Sequenciamento de leptospiras e suas descobertas

Transcrição

1 Universidade Federal de Pelotas Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CDTec) Sequenciamento de leptospiras e suas descobertas Leonardo Garcia Monte (lmonte.ib@ufpel.edu.br)

2 Leptospira e LEPTOSPIROSE

3 Leptospira

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5 Leptospira Antes de 1989 a classificação sororológica considerava L. interrogans as patogênicas e L. biflexa as saprófitas Levett 2001 (mais de 200 sorovares) Adler and Moctezuma 2009 Com a classificação genotípica hoje o gênero é composto por 19 espécies e mais de 260 sorovares

6 Leptospira

7 Leptospira

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9 Lipx, Treponema e Borrelia, LPS estruturalmente relacionado ao LPS de Enterobacteriaceae

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11 LEPTOSPIROSE A leptospirose é a zoonose mais disseminada no mundo (OMS) Acomete seres humanos e animais (silvestres e domésticos) Causada por bactérias patogênicas pertencentes ao gênero Leptospira

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13 LEPTOSPIROSE Exibe distintos graus de severidade: - Febre, dores de cabeça e musculares - Falha hepática e renal Freqüentemente confundida com outras doenças febris - gripe - dengue - hantavirose...

14 Teste de Aglutinação Microscópica (MAT) - Problemas durante a fase inicial da doença ELISA, PCR... Diagnóstico

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18 Futuro Próximo...

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22 Histórico Com a necessidade da implementação de técnicas modernas de diagnóstico e de medidas preventivas mais eficazes para o controle da leptospirose; Projeto Nacional do Genoma da Leptospira; China e o Brasil investiram no seqüênciamento do genoma da Leptospira; Colaboração entre FAPESP, FIOCRUZ e universidades federais (UFPel) O genoma de L. interrogans sorovar Copenhageni foi sequenciado de 2002 a 2004

23 Artigos Gerados Guo-ping Zhao 2003 Impact Factor A.L.T.O. Nascimento 2004 Dieter M. Bulach 2006 M. Picardeau 2008

24 Histórico Duas cepas pertencentes à espécie L. interrogans e ao sorogrupo Icterohaemorrhagiae, cepas Lai (Ren et al 2003) e Fiocruz L1-130 (Nascimento et al 2004) Consideradas como agentes endêmicos e responsáveis por muitos dos casos graves de leptospirose humana em seus países, tiveram os seus genomas seqüenciados;

25 Histórico O seqüênciamento do genoma da cepa Fiocruz L1-130 foi realizado em uma colaboração que envolveu a Fundação Oswaldo Cruz (RJ e BA), Instituto Butantan e a Universidade Federal de Pelotas, entre outras instituições nacionais e internacionais; Posteriormente duas cepas do sorovar Hardjo pertencentes à espécie L. borgpetersenii, importantes causas de leptospirose humana e animal no mundo, também tiveram o seu genoma seqüenciado e comparado com os outros genomas disponíveis, por um consórcio entre os EUA e a Austrália (Bulach et al 2006).

26 Cepas NC_ Leptospira biflexa serovar Patoc strain 'Patoc 1 (Paris)' plasmid p74, complete sequence DNA; circular; Length: 74,116 nt Replicon Type: plasmid Replicon Name: p74 Created: 2008/06/10 NC_ Leptospira biflexa serovar Patoc strain 'Patoc 1 (Paris)' chromosome I, complete sequence DNA; circular; Length: 3,599,677 nt Replicon Type: chromosome Replicon Name: I Created: 2008/04/15 NC_ Leptospira biflexa serovar Patoc strain 'Patoc 1 (Paris)' chromosome II, complete sequence DNA; circular; Length: 277,655 nt Replicon Type: chromosome Replicon Name: II Created: 2008/06/10

27 Cepas NC_ Leptospira biflexa serovar Patoc strain 'Patoc 1 (Ames)' chromosome II, complete sequence DNA; circular; Length: 277,995 nt Replicon Type: chromosome Replicon Name: II Created: 2008/06/10 NC_ Leptospira biflexa serovar Patoc strain 'Patoc 1 (Ames)' plasmid p74, complete sequence DNA; circular; Length: 74,117 nt Replicon Type: plasmid Replicon Name: p74 Created: 2008/06/10 NC_ Leptospira biflexa serovar Patoc strain 'Patoc 1 (Ames)' chromosome I, complete genome DNA; circular; Length: 3,603,977 nt Replicon Type: chromosome Replicon Name: I Created: 2008/06/10

28 Cepas NC_ Leptospira interrogans serovar Lai str chromosome I, complete genome dsdna; circular; Length: 4,332,241 nt Replicon Type: chromosome Replicon Name: I Created: 2002/10/21 NC_ Leptospira interrogans serovar Lai str chromosome II, complete sequence dsdna; circular; Length: 358,943 nt Replicon Type: chromosome Replicon Name: II Created: 2002/10/21

29 Cepas NC_ Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz L1-130 chromosome I, complete sequence dsdna; circular; Length: 4,277,185 nt Replicon Type: chromosome Replicon Name: I Created: 2004/03/23 NC_ Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz L1-130 chromosome II, complete sequence DNA; circular; Length: 350,181 nt Replicon Type: chromosome Replicon Name: II Created: 2004/03/23

30 Cepas NC_ Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo-bovis JB197 chromosome I, complete sequence DNA; circular; Length: 3,576,473 nt Replicon Type: chromosome Replicon Name: 1 Created: 2006/10/21 NC_ Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo-bovis JB197 chromosome II, complete sequence dsdna; circular; Length: 299,762 nt Replicon Type: chromosome Replicon Name: 2 Created: 2006/10/21

31 Cepas NC_ Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo-bovis L550 chromosome I, complete sequence dsdna; circular; Length: 3,614,446 nt Replicon Type: chromosome Replicon Name: 1 Created: 2006/10/21 NC_ Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo-bovis L550 chromosome II, complete sequence dsdna; circular; Length: 317,336 nt Replicon Type: chromosome Replicon Name: 2 Created: 2006/10/21

32 Artigos

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37 Artigos Genes maiores ou igual a 180pb

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50 Sequenciamento O DNA genômico foi aleatoreamente cortado por nebulization (HydroShear, GeneMachines) e as extremidades reparadas enzimaticamente

51 Sequenciamento Fragmentos (~1.5 4 kb) foram ligados aos plasmídeos pgem7zf+ (Promega) (cepa Paris strain) or psmart-hc and psmart-lc (Lucigen Corp.) (cepa Ames); Fragmentos maiores (35 45 kb) foram ligados à fosmídeos pcc1fos (Epicentre, Madison, WI) (Paris strain) Fragmentos intermediários (7 12 kb) foram preparados de digestões parciais usando BamHI cepa Ames e ligados em pzero-1 (Invitrogen). Kit de amplificação do DNA plasmidial - GE Healthcare Bio-Sciences ou SprintPrep plasmid preparation kits (Agencourt Bioscience). A purificação do DNA do fosmídeo foi realizada com kit Montage BAC Miniprep96 Millipore)

52 Sequenciamento

53 Sequenciamento

54 Sequenciamento Figure 10-3 part 2 of 3 Whole genome shotgun sequencing ABI PRISM BigDye Terminator cycle sequencing ready reactions kits and run on a 3700 or a 3730 xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems)

55 Sequenciamento

56 Descobertas

57 Descobertas

58 Descobertas Housekeeping function Housekeeping function Metabolismo de RNA e DNA; Processamento e secreção de proteínas; Processos celulares; Metabolismo; Manutenção da estrutura celular... Genes ortólogos em todas as espécies transferência genética

59 Descobertas

60 OBRIGADO PELA ATENÇÃO