ARS VETERINARIA, 15(1):26-32, 1999.

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1 26 PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leptospira interrogans EM SOROS DE OVINOS DO ESTADO DE SÃO PAULO. AVALIAÇÃO DO SOROTIPO jequitaia DE Leptospira biflexa COMO ANTÍGENO DE TRIAGEM SOROLÓGICA 1 ( INVESTIGATION OF ANTIBODIES TO Leptospira interrogans IN SERA OF OVINE FROM THE STATE OF SÃO PAULO, BRAZIL. EVALUATION OF THE SEROVAR jequitaia OF Leptospira biflexa AS ANTIGEN FOR SEROLOGICAL SCREENING ) J. BARBUDO FILHO 2, R. J. S. GIRIO 3, L. A. MATHIAS 3, A. V. OLIVEIRA 4, M. MARINHO 5 RESUMO O presente trabalho teve por objetivo pesquisar, no soro sangüíneo de ovinos do Estado de São Paulo, a ocorrência de aglutininas contra 21 sorotipos de Leptospira interrogans, e também avaliar a eficiência do sorotipo jequitaia de Leptospira biflexa como antígeno único de triagem, através da técnica de soroaglutinação microscópica (SAM). Foram examinadas 846 amostras de soros de ovinos pertencentes a 15 rebanhos, sendo que 73 (8,6%) foram reagentes e 773 (91,4%) não foram reagentes contra L. interrogans. O sorotipo de L. interrogans mais freqüente foi o wolffi, contra o qual foi observada a ocorrência de aglutinação em 5,1% das amostras examinadas, seguido dos sorotipos icterohaemorrhagiae (1,2%), grippotyphosa (0,7%), castellonis (0,7%) e hardjo (0,4%). Os títulos sorológicos encontrados variaram entre 1/100 e 1/1.600, e a maioria dos rebanhos com ovinos reagentes apresentava histórico de alteração reprodutiva (abortamentos, repetições de cio e partos distócicos). Os resultados obtidos na prova de SAM com os 21 sorotipos de L. interrogans e os resultados obtidos com o sorotipo jequitaia de L. biflexa apresentaram uma concordância de 86,8%. Das 73 amostras reagentes contra os sorotipos de L. interrogans, apenas 11 (15,1%) reagiram também contra o sorotipo jequitaia, e das 773 amostras negativas contra os sorotipos de L. interrogans, 724 (93,7%) também foram negativas contra o sorotipo jequitaia. Com isso, o sorotipo jequitaia apresentou um baixo desempenho sorológico no diagnóstico da leptospirose ovina. Não se constatou diferença significativa entre as proporções de reagentes encontradas em machos e em fêmeas. PALAVRAS-CHAVE: Leptospirose, soroaglutinação, diagnóstico sorológico, ovinos. SUMMARY This work was carried out to investigate, in sera of ovine from the State of São Paulo, Brazil, the occurrence of agglutinins to 21 serovars of Leptospira interrogans, and evaluate the efficiency of the serovar jequitaia of Leptospira biflexa as single antigen for screening by the microscopic agglutination test. Eight hundred and forty-six ovine serum 1 Dissertação de Mestrado apresentada junto ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração em Medicina Veterinária Preventiva da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Campus de Jaboticabal-Unesp. 2 Aluno do Curso de Pós-Graduação da FCAVJ-Unesp, Professor da Faculdade de Medicina Veterinária da Unicastelo - Fernandópolis-SP. 3 Departamento de Medicina Veterinária Preventiva - FCAVJ-Unesp, Rodovia Carlos Tonanni, km 5, Jaboticabal- SP. 4 Aluno do Curso de Graduação em Medicina Veterinária da FCAVJ-Unesp. 5 Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal, Unesp - Araçatuba.

2 27 samples from 15 herds were examined; 73 of them (8.6%) reacted to L. interrogans serovars, and 773 did not react. The most frequent L. interrogans serovars, and 773 did not react. The most frequent L. interrogans serovars was wolffi, to which agglutination was observed in 5.1% of the examined samples, followed by serovars icterohaemorrhagiae (1,2%), grippotyphosa (0,7%), castellonis (0,7%) and hardjo (0,4%). The serological titres varied between 1/100 and 1/1,600, and the majority of the herds with reacting sheeps showed history of reproductive alterations as abortions, repeat breeding and dystocia. The results showed by the microscopic agglutination test using the 21 L. interrogans serovars and the results obtained with the serovar jequitaia of L. biflexa showed an agreement of 86.8%. Of the 73 samples reacting to the L. interrogans serovars, only 11 (15.1%) reacted also to the jequitaia serovar, and from the 773 samples negative to L. interrogans serovars, 724 (93.7%) were also negative to the jequitaia serovar. The jequitaia serovar showed a poor performance in the serological diagnosis of ovine leptospirosis. There was no significative difference between the proportion of reactors in males and in females. KEY-WORDS: Leptospirosis, serological diagnosis, microscopic agglutination test, ovine. INTRODUÇÃO Na espécie ovina a leptospirose pode causar icterícia, anemia, infertilidade, aborto e morte perinatal, podendo ocorrer, na maioria dos casos, a forma inaparente, dificultando com isso o diagnóstico clínico e epidemiológico (BLOOD et al., 1983; QUINN et al., 1994). Em nosso país, um dos primeiros estudos sorológicos para leptospirose ovina foi realizado por SANTA ROSA & CASTRO em 1963, no Estado de São Paulo, onde foram encontrados 34% de soros reagentes contra vários sorotipos de Leptospira interrogans. Na Bahia, CALDAS et al. (1989) encontraram 11,7% de ovinos reagentes, de 930 animais examinados, sendo que os sorotipos mais freqüentes foram butembo, wolffi, tarassovi e castellonis. Em Ribeirão Preto, Estado de São Paulo, GIRIO et al. (1989) verificaram que, de 30 ovinos de um biotério, 11 eram reagentes contra o sorotipo icterohaemorrhagiae e dois, contra o sorotipo pomona. Na Austrália, ELLIS et al. (1994) verificaram, em 36 rebanhos de ovinos examinados, que 42% dos animais reagentes contra o sorotipo hardjo eram da raça Merino. Na Nova Zelândia, VERMUNT et al. (1994) observaram que o sorotipo pomona causou elevada mortalidade em ovinos que apresentavam sinais clínicos de icterícia e hemoglobinúria. São poucos os estudos que relacionam os sinais clínicos da leptospirose ovina. Na grande maioria das vezes, os sinais clínicos podem passar despercebidos, o que requer a execução de exames laboratoriais, para esclarecer a suspeita da infecção. Dentre os exames laboratoriais empregados para a confirmação do diagnóstico da leptospirose, a prova de soroaglutinação microscópica (SAM) é a técnica mais amplamente difundida. No entanto, é trabalhosa, pois necessita de um grande número de antígenos vivos de leptospira, para o exame de uma única amostra de soro sangüíneo (FAINE, 1982). Há estudos sugerindo que sorotipos apatogênicos de Leptospira biflexa, às vezes, podem ser utilizados com antígeno de triagem sorológica em casos de leptospirose humana, mas não no diagnóstico da leptospirose animal (GENOVEZ, 1985; VASCONCELLOS, 1986). A ineficiência desses sorotipos no diagnóstico da leptospirose foi demonstrada por GIRIO & MATHIAS (1988), através de infecção induzida em cobaias pelos sorotipos canicola, grippotyphosa, hardjo, icterohaemorrhagiae, pomona, tarassovi e wolffi. O sorotipo jequitaia de L. biflexa começou a ser estudado como antígeno de triagem sorológica para a leptospirose ovina por CALDAS et al. (1991), os quais observaram que 19,6% dos soros examinados apresentavam aglutininas contra leptospira, tanto para L. interrogans como para o sorotipo jequitaia. VIEGAS et al. (1992) encontraram níveis de sensibilidade, especificidade e concordância superiores a 60% ao usarem o sorotipo jequitaia como antígeno de triagem em soros de ovinos e caprinos naturalmente infectados com 18 diferentes sorotipos de L. interrogans. Diante desses aspectos peculiares das diferentes respostas sorológicas para o diagnóstico da leptospirose, o presente trabalho teve por objetivo pesquisar, no soro sangüíneo de ovinos do Estado de São Paulo, a ocorrência de aglutininas contra 21 sorotipos de L. interrogans e também avaliar a eficiência do sorotipo jequitaia de L. biflexa como antígeno único de triagem na técnica de SAM. População estudada MATERIAL E MÉTODOS Os ovinos utilizados no estudo pertencem aos principais rebanhos cadastrados pela Associação Paulista

3 28 de Criadores de Ovinos, os quais estão concentrados principalmente nas regiões de Sorocaba, Presidente Prudente, Araraquara, Ribeirão Preto e Campinas. A maioria dos ovinos estudados foram das raças Suffolk, Ile de France, Hampshire, Merino, Santa Inês, Texel e Corriedale. Amostras de soro As amostras de soro sangüíneo foram colhidas de 846 ovinos, sendo 706 fêmeas e 140 machos, que pertenciam a rebanhos que tinham ou não histórico de alteração reprodutiva, de 15 diferentes municípios do Estado de São Paulo. Preparo dos antígenos Os antígenos foram preparados a partir de matrizes repicadas semanalmente em meio de EMJH (Difco) acrescido de 10% de Leptospira enrichment (Difco) e mantidos em estufa bacteriológica a 28 o C. A concentração considerada ideal era padronizada para corresponder à metade da turvação do tubo n o 1 da escala de MacFarland, livre de contaminação e de autoaglutinação, segundo as orientações de SULZER & JONES (1980). Pesquisa de anticorpos O trabalho foi dividido em duas fases. Na primeira fase, todos os soros foram testados pela prova de SAM, preconizada por FAINE (1982), com os seguintes sorotipos de L. interrogans: australis, bratislava, autumnalis, ballum, canicola, castellonis, bataviae, brasiliensis, butembo, whitcombi, grippotyphosa, icterohaemorrhagiae, copenhageni, javanica, panama, pomona, pyrogenes, wolffi, hardjo, shermani e tarassovi. Na segunda fase, os soros reagentes e não reagentes foram submetidos à mesma prova com o sorotipo jequitaia de L. biflexa. Todos os soros foram diluídos em solução tamponada de Sörensen, segundo SANTA ROSA (1970). Para leitura da reação, seguiram-se os critérios recomendados por FAINE (1982). Análise estatística Os resultados obtidos com o uso dos 21 sorotipos de L. interrogans foram comparados, através do teste de duas proporções para populações relacionadas, teste de McNemar (SIEGEL, 1981), com aqueles obtidos pela prova de SAM utilizando-se o sorotipo jequitaia de L. biflexa. As freqüências de reagentes em machos e em fêmeas foram comparadas entre si por meio do teste de qui-quadrado. RESULTADOS Dos 846 soros examinados, 73 (8,6%) foram reagentes contra vários sorotipos de L. interrogans e 773 (91,4%) foram não reagentes. Os maiores percentuais de animais reagentes foram encontrados nos municípios de Bauru, São Manoel e Monte Azul Paulista, respectivamente, com 30,0%, 20,8% e 16,7% (Tabela 1). Nesses rebanhos constatou-se a ocorrência de abortamento e repetição de cio, sendo que as raças que predominavam eram a Suffolk e a Corriedale. Dos 15 rebanhos examinados, sete já tinham apresentado alguma alteração reprodutiva, como abortamento, repetição de cio e parto distócico, e oito ainda não tinham apresentado alteração reprodutiva. Desses rebanhos que não tinham histórico de alteração reprodutiva, dois não apresentaram animais reagentes, sendo que as raças predominantes eram a Suffolk e a Santa Inês. O menor percentual de animais reagentes, 1,4%, foi encontrado em ovinos da raça Corriedale com elevada taxa de fertilidade. A Tabela 2 mostra que 5,1% do total de amostras de soros examinadas foram reagentes contra o sorotipo wolffi e 1,2%, contra o sorotipo icterohaemorrhagiae. Dentro das amostras reagentes, o sorotipo wolffi foi o mais freqüente (58,9%), seguido pelos sorotipos icterohaemorrhagiae (13,7%), grippotyphosa (8,2%), castellonis (8,2%) e hardjo (4,1%). Os maiores títulos sorológicos encontrados foram de l/l.600 e de 1/800. A grande maioria dos soros reagentes, 40 amostras, apresentou títulos sorológicos 1/100. Dos 21 sorotipos de L. interrogans pesquisados, observou-se a ocorrência de aglutininas contra nove (australis, bratislava, castellonis, grippotyphosa, hardjo, icterohaemorrhagiae, pyrogenes, whitcombi e wolffi) através da prova de SAM, e contra os outros 12 não se observaram reações sorológicas. A Tabela 3 mostra os resultados obtidos pela prova de SAM com os 21 sorotipos de L. interrogans, que foram comparados com os resultados obtidos com o sorotipo jequitaia de L. biflexa. Verifica-se que, dos 773 soros que não apresentaram títulos sorológicos para os sorotipos de L. interrogans, 38 apresentaram títulos de 1/100 e outros 11 apresentaram títulos de 1/200 contra o sorotipo jequitaia, caracterizando com isso, reações falsonegativas. As cinco amostras que apresentaram títulos de 1/800 e as quatro que apresentaram títulos de 1/1.600 os sorotipos de L. interrogans não foram reagentes contra o sorotipo jequitaia. Esses achados demonstraram que o teste com o antígeno jequitaia não foi capaz de proporcionar aglutinação em amostras com altos títulos sorológicos. Na Tabela 4 pode-se observar que, das 846 amostras de ovinos examinadas, 60 foram reagentes contra

4 29 Tabela 1 - Resultados da prova de soroaglutinação microscópica contra 21 sorotipos de Leptospira interrogans em rebanhos ovinos do Estado de São Paulo, M unicípio R eagente N egativo Total N o % N o % Avaré 0 0, ,0 75 Bauru 12 30, ,0 40 Bocaina 1 1, ,4 61 Botucatu 3 10, ,7 29 C olômbia 2 6, ,8 32 Dobrada 3 8, ,2 34 G avião Peixoto 1 4, ,8 24 Itaí 4 6, ,1 58 Jaboticabal 7 5, ,9 138 Lavínia 1 1, ,6 72 M onte Azul Paulista 2 16, ,3 12 Pontal 0 0, ,0 36 São Joaquim da Barra 8 16, ,7 49 São M anoel 26 20, ,2 125 Serra Azul 3 4, ,1 61 TOTAL 73 8, ,4 846 Tabela 2 - Freqüência de soros ovinos examinados pela prova de soroaglutinação microscópica para leptospirose segundo o sorotipo reagente e o título* obtido. Estado de São Paulo, SOROTIPO TÍTULO Total (% ) (% ) australis ,7 0,2 autumnalis ,0 0,0 ballum ,0 0,0 bataviae ,0 0,0 brasiliensis ,0 0,0 bratislava ,4 0,1 butembo ,0 0,0 canicola ,0 0,0 castellonis ,2 0,7 copenhageni ,0 0,0 grippotyphosa ,2 0,7 hardjo ,1 0,4 ictero ,7 1,2 ja van ica ,0 0,0 panama ,0 0,0 pomona ,0 0,0 pyrogenes ,4 0,1 shermani ,0 0,0 tarassovi ,0 0,0 whitcombi ,4 0,1 w olffi ,9 5,1 TOTAL ,0 8,6 * = Recíproca da maior diluição do soro com 50% de aglutinação. ictero... = icterohaemorrhagiae 1 = Freqüência entre o total de animais reagentes. 2 = Freqüência entre o total de animais examinados.

5 30 Tabela 3 - Distribuição dos resultados da prova de soroaglutinação microscópica para leptospirose em ovinos, utilizandose como antígeno o sorotipo jequitaia, de acordo como os títulos* obtidos contra os sorotipos de Leptospira interrogans. Estado de São Paulo, SOROTIPO L. interrogans jequitaia N TOTAL N TOTAL * = Recíproca da maior diluição do soro com 50% de aglutinação. N = Não reagente. Tabela 4 - Comparação dos resultados obtidos através da prova de soroaglutinação microscópica contra o antígeno jequitaia e contra os antígenos de Leptospira interrogans em soros de ovinos. Estado de São Paulo, L. interrogans SOROTIPO Positivo Negativo TOTAL jequitaia N o % N o % N o % Positivo 11 15,1 49 6,3 60 7,1 Negativo 62 84, , ,9 TOTAL , , , Concordância = X 100 = 86,8% 846 o sorotipo jequitaia e 786 foram negativas. Nota-se que somente 11 (15,1%) amostras de soros foram reagentes tanto para os sorotipos de L. interrogans como para o sorotipo jequitaia. A concordância entre os testes usando os antígenos de L. interrogans e do sorotipo jequitaia foi de 86,8%. De acordo com a análise estatística, a distribuição dos valores discordantes está dentro da expectativa do acaso ao nível de significância de 5%. A análise estatística demonstrou, com 95% de probabilidade, que houve independência na distribuição das freqüências, em relação ao sexo dos animais reagentes para os sorotipos de L. interrogans e para o sorotipo jequitaia. DISCUSSÃO A prova de SAM demonstrou maior freqüência de reagentes para o sorotipo wolffi (5,1%). Esses achados estão de acordo com os resultados obtidos por DRAGHI DE BENITEZ et al. (1984), na Argentina, e por CALDAS et al. (1989), na Bahia. O sorotipo hardjo, que apresentou uma ocorrência de 0,4%, foi considerado importante por SCHÖNBERG et al. (1986), em rebanhos de ovinos na Alemanha, onde a sua prevalência em algumas regiões foi de 14,2%. Vale mencionar que esse sorotipo é considerado de grande importância para a espécie bovina, principalmente no continente americano (QUINN et al., 1994). Os resultados encontrados mostraram que nenhuma amostra foi reagente contra o sorotipo pomona; em países como a Nova Zelândia, esse sorotipo parece ter importância, principalmente para os ovinos jovens. No entanto, o sorotipo icterohaemorrhagiae, o segundo de maior ocorrência (1,2%), foi mencionado por LEON-VIZCAINO (1987), em casos de abortamentos na Espanha, e por GIRIO et al. (1989), em casos assintomáticos de leptospirose ovina no Estado de São Paulo. No presente estudo, verificou-se que alguns

6 31 rebanhos reagentes apresentaram problemas reprodutivos como abortamento, repetição de cio e parto distócico. Dessas alterações reprodutivas, a mais clássica na espécie ovina é o aborto, causado pelos sorotipos hardjo e pomona. De acordo com BLOOD et al. (1983), nas infecções pelo sorotipo hardjo o abortamento pode ser considerado como único sinal clínico observado, e nas infecções pelo sorotipo pomona é comum uma manifestação de forma aguda da doença, podendo às vezes causar elevada mortalidade em cordeiros (VERMUNT et al., 1994). Entretanto, QUINN et al. (1994) incriminam o sorotipo hardjo como responsável principalmente por infecções subclínicas, e o ovino quando infectado geralmente fica portador renal. Como a grande maioria dos ovinos que apresentaram transtornos reprodutivos foram reagentes para o sorotipo wolffi, é admissível que esse sorotipo possa ter sido um dos responsáveis pelos abortamentos, repetições de cio e pelos partos distócicos. Casos de leptospirose sem manifestações clínicas podem apresentar grande importância, do ponto de vista epidemiológico, diante da perspectiva de que os animais com infecção inaparente possam garantir a persistência da L. interrogans nos rebanhos, situação essa que pode estar ocorrendo nos seis rebanhos onde se observaram animais reagentes, mas sem histórico clínico da infecção. O sorotipo jequitaia não apresentou resultados satisfatórios quando usado como antígeno de triagem na prova de SAM para o diagnóstico sorológico da leptospirose ovina. Pode-se constatar, através da Tabela 3, que esse antígeno não foi capaz de detectar anticorpos em soros que apresentaram títulos relativamente elevados, 1/800 e 1/1.600, quando testados contra os sorotipos de L. interrogans. Verifica-se também que esse antígeno revelou resultados falso-positivos em 49 (6,4%) soros que não foram reagentes contra 21 sorotipos de leptospiras patogênicas. Constatação de falso-positivos também foi feita por VIEGAS et al. (1992), em teste de triagem com antígeno do sorotipo jequitaia em soros de ovinos, em comparação com os resultados obtidos com uma bateria de 18 sorotipos de L. interrogans. Entretanto, CALDAS et al. (1991) obtiveram resultados satisfatórios com o antígeno do sorotipo jequitaia, quando comparados com os resultados obtidos com 16 sorotipos de L. interrogans. Os títulos sorológicos encontrados em todas as amostras examinadas contra o sorotipo jequitaia foram de 1/100 e 1/ 200. Tal observação pode ser explicada porque nas reações heterólogas, nas quais supostamente se incluem as reações com sorotipos de L. biflexa (aqüícolas), não se observa, na maioria das vezes, a proporção de 50% de leptospiras aglutinadas, mas sim aglutinações discretas ou pequena diminuição no número de leptospiras livres no campo microscópico. Nesse caso, os títulos são muito baixos ou não ultrapassam o limite mínimo de reatividade considerado positivo (VASCONCELLOS, 1986). Comparando-se os resultados obtidos contra o sorotipo jequitaia com os resultados obtidos contra os 21 sorotipos de L. interrogans (Tabela 4), verifica-se uma concordância de 86,8%. No entanto, embora pareça um valor não desprezível, é fundamental levar em consideração que, dos 73 soros com resultados positivos contra L. interrogans, apenas 11 (15,1%) apresentaram também resultado positivo contra o sorotipo jequitaia, o que implica em uma sensibilidade relativa extremamente baixa para o teste com esse sorotipo. Já entre os 773 soros com resultados negativos contra L. interrogans, 724 (93,6%) apresentaram também resultados negativos contra o sorotipo jequitaia, caracterizando com isso uma especificidade relativa não tão baixa. A pequena proporção de soros positivos contra o sorotipo jequitaia pode revelar que os ovinos reagentes estavam infectados naturalmente com esse sorotipo, dando com isso condição da prova de SAM revelar anticorpos homólogos e não anticorpos induzidos pelos sorotipos patogênicos. Os resultados obtidos estão de acordo com as observações realizadas, através de experimento conduzido em laboratório, por GIRIO & MATHIAS (1988), em cobaias que foram infectadas com sete diferentes sorotipos de L. interrogans, que não sofreram qualquer influência do meio ambiente. Nesse experimento, os sorotipos apatogênicos (buenos aires, patoc 1, rufino e são paulo) não revelaram anticorpos nos soros das cobaias infectadas com leptospiras patogênicas. No entanto, vale ressaltar que VIEGAS (1989) observou reações cruzadas entre o sorotipo pomona entre o 4 o e o 16 o dia após infecção experimental em caprinos. Apesar do sexo não ser um fator predisponente para a infecção por leptospiras, as fêmeas em gestação são os animais para os quais a leptospirose apresenta maior importância, pois pode causar abortamento e com isso acarretar sérios prejuízos para os rebanhos de ovinos. No presente estudo, a análise estatística revelou que houve uma independência na distribuição das freqüências para os sexos, com 95% de probabilidade, tanto nos resultados obtidos contra os sorotipos de L. interrogans quanto nos resultados obtidos contra o sorotipo jequitaia. O desempenho apresentado pelo o antígeno de L. biflexa sorotipo jequitaia não permite recomendar sua inclusão nas coleções de antígenos empregados para o diagnóstico da leptospirose na espécie ovina, e nem mesmo como antígeno de triagem para a identificação de focos da doença. Os baixos títulos aglutinantes observados no presente trabalho eliminam a perspectiva de seu emprego para uma avaliação quantitativa que ofereça subsídios para diagnosticar infecções precoces, conforme observou VIEGAS (1989), estudando caprinos experimentalmente infectados com o sorotipo pomona.

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