UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA (CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL)

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1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA (CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL) Ariel Director DIAGNÓSTICO DA LEPTOSPIROSE EM OVINOS POR PROVAS MOLECULARES (PCR) NITERÓI 2013

2 2 Ariel Director DIAGNÓSTICO DA LEPTOSPIROSE EM OVINOS POR PROVAS MOLECULARES (PCR) Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal Orientador: Prof. Dr. WALTER LILENBAUM NITERÓI 2013

3 3 Ariel Director DIAGNÓSTICO DA LEPTOSPIROSE EM OVINOS POR PROVAS MOLECULARES (PCR) Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Walter Lilenbaum Orientador Universidade Federal Fluminense Prof. Dr. Felipe Zandonadi Brandão Universidade Federal Fluminense Prof. Dr. Guilherme Nunes de Souza Embrapa Gado de Leite NITERÓI 2013

4 4 AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar, gostaria de agradecer a D s que sempre marcou o meu caminho e me fez chegar até aqui. Agradeço a toda equipe do laboratório, especialmente Gabriel Martins, Bruno Penna, Denis Otaka, Ana Paula Loureiro, Camila Hammond, Carla Dray e Carlos Zarden, que me acolheram e ensinaram, não somente as técnicas de laboratório, mas também suas diferentes culturas e formas de pensar, com as quais cresci muito e desfrutei bons momentos, tornando mais amena a rotina diária. Pegando carona, agradeço aos companheiros de mestrado que tornaram mais agradável esta caminhada. Sem faltar, meu orientador Prof. Dr. Walter Lilenbaum, que me deu as boas vindas, abriu as portas do laboratório e me ensinou lições que levarei para toda a vida. Agradeço aos professores Nádia Regina Pereira Almosny e Felipe Zandonadi Brandão, que foram os primeiros a me receber, de forma cálida e amável, desde antes de começar o mestrado. Ao Dr. Marco Alberto Medeiros por ter aberto as portas de seu laboratório para fazer parte desta pesquisa. Aos proprietários e ajudantes das fazendas que deram a ajuda necessária para realizar esse estudo. À Profa. Marcela Ribeiro (Faculdade de

5 Veterinária de Valença - CESVA) e a Thaynná que mostraram dedicação em passar contatos de produtores para poder desenvolver este projeto. 5 Aos professores e amigos com quem inicie na ciência, tanto de Física Biológica quanto de Teriogenologia, especialmente Susana Giuliano, Marcelo Miragaya, Vicky Trasorras, Enrique Capdevielle, Alicia Agüero e Graciela (Gati) Chaves. A meus amigos Javi Laster, Eduardo Nejmark e Arie-Leib Rizicman que mostraram que para a amizade não há distância. Aos meus pais e irmã que apesar dos quilômetros que nos separam dão o apoio necessário, mostrando que sempre estão presentes. Por fim, agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte prestado e ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Veterinária (Clínica e Reprodução Animal). E principalmente a minha família, Chaya, que dá todo o apoio, não só neste trabalho, mas em tudo o que acontece em nossas vidas. A Sarah Mushka e Naftali, que com sorrisos, choros, brincadeiras e viradas de noite trazem a maior alegria que um pode ter. A todos eles que dão sentido a minha vida.

6 6 RESUMO A leptospirose pode causar problemas reprodutivos em ovinos, tais como infertilidade, abortamento, mumificação, orquites, ocorrência de natimortos, gerando perdas econômicas para os criadores. Os testes sorológicos não permitem o diagnóstico precoce da enfermidade e são influenciados pela produção de anticorpos, induzidos pela vacinação ou anticorpos maternos. Isto pode ocasionar resultados falsos positivos, o que diminui sua especificidade. O isolamento do microrganismo constitui o método mais confiável para confirmar a infecção por leptospiras. No entanto, seu cultivo é trabalhoso e seu crescimento pode levar até 13 ou mais semanas, apresentando uma baixa sensibilidade. Já a PCR, por meio da detecção direta do DNA do agente, tem sido desenvolvida para diagnóstico de leptospirose. Poucos estudos têm sido desenvolvidos com enfoque na transmissão venérea de leptospiras em ovinos, por isso, o presente estudo objetivou a detecção de carreadores renais e genitais de Leptospira spp. em ovinos aplicando ferramentas moleculares. Foi realizado um inquérito sorológico em seis rebanhos com um total de 156 animais. Destas amostras de soro testadas, 14,1% (22/156) apresentaram sororreatividade. Três rebanhos apresentaramse soronegativos e em dois foi observada sororreatividade contra o sorogrupo Icterohaemorrhagiae, enquanto o sexto apresentou 33,3% de sororreatividade contra o sorogrupo Sejroe (serovar Hardjo). Selecionou-se o último rebanho como grupo de trabalho e um rebanho soronegativo como grupo controle, dos quais foram colhidas amostras de urina, sêmen/muco vaginal para processamento bacteriológico e para a PCR. Obteve-se uma cultura pura de Leptospira, a partir de uma amostra de fluido vaginal de uma ovelha do grupo de trabalho. Já no grupo controle, todas as amostras, tanto de urina quanto de fluido vaginal e sêmen, foram negativas na tentativa de isolamento do microorganismo. No que se refere aos resultados obtidos na PCR, 5/18 (27,8%) amostras de fluido vaginal/sêmen foram positivas e em relação às amostras de urina, 7/18 (38,9%) apresentaram positividade no grupo de trabalho. Das amostras de urina positivas neste grupo, três foram positivas na PCR de fluido vaginal/sêmen. Já no grupo controle, 7/18 (38,9%) amostras de fluido vaginal/sêmen e 1/19 (5,3%) amostra de urina foram positivas na PCR, sendo esta positiva também no fluido vaginal. Avaliou-se a cultura pura de Leptospira na sorogrupagem e por métodos moleculares, resultando que o serovar Hardjoprajitno foi aquele que apresentou o maior título (12.800) na sorogrupagem. Já no sequenciamento da amostra isolada foi observada 100% de homologia para a espécie L. interrogans, para os genes rrs e secy. A VNTR apresentou o seguinte perfil de pares de base: VNTR4: 450bp, VNTR7: 710 bp, e VNTR10: 1050 bp, também sugestivo de Hardjoprajitno. Deste modo, concluiu-se que a amostra bacteriana isolada tratava-se de L. interrogans sorogrupo Sejroe serovar Hardjoprajitno. O isolamento de Leptospira a partir de amostras de fluidos vaginais reforça a ideia da transmissão venérea em ovinos. Palavras chaves: 1. Leptospira; 2. Diagnóstico molecular; 3. Pequenos ruminantes

7 7 ABSTRACT Leptospirosis can cause reproductive problems in sheep, such as infertility, abortion, mummification, orchitis and stillbirth, leading to economic losses to producers. Serological tests do not allow early diagnosis of this disease and are influenced by the production of antibodies induced by vaccination or by the presence of maternal antibodies. This can lead to false positive results, reducing its specificity. The isolation of the organism is the most reliable method to confirm infection by leptospires. However, its culture is laborious and its growth can take 13 weeks or more, with a low sensitivity. PCR, by direct detection of DNA of the agent, has already been developed for diagnosis of leptospirosis. Since few studies have been developed with a focus on venereal transmission of leptospires in sheep, this study aimed to detect renal and genital carriers of Leptospira in sheep applying molecular detection methods. In this study a serological survey was conducted in six herds with a total of 156 animals. Of these serum samples, 14.1% (22/156) showed seroreactivity. Three herds were seronegative and two were seroreactive against serogroup Icterohaemorrhagiae while the sixth showed 33.3% of seroreactivity against serogroup Sejroe (serovar Hardjo). This last herd (workgroup) and one of the seronegatives herds (control group), were selected Urine samples, as well as semen/vaginal fluids were collected from those groups, processing for bacteriological and molecular testing. A pure culture of Leptospira was obtained from a sample of vaginal fluid of a sheep's workgroup. In the control group, all samples in both urine and vaginal fluid and semen were negative in an attempt to isolate the micro-organism. Regarding the results obtained in PCR, 5/18 (27.8%) samples of vaginal fluid/semen were positive and from the urine samples, 7/18 (38.9%) were positive in the workgroup. From the positive urine samples in this group, three were positive in PCR vaginal fluid/semen. In the control group, 7/18 (38.9%) samples of vaginal fluid/semen and 1/19 (5.3%) urine sample were positive in PCR. This was also positive for PCR from vaginal fluid. The pure culture of Leptospira was evaluated by serogrouping and molecular methods. The result was that serovar Hardjoprajitno showed the highest titer (12,800). As for genes rrs and secy, the sequence showed 100% homology to L. interrogans and VNTR showed the following profile: VNTR4: 450bp, VNTR7: 710 bp and VNTR10: 1050 bp, suggestive of Hardjoprajitno. It was concluded that the isolate was L. interrogans serogroup, serovar Sejroe type Hardjoprajitno. The isolation of Leptospira from samples of vaginal fluid reinforces the idea of venereal transmission in sheep. Keywords: 1. Leptospira; 2. Molecular testing; 3. Small ruminants

8 8 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO, p.16 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA, p O AGENTE, p LEPTOSPIROSE EM OVINOS, p Leptospirose: inquéritos sorológicos, p Leptospirose: inquéritos sorológicos no Brasil, p Leptospirose: Isolamento de cepas em ovinos, p Leptospirose no trato genital, p MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO, p Métodos indiretos, p Teste de soroaglutinação microscópica (SAM), p Métodos Diretos, p Cultura bacteriológica - Isolamento, p Métodos moleculares, p OBJETIVOS, p OBJETIVO GERAL, p OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p MATERIAL E MÉTODO, p DESENHO DO ESTUDO, p LOCAL DE REALIZAÇÃO DO ESTUDO, p. 38

9 9 4.3 AMOSTRAS DE ANIMAIS, p PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS, p Sorologia, p Cultivo bacteriológico, p Técnicas moleculares, p Amostras clínicas, p Detecção do Gene LipL32, p Amostras Bacterianas, p Detecção do Gene rrs (16S rrna) e secy, p VNTR, p Sorogrupagem, p ANÁLISES ESTATÍSTICAS, p RESULTADOS, p DISCUSSÃO, p CONCLUSÃO, p OBRAS CITADAS, p. 63 ANEXO 1, p. 74

10 10 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Desenho de estudo, p.37 Figura 2 Fotografia do gel da corrida de eletroforese das amostras de urina e fluido vaginal processadas para a realização da PCR (amplificação do gene LipL32) dos animais 1 a 6 do grupo de trabalho, p. 52 Figura 3 Fotografia do gel da corrida de eletroforese das amostras de fluido vaginal (amostra 1) e do DNA extraído da cultura pura obtida do fluido vaginal de mesma ovelha pertencente a grupo de trabalho (amostra 2) processadas para a realização da PCR (amplificação do gene LipL32), p.52 Figura 4 Fotografia do gel da corrida de eletroforese das amostras de urina e fluido vaginal processadas para a realização da PCR (amplificação do gene LipL32) dos animais 1 a 7 do grupo controle (e urina do animal 8), p. 53

11 11 Figura 5 Fotografia do gel da corrida de eletroforese do DNA extraído da cultura pura (1) obtida do fluido vaginal de ovelha pertencente a grupo de trabalho processado para a realização da VNTR, p. 54

12 12 LISTA DE QUADROS Quadro 1 Ocorrência de aglutininas anti-leptospira em ovinos em diversos países no período de 1984 a 2007, diagnosticada pelo teste da soroaglutinação microscópica (SAM), p. 23 Quadro 2 Ocorrência de aglutininas anti-leptospira em ovinos das diversas regiões no Brasil, diagnosticadas pelo teste da soroaglutinação microscópica (SAM), p. 25 Quadro 3 Serovares de Leptospira sp. empregados como antígenos no teste da soroaglutinação microscópica (SAM) em amostras de ovinos do estado do Rio de Janeiro, 2012, p. 40 Quadro 4 Antissoros utilizados na sorogrupagem da amostra bacteriana de Leptospira isolada de um ovino no Rio de Janeiro, 2012, p. 46

13 13 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Resultados obtidos nos testes sorológicos de 156 animais pertencentes a seis rebanhos estudados no estado do Rio de Janeiro, 2012, p. 49 Tabela 2 Resultados obtidos pela SAM (para sorogrupo Sejroe/serovar Hardjo), cultura bacteriológica e PCR de fluido vaginal/sêmen e urina dos 18 animais pertencentes ao rebanho ovino sororreativo, p. 50 Tabela 3 Resultados obtidos pela SAM (para sorogrupo Sejroe/serovar Hardjo), cultura bacteriológica e PCR de fluido vaginal/sêmen e urina dos 19 animais pertencentes ao rebanho soronegativo, p. 51

14 14 Tabela 4 Resultados da PCR das amostras de urina em relação á sororreatividade dos dois rebanhos estudados no estado do Rio de Janeiro, 2012, p. 55 Tabela 5 Resultados da PCR das amostras de fluido vaginal/sêmen em relação á sororreatividade dos dois rebanhos estudados no estado do Rio de Janeiro, 2012, p. 55

15 15 LISTA DE SIGLAS μm CEUA DNA EMJH FIOCRUZ LPS OIE PBS Micrometro Comitê de Ética no Uso de Animais Ácido desoxirribonucleico Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris Fundação Instituto Osvaldo Cruz Lipopolissacarídeo Organização Mundial de Saúde Animal (World Organization for Animal Health) Solução salina tamponada com fosfato (Phosphate buffered saline) PCR RFLP SAM VNTR WHO Reação em cadeia da polimerase (Polymerase chain reaction) Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (Restriction fragment length polymorphism) Soroaglutinação microscópica Número variável de sequências repetidas (Variable Number of Tandem Repeats) World Health Organization

16 16 1 INTRODUÇÃO A leptospirose em ovinos pode ser assintomática, moderada ou grave, aguda ou crônica. Os sintomas clínicos agudos são geralmente relacionados com enfermidades renais, hepáticas e/ou disfunções reprodutivas. Já os animais infectados crônicos costumam ser assintomáticos. A infecção afeta animais de ambos os sexos e de qualquer idade. Além disso, a enfermidade é reconhecida como uma importante causa de abortamentos determinando graves prejuízos econômicos. Infecções em animais não gestantes muitas vezes podem passar despercebidas por seu caráter subclínico. Os abortamentos ocorrem principalmente no terço final da gestação e, além disso, tem sido observado o aumento de estudos relatando a ocorrência de natimortos, fetos mumificados e cordeiros fracos ao nascer. O principal método de diagnóstico recomendado pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) é o teste de soroaglutinação microscópica (SAM). Este teste não permite o diagnóstico precoce porque se baseia na detecção de anticorpos anti-leptospira, que aparecem normalmente de cinco a sete dias depois da exposição. Além disso, o diagnóstico é influenciado pela produção de anticorpos induzidos pela vacinação, podendo ocasionar resultados falsos positivos. O isolamento do microrganismo a partir da urina ou dos tecidos de animais constitui o método mais confiável (padrão-ouro) para confirmar a infecção por Leptospira. No entanto, o cultivo desta bactéria é

17 17 trabalhoso e o crescimento pode levar até 13 ou mais semanas, apresentado uma baixa sensibilidade. Já a reação em cadeia da polimerase (PCR Polymerase Chain Reaction ) tem sido desenvolvida para diagnóstico de leptospirose, por meio da detecção direta do DNA do agente. No entanto, esse método não pode identificar o serovar infectante, o que reduz seu valor em termos de investigação epidemiológica e de saúde pública. Por isso, para realizar tratamentos e controles mais eficazes, é importante ter disponível testes diagnósticos confiáveis na fase inicial aguda da doença, sendo os métodos moleculares os que melhores se adequam a essas exigências, visto que o DNA do micro-organismo pode ser detectado em baixas concentrações, e em diferentes amostras clínicas, como sangue e urina, fato que corrobora com a identificação da infecção em todas as fases da doença. Em vista a tudo isso, o objetivo deste estudo foi demonstrar a possibilidade de detecção de carreadores de Leptospira sp. em ovinos por meio de ferramentas moleculares, de modo a contribuir de forma significativa para o diagnóstico da leptospirose nestes animais.

18 18 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1 O AGENTE Leptospira spp. são espiroquetas com 0,10-0,25 μm de diâmetro e 6-25 μm de comprimento. São aeróbios obrigatórios com uma temperatura ótima de crescimento de ºC (BHARTI et al., 2003). A estrutura da parede celular do agente se assemelha à estrutura de bactérias Gram-negativas; entretanto leptospiras não são bem coradas por esse método, mas pela técnica de impregnação pela prata (FAINE, 1965). Elementos como vitaminas B1 e B12, ácidos graxos de cadeia longa e sais de amónio são necessários na composição dos meios de cultura para crescimento do micro-organismo (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). O gênero Leptospira, que pertence à família Leptospiraceae, ordem Spirochaetales, compreende tanto espécies saprófitas (L. biflexa sensu lato) como patogênicas (L. interrogans sensu lato). A classificação sorológica das leptospiras está baseada na expressão dos epítopos expostos do lipopolissacarídeo (LPS) (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Com o advento das metodologias moleculares, Yasuda e colaboradores (1987) propuseram sete novas espécies de Leptospira, relacionadas à homologia de DNA, devido à grande heterogeneidade entre estas. Porém a classificação sorológica não se correlacionou bem com a identificação de espécies por

19 19 métodos moleculares (LEVETT, 2001). Na reunião do Subcomitê de Taxonomia de Leptospiraceae, no ano de 2007, foi decidido dar o status de espécies segundo a classificação molecular, dando como resultado 13 espécies de leptospiras patogénicas (L. alexanderi, L. alstonii, L. borgpetersenii, L. inadai, L. interrogans, L. fainei, L. kirschneri, L. licerasiae, L. noguchi, L. santarosai, L. terpstrae, L. weilii e L. wolffi), com mais de 260 serovares, além das espécies saprófitas (L. biflexa, L. meyeri, L. yanagawae, L. kmetyi, L. vanthielii e L. wolbachii) (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). 2.2 LEPTOSPIROSE EM OVINOS Existe um grande número de animais hospedeiros que mantêm Leptospira, principalmente nos túbulos renais e, também, no trato genital (ELLIS, 1994; GROOMS; BOLIN, 2005). Apesar de ratos e camundongos serem reconhecidos como os principais hospedeiros na epidemiologia da leptospirose, existem outros mamíferos que podem ser portadores e, assim, fonte de infecção da doença (MIRAGLIA et al., 2012). Entre esses se encontram os ovinos (LILENBAUM et al., 2009). Os animais podem ser divididos em hospedeiros de manutenção e hospedeiros incidentais. Quando um serovar está adaptado a uma determinada espécie animal, a doença pode se apresentar de forma assintomática ou com sintomatologia leve, moderada e crônica, e os animais são considerados hospedeiros de manutenção. Estes são capazes de eliminar leptospiras em grandes quantidades no meio ambiente, durante meses ou anos (LEVETT, 2001). Animais considerados hospedeiros incidentais terão geralmente mais sinais clínicos e sintomatologia de forma aguda já que a doença é causada por serovares que não estão adaptados a essas espécies animais (GUERRA, 2009). Por exemplo, entre os serovares com hospedeiros de manutenção podem-se destacar, Canicola em cães (SUEPAUL et al., 2010), Bratislava em cavalos (PINNA et al., 2012; PINNA et al., 2010), Pomona em suínos e Hardjo em ruminantes (ELLIS, 1994; GROOMS, 2006). O serovar Pomona, mantido pelos suínos, por exemplo, apresenta-se como a fonte mais importante de

20 20 infecção incidental (surtos) para o gado na América do Norte, Austrália e Nova Zelândia, sendo que Grippotyphosa constitui outro agente importante que atua de forma incidental nos rebanhos (ELLIS, 1994). Em referência aos ovinos, Vermunt e colaboradores (1994) estudaram três surtos determinados pelo serovar Pomona. Estes se apresentam de forma aguda e esporádica. Portanto, a baixa prevalência geral do serovar Pomona junto a outras características da doença, forneceu mais uma prova da natureza incidental da infecção com este serovar em ovinos (DORJEE et al., 2008). Por sua vez, os achados de Blackmore, Bahaman e Marshall (1982) mostraram que ovinos são suscetíveis e é possível ocorrer infecção esporádica com Hardjo, mas que não pode ser considerada endêmica já que, como houve gado bovino em contato com os ovinos, os primeiros eram os hospedeiros principais e fonte de infecção para os ovinos. Reforçando essa ideia, os pequenos ruminantes foram citados como animais com menor suscetibilidade a leptospirose e, portanto, considerava-se que não atuavam como hospedeiros primários (LEON-VIZCAINO et al, 1987). No entanto, relatos de leptospirúria do serovar Hardjo em ovinos sem contato com bovinos estabeleceram que Hardjo pudesse estar adaptado a estes pequenos ruminantes, tornando-os importantes na manutenção e disseminação da leptospirose dentro dos rebanhos (HATHAWAY; MARSHALL, 1979; GORDON, 1980; COUSINS et al., 1989; GERRITSEN et al., 1994). Deste modo, a persistência de uma infecção assintomática com Hardjo em ovinos sugere uma adaptação deste serovar nesta espécie animal (DORJEE et al., 2008). Em geral, hospedeiros de manutenção que se recuperam dos sintomas da leptospirose podem tornar-se portadores assintomáticos. Nestes, leptospiras estão localizadas nos túbulos renais por prolongados períodos e são eliminadas pela urina no meio ambiente (LEVETT, 2001). Outro aspecto a considerar é que leptospiras não sobrevivem em urina ácida, mas podem permanecer viáveis quando esta é alcalina. Em consequência, herbívoros e outros animais cuja dieta produz urina com este perfil, são relativamente mais importantes como disseminadores do agente do que animais de urina ácida (HARTSKEERL et al, 2011). Portanto, os ruminantes costumam atuar como hospedeiros de manutenção do serovar Hardjo, eliminando o agente ao meio

21 21 ambiente por longos períodos, de forma intermitente, sem apresentar necessariamente sinais clínicos graves, atuando como portadores ou reservatórios (HERNÁNDEZ-RODRÍGUEZ et al., 2011). Este serovar está normalmente presente em animais que apresentam sinais clínicos como transtornos reprodutivos crônicos, como abortamentos, natimortos e crias fracas com altas taxas de mortalidade nos primeiros dias de nascimento (ELLIS, 1994; GERRITSEN et al. 1994), além de mastite e agalactia em ovelhas (MCKEOWN; ELLIS, 1986). Os animais sororreativos com uma infeção recente apresentam títulos aglutinantes entre 100 e 200 (ELLIS, 1994). Tanto nos bovinos como nos ovinos, duas estirpes do serovar Hardjo, sorologicamente idênticos, mas geneticamente distintos, foram identificados: Leptospira interrogans serovar Hardjo (Hardjoprajitno) e Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo (Hardjobovis). Destes, Hardjobovis parece estar mais bem adaptada do que Hardjoprajitno, sendo comum no gado de todo o mundo. Em sua revisão, Ellis (ELLIS, 1994; GROOMS, 2006) relata que Hardjoprajitno foi isolado no Reino Unido, Nigéria, Índia, Malásia, Brasil, México e Estados Unidos. A leptospirose em ovinos foi relatada pela primeira vez em 1950 na Nova Zelândia (HARTLEY, 1952). O autor relatou dois surtos causados pelo serovar Pomona e diagnosticados por achados da necropsia (icterícia generalizada, fígado marrom-amarelado, rins com uma coloração marrom em particular no córtex e vesícula urinária com urina rosada). Na histopatologia, quando avaliado pela coloração de Levaditi, observou-se leptospiras no fígado e nos rins. As alterações com microscopia eletrônica, ocorridas nos túbulos renais de ovinos experimentalmente infectados com Leptospira serovar Pomona também foram estudadas (MARSHALL, 1974). No entanto, somente em estudos posteriores foi demostrada a presença do serovar Hardjo nos rebanhos ovinos (BLACKMORE et al., 1982; GORDON, 1980; HATHAWAY et al., 1982; MCCAUGHAN et al., 1980; RIS, 1975).

22 Leptospirose: inquéritos sorológicos No que se refere à soroprevalência observada em diversos países, verifica-se que a leptospirose em ovinos está bastante disseminada (Quadro 1). Na Europa, verificou-se na Itália, 6,1% a 12,3% dos ovinos estudados eram reativos (CERRI et al., 2003; CICERONI et al., 2000), e na Espanha, 1,7% dos casos de abortamento foram causados por leptospirose (LEON-VIZCAINO et al., 1987), enquanto na Polônia não se verificou evidência de infeção por Hardjo (KRAWCZYK, 2005). Na Grécia, 5,7% dos animais foram sororreativos (BURRIEL et al., 2003), assim como na Turquia, onde 8% dos ovinos apresentaram sororreatividade (OZDEMIR; EROL, 2002). Também na Ásia e Oceania a leptospirose em ovinos é comum. No Irã, detectou-se a presença de anticorpos anti-leptospira spp. em 14,9% dos ovinos, sendo Pomona (43,8%) o principal serovar encontrado (HAJI HAJIKOLAEI et al., 2007), enquanto na Nova Zelândia, cerca de 20% dos animais apresentaram sororreatividade contra Hardjo (BLACKMORE et al., 1982) e na Austrália, 42% dos ovinos apresentaram reatividade (ELLIS et al., 1994). A prevalência da leptospirose parece ser baixa em ovinos do Canadá (1%), mas nos EUA a presença de aglutininas em cordeiros foi bem maior (até 61,7%) (KINGSCOTE, 1985). Já no Chile, foi estimada em 5,7% (ZAMORA et al., 1999), enquanto na Argentina 20% dos ovinos apresentaram sororreatividade (DRAGHI et al., 1984).

23 23 QUADRO 1 - Ocorrência de aglutininas anti-leptospira em ovinos em diversos países no período de 1984 a 2007, diagnosticada pelo teste da soroaglutinação microscópica (SAM). Continente País Amostras reativas Referência (%) Itália 6,1-12,3 CICERONI et al., 2000; CERRI et al., 2003 Espanha 1,7 LEON-VIZCAINO et al., 1987 Europa Polônia 0,6 KRAWCZYK, 2005 Grécia 5,7 BURRIEL et al., 2003 Turquia 8,0 OZDEMIR; EROL, 2002 Ásia Irã 14,9 HAJI HAJIKOLAEI et al., 2007 N. Zelândia 18,5 BLACKMORE et al., 1982 Oceania Austrália 42,0 ELLIS et al., 1994 Canadá 1,0 KINGSCOTE, 1985 América EUA 61,7 KINGSCOTE, 1985 Chile 5,7 ZAMORA et al., 1999 Argentina 20,0 DRAGHI et al., Leptospirose: inquéritos sorológicos no Brasil A detecção de anticorpos anti-leptospira indica exposição ao organismo, vacinação ou presença de anticorpos maternos, no caso de animais com menos de seis meses de idade (MALONE et al., 2010). Uma vez que inquéritos sorológicos são necessários para conhecer cada situação em particular, foram realizados vários estudos para quantificar a infecção por leptospiras em ovinos no Brasil (Quadro 2) (AGUIAR et al., 2010). Além disso, os ovinos têm importância econômica e social destacada nas economias das regiões Sul e Nordeste do país, e em expansão na região Sudeste (CARVALHO et al., 2011). Na região Nordeste, na Paraíba observou-se apenas 5,4% de sororreatividade, sendo Autumnalis o serovar mais frequente (ALVES et al., 2012), similar sororreatividade foi observada em Rio Grande do Norte (AZEVEDO et al., 2004), onde verificou-se 3,5% com predominância de

24 24 Castellonis. Por sua vez, no Piauí, a taxa de ocorrência de anticorpos anti- Leptospira foi de 28,6% (CARVALHO et al., 2011), onde os resultados sorológicos indicaram maior importância para Autumnalis. Na região Norte, 33,3% dos animais estudados apresentaram sororreatividade, sendo que 80,0% das propriedades apresentaram pelo menos um animal reagente. Os principais serovares detectados foram Patoc (29,7%) seguido de Autumnalis (14,8%) (AGUIAR et al., 2010). Na região Centro-Oeste do Brasil, um estudo conduzido com amostras do Distrito Federal determinou que apenas 3,0% dos animais foram soropositivos, com predomínio de Hardjo (SEIXAS et al., 2011). A infecção parece estar mais disseminada nos estados do Sul e Sudeste. No Rio Grande do Sul, a soroprevalência chega a 34,3% (HERMANN et al., 2004), e 83,1% dos rebanhos apresentam pelo menos uma amostra sororreativa. O serovar Hardjo foi o mais prevalente (30,1%) dos soros reativos. No que se refere à região Sudeste do Brasil, foram obtidas amostras em dois abatedouros em São Paulo, sendo que 18,7% dos animais apresentaram sororreatividade, principalmente ao serovar Copenhageni (DA SILVA et al., 2012). Outro estudo desenvolvido em várias espécies animais, teve como resultado 0,7% de soropositividade para Icterohaemorrhagiae em ovinos (FAVERO et al., 2002). Por outro lado, em Minas Gerais, observou-se uma soroprevalência em ovinos de 22,2% com predominância de Hardjo, sendo apenas 16,7% (2/12) das propriedades estudadas consideradas livres de animais sororreativos (SALABERRY et al., 2011). No caso do Rio de Janeiro, Lilenbaum e colaboradores encontraram 13,7% de animais sororreativos, sendo o sorogrupo Sejroe (representado pelo serovar Hardjo) o mais comum (LILENBAUM et al., 2009). Apenas três anos depois, um estudo desenvolvido com uma população semelhante do mesmo estado, apresentou uma sororreatividade de 47,4% ovinos, sendo o serovar Hardjo o mais frequente (50%) (MARTINS et al., 2012a). Além disso, apesar de a sororreatividade a um serovar não significar necessariamente que o animal está clinicamente doente, este estudo sugeriu que a leptospirose está amplamente disseminada entre rebanhos ovinos, sendo a doença mais frequente, e prejudicando a

25 25 produtividade em pequenos ruminantes no Rio de Janeiro (MARTINS et al., 2012a). Baseado nestes inquéritos foi evidenciado que a infecção em pequenos ruminantes por Leptospira é na maioria dos casos associada à presença do serovar Hardjo, ou ao menos a membros do sorogrupo Sejroe. Adicionalmente, membros deste sorogrupo representam os maiores responsáveis pelas perdas reprodutivas em bovinos e ovinos no Brasil (HERMANN et al., 2004). QUADRO 2 - Ocorrência de aglutininas anti-leptospira em ovinos das diversas regiões no Brasil, diagnosticadas pelo teste da soroaglutinação microscópica (SAM). Região Sororreatividade Sorogrupo (%) predominante Referência 5,4 Autumnalis ALVES et al., 2012 Nordeste 28,6 Autumnalis CARVALHO et al., ,5 Castellonis AZEVEDO et al., 2004 Norte 33,3 Patoc/Autumnalis AGUIAR et al., 2010 Centro-Oeste 3,0 Sejroe SEIXAS et al., 2011 Sul 34,3 Sejroe HERMAN et al., ,7 Copenhageni DA SILVA et al., ,4 Sejroe MARTINS et al., 2012a Sudeste 22,2 Sejroe SALABERRY et al., ,7 Sejroe LILENBAUM et al., ,7 Icterohaemorrhagiae FAVERO et al., Leptospirose: Isolamento de cepas em ovinos Existem poucas pesquisas que relatam o isolamento de Leptospira em ovinos infectados naturalmente. Na Nova Zelândia (BAHAMAN et al., 1980; DORJEE et al., 2008), no Canada (KINGSCOTE, 1985), na Espanha, a partir de abortos (LEON-VIZCAINO et al., 1987), na Australia, a partir de urina (COUSINS et al., 1989), na Holanda, a partir de urina e rim (GERRITSEN et al., 1994), e na Itália, a partir de rins, mas não de trato genital de ovelha (CERRI et al., 1996) isolaram-se amostras de leptospiras. Já no Brasil, os únicos relatos

26 26 de isolamento de leptospiras a partir de amostras de ovinos são provenientes de rins ou fígados, em um abatedouro na Paraíba (AZEVEDO et al., 2004), em Pelotas, RS (SILVA et al., 2007) e São Paulo (DA SILVA et al., 2012) Leptospirose no trato genital De maneira geral, investiga-se a eliminação renal de leptospiras, mas o estudo destes micro-organismos no trato genital é importante e deve ser considerado, especialmente, em nível de rebanhos (FAINE et al., 2000). Estudos foram feitos sobre a possibilidade da transmissão venérea de Leptospira spp., seja avaliando a presença do micro-organismo no sêmen e trato genital masculino de várias espécies animais, como caninos (KIM et al., 2006), bovinos (ELLIS; CASSELLS; DOYLE, 1986; HEINEMANN et al., 2000; KIKTENKO et al., 1976; MASRI et al., 1997), suínos (ELLIS; THIERMANN, 1986a; RAMOS et al., 2006; ELLIS et al., 1986a; ELLIS et al., 1985) e pequenos ruminantes (FARINA et al.,1996; LILENBAUM et al., 2008). Já no trato genital de fêmeas, a presença de leptospiras foi verificada em bovinos (DHALIWAL et al., 1996; ELLIS et al., 1986b; ELLIS; THIERMANN, 1986b). No entanto, poucos estudos têm sido desenvolvidos com enfoque na transmissão venérea de leptospiras em ovinos (CERRI et al., 1996; FARINA et al.,1996; LILENBAUM et al., 2008). Em pequenos ruminantes, Lilenbaum e colaboradores (2008) demonstraram a presença de leptospiras por microscopia de campo escuro e de DNA leptospírico por PCR em fluido vaginal e sêmen tanto de ovinos quanto de caprinos. Esses fatos suportam a hipótese de que a presença de leptospiras no trato genital de ovinos é possível e que uma potencial transmissão venérea das leptospiras pode ocorrer nesta espécie. No ano de 1961, Sleight e colaboradores demonstraram, de forma natural e experimental, a presença de Leptospira no sêmen de touros infectados, indicando a possibilidade de transmissão da leptospirose bovina por coito ou por inseminação artificial (SLEIGTH; WILLIAMS, 1961 apud MAGAJEVSKI et al., 2005). Posteriormente demonstrou-se a presença de anticorpos IgG e IgA contra Hardjo na descarga genital de vacas naturalmente infectadas, o que sugeriu que a transmissão pode ocorrer de forma venérea, já

27 27 que a IgA é produzida na superfície das mucosas. Adicionalmente, o estudo conseguiu demonstrar a presença do agente nas secreções genitais por imunofluorescência direta (DHALIWAL et al., 1996). 2.3 MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Métodos indiretos Teste de soroaglutinação microscópica (SAM) O reconhecimento da infeção por Leptospira spp. e a epidemiologia da leptospirose é classicamente descrita com base em dados sorológicos (HAJI HAJIKOLAEI et al., 2007; MARTINS et al., 2012b). O método de referência para o diagnóstico sorológico da leptospirose é o teste de soroaglutinação microscópica (SAM), que é capaz de determinar o sorogrupo envolvido (LEVETT, 2001). O teste baseia-se na soroaglutinação microscópica com antígenos vivos e leitura em microscópio equipado com condensador de campo escuro (FAINE et al., 2000). É um teste indireto, que não detecta a presença do micro-organismo e sim de anticorpos contra a bactéria. A SAM é mais utilizada como screening (triagem) do rebanho, ao invés do diagnóstico individual, devido que este teste tem alto nível de sensibilidade e menor especificidade (ELLIS, 1994; OTAKA et al., 2012). Os anticorpos começam a aparecer entre sete e 10 dias após a infeção. Assim, o teste não indica se a infecção é ativa, a menos que o título alcançado seja notavelmente alto ou por meio de sorologia pareada (ELLIS, 1994). Portanto, a detecção dos anticorpos acontece no final da fase aguda quando o tratamento com antibióticos poderia ser menos eficaz (AHMED et al., 2009). Além disso, o resultado sorológico normalmente conflita com resultados de métodos diretos, quando estes são comparados, uma vez que um animal sororreativo, não é, necessariamente, um portador da bactéria. Adicionalmente a taxa de portadores ou carreadores pode ser muito diferente da prevalência de animais soropositivos (FAINE, 1962). Assim, animais que não se apresentam sororreativos na SAM, podem ser portadores e o estado de portador pode não ser detectado em animais com resultados soronegativos

28 28 (OTAKA et al., 2012). Por outro lado, a ausência de níveis detectáveis de anticorpos séricos em alguns animais infectados faz com que o método, por ser indireto, seja ineficiente (ELLIS, 1994). O lipopolissacarídeo de superfície (LPS) é o principal antígeno reconhecido pelo animal convalescente e a imunidade após infecção é restrita a serovares com LPS sorologicamente relacionados (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Embora a SAM ainda seja o teste de referência para o diagnóstico de leptospirose (OIE, 2008), ela não é uma técnica precisa. Pode ser influenciada pela produção de anticorpos induzidos pela vacinação, possibilitando o aparecimento de resultados falsos positivos, o que diminui a especificidade do teste; além da subjetividade da interpretação dos resultados e da falta de um ponto de corte preciso (PALANIAPPAN et al, 2007; ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Por exemplo, um estudo na Colômbia demonstrou não haver correlação direta entre resultados sororreativos ou negativos no diagnóstico sorológico da doença (HERNÁNDEZ-RODRÍGUEZ et al., 2011) e, em ovinos, títulos verificados de 100 a 400 poderiam caracterizar infecção na fase crônica (CICERONI et al., 2000; ELLIS, 1994). Além disso, para realizar o SAM é necessário haver culturas vivas de diferentes sorogrupos e serovares locais da região em estudo (FAINE, et al., 2000). No entanto, a SAM é, ainda, amplamente utilizado como método de diagnóstico em nível de rebanho, mas a ausência de níveis detectáveis de anticorpos séricos em alguns animais infectados confere uma menor sensibilidade aos métodos indiretos (MIRAGLIA et al., 2012). Além disso, esta metodologia mostra-se importante para a compreensão da epidemiologia da doença, uma vez que, a sugestão de um sorogrupo infectante possibilitaria a organização de estratégias de prevenção orientadas contra as leptospiroses, tanto endêmica como epidêmica.

29 Métodos Diretos Cultura bacteriológica - Isolamento Leptospiras vêm sendo isoladas de vários hospedeiros diferentes, entre os quais se incluem equinos (ROCHA, 2004), bovinos (ELLIS et al., 1986b), pequenos ruminantes (AZEVEDO et al., 2004; LILENBAUM et al., 2007; SILVA et al., 2007), suínos (MIRAGLIA et al., 2008; SHIMABUKURO et al., 2003), cervídeos (SUBHARAT et al., 2010), caninos, roedores (SUEPAUL et al., 2010) e humanos (LEVETT et al., 2006; TURK et al., 2009). Para um melhor esclarecimento a respeito da epidemiologia da doença, o isolamento de cepas locais é necessário, visto que apenas após a obtenção das mesmas é possível tipificar e caracterizar as espécies e os serovares de uma região ou rebanho, e inclui-los no grupo de antígenos utilizados nas análises sorológicas, além de produzir e usar vacinas homólogas específicas para os animais dessa região. Vários meios líquidos enriquecidos com soro de coelho já foram descritos na tentativa de isolar o micro-organismo (FAINE et al., 2000). Atualmente, o meio liquido mais amplamente utilizado é o Ellinghausen- McCullough-Johnson-Harris (EMJH), que contém ácido oleico ou outros ácidos de cadeia longa (polisorbatos) e 1% de albumina de soro bovino (BSA, que é usado como desintoxicante) (ELLINGHAUSEN, 1983). Entre os meios semissólidos foram descritos: Noguchi (NOGUCHI, 1918), Korthoff (SHENBERG, 1967) e Fletcher (FLETCHER, 1928), sendo este último o mais utilizado. Nos meios semissólidos, o crescimento atinge uma densidade máxima em uma zona discreta abaixo da superfície do meio, o qual se torna cada vez mais turva à medida que prossegue a incubação. Este crescimento está relacionado com a tensão de oxigénio ótima e é conhecido como um anel ou disco de Dinger (LEVETT, 2001). Devido à possibilidade de contaminação, as culturas devem ser verificadas, inicialmente, depois de três ou quatro dias (BHARTI et al., 2003). O crescimento de contaminantes em amostras clínicas pode ser inibido com a adição de 5-fluorouracil (JOHNSON, 1989), gentamicina, ácido nalidíxico ou

30 30 rifampicina (FAINE et al., 2000). Por sua vez, culturas contaminadas com pequenas quantidades de outros micro-organismos podem ser subcultivadas a partir de várias diluições seriadas replicadas. Outro método para a purificação de culturas contaminadas é a filtração, que consiste na remoção de contaminantes ao passar o meio com leptospiras através de um filtro de 0,2 μm, que retém a maioria das outras bactérias (WHO, 2003). Geralmente, o crescimento destes micro-organismos é lento em isolamento primário, as culturas têm que ser mantidas por 13 semanas ou mais antes de serem descartadas (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Leptospiras podem ser eliminadas pela urina de animais infectados de forma aguda. Por sua vez, portadores crônicos podem eliminar esta bactéria por meses ou anos (FAINE et al., 2000), mas o isolamento deste microorganismo a partir da urina, outros fluidos (MAGAJEVSKI et al., 2005), tecidos de animais ou abortos (LEON-VIZCAINO et al., 1987) é trabalhoso e com resultados incertos. A sobrevivência de Leptospira spp. em urina (assim como em outros fluidos corporais) é limitada, de modo que as amostras devem ser processadas imediatamente após a colheita (BAL et al., 1994). As culturas devem ser incubadas a C e examinadas semanalmente por microscopia de campo escuro (BHARTI et al., 2003) Métodos moleculares Apesar da cultura bacteriológica ser considerada o método padrão para o diagnóstico da leptospirose, existem várias situações onde as abordagens moleculares devem ser consideradas quando a cultura convencional não consegue identificar o organismo causal (MILLAR et al., 2007). As vantagens dos testes baseados na detecção de DNA em relação aos métodos microbiológicos são a possibilidade de obtenção de resultados rápidos, baixos limites de detecção (teoricamente uma única célula), e a detecção do organismo específico (MOTHERSHED; WHITNEY, 2006). Para entender de forma simples e básica, a PCR é utilizada para amplificar sequências específicas de DNA (CHANDLER; COLITZ, 2006). Nesse contexto, a PCR depende da temperatura e de uma enzima (Polimerase), além de outros compostos e minerais, para replicação de uma sequência específica

31 31 de DNA in vitro. O princípio da PCR baseia-se em ciclos repetitivos de três reações, sendo a desnaturação a elevação da temperatura para cerca de 95 C e separação do molde do DNA em duas cadeias simples; anelamento a diminuição da temperatura para 55 C (aproximadamente), quando os primers se ligam ao molde de DNA complementar; e extensão, elevação da temperatura para 72 ºC, quando a enzima sintetiza a cadeia complementar de todos os DNA molde (MILLAR et al., 2007). No que diz respeito ao diagnóstico de doenças infecciosas, a PCR é uma técnica muito útil, uma vez que pode ser usada para a detecção de agentes fastidiosos, micro-organismos em culturas com menos tempo de incubação e para detectar a presença de organismos a partir de amostras clínicas sem a necessidade de DNA purificado. Portanto, não são necessárias culturas puras (MOTHERSHED; WHITNEY, 2006), fator importante no caso de leptospiras. Como vantagem adicional, as amostras utilizadas na PCR podem ser conservadas por congelamento (BAL et al., 1994; VAN EYS et al.,1989) ou fixadas em formalina-parafina (D ANDREA et al., 2012), enquanto para a realização da cultura é preferível a utilização de amostras recém-colhidas. A existência de animais negativos na cultura, mas positivos na PCR das amostras podem refletir uma maior sensibilidade da PCR, seja o fato de que a PCR detecta o DNA de bactérias mortas ou a contaminação da amostra (AHMED et al., 2009; BAL et al., 1994; YERSIN et al., 1999). Adicionalmente, a PCR apresenta-se como uma ferramenta de diagnóstico precoce quando comparada com a sorologia, por exemplo. Uma vez que a primeira possibilita a detecção direta do agente ainda na primeira fase da infecção (leptospiremia 3-10 dias), enquanto a detecção de anticorpos anti-leptospira ocorre normalmente de cinco a sete dias após a exposição ao agente (BROWN et al., 1995). Neste estudo a presença de DNA leptospiríco foi demonstrada em 13/71 pacientes, antes do desenvolvimento de anticorpos, assim como em dois pacientes soronegativos durante todas as fases da doença. Em relação ao diagnostico da leptospirose, a PCR já foi utilizada nos equinos (HAMOND et al., 2012), bovinos (OTAKA et al., 2012), ovinos e caprinos (LILENBAUM et al., 2009), suínos (SHIMABUKURO et al., 2003),

32 32 humanos (GRAVEKAMP et al., 1993), e animais silvestres (VIEIRA et al., 2011). É utilizada com amostras de diversos tecidos, seja em sangue (GRAVEKAMP et al., 1993), líquido cérebro-espinhal (LEVETT, 2001), urina (VAN EYS et al.,1989; OTAKA et al., 2012), em abortos (RICHTZENHAIN et al., 2002), sêmen e fluidos vaginais (LILENBAUM et al., 2008), rim e fígado (SHIMABUKURO et al., 2003). Outros estudos inocularam leptospiras a diversos fluidos para avaliar o uso da PCR e os limites de detecção nesses fluidos (HEINEMANN et al., 2000; MAGAJEVSKI et al., 2005). Destes, Heinemann e colaboradores (2000) coletaram amostras de sêmen de um touro e o contaminaram com leptospiras. Este grupo detectou um limite de 100 bactérias/mililitro (bac/ml) de sêmen. Utilizando a técnica de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) conseguiu diferenciar serovares de Leptospira spp. Desta forma, concluíram que esta estratégia pode representar uma ferramenta útil para a rápida detecção e diferenciação de serovares de Leptospira spp. de sêmen bovino. Magajevski e colaboradores (2005) avaliaram a técnica de PCR para a detecção de leptospiras na urina e sêmen de touros sorologicamente reagentes para Hardjo. Apesar de que o estudo conseguiu isolar leptospiras a partir de fígado e rim de hamster após a inoculação intraperitoneal de sêmen, nenhuma das amostras de sêmen teve resultado positivo pela PCR. Vários protocolos têm sido desenvolvidos para a detecção de DNA leptospírico mediante o uso da PCR desde a década de Entre eles se destacam os estudos de Van Eys e colaboradores (1989) e Gerrtisen e equipe (1991), que desenvolveram a PCR para a detecção de leptospiras em amostras de urina. Como o gene rrs (16S rrna) é encontrado em todas as bactérias e contém conservadas certas regiões da sequência, este é usado, frequentemente, na PCR para a detecção de DNA de micro-organismos (MILLAR et al., 2007). No ano de 1992, Mérien e colaboradores relataram o desenvolvimento da PCR para a detecção de DNA de leptospiras, baseada na amplificação do gene rrs (16S), não sendo possível naquele momento a distinção entre leptospiras saprófitas e patogênicas, considerando o baixo desvio na sequencia deste gene (AHMED et al., 2009).

33 33 Por sua vez, foi desenvolvido uma PCR em tempo real (Taqman), desenhando primers para o gene LipL32 (STODDARD et al., 2009). Este gene de Leptospira spp. codifica uma lipoproteína da membrana externa que é considerada um fator de virulência, não estando assim, presente em espécies não-patogênicas. É exclusiva, e altamente conservada entre leptospiras patogênicas, mas a expressão destas proteínas pode ser perdida nos repiques sucessivos no laboratório, com perda concomitante de virulência (HAAKE et al., 2000). Neste contexto, o aumento na utilização da PCR para o diagnóstico da leptospirose resultou em uma melhoria no diagnóstico rápido da doença, mas reduz seu valor para investigação epidemiológica (PEREZ; GOARANT, 2010). Por isso, para determinar a espécie infectante, é possível o uso dos polimorfismos nos fragmentos copiados de DNA. Estudo de locus S10-spc demostrou que este é altamente conservado nas espécies do gênero Leptospira, sendo que a sequência do gene secy, de 245 bp, é de valor diagnóstico e tem potencial para soluções das questões taxonômicas no que diz respeito a Leptospira spp. (VICTORIA et al., 2008; ZUERNER et al., 2000). Este gene codifica uma pré-proteina (translocase), e consiste em regiões conservadas e variáveis de forma alternada, o que resulta adequado para desenvolver primers que gerem amplicons com suficiente heterogeneidade na sequência para permitir a interpretação filogenética de leptospiras. Por sua vez, Ahmed e colaboradores (2009) desenvolveram uma PCR em tempo real com primers específicos para o gene secy e detectaram somente leptospiras patogênicas. Por sua vez, varias sequências repetidas, incluindo sequências de inserção, foram encontrados em genomas de algumas espécies de Leptospira sp. A análise do número variável de sequências repetidas (VNTR Variable Number of Tandem Repeats,) é uma metodologia que se baseia na existência destas sequências repetitivas, sendo que podem ser encontradas em um único locus. Este método consiste em amplificar essas regiões, que por sua vez mostram polimorfismo, para que seja possível diferencia-las de acordo com o tamanho do amplicon. Essa metodologia vem sendo empregada na caracterização de leptospiras, principalmente nas espécies L. interrogans e L.

34 kirshneri (CERQUEIRA; PICARDEAU, 2009; PAVAN et al., 2011; SALAÜN et al., 2006). 34

35 35 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Demonstrar a possibilidade de detecção de carreadores renais e genitais de Leptospira sp. em ovinos por meio de ferramentas moleculares, de modo a contribuir de forma significativa para o diagnóstico da leptospirose nestes animais. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS I. Isolar o agente infeccioso em amostras de urina e sêmen/fluido vaginal de animais em idade de reprodução. II. Caracterizar os isolados por métodos sorológicos e moleculares. III. Identificar o DNA leptospírico em amostras de urina e sêmen/fluido vaginal de animais em idade de reprodução oriundos de rebanhos sorologicamente reativos à leptospirose por PCR.

36 36 4 MATERIAL E MÉTODO O presente estudo foi submetido ao Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal Fluminense, sendo aprovado sob o nº 225, intitulado Diagnóstico de Leptospirose em pequenos ruminantes por provas moleculares (Anexo 1). 4.1 DESENHO DO ESTUDO O estudo foi desenvolvido em duas etapas: inicialmente, testes sorológicos foram realizados em rebanhos ovinos do estado do Rio de Janeiro. Assim, 156 ovinos de seis rebanhos localizados na região Metropolitana do estado do Rio de Janeiro foram selecionados. A triagem sorológica (SAM) dos rebanhos consistiu na coleta de sangue de um mínimo de 20% dos animais em rebanhos, com no mínimo 60 animais ou do total do rebanho em rebanhos com até 59 animais. No momento da colheita de amostras nenhum animal apresentava sintomas característicos de leptospirose aguda. Na etapa seguinte, considerando-se os resultados dos testes sorológicos, foram selecionados dois rebanhos. O primeiro (grupo de trabalho) apresentou índices elevados de sororreatividade (títulos 200). Este era composto por ovinos de raça Santa Inês, não vacinados contra leptospirose, sistema de criação do tipo semi-extensivo e cobertura por monta natural sendo

37 37 que todos os ovinos ficam soltos juntos todo o ano. Enquanto o segundo (grupo controle) apresentou resultados negativos. Este era composto por ovinos de raça Santa Inês e Dorper e ao igual que o primeiro grupo não estavam vacinados contra leptospirose, o sistema de criação era do tipo semi-extensivo com cobertura por monta natural sendo que todos os ovinos ficam soltos juntos todo o ano. Destes grupos, foram colhidas amostras de urina, fluido vaginal/sêmen para procedimentos bacteriológicos (isolamento) e para o ensaio molecular (PCR). Além disso, neste momento foi coletado sangue para a realização de um novo exame sorológico. Figura 1 - Desenho de estudo

38 LOCAL DE REALIZAÇÃO DO ESTUDO O estudo foi realizado no Laboratório de Bacteriologia Veterinária, pertencente ao Departamento de Microbiologia e Parasitologia do Instituto Biomédico da Universidade Federal Fluminense (UFF). Os ensaios moleculares foram realizados no Laboratório de Tecnologia Recombinante (LATER) de Bio- Manguinhos, FIOCRUZ. A caracterização molecular da amostra bacteriana obtida foi realizada na Unidade de Biologia de Espiroquetas, Instituto Pasteur, França (Unité de Biologie des Spirochétes, Institut Pasteur, França). 4.3 AMOSTRAS DE ANIMAIS Para o inquérito sorológico, o sangue foi coletado dos animais por punção da veia jugular, após antissepsia local com solução de álcool iodado a 2%. Utilizou-se agulhas 25 x 0,8 mm com seringas descartáveis ou tubos à vácuo sem anticoagulante (BD Brasil, Vacutainer, São Paulo, SP) com agulhas BD Vacutainer. As amostras de sêmen foram obtidas por eletroejaculação (Eletropulsador TK TK Reprodução, Uberaba, MG, Brasil) e coletadas em frasco estéril descartável de 50 ml, após a limpeza do prepúcio e das áreas adjacentes com agua. As amostras de fluido vaginal foram colhidas por meio do uso de tampão com aplicador (Tampax Regular, Proctoer and Gamble, São Paulo, SP, Brasil) introduzido na vagina com a ajuda de um espéculo estéril ou de forma manual. Depois de 10 minutos (min) dentro da vagina, o tampão foi removido e colocado em um frasco estéril contendo 20 ml de solução salina tamponada com fosfato, segundo Lilenbaum e colaboradores (2008). Após a coleta de sêmen ou fluido vaginal, as amostras de urina foram colhidas, sendo precedidas por uma limpeza na região do períneo e aplicação de furosemida (Teuto Brasileiro, Anápolis, Brasil) a uma dose de 0,5-1 miligramas por quilo (mg/kg). Foram recolhidos aproximadamente 20 ml de urina em frasco estéril descartável de 50 ml, após desprezar-se a primeira micção. Para a cultura bacteriológica, as amostras de urina e sêmen foram semeadas, 500 microlitros (μl) em 5 ml de meio líquido Ellinghausen-

39 39 McCullough-Johnson-Harris (EMJH) (Difco Laboratories, EUA) e meio semissólido Fletcher (Difco, Detroit, MI, EUA), logo após a coleta (a campo). Para a realização da PCR, as amostras foram adicionadas a criotubos (eppendorff ) com 100 μl de PBS. O sangue e as amostras de sêmen e urina para PCR foram refrigerados, enquanto os tampões em PBS e os meios de cultura semeados foram transportados ao laboratório a temperatura ambiente. 4.4 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS Para a sorologia as amostras de sangue foram centrifugadas a 800 x g por 10 min e o soro foi extraído, identificado e armazenado em microtubos de 1,5 ml a -20 C, até a realização da SAM. Já para a cultura e PCR, os tampões vaginais foram assepticamente espremidos e o líquido foi centrifugado a 3000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi utilizado para cultura bacteriológica e PCR. Para a primeira foram semeados 500 μl em 5 ml de meio EMJH e igual proporção para meio semissólido (Fletcher). Além disso, 1,4 ml deste sobrenadante foram adicionados a criotubos com 100 μl de PBS para a realização da PCR Sorologia Os exames sorológicos foram realizados por soroaglutinação microscópica. Como esta técnica utiliza antígenos vivos, esses foram mantidos em meio líquido (EMJH) de acordo com OIE (OIE, 2008). Para a manutenção das cepas utilizadas, foram feitos repiques semanais em EMJH e mantidas entre 28 e 30 C em estufa D.B.O. (Eletrolab, São Paulo, SP). A fim de verificar se estavam livres de autoaglutinação e contaminação, as culturas foram examinadas ao microscópio antes de cada exame. Os antígenos utilizados foram os mais comumente relatados na região estudada (LILENBAUM et al., 2007; MARTINS et al., 2012a; SOUZA et al., 2001) e estão apresentados no Quadro 3. Cada amostra de soro foi inicialmente diluída a 1:50 em solução salina. Desta diluição, foram incluídos 50 μl em uma microplaca de vinil de fundo

40 40 plano contendo 96 poços (Costar, Corning, NY, EUA), onde agregou-se o mesmo volume de cada antígeno correspondente, obedecendo à marcação das placas. Como resultado, foi obtida uma diluição final de 1:100. Em cada reação utilizou-se solução salina (NaCl 0,9%) como controle negativo. As microplacas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37 C por 90 min. A leitura de cada exame foi realizada em microscópico óptico (Zeiss, Standort Göttingen, Vertrieb, Alemanha), com condensador seco de campo escuro. Avaliou-se a formação de aglutinações, sendo as amostras classificadas de acordo com o resultado. As diluições realizadas foram 1:100, 1:200, 1:400 e 1:800, sendo consideradas positivas quando apresentaram título 200 e nível de aglutinação 50%. As amostras que apresentaram reatividade na última diluição foram classificadas como 800. Nas amostras que resultaram sororreativas para mais de um antígeno, considerou-se o serovar com maior frequência como o infectante. Quadro 3 Serovares de Leptospira sp. empregados como antígenos no teste da soroaglutinação microscópica (SAM) em amostras de ovinos do estado do Rio de Janeiro, Espécie Sorogrupo Serovar Amostra referência L. interrogans Icterohaemorrhagiae Copenhageni M 20 L. interrogans Sejroe Hardjo Hardjoprajitno L. interrogans Hebdomadis Hebdomadis Hebdomadis L. interrogans Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae RGA L. interrogans Pomona Pomona Pomona L. interrogans Sejroe Wolffi 3705

41 Cultivo bacteriológico Os meios de cultura semeados (urina, sêmen e fluido vaginal) foram incubados em estufa D.B.O entre 28 e 30 ºC e examinados com microscópio de campo escuro uma vez por semana. Todas as amostras suspeitas de conterem Leptospira, mas contaminadas com pequenas quantidades de outros microorganismos eram centrifugadas a 3000 rpm e filtradas com filtro de 0,22 μm (Millipore ) e novamente inoculadas em meio EMJH ou somente filtradas Técnicas moleculares Amostras clínicas Detecção do Gene LipL32 As amostras de urina, sêmen e fluido vaginal foram processadas para a realização da PCR. O DNA das amostras foi extraído pelo Wizard SV Genomic DNA Purification System (Promega, Madison, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante. Utilizaram-se primers desenhados por Stoddard e colaboradores (2009), para a detecção do gene LipL32 (presente apenas em leptospiras patogênicas): LipL32-45F (5 -AAG CAT TAC CGC TTG TGG TG-3 ) e LipL32-286R (5 -GAA CTC CCA TTT CAG CGA TT-3 ), os quais geram um fragmento de 242pb. Foi utilizado um volume de 25 µl de solução contendo: 300 micromolar (µm) de cada desoxinucleotídeo (Invitrogen, Carlsbad, EUA), 75 milimolar (mm) de TrisHCl, 50 mm de KCl, 20 mm de (NH 4 ) 2 SO 4, 2,4 mm de MgCl 2, 0,6 µm de cada primer (Integrated DNA Technologies, Coral ville, EUA), 1 unidade (U) de Taq DNA polimerase (Biotools B&M Labs, SA,Valle de Tobalina, Espanha) e 3,5 µl de DNA extraído da amostra clínica. Para cada conjunto de amostras, água ultrapura (UltraPure DEPC-treated Water, Invitrogen, Van Allen Way Carlsbad, CA, EUA) foi utilizada como controle negativo. Foram utilizados 10 fg de DNA extraído de Leptospira interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1130 como controle positivo. Todas as reações ocorreram no termociclador

42 Gene Amp PCR System 9700 (AppliedBiosystems, Foster City, EUA). O protocolo da reação consistiu no seguinte: Desnaturação inicial: 95 C / 2 min, 2. Desnaturação: 94 C / 30 segundos (s) 3. Anelamento: 53 C / 30 s 4. Extensão: 72 C / 30 s 5. Extensão final: 72 C / 5 min 6. Extensão: 4 C / T indeterminado 35 ciclos Cada amostra foi preparada para eletroforese com adição de 5 µl de tampão de corrida ( Loading buffer : 0,1% azul de bromofenol, glicerol e água destilada q.s.p.) em 25µl da reação. A seguir as amostras e o padrão de peso molecular (1 Kb DNA Ladder, Invitrogen TM ) foram aplicados em gel de agarose e submetidos a eletroforese com 5 V / cm 2 (110 V / 45 min) em uma cuba horizontal (Biorad Ampla Mini-Sub Célula GT, Hercules, CA, EUA) com tampão TAE 1x (40 mm Tris-acetado e 1 mm EDTA). Uma vez finalizada a eletroforese, os géis foram incubados em uma solução de brometo de etídio (0,5 µg/ml), analisados em transiluminador de luz ultravioleta (LTB - 21x26 HE, Loccus Biotecnologia, São Paulo) e fotografados no foto documentador (L-Pix HE, Loccus Biotecnologia, São Paulo, Brasil) para posterior análise dos resultados Amostras Bacterianas Detecção do Gene rrs (16S rrna) e secy A cultura do micro-organismo isolado a partir do fluido vaginal foi processada para a realização da PCR. Uma vez extraído o DNA, utilizaram-se primers desenhados por Mérien e colaboradores (1992), para a detecção do gene rrs (16S rrna): LA (5'-GGC GGC GCG TCT ITA AAC ATG-3') e LB (5'- TTC CCC CCA TTG AGC AAG ATT-3'), na PCR convencional. Após a confirmação da presença do gene na PCR, este amplicon foi utilizado na

43 43 reação de sequenciamento, utilizando-se os seguintes primes : LC (5'-CAA GTC AAG CGG AGT AGC AA-3') e RS4 (5'-TCT TAA CTG CTG CCT CCC GT- 3'). Já para a detecção do gene secy na PCR, utilizaram-se primers desenhados por Ahmed e colaboradores (2009): secyf (5'-ATG CCG ATC ATT TTT GCT TC-3') e secyr (5'-CCG TCC CTT AAT TTT AGA CTT CTT C-3'). Novamente, para o sequenciamento foram utilizados os primers : SecYIVF (5'- GCG ATT CAG TTT AAT CCT GC-3') e SecYIVR (5'-GAG TTA GAG CTC AAA TCT AAG-3'). O protocolo da PCR foi o mesmo tanto para a amplificação do gene rrs (16s rrna) quanto para secy, sendo assim: 5 µl de tampão 10X, 3 µl de MgCl2 25 mm, 4 µl de dntp (100 µm diluído 1/20), 1 µl de cada primer (10µM [100 µm diluído 1/10]), 0,2 µl rtaq (GE Healthcare Life Sciences, São Paulo, SP) 5U/µL e 33,8 µl de água ultra pura (q.s.p. 48 µl) (B. Braun Medical, Buenos Aires, Capital Federal, Argentina), além de 2 µl do DNA extraído. Para cada conjunto de amostras, foram incluídos um controle negativo (DNA substituído por água ultrapura), um controle positivo de amplificação (por exemplo, cepa Patoc) e um controle negativo da extração (extração de água ultrapura) realizado em paralelo com a extração de DNA. O protocolo da reação consistiu no seguinte: 1. Desnaturação inicial: 94 C / 3 min, 2. Desnaturação: 94 C / 30 segundos (s) 3. Anelamento: 55 C / 30 s 4. Extensão: 72 C / 45 s 5. Extensão final: 72 C / 5 min 35 ciclos Cada amostra foi preparada para eletroforese com adição de 5 µl de tampão de corrida ( Loading buffer : 0,1% azul de bromofenol, glicerol e água destilada q.s.p.) em 25 µl da reação. A seguir as amostras e o padrão de peso molecular (1 Kb DNA Ladder, Invitrogen TM ) foram aplicados em gel de agarose e submetidos a eletroforese com 5 V / cm 2 (110 V / 45 min) em uma cuba horizontal (Biorad Ampla Mini-Sub Célula GT, Hercules, CA, EUA) com tampão

44 44 TAE 1x (40 mm Tris-acetado e 1 mm EDTA). Uma vez finalizada a eletroforese, os géis foram incubados em uma solução de brometo de etídio (0,5 µg/ml), analisados em transiluminador de luz ultravioleta (LTB - 21x26 HE, Loccus Biotecnologia, São Paulo) e fotografados no foto documentador (L-Pix HE, Loccus Biotecnologia, São Paulo, Brasil) para posterior análise dos resultados. O tamanho das amplificações esperadas na PCR para o gene 16S eram de 331 pb e 201 pb para secy. Em seguida, as amostras positivas foram sequenciadas VNTR A cultura do micro-organismo isolado a partir do fluido vaginal foi processada para a realização da VNTR. Uma vez extraído o DNA, utilizaram-se primers desenhados por Salaün e colaboradores (2006), para o locus VNTR-4 4a_bis (5 -AAG TAA AAG CGC TCC CAA GA-3 ) e 4b_bis (5 -ATA AAG GAA GCT CGG CGT TT-3 ), para o locus VNTR-7, 7a_bis (5 -GAT GAT CCC AGA GAG TAC CG-3 ) e 7b (5 -TCC CTC CAC AGG TTG TCT TG-3 ), e para o locus VNTR-10, 10a_bis (5 -GAG TTC AGA AGA GAC AAA AGC-3 ) e 10b_bis (5 -ACG TAT CTT CAT ATT CTT TGC G-3 ). Como controle positivo, utilizouse uma cultura de Leptospira interrogans Canicola e como negativo, meio de cultura estéril. O protocolo da reação consistiu no seguinte: 1. Desnaturação inicial: 94 C / 5 min, 2. Desnaturação: 94 C / 30 segundos (s) 3. Anelamento: 55 C / 30 s 4. Extensão: 72 C / 60 s 5. Extensão final: 72 C / 10 min 35 ciclos Os produtos amplificados foram aplicados por eletroforese em gel de agarose 1%, onde foram submetidos a eletroforese com 5 V / cm 2 (110 V / 120 min) com tampão TBE 1x (Tris-Base 89 mm, Ácido Bórico 89mM, EDTA 2 mm). Uma vez finalizada a eletroforese, os géis foram incubados em uma solução de

45 45 brometo de etídio (0,5 µg/ml), analisados em transiluminador de luz ultravioleta e fotografados para posterior análise dos resultados. Os tamanhos dos fragmentos amplificados foram estimados por comparação com uma escada de 100 pb (1 Kb DNA Ladder, InvitrogenTM) Sorogrupagem Esta metodologia objetiva estimar o sorogrupo ao qual pertencem amostras bacterianas de Leptospira. Consiste em uma soroaglutinação microscópica realizada de forma inversa, na qual se utilizam antissoros (anticorpos anti-leptospira) conhecidos para determinar a qual sorogrupo pertence o micro-organismo isolado. Esta foi empregada da seguinte maneira: cada antissoro liofilizado, representando cada sorogrupo testado, foi reconstituído com água destilada em volume específico, descrito pelo fabricante (Royal Tropical Institute, Amsterdam, Holanda). A seguir, foram realizadas diluições dos antissoros na proporção 1:25, desta vez com solução salina (0,9%). Um total de 500 µl desta solução (1:25), foram separadas 10 alíquotas de 50 µl. Cada uma destas foi diluída por fim em 750 µl de solução salina, obtendo-se a uma diluição final de 1:400. Após esta etapa, foram incluídos 80 µl de cada solução 1:400 referente a cada antissoro (Quadro 4) em uma microplaca de vinil de fundo plano contendo 96 poços (Costar, Corning, NY, EUA) com 80 µl da cultura isolada (diluição 1:800) por duas horas a 37 ºC. As microplacas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37 C por 120 min. A leitura de cada exame foi realizada em microscópico óptico (Zeiss, Standort Göttingen, Vertrieb, Alemanha), com condensador seco de campo escuro. A positividade foi determinada mediante aglutinações (>75%). Para as amostras que apresentaram reatividade nesta diluição (1:800) foram realizadas diluições seriadas de 1:1.600 até 1: , a fim se determinar a qual sorogrupo pertencia a amostra examinada obtida.

46 Quadro 4 - Antissoros utilizados na sorogrupagem da amostra bacteriana de Leptospira isolada de um ovino no Rio de Janeiro, Nº Espécie Sorogrupo Serovar Cepa 1 L. biflexa Andamana Australis CH 11 2 L. interrogans Australis Bratislava Jez-Bratislava 3 L. interrogans Australis Australis Ballico 4 L. interrogans Autumnalis Autumnalis Akiyami A 5 L. borgpetersenii Ballum Castellonis Castellon 3 6 L. interrogans Bataviae Bataviae Swart 7 L. interrogans Canicola Canicola Hond Utrecht IV 8 L. weilii Celledoni Celledoni Celledoni 9 L. wolbachii Codice Codice CDC 10 L. kisrchneri Cynopteri Cynopteri 3522 C 11 L. interrogans Djasiman Djasiman Djasiman 12 L. kisrchneri Grippothyphosa Grippothyphosa Grippothyphosa 13 L. interrogans Hebdomadis Hebdomadis Hebdomadis 14 L. vanthielii Holland Holland WaZ Holland 15 L. interrogans Icterohaemorrhagiae Copenhageni M20 16 L. interrogans Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae RGA 17 L. borgpetersenii Javanica Javanica Veldrat Batavia L. noguchii Louisiana Louisiana LSU L. inadai Lyme Lyme L. alexandri Manhao Manhao L60 21 L. borgpetersenii Mini Mini Sari 22 L. noguchii Panama Panama Cz 214 k 23 L. interrogans Pomona Pomona Pomona 24 L. interrogans Pyrogenes Pyrogenes Salinem 25 L. alstonii Ranarum Pinchang L. weilii Sarmin Sarmin Sarmin 27 L. interrogans Sejroe Hardjo type Prajitno Hardjoprajitno 28 L. borgpetersenii Sejroe Hardjo type Bovis Sponselee 29 L. interrogans Sejroe Wolffi L. biflexa Semaranga Patoc Patoc 1 31 L. santarosai Shermani Shermani 1342 K 32 L. borgpetersenii Tarassovi Tarassovi Perepelitsin 46

47 ANÁLISES ESTATÍSTICAS A associação entre o titulo de anticorpos do animal e sua condição de portador de leptospiras (PCR) foi avaliada pelo teste não-paramétrico do χ2 (qui-quadrado) e ajuste de Fisher, considerando-se um nível de confiança de 95% (P<0,05). Todas as análises foram realizadas com o programa SPSS 20.0 for Windows.

48 48 5 RESULTADOS Das 156 amostras de soro testadas na primeira etapa do estudo (inquérito sorológico), 14,1% (22/156) apresentaram sororreatividade, ou seja, título igual ou superior a 200. Com relação ao nível de sororreatividade dos rebanhos, dos seis estudados, três apresentaram-se soronegativos e consequentemente três sororreativos. Dos rebanhos sororreativos, em dois foram observados anticorpos predominantemente contra o sorogrupo Icterohaemorrhagiae, com uma ocorrência de 14,6% (6/41) e 21,4% (9/42) e títulos variando de 200 a 400. Além disso, o terceiro rebanho sororreativo foi o que apresentou maior grau de reatividade (33,3% - 7/21), com anticorpos predominantemente para o sorogrupo Sejroe (serovar Hardjo) com títulos variando também entre 200 e 400 na SAM. Estes resultados podem ser observados na Tabela 1. As características encontradas neste último rebanho (elevada sororreatividade e predominância de Hardjo) o habilitaram como escolha como grupo de trabalho para a segunda etapa. Mais detalhadamente, este rebanho era composto por 21 animais (18 fêmeas e três machos). Como grupo de controle, trabalhou-se com um dos rebanhos soronegativos, composto por 19 animais (15 fêmeas e quatro machos).

49 Tabela 1 Resultados obtidos nos testes sorológicos de 156 animais pertencentes a seis rebanhos estudados no estado do Rio de Janeiro, Rebanho N Sororreativos Sororreativos (%) Sorogrupo ,4 Icterohaemorrhagiae ,6 Icterohaemorrhagiae * ,3 Sejroe 6** Total ,1 *Escolhido como Grupo de Trabalho ** Escolhido como Grupo Controle 49 Icterohaemorrhagiae / Sejroe Na segunda etapa do estudo foram colhidas 18 amostras de sangue e 18 de urina, 15 de fluido vaginal (não se conseguiu colher amostras de três fêmeas) e três de sêmen do grupo de trabalho e 19 amostras de sangue e urina, 15 de fluido vaginal e três de sêmen do grupo controle (não se conseguiu colher sêmen de um macho). Após a realização da SAM para as amostras de soro colhidas na segunda etapa, no grupo de trabalho foi observado que 66,6% (12/18) amostras apresentaram reatividade (títulos 200), novamente para o sorogrupo Sejroe. Já no grupo controle, todas as amostras de soro testadas na segunda etapa se mantiveram negativas na SAM. Após a cultura microbiológica das amostras de urina, fluido vaginal e sêmen, obteve-se uma amostra bacteriana de Leptospira, obtida a partir de uma amostra de fluido vaginal de uma ovelha do grupo de trabalho. Já no grupo controle, todas as amostras, tanto de urina, quanto de fluido vaginal e sêmen, foram negativas na tentativa de isolamento do micro-organismo. No que se refere aos resultados obtidos na PCR, 27,8% (5/18) amostras de fluido vaginal/sêmen (quatro e uma, respectivamente) foram positivas no grupo de trabalho, incluindo aquela da qual se obteve o isolamento. Em relação à PCR das amostras de urina, 38,9% (7/18) apresentaram positividade. Das

50 50 amostras de urina positivas neste grupo, duas foram positivas também na PCR de fluido vaginal (11,1%) e uma de sêmen (5,5%). Já no grupo controle, 38,9% (7/18) das amostras de fluido vaginal/sêmen (seis e uma, respectivamente) foram positivas na PCR. Além disso, 5,3% (1/19) amostra de urina foi positiva na PCR, sendo esta positiva também no fluido vaginal. Como complemento, as figuras 2, 3 e 4 ilustram alguns ensaios de PCR realizados. Os resultados da sorologia (2 a etapa), da cultura bacteriológica e da PCR estão apresentados nas tabelas 2 e 3. Tabela 2 - Resultados obtidos pela SAM (para sorogrupo Sejroe/serovar Hardjo), cultura bacteriológica e PCR de fluido vaginal/sêmen e urina dos 18 animais pertencentes ao rebanho ovino sororreativo. Nº Sexo SAM Cultura PCR fv/s PCR urina (FV) : Negativo; +: Positivo

51 51 Tabela 3 - Resultados obtidos pela SAM (para sorogrupo Sejroe/serovar Hardjo), cultura bacteriológica e PCR de fluido vaginal/sêmen e urina dos 19 animais pertencentes ao rebanho soronegativo. Nº Sexo SAM Cultura PCR fv/s PCR urina N/C : Negativo; +: Positivo; N/C: Não colhida

52 52 Figura 2 - Fotografia do gel da corrida de eletroforese das amostras de urina e fluido vaginal processadas para a realização da PCR (amplificação do gene LipL32) dos animais 1 a 6 do grupo de trabalho. M CNe CNp CP M- Marcador de peso molecular (100 bp); CNe- Controle Negativo da extração; CNp- Controle negativo da PCR; CP- Controle positivo; 1, 9 e 10: amostras positivas. Figura 3 - Fotografia do gel da corrida de eletroforese das amostras de fluido vaginal (amostra 1) e do DNA extraído da cultura pura obtida do fluido vaginal de mesma ovelha pertencente a grupo de trabalho (amostra 2) processadas para a realização da PCR (amplificação do gene LipL32). M CNp CP 1 2 M- Marcador de peso molecular (100 bp); CNp- Controle negativo da PCR; CP- Controle positivo.

53 Figura 4 - Fotografia do gel da corrida de eletroforese das amostras de urina e fluido vaginal processadas para a realização da PCR (amplificação do gene LipL32) dos animais 1 a 7 do grupo controle (e urina do animal 8). 53 M CNe CNp CP M- Marcador de peso molecular (100 bp); CNe- Controle negativo da extração; CNp- Controle negativo da PCR; CP- Controle positivo; 4,6,10, 14 e 15: amostras positivas. Foi observada reação positiva (título de 800) na sorogrupagem para o sorogrupo Sejroe. É importante destacar que os serovares Wolffi, Hardjobovis e Hardjoprajitno eram os representativos deste sorogrupo. Na segunda sorogrupagem (titulação), o serovar Hardjoprajitno foi aquele que apresentou o maior título (12.800). Já no sequenciamento da amostra isolada foi observada 100% de homologia para a espécie L. interrogans, tanto para o gene rrs, quanto para o secy. Adicionalmente, a VNTR da amostra apresentou o seguinte perfil de pares de base: VNTR4: 450bp, VNTR7: 710 bp, e VNTR10: 1050 bp (Figura 5). Desta forma, considerando-se a soma dos resultados obtidos, concluiu-se que a amostra bacteriana isolada tratava-se de L. interrogans sorogrupo Sejroe serovar Hardjoprajitno.

54 54 Figura 5 - Fotografia do gel da corrida de eletroforese do DNA extraído da cultura pura (1) obtida do fluido vaginal de ovelha pertencente a grupo de trabalho processado para a realização da VNTR. M- Marcador de peso molecular (100 bp); CN- Controle negativo (L. biflexa Patoc); CP- Controle positivo (L. interrogans Canicola). Após as análises estatísticas observou-se que, ao comparar-se os resultados da PCR da urina em relação á sororreatividade dos rebanhos (Tabela 4), existe diferença significativa (P=0,019). Além disso, o risco de um animal proveniente de um rebanho sororreativo apresentar positividade na PCR de urina foi 7,4 vezes maior do que dos animais do rebanho soronegativo. Já na comparação dos resultados da PCR de fluido vaginal/sêmen separadamente em relação á sororreatividade dos rebanhos (Tabela 5), a diferença não foi significativa (P=0,725), visto que sete animais de rebanho soronegativo apresentaram PCR positiva no fluido vaginal/sêmen, e apenas um também na urina.