * F006dB 1,75 1,87 0,36 ns F015d 1,53 1,83 0,11 ns (1) F: Fusrium spp.; F : nome do genótipo de soj do qul o isoldo foi otido; d: isoldo de solo rizosférico de plnts com sintoms d doenç; A ou B: isoldos morfologicmente diferentes de um mesmo genótipo. (2) Clsses de ntgonismo (dptdo de CARVALHO et l., 2011). Clsse 1: Trichoderm spp. cresce sore o ptógeno e ocup tod superfície do meio; clsse 2: Trichoderm spp. cresce sore pelo menos 2/3 d superfície do meio; clsse 3: Trichoderm spp. ocup proximdmente metde d superfície do meio; clsse 4: Trichoderm spp. cresce sore 1/3 do meio; e clsse 5: Trichoderm spp. não cresce e o ptógeno ocup tod superfície d plc (BELL; WELLS; MARKHAM, 1982); ( * ) signi ctivo; ( ns ) não signi ctivo pelo Teste U de Mnn-Whitney. (p ** ) Proilidde de erro (p <0,05). Fonte: Elorção dos utores. Tel 4. Isoldos de Trichoderm sp. mis competitivos no teste de confrontção diret (clsse de ntgonismo 1) frente isoldos de Fusrium spp. de plnts com Síndrome d Morte Súit (SMS). Snt Mri, RS, Isoldos de Trichoderm sp. * T53d T55d T002dA T002dB T031d T006s T005s T002sB Isoldos de Fusrium spp. * controldos F010dB, F006dA e F015d F010dB, F006dA e F002d F001dA, F010dB, F002d e F015d F010dB, F002d, F015d e F001d F010dB, F00d2, F015d e F001dA F010dA F005d F010dA ( * ) Isoldos seguidos pels letrs T: Trichoderm sp. e F: Fusrium spp.; T e F : nome do genótipo de soj do qul o isoldo foi otido; d ou s : isoldo de solo rizosférico de plnts com ou sem sintoms d doenç; A ou B : isoldos morfologicmente diferentes otidos de um mesmo genótipo. Fonte: Elorção dos utores Semin i nci A r ri ondrin v. 34 n. 6 uplemen o 1 p

12 De ecção de Fusrium pp. e Trichoderm pp. e n oni mo de Trichoderm p. em o o pln io dire o Figur 3. Dendogrm logenético sedo no método de Neighor-Joining derivdo ds sequêncis ds regiões ITS1-5.8S-ITS2 do rdna mpli cds pelos oligonucleotídeos ITS1 e ITS4, com se em 1000 réplics de ootstrp, pr isoldos de Trichoderm sp.: T53d, T005s, T002sB, T006s, T002dA e T002dB. As sequêncis otids e utilizds nesse estudo, com seus respectivos números de cesso no GenBnk, estão listds n Tel 1. O número ns rmi cções represent o número de ootstrp. Fusrium oxysporum (EF464166) foi utilizdo como outgroup. Snt Mri, Trichoderm dorothee (DQ333547) T002dB (KC481705) Trichoderm dorothee (DQ313144) Trichoderm dorothee (DQ313145) Trichoderm ovlisporum (AY380897) 59 Trichoderm ovlisporum (AY380896) Trichoderm koningii (AF414312) 64 Trichoderm koningii (AF414310) Trichoderm dorothee (DQ313136) 81 Trichoderm koningii (AF055211) Trichoderm koningiopsis (KC428393) Trichoderm koningiopsis (KC155358) T53 d (KC481709) 100 T005s (KC481707) T002sB (KC481706) T006s (KC481708) T002dA (KC481704) Hypocre koningii (KC113283) Trichoderm koningiopsis (GU479416) Trichoderm hrzinum (KC139307) Trichoderm hrzinum (KC139308) Trichoderm hrzinum (JQ418366) Trichoderm hrzinum (JQ418474) Fusrium oxysporum (EF464166) 0.05 Fonte: Elorção dos utores. Contrrimente, os isoldos T006s, T005s e T002sB, oriundos de plnts sem SMS, form e czes no controle de pens um isoldo de Fusrium cd (F010dA e F005d). Estes resultdos revelm que ioprospecção de isoldos de Trichoderm ntgonists Fusrium em locis onde há proliferção d doenç pode ser um estrtégi promissor, pois pode levr à otenção de Semin i nci A r ri ondrin v. 34 n. 6 uplemen o 1 p

13 ilne i.. e l. novs linhgens mis competitivs contr gentes ptogênicos. As espécies de Trichoderm podem soreviver expenss de croidrtos complexos lierdos pel degrdção de outros fungos, lém d produção de enzims e ntiióticos, expressão de proteíns e iocontrole de toptógenos (BENÍTEZ et l., 2004). Nesse sentido, é possível que os isoldos de Trichoderm sp. vlidos nesse estudo induzm produção de enzims quitinolítics e endoglucnses em céluls do sistem rdiculr do hospedeiro, compostos estes tmém ssocidos o seu micoprsitismo (ALMEIDA et l., 2007; GAJERA; VAKHARIA, 2010). T. koningiopsis, pesr de ser considerdo cosmopolit, é mis comum em ltitudes de clim tropicl do que clim temperdo, pois frequentemente são otidos isoldos dess espécie como endofíticos em Theorom spp. Tmém constitui um espécie gregd T. koningii Oudem. 1902, com potencil pr o controle iológico de diversos ptógenos (SAMUELS et l., 2006). Assim como outrs espécies de Trichoderm, T. koningii ene ci snidde d plnt e pode tur n iominerlizção de cristis de cálcio no solo (OYARBIDE; OSTERRIETH; CABELLO, 2001). Dl Soglio et l. (1998) oservrm presenç de enzims quitinolítics o vlirem o efeito de trtmentos compostos por ltrdos de cultur de T. hrzinum Rifi 1969, isoldo Th008, plicdos em sementes de soj, inoculds com um isoldo de Rhizoctoni solni. Os utores evidencirm presenç de três enzims quitinolítics n rizosfer ds plântuls de soj 15 dis pós emergênci. Um ds crcterístics trelds o controle iológico que Trichoderm spp. possuem é produção de enzims lítics extrcelulres que degrdm prede celulr de outros fungos. Além disso, indivíduos desse gênero são importntes n ciclgem de nutrientes e, em lguns csos, vêm sendo utilizdos pr produção de celulse em escl comercil (CORABI-ADELL; LUCON; KOIKE, 2002). As interções ntgonístics desenvolvids n rizosfer melhorm o crescimento ds plnts (HOYOS-CARVAJAL; ORDUZ; BISSETT, 2009) e snidde ds mesms, colorndo pr mnutenção d qulidde do solo e dos groecossistems (BAREA; AZCÓN; AZCÓN-AGUILAR, 2002), já que competênci de rizosfer é um crcterístic importnte pr seleção de gentes de controle iológico (HARMAN et l., 2004). Esse resultdo pode indicr lt cpcidde ntgônic os isoldos de Fusrium vlidos e pont que os isoldos de Trichoderm sp. testdos podem presentr um elevdo potencil pr utilizção em um mnejo integrdo de doençs rdiculres n cultur d soj. Além disso, esse estudo tmém demonstrou que Trichoderm sp. poderi presentr um cráter gressivo, sendo cpz de se estelecer em um ddo miente (mesmo com um mior pressão do ptógeno, conforme os resultdos cim presentdos), desde que dds às condições proprids pr tl, prevlecendo sore outrs espécies. Os isoldos de Fusrium F010dA (F. oxysporum), F015d (F. solni), F002d (F. solni) e F001d (F. venceum) form os que tiverm um mior número de isoldos de Trichoderm sp. cpzes de controlá-los, indicndo que esses isoldos do ptógeno poderim ser mis sensíveis à ção do ntgonist. Tmém não pode ser desconsiderdo o fto de que esss espécies de Fusrium não serim tão gressivs. Ethur et l. (2005), vlindo fungos ntgonists Sclerotini sclerotiorum (Li.) de Bry 1884, reltrm que lém d vriilidde entre isoldos de Trichoderm pode-se encontrr tmém diferençs n ção desses dependendo d tempertur, umidde e tipo de solo. Selecionndo isoldos de Trichoderm spp. pr o controle de Sclerotium rolfsii Scc. em soj, Lohmnn et l. (2007) oservrm que os isoldos I, II e III do ntgonist, oriundos de três mostrs de solo coletds em diferentes áres, presentrm 3230 Semin i nci A r ri ondrin v. 34 n. 6 uplemen o 1 p

14 De ecção de Fusrium pp. e Trichoderm pp. e n oni mo de Trichoderm p. em o o pln io dire o efeito controldor sore o ptógeno, provocndo menor incidênci de dmping off em plântuls de soj. Além disso, contgem de conídios dos isoldos de Trichoderm spp. I e II foi mior qundo comprd o isoldo III, sendo os primeiros mis gressivos e cpzes de dominr o miente, controlndo o toptógeno. Os isoldos de Trichoderm spp. T53d, T55d, T002dA, T002dB e T031d, oriundos de solo rizosférico de genótipos de soj com sintoms de SMS, presentrm mior cpcidde ntgônic os isoldos de Fusrium spp. testdos. Em comprção com outros utores, foi oservdo que os isoldos de Trichoderm sp. que otiverm not 1 no teste de confrontção diret form mis competentes em se estelecer n rizosfer dos genótipos de soj estuddos e poderim ter tudo sore s condições mientis do solo, modi cndo-s, disputndo nutrientes e espço com o toptógeno. É importnte ressltr que ind há um crênci de resposts cerc ds interções entre ntgonists e o ptossistem soj-sms, visto que utilizção do controle iológico de doençs, compondo um mnejo integrdo, tri considerável interesse de produtores ruris e empress, que integrm um nicho de mercdo voltdo à sustentilidde n gricultur. A relizção de testes em csde-vegetção e seleção de novos isoldos de Trichoderm sp., entre outrs espécies do fungo, juntmente com estudos de su vriilidde genétic, enftiz importânci pel usc de novs perspectivs pr emprego do controle iológico no mnejo de SMS e outrs doençs cusds por ptógenos de solo n soj. Conclusões Nos genótipos de soj CEPS RR, CEPS RR, FUNDACEP 53 RR, CEPS RR, CEPS RR, CEPS RR, FUNDACEP 55 RR e CEPS RR, populção de Fusrium spp. em solo rizosférico difere em quntidde pens entre genótipos sem sintoms de Síndrome d Morte Súit e Trichoderm spp. está ssocido o solo rizosférico em soj, tnto em plnts sem sintoms de Síndrome d Morte Súit qunto em plnts com sintoms d doenç, em quntiddes diferentes nos diferentes genótipos estuddos. Os isoldos de Trichoderm spp. T55d e Trichoderm sp. T53d, T002dA, T002dB e T031d, de solo rizosférico de genótipos de soj com sintoms de Síndrome d Morte Súit, presentm mior cpcidde ntgônic Fusrium spp. e podem ser utilizdos em testes cmpo, envolvendo os genótipos ds quis form otidos, entre outros, m de veri cr se o ntgonismo é mntido e uscr o controle iológico d doenç. Agrdecimentos Os utores grdecem à Coordenção de Aperfeiçomento de Pessol de Ensino Superior (CAPES) pel concessão de olss de estudo; à FUNDACEP/CCGL por viilizr colet de solo em su áre experimentl; e os revisores nônimos pels importntes sugestões e correções. Referêncis AIRA, M.; GÓMEZ-BRANDÓN, M.; LAZCANO, C.; BÅÅTH, E.; DOMÍNGUEZ, J. Plnt genotype strongly modi es the structure nd growth of mize rhizosphere microil communities. Soil Biology & Biochemistry, Elmsford, v. 42, n. 12, p , ALMEIDA, F. B.; CERQUEIRA, F. M.; SILVA, R. N.; ULHOA, C. J. Mycoprsitism studies of Trichoderm hrzinum strins ginst Rhizoctoni solni: evlution of coiling nd hydrolytic enzyme production. Biotechnology Letters, Netherlnds, v. 29, n. 8, p , ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, T. L.; SCHAFFON, A. A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.; MILLER, W.; LIPMAN, D. J. Gpped BLAST nd PSI-BLAST: new genertion of protein dt se serch progrms. Nucleic Acids Reserch, Bethesd, v. 73, n. 17, p , AOKI, T.; O DONNELL, K.; SCANDIANI, M. M. Semin i nci A r ri ondrin v. 34 n. 6 uplemen o 1 p

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