RENATO GUIMARÃES VARGES

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA CURSO DE DOUTORADO EM MEDICINA VETERINÁRIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL RENATO GUIMARÃES VARGES CORREÇÃO DE FATORES DE MANEJO COMO FERRAMENTA COMPLEMENTAR AO CONTROLE DA LEPTOSPIROSE EM UM REBANHO BOVINO NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL NITERÓI 2009

2 RENATO GUIMARÃES VARGES CORREÇÃO DE FATORES DE MANEJO COMO FERRAMENTA COMPLEMENTAR AO CONTROLE DA LEPTOSPIROSE EM UM REBANHO BOVINO NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal. Orientador: Prof. Dr. WALTER LILENBAUM NITERÓI 2009

3 V297 Varges, Renato Guimarães Correção de fatores de manejo como ferramenta complementar ao controle da leptospirose em um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro/Renato Guimarães Varges; orientador Walter Lilenbaum f. Tese(Doutorado em Clínica e Reprodução Animal) Universidade Federal Fluminense, Orientador: Walter Lilenbaum 1. Doenças do bovino. 2. Leptospirose em animal. 3. Controle de doença transmissível. I. Título. CDD

4 RENATO GUIMARÃES VARGES CORREÇÃO DE FATORES DE MANEJO COMO FERRAMENTA COMPLEMENTAR AO CONTROLE DA LEPTOSPIROSE EM UM REBANHO BOVINO NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal. Aprovada em de de BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. WALTER LILENBAUM - Orientador Universidade Federal Fluminense Prof. Dr. GUILHERME NUNES DE SOUZA Empresa Brasileira de Pesquisa e Agropecuária Profª. DRA RACHEL FERREIRA Laboratório Nacional Agropecuário Profª DRA RITA LEAL PAIXÃO Universidade Federal Fluminense Prof. Dr. ALOYSIO DE MELLO FIGUEIREDO CERQUEIRA Universidade Federal Fluminense NITERÓI 2009

5 Aquele que perscruta os corações sabe o que deseja o Espírito, que intercede pelos seus santos, segundo Deus. Aliás, sabemos que todas as coisas concorrem para o bem daqueles que amam a Deus, daqueles que são eleitos segundo seus desígnios. Os que Ele distinguiu de antemão, também os predestinou para serem conformes à imagem de seu Filho. E aos que predestinou, também os chamou; a aos que chamou, também os justificou; e aos que justificou, também os glorificou. Que diremos depois disso? Se Deus é por nós, quem será contra nós? Aquele que não poupou seu próprio Filho, mas que por todos nós o entregou, como não nos dará também com Ele todas as coisas? Quem poderia acusar os escolhidos de Deus? É Deus quem os justifica. Quem os condenará?é Cristo ressuscitado que intercede por nós! Quem nos separará do amor de Cristo?A tribulação? A angústia? A perseguição? A fome? A nudez? O perigo?a espada? Em todas as coisas somos mais que vencedores em virtude Daquele que nos amou primeiro. (Romanos 8, 27-37)

6 Aqueles que mais amo. Em memória ao meu amado pai, que há exatamente um ano nos deixou. Papai que com sua incomparável simplicidade nunca me deixou faltar as coisas mais essenciais da vida: fé, amor, escuta, carinho, amizade, atenção e participação nas minhas decisões mais importantes. Que descanse eternamente na Paz Daquele que você tanto amou neste mundo! À Luciana, minha amada esposa, que com sua oferta diária de amor, sua presença cheia de fé e alegria tanto me inspira e anima. Eu te amo! À Teresa, que com sorriso incansável e delicadeza inspiradora me diverte e renova em meu coração a alegria de ser pai. Eu te amo! À mamãe, por todos os sacrifícios feitos e pelo exemplo de força e dedicação que sempre encontrei em você, seu espírito vencedor e empreendedor muito me estimula. À vovó, que incansavelmente se dedica ao ofício de amar com doçura, pureza e gratuidade. Sua vida é um exemplo! À Dani, mais que irmã, uma eterna amiga que amo muito, muito, muito profundamente! Ao meu amado vovô, pelas inúmeras lições de família, clínica e vida. Dedico tudo que faço a você, um exemplo de determinação, fibra, sacrifício e simplicidade. Você é o melhor veterinário do mundo! Finalmente, a duas pessoas que amo muito intensamente e não estão entre nós, minha bisavó Calixta, a quem já não posso mais beijar e sei que muito intercede por mim junto a Deus e a outra que ainda não posso beijar diretamente, mas beijo incansavelmente sobre a barriga da Luciana, sem ao menos saber qual será teu nome. Papai te ama!

7 AGRADECIMENTOS A Deus pela gratuidade e primazia de seu amor, Ao Prof. Dr. Walter Lilenbaum, por sua incansável labuta científica, pelas orientações científicas e pessoais, pelos ensinamentos, pela ajuda, pela compreensão, pela atenção, pela confiança...por tudo! À toda equipe de amigos do Laboratório de Bacteriologia Veterinária da UFF, Bruno Penna, Luciana Medeiros, Luciana Fonseca, Carla Dray, Gabriel Martins, Sabrina Thomé, Claudius Cabral (pela valiosa contribuição na formatação deste trabalho), Bernardo Figueiredo, Rodrigo Martins, Willian Renato da Silva Mendes Aline Pinna, Camila Hamond, Melissa Pinna (pelas contribuições na qualificação deste trabalho), Lais Falcão, Eliane Fernandes, Paulina e Valdeci, pelo maravilhoso e enriquecedor convívio. Vocês são fantásticos! Ao Paulo Marcio de Bragança Teixeira, proprietário da fazenda Santa Lúcia e ao Dr. Marcelo Fabricante, veterinário assistente, que tanto contribuíram com a colheita de dados deste estudo. À Prof. Drª Rita Leal Paixão e ao Prof Dr. Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira pelas valiosas contribuições dadas na etapa de qualificação deste trabalho e pela alegria de tê-los na banca de defesa desta tese. ii

8 À Prof Dra Rachel Ferreira e ao Prof Dr. Guilherme Nunes de Souza por prontamente aceitarem participar da banca de defesa desta tese, Aos meus queridos alunos, que tanto contribuem para minha paixão pela docência, À FAPERJ, CAPES e TECNORTE pelo apoio financeiro, À Prof.ª Ana Ferreira, nossa querida coordenadora do programa de Pós Graduação por todo apoio que me deu desde o início deste curso, À Profª Helena Lopes pelo incentivo e pelo apoio, Aos meus queridos irmãos da Comunidade Católica Shalom, pelos intensos momentos de fraternidade e alegria passamos. Deus os abençoe! À minha família, por tudo que representam para mim! A todos que de alguma forma ajudaram neste trabalho. ii

9 RESUMO A leptospirose é uma doença infecto-contagiosa que acomete os bovinos determinando perdas reprodutivas. O presente estudo objetivou identificar fatores de manejo e ambientais associados à ocorrência da leptospirose em um rebanho bovino localizado no estado do Rio de Janeiro e avaliar a adoção de medidas complementares visando aperfeiçoar o protocolo atualmente preconizado para o controle desta enfermidade em bovinos mantidos em clima tropical. Estudou-se sorologicamente para leptospirose um rebanho com 432 bovinos, sendo 206 de aptidão leiteira e 226 de corte. Dentre estes, 94 animais (21,8%) apresentavam falhas reprodutivas, sendo 54 (57,4%) destes no gado leiteiro e 40 (42,6%) no gado de corte. No primeiro momento do estudo (maio de 2007), verificou-se soroprevalência de 46,2%, sendo reativos 49,5% dos animais de exploração leiteira e 36,3% dos de corte, com forte predominância do serovar Hardjo (88%). Aplicou-se o programa tradicional de controle da leptospirose, baseado em antibioticoterapia e vacinação. Após 13 meses (junho de 2008) o rebanho foi reavaliado em seus parâmetros reprodutivos e sorológicos, e observou-se redução na sororeatividade para 25% e nas falhas reprodutivas para 14,3%. Apesar do sucesso nos animais de corte, o gado leiteiro ainda apresentava níveis inaceitáveis de falhas reprodutivas e de sororeatividade. Determinou-se os fatores associados à infecção na propriedade e no manejo dos animais, como acesso a áreas alagadas e higiene na ordenha, que acometiam exclusivamente os animais leiteiros, que foram então corrigidos. Seis meses após tais correções (dezembro de 2008) os índices de sororeatividade foram reduzidos a 3% no gado leiteiro e zero nos de corte, enquanto as falhas reprodutivas foram reduzidas a 4,8% e 3,5%, respectivamente. Concluiu-se que o programa tradicionalmente recomendado para o controle da leptospirose é capaz de reduzir a soroprevalência do rebanho e os índices de falhas reprodutivas. No entanto, em rebanhos infectados pelo serovar Hardjo e mantidos sob condições tropicais, tal programa pode ser insuficiente para eliminar a doença do rebanho e manter as falhas reprodutivas em níveis aceitáveis. Desta forma, mudanças no manejo dos animais e na estrutura física da propriedade podem aperfeiçoar o controle da leptospirose, permitindo seu sucesso nestas regiões. Palavras chave: Leptospirose, Bovinos, Hardjo, Controle, trópicos.

10 ABSTRACT Leptospirosis is an infectious and contagious disease that affects cattle determining reproductive losses. This study aimed to identify management and environmental factors associated with the occurrence of leptospirosis in a cattle herd located in the state of Rio de Janeiro and evaluate the adoption of additional measures to improve the currently recommended protocol for controlling this disease in cattle kept in tropical climate. A 432 cattle herd (206 dairy and 226 beef) was serologically studied for leptospirosis. Among these, 94 animals (21.8%) had reproductive failure, being 54 (57.4%) dairy cattle and 40 (42.6%) beef cattle. In the first moment of the study (May 2007), there was seroprevalence of 46.2%, being reactive 49.5% of the dairy animals and 36.3% of the beef, with clear predominance of Hardjo serovar (88%). It was applied the traditional leptospirosis control program, based on antibiotics and vaccination. After 13 months (June 2008) the herd was reassessed on its reproductive and serological parameters, and it was observed a reduction in sororeatictivity to 25% and in reproductive failures to14.3%. Despite the success reached with the beef herd, the dairy cattle still had unacceptable levels of reproductive failure and sororeactivity. It was determined the factors associated with the infection in the property and in the animal s management, such as access to flooded areas and hygiene in the milking, which affects only the dairy cows, that were then corrected. Six months after such corrections (December 2008) the sororeactivity rates were reduced to 3% in dairy cattle and zero in the beef, while the reproductive failures have been reduced to 4.8% and 3.5% respectively. It was concluded that the program traditionally recommended for leptospirosis control is able to reduce the herd seroprevalence and the rate of reproductive failure. However, in herds infected with Hardjo serovar and kept under tropical conditions, this program may be insufficient to eliminate the disease from the herd and maintain acceptable levels in reproductive failures. Thus, changes in the management of animals and in the physical structure of the property can improve the control of leptospirosis, allowing their success in these regions. Key words: Leptospirosis, Bovine, Hardjo, Control, Tropics.

11 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Quadro 1 Lista de alguns serovares, sorogrupos, espécie e hospedeiro de manutenção de Leptospira sp. (Adaptado de Faine et al. 2000) f.19 Figura 01 Comparação da soroprevalência de anticorpos anti-leptospira no rebanho e quanto ao tipo de exploração dos animais no 1º e 2º momentos do estudo f.53 Figura 02 Comparação da ocorrência de transtornos reprodutivos do gado leiteiro entre o 1º e 2º momentos do estudo f.58 Figura 03 Comparação da ocorrência de transtornos reprodutivos do gado de corte entre o 1º e 2º momentos do estudo f.58 Figura 04 Animal na sala de ordenha da propriedade, onde pode-se observar a formação de poças de urina no chão f.60 Figura 05. Animais se banhando em alagadiços presentes na propriedade f.61 Figura 6. Figura 6. Comparação da soroprevalência de anticorpos anti-leptospira entre os animais de exploração leiteira e de corte nos três momentos do estudo f.63 Figura 7. Comparação do percentual de falhas reprodutivas nos animais de exploração leiteira e de corte nos três momentos do estudo f.64

12 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Amostras de leptospiras utilizadas como antígenos para o diagnóstico sorológico de leptospirose em bovinos f.44 Tabela 2. Soroprevalência de anticorpos anti-leptospira em animais de exploração leiteira e de corte no primeiro momento (maio 2007) do estudo de um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro f.49 Tabela 3. Distribuição de serovares de Leptospira no primeiro momento (maio 2007) do estudo de um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro f.50 Tabela 4. Soroprevalência de anticorpos anti-leptospira em animais de exploração leiteira e de corte no segundo momento (junho 2008) do estudo de um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro f.52 Tabela 5. Distribuição de serovares de Leptospira no segundo momento (junho 2008) do estudo de um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro f.54 Tabela 6. Comparação dos problemas reprodutivos observados no rebanho bovino estudado entre o 1º e 2º momentos do estudo f.57

13 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO f REVISÃO DE LITERATURA f CARACTERÍSTICAS GERAIS DA LEPTOSPIROSE f Histórico f O agente f Epidemiologia da Leptospirose f A INFECÇÃO NOS BOVINOS f Ocorrência do serovar Hardjo f A enfermidade em bovinos f Patogenia f Profilaxia e Controle da leptospirose em bovinos f.33 3 OBJETIVOS f OBJETIVO GERAL f OBJETIVOS ESPECÍFICOS f MATERIAL E MÉTODOS f DESENHO DO ESTUDO f CARACTERIZAÇÃO DO REBANHO f ANÁLISE DA PROPRIEDADE E DO MANEJO DOS ANIMAIS f ANÁLISE DOS PARÂMETROS REPRODUTIVOS f ANÁLISE SOROLÓGICA f ANTIBIOTICOTERAPIA E VACINAÇÃO f ANÁLISE ESTATÍSTICA f RESULTADOS f ANÁLISE SOROLÓGICA f.48

14 5.2 ANÁLISE DOS PARÂMETROS REPRODUTIVOS f ANÁLISE DA PROPRIEDADE E MANEJO DOS ANIMAIS f ANÁLISE FINAL DO REBANHO f DISCUSSÃO f CONCLUSÕES f REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS f.73 ANEXOS f.84

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16 1 INTRODUÇÃO A leptospirose é uma doença infecciosa determinada pelos diferentes serovares da espiroqueta Leptospira sp. e pode acometer diversas espécies de animais, inclusive os bovinos. O microrganismo está presente na água, solo e reservatórios animais de zonas urbanas e rurais. Os animais infectados podem desenvolver o estado de portadores crônicos renais e tornarem-se reservatórios, eliminando leptospiras viáveis na urina por tempo variável. A leptospirose nos bovinos está amplamente distribuída em nosso meio, gerando grandes perdas econômicas para os produtores por estar diretamente ligada a problemas reprodutivos, tais como abortamentos, mumificação de fetos e ocorrência de natimortos, além de diminuição na produção de leite e no ganho de peso dos animais. Em 1984, Ellis analisou a patogênese e controle da leptospirose em bovinos em países de clima tropical e a dividiu etiologicamente em dois grandes grupos: uma doença determinada por serovares adaptados aos bovinos, como Hardjo, e outra determinada por serovares incidentais, mantidos por outras espécies domésticas ou silvestres que também atuam como reservatórios de Leptospira sp. para os rebanhos, principalmente em regiões de clima tropical. A transmissão e a manutenção da leptospirose em um rebanho bovino dependem de condições favoráveis para a sobrevivência do agente no meio, do número de portadores animais na população, do tempo em que esses animais permanecem como reservatórios de leptospiras e do grau de contato entre hospedeiros naturais e hospedeiros incidentais. Estas condições estão diretamente ligadas às características de manejo de cada rebanho e ao sistema de criação dos

17 15 animais, estando associados a variados fatores de risco relacionados à ocorrência da leptospirose. Alguns importantes fatores de risco associados à transmissão e manutenção da leptospirose em bovinos foram estudados por Lilenbaum e Santos (1996) e Lilenbaum e Souza (2003), tais como região geográfica, sistema de criação, medidas de manejo, assistência veterinária e grau de tecnificação da propriedade. Estes estudos revelaram que, independentemente da região geográfica estudada, em propriedades altamente tecnificadas predomina a infecção determinada por amostras adaptadas, visto que os mecanismos de transmissão de amostras incidentais seriam eliminados pela tecnificação. Já a leptospirose determinada por serovares incidentais está estreitamente relacionada à transmissão indireta, que ocorre quando um bovino entra em contato com leptospiras presentes no meio ambiente contaminado com urina de animais portadores. Por isso, o baixo índice de tecnificação das propriedades e as criações mistas de bovinos com outras espécies são fatores que favorecem a ocorrência deste tipo de infecção. Infecções determinadas por Hardjo apresentam características epidemiológicas bem definidas, pois sendo este serovar adaptado e mantido pelos bovinos, os próprios animais atuam como reservatórios permanentes do agente no rebanho, perpetuando a infecção no rebanho independentemente do contato direto ou indireto com outras espécies. Logo, este tipo de leptospirose é menos dependente do sistema de criação, da região geográfica e de fatores ambientais. O controle da leptospirose em bovinos está associado a diversos fatores ligados ao hospedeiro, ao agente e ao ambiente, que estarão sempre interferindo na ocorrência e no controle da enfermidade num rebanho. Protocolos de controle baseados em vacinação e antibioticoterapia foram descritos (MOREIRA, 1994), mas seus resultados são bastante variáveis, sendo muitas vezes desapontadores. A adoção de mudanças no sistema de manejo que, associadas à vacinação e antibioticoterapia, visem a minimizar os fatores de risco associados à transmissão da leptospirose em cada rebanho, podem contribuir para aumentar a taxa de sucesso nos programas de controle. Portanto, rebanhos bovinos com leptospirose devem ser minuciosamente avaliados a fim de se determinar qual o serovar envolvido na infecção, e se este é adaptado ou incidental. A partir de tais informações, considerando-se as particularidades de cada rebanho e de seu manejo, além de fatores ambientais,

18 16 deve-se estabelecer um programa de controle específico que atue minimizando os fatores de risco ligados à infecção, associando tais medidas complementares ás já consagradas antibioticoterapia e vacinação.

19 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1CARACTERÍSTICAS GERAIS DA LEPTOSPIROSE Histórico A leptospirose é uma doença infecto-contagiosa que acomete os animais domésticos, silvestres e os seres humanos sendo, portanto, classificada como uma zoonose. Esta enfermidade vem assumindo grande importância, tanto nos países em desenvolvimento quanto nos desenvolvidos, afetando a saúde animal, a economia de produção e a saúde pública (GENOVEZ et al. 2003). Em 1907, Stimson observou pela primeira vez as leptospiras em cortes histológicos de rins corados pela prata de um paciente com diagnóstico de febre amarela. As leptospiras formavam agregados nos rins e individualmente apresentavam forma de ponto de interrogação, sendo por isso denominadas como Spirochaeta interrogans. Vinte e um anos antes, em 1886, o médico alemão Adolf Weil descreveria pela primeira vez a leptospirose, como uma doença infecciosa que causa esplenomegalia, nefrite e icterícia ; e assim a forma grave da doença em humanos foi denominada Doença de Weil. O primeiro isolamento de leptospiras patogênicas foi feito por Inada e colaboradores, em 1916, no Japão, que tambémrealizaram estudos clássicos de infecção experimental, comprovando os Postulados de Koch, a proteção passiva em cobaios, distribuição da bactéria nos tecidos, características morfológicas das leptospiras, bem como o papel da ratazana como reservatório (FAINE et al., 2000).

20 18 A leptospirose humana é historicamente uma doença ocupacional. Na China, foi denominada icterícia dos plantadores de arroz. Em outras partes do mundo, como Austrália e Europa, esta foi denominada doença dos cortadores de cana, doença dos criadores de suínos e doença dos trabalhadores de esgoto. No Japão a doença era conhecida como febre outonal. Há relatos de leptospirose na França e Alemanha durante a Primeira Guerra Mundial. Nos anos de , diversas formas clínicas da leptospirose em humanos foram observadas. Nesta mesma época evidenciou-se também a importância da doença nos animais domésticos (LEVETT, 2001). Com o passar dos anos, diversas variantes de Leptospira sp. foram isoladas de pacientes humanos determinando variadas síndromes, que aos poucos foram sendo reconhecidas como diferentes manifestações clinicas da leptospirose. Além disso, muitas amostras foram identificadas em diferentes reservatórios animais. Os primeiros relatos publicados identificando novas amostras de Leptospira sp. e seus respectivos reservatórios animais foram de pesquisadores japoneses e alemães nas décadas de 20 e 30 (FAINE et al. 2000). Nesta mesma época a leptospirose foi caracterizada como uma enfermidade primariamente relacionada aos cães, causada pelos serovares Canicola e Icterohaemorrhagiae. No entanto, somente nas décadas de 30 e 40 a leptospirose foi reconhecida como uma doença de relativa importância na medicina veterinária, quando os primeiros relatos da enfermidade foram feitos em bovinos na Rússia, relacionando a doença à queda na produção dos animais (SEMSKOV, 1940). Em 1939, uma ampla relação de serovares e seus relativos hospedeiros foi publicada (Walch-Sorgdrager, 1939) e em 1958 Alston e Broom complementaram esta listagem acrescentando outros serovares. O conhecimento sobre a leptospirose em animais domésticos foi bastante enriquecido pelos relatos de Morse e colaboradores (1957) e Morter e colaboradores (1958). Na década de 80, Ellis e seus colaboradores (1981;1983;1984;1985;1986) demonstraram o papel da glândula mamária e do trato genital na transmissão da leptospirose e atestaram sua grande importância na medicina veterinária. Kmety e Dikken (1988) publicaram um documento com histórico cronológico e bibliográfico completo da identificação dos serovares de Leptospiras sp. O quadro 1 apresenta os principais sorogrupos e serovares de Leptospira sp. e seus respectivos hospedeiros de manutenção.

21 19 Quadro 1 Lista de alguns serovares, sorogrupos, espécie e hospedeiro de manutenção de Leptospira sp. (Adaptado de Faine et al. 2000) Serovar Sorogroupo Espécie Hospedeiro Hardjo (hardjobovis) Sejroe L. borgpetersenii Bovinos Hardjo (hardjoprajitno) Sejroe L. interrogans Bovinos Copenhageni Icterohaemorrhagiae L. interrogans Roedores Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae L. interrogans Ratazana Pomona Pomona L. interrogans Suínos Canicola Canicola L. interrogans Caninos

22 O agente A palavra leptospira deriva do grego e traduz-se leptós - fino, pequeno, delicado e speira, espiral. São bactérias helicoidais de 6 a 20 µm de comprimento e 0,1 µm de diâmetro (LEVETT, 2001), filamentosas, delgadas, podendo apresentar uma ou ambas as extremidades curvadas em formato de gancho (LEVETT, 2001; TORTORA, FUNKE e CASE, 2003). Nestas extremidades, as leptospiras, que são espiroquetas, possuem dois flagelos polares conhecidos como filamentos axiais ou flagelos periplasmáticos, que lhes garantem alta motilidade (FAINE et al., 2000; LEVETT, 2001; BARTHI et al., 2003). Assim, podem realizar movimentos de rotação e translação ao longo do seu eixo, em linha reta ou em círculos (TORTORA et al., 2003). O lipopolissacarídeo que compõe a membrana externa das leptospiras se assemelha com o das bactérias Gram-negativas, porém possui menor atividade endotóxica (SHIMIZU et al., 1987). Estas espiroquetas não se coram pelos métodos usuais de coloração, sendo visualizadas apenas em microscopia de campo escuro ou em microscopia de campo claro de contraste de fase, ou ainda, em preparações impregnadas pela prata (FAINE et al., 2000). Condições aeróbicas são essenciais e determinam seu crescimento (LEVETT, 2001; TORTORA et al., 2003). Vale salientar que uma concentração ainda indefinida de CO 2 é indispensável para o início do crescimento acima citado. Desenvolvem-se em temperatura ótima de 28 a 30ºC e ph 7,2 a 7,6 (FAINE et al., 2000). Demandam meios especiais de cultivo, não crescendo na ausência de albumina (opta-se geralmente pela bovina a qual se acrescenta 1% ao meio) ou soro (sendo mais utilizado o de coelho na proporção de 10%), sendo que vitaminas B1, B12, fosfato, cálcio, magnésio, amônia e ferro são nutrientes essenciais para o seu desenvolvimento (FAINE et al., 2000; LEVETT, 2001). A sua principal fonte de energia são os ácidos graxos de cadeia longa. O meio de cultura mais utilizado para o seu cultivo é o meio líquido de Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH), que contém ácido oléico, soroalbumina bovina como detoxificante e tween 80 como fonte de carbono (ELLINGHAUSEN e MCCULLOUGH, 1965; JOHNSON e HARRIS, 1967). As leptospiras patogênicas possuem longo tempo de geração, variando de 8 a 18 horas. O crescimento em meio de cultura pode variar de dois a 30 dias (FAINE

23 21 et al., 2000), podendo levar até 26 semanas em isolamentos primários (ELLIS et al., 1983). As bactérias do gênero Leptospira sp são pouco resistentes, sendo rapidamente eliminadas pela desidratação e temperatura entre C. A resistência aos desinfetantes é bastante pequena. São inibidas em ph inferior a 6,8 ou superior a 8,0 e temperaturas inferiores a 10 C. No entanto, quando em condições favoráveis, sobrevivem na água e em cultura por longos períodos (TRUEBA et al., 2004). Solos, lama, coleções de água doce, rios (NELSON e COUTO, 2006), pântanos, órgãos e tecidos de animais vivos ou mortos são também citados como possíveis habitats para a espiroqueta. As espécies patogênicas podem sobreviver no ambiente, mas preferencialmente encontram-se no hospedeiro, onde se multiplicam (FAINE et al., 2000). As leptospiras saprófitas e patogênicas tendem naturalmente a formar agregados em coleções de água (TRUEBA et al., 2004; GANOZA et al., 2006) e são capazes de formar biofilmes in vitro (RISTOW et al., 2008). Agregados de leptospiras também são observados nos túbulos renais de ratos colonizados (ATHANAZIO et al., 2008). As leptospiras pertencem a Ordem Spirochaetales, a qual faz parte de um filo bacteriano único, Spirochaetes. A família Leptospiraceae compreende o gênero Leptospira sp, o qual é composto por bactérias saprófitas e patogênicas. A taxonomia e classificação das leptospiras são bastante complexas e vêm sofrendo diversas alterações ao longo dos últimos anos (PEROLAT et al., 1998; BRENNER et al., 1999; LEVETT et al., 2001). Até 1989 o gênero Leptospira sp era classificado de acordo com a sorologia, baseando-se na variabilidade do lipopolissacarídeo de parede, e de acordo com o fenótipo bacteriano; sendo dividido em dois grandes grupos, Leptospira biflexa sensu lato, contendo as leptospiras saprófitas ou ambientais e Leptospira interrogans sensu lato, contendo as leptospiras patogênicas (BHARTI et al., 2003). Diversos serovares foram identificados de acordo com a aglutinação sorológica que era observada (FAINE et al., 2000) e os que se relacionavam antigenicamente foram reunidos em sorogrupos, os quais não fazem parte da taxonomia, mas são indispensáveis à compreensão da epidemiologia e diagnóstico da doença. Sabe-se que existem mais de 250 serovares agrupados em 24 sorogrupos (LEVETT, 2001).

24 22 A classificação fenotípica vem sendo substituída pela genotípica, baseada na hibridização DNA-DNA, a qual agrupou as leptospiras em diversas espécies genômicas, correspondendo então a grupos com DNA relacionado (LEVETT et al., 2001; MATTHIAS et al., 2008). Até o momento, foram identificadas 14 espécies e quatro genomospecies (ainda não denominadas), com cepas contendo 70% ou mais de relação DNA-DNA (PEROLAT et al., 1998; BRENNER et al., 1999; LEVETT et al., 2005; MATTHIAS et al., 2008). Como a reclassificação do gênero manteve os nomes das espécies L. interrogans e L. biflexa, para evitar confusão na nomenclatura chama-se L. interrogans sensu lato e L. biflexa sensu lato quando se refere à antiga nomenclatura sorológica, e L. interrogans sensu strictu e L. biflexa sensu strictu quando se refere às genomoespécies (LEVETT, 2001). O maior problema da classificação genotípica é que muitas vezes um mesmo serovar pode representar mais de uma espécie genômica (BRENNER et al., 1999). A classificação molecular permanece confusa para a microbiologia clínica e a epidemiologia, sendo ainda aceito referir-se às leptospiras pela classificação sorológica antiga (BHARTI et al., 2003) Epidemiologia da Leptospirose A leptospirose é uma doença que acomete humanos e animais, tem distribuição mundial em áreas urbanas, silvestres e rurais e sua ocorrência está ligada a fatores ambientais e climáticos (VASCONCELLOS, 2000), podendo manifestar-se em níveis endêmicos ou gerar surtos epidêmicos (BLAZIUS et al., 2005). Possui caráter sazonal descrito por diversos autores, estando diretamente relacionada a períodos chuvosos, quando há elevação do índice pluviométrico (JOUGLARD e BROD, 2000; BLAZIUS et al., 2005). Os roedores são os principais reservatórios do agente, notadamente do serovar Icterohaemorrhagiae, e a ratazana de esgoto (Rattus norvegicus) tem papel fundamental na transmissão da doença no meio urbano (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003). Há uma grande diversidade de reservatórios ou hospedeiros de manutenção de leptospiras, compreendendo animais silvestres e domésticos. Cada serovar tende a ser mantido por um hospedeiro animal específico,

25 23 sendo então este serovar considerado adaptado à determinada espécie animal (ELLIS, 1984; FAINE et al., 2000). Os reservatórios animais são cronicamente infectados nos rins pelos diferentes serovares de Leptospira sp. (ATHANAZIO et al., 2008). Assim, a transmissão da leptospirose ocorre pela eliminação de leptospiras na urina com a posterior contaminação da água e solo, sendo esse o principal veículo de transmissão da doença (JOUGLARD e BROD, 2000; MCBRIDE et al., 2005); ou ainda, as leptospiras podem persistir no trato genital, sendo desta forma eliminadas pelo sêmen e secreções vaginais e, portanto transmitidas pela cópula ou inseminação artificial (FAINE et al., 2000). Acredita-se que as leptospiras sejam eliminadas em altas concentrações na urina de ratos, visto que recente estudo demonstrou que ratos experimentalmente infectados eliminam até 10 7 bactérias/ml de urina (NALLY et al., 2005). No Rio de Janeiro, já foi demonstrado que cerca de 30% das ratazanas de vida livre são portadoras de leptospiras, predominantemente do sorogrupo Icterohaemorrhagiae (LILENBAUM et al., 1993). O estado de portador renal dos hospedeiros de manutenção é um elemento chave na transmissão da leptospirose. As leptospiras naturalmente tendem a formar agregados na água, o que pode estar relacionado à sua manutenção no meio ambiente (TRUEBA et al., 2004). As vias de transmissão clássicas da leptospirose são através do contato com a pele lesada e mucosa. O conhecimento dos serovares e seus hospedeiros de manutenção são essenciais para a compreensão da epidemiologia da doença em uma dada região (LEVETT, 2001). Os animais que sobrevivem à fase aguda da leptospirose podem desenvolver a condição de portadores convalescentes onde as leptospiras instalam-se e multiplicam-se nos túbulos renais e são eliminados para o meio ambiente por períodos variáveis. Imunoglobulinas específicas são normalmente achadas na urina (FAINE et al., 2000). A enfermidade nos animais domésticos apresenta diversas manifestações clínicas, dependendo da espécie animal, do serovar infectante envolvido e do ambiente. Serovares adaptados tendem a causar doença crônica e por vezes subclínica nos hospedeiros de manutenção; enquanto que serovares não adaptados tendem a causar doença aguda e grave. Nos bovinos, por exemplo, doença determinada por serovares não adaptados, como Grippotyphosa ou Pomona, em geral apresentam caráter agudo, com manifestações clínicas aparentes

26 24 (LILENBAUM e SANTOS, 1995). No entanto, em casos de infecção determinadas por Hardjo, é mais comum observar-se doença crônica e subclínica associada a problemas reprodutivos. A ocorrência de leptospirose é variável em diferentes partes do mundo, podendo observar-se tanto de forma esporádica quanto endêmica. Os surtos ocorrem por exposição à água contaminada com urina ou tecidos provenientes de animais infectados (FAVERO et al. 2002). Existem vários ciclos epidemiológicos na leptospirose, que envolvem diferentes reservatórios e mecanismos de transmissão, mas as condições ambientais são sempre muito importantes para a ocorrência da doença (ANDRÉ-FONTAINE E GARNIÉRE, 1990). 2.2 A INFECÇÃO NOS BOVINOS A leptospirose em bovinos é uma zoonose relatada mundialmente como importante causa de prejuízos econômicos por comprometer os níveis de produção e produtividade dos rebanhos afetados (FAVERO et al., 2001) Os primeiros trabalhos sobre leptospirose em bovinos no Brasil surgiram no final da década de 1950, a partir dos relatos pioneiros de Freitas e colaboradores (1957), que pela primeira vez identificaram no país a existência da infecção pelo serovar Pomona, em um feto abortado em São Paulo. Nos anos 70, um número consideravelmente maior de pesquisadores interessou-se pelo estudo das leptospiroses em bovinos. Assim, além de São Paulo, houve relatos da enfermidade em bovinos de Minas Gerais (REIS et al., 1973; MOREIRA et al., 1979), Rio de Janeiro (CORDEIRO et al., 1975), Rio Grande do Sul (WILLIAMS et al., 1975; OLIVEIRA, 1977; VAZ & OLIVEIRA, 1977) e na Bahia (DÓRIA & SANTANA, 1976; CALDAS et al., 1977). Até então, na maior parte dos relatos, observava-se a predominância do serovar Pomona, seguido por Wolffi e Sejroe. No entanto, na época, o serovar Hardjo não era incluído nas baterias de diagnóstico. A técnica de soroaglutinação com antígenos vivos já era, então, amplamente aceita e utilizada nestes estudos.

27 Ocorrência do serovar Hardjo O serovar Hardjo passou a ser mais valorizado a partir de seu primeiro isolamento a partir de bovinos nos Estados Unidos (ROTH e GALTON, 1960). Na América Latina o primeiro isolamento foi obtido na Argentina (MYERS & JELAMBI, 1975). No início da década de 80, diversos pesquisadores passaram a se dedicar ao estudo das leptospiroses em bovinos, em especial à compreensão da epidemiologia que envolve o serovar Hardjo nesta espécie. Nesta época, Oliveira e colaboradores (1980) relataram altos títulos reagentes para Hardjo em bovinos no Rio Grande do Sul. Estes mesmos autores obtiveram pela primeira vez no Brasil o isolamento de leptospiras do sorogrupo Hebdomadis sorogrupo a que pertencia o serovar hardjo na ocasião - a partir do sangue de um animal, que, no entanto, não chegou à classificação final do serovar. A transmissão de Hardjo entre bovinos foi mais bem elucidada por Ellis e colaboradores (1981) que obtiveram seu isolamento a partir dos rins de 57 vacas, o que confirmou a adaptação desta amostra à espécie bovina e o papel desta como mantenedora renal do espiroqueta. A partir de tal fato, pesquisadores de outras regiões passaram a incluir amostras de Hardjo em suas baterias de sorodiagnóstico. A partir de achados sorológicos, Abuchaim e Dutra (1985), constataram a grande importância deste serovar em animais da bacia leiteira de Porto Alegre, paralelamente à Pomona e Sejroe. Na Bahia (DÓRIA et al., 1980), no Mato Grosso (MADRUGA et al., 1980) e em Minas Gerais, foi observada alta ocorrência de Hardjo (RIBEIRO et al., 1988). Posteriormente, o isolamento de Hardjo no trato genital de vacas não-prenhas mostrou que a persistência extra-renal da espiroqueta poderia ser importante para a manutenção do estado de portador, sugerindo a transmissão venérea da enfermidade entre bovinos, visto que também houve isolamento do trato genital de touro naturalmente infectados (ELLIS et al. 1986). A partir destes relatos, dois estudos realizados em São Paulo por GIRIO e MATHIAS (1989) e, posteriormente, GIRIO e colaboradores (1990) estudaram a influência das leptospiroses e do serovar Hardjo sobre a eficiência reprodutiva de vacas leiteiras. Em 1993, Moreira e colaboradores estudaram um surto de leptospirose em Minas Gerais e descreveram a ocorrência de abortamentos, mastites e morte fetal com predominância de Hardjo e Wolffi no sorodiagnóstico. No mesmo ano,

28 26 Lilenbaum e colaboradores (1993) relataram a importância do sorogrupo Sejroe, incluindo o serovar Hardjo, como agentes da leptospirose em bovinos do Rio de Janeiro. Em um estudo mais amplo no Rio de Janeiro, Lilenbaum e colaboradores (1995) examinaram 405 amostras de vacas com problemas reprodutivos, e observaram 68,4% de reações positivas, com predominância de Hardjo (21%), seguido de Wolffi (13,8%). No mesmo ano, Lilenbaum e Santos analisaram o papel do serovar Hardjo nas leptospiroses em bovinos, que foi encontrado em 80,9% das propriedades testadas, o que atestou sua ampla disseminação no rebanho bovino deste estado. No período de 1984 a 1997 Favero e colaboradores (2001) compilaram dados sorológicos para determinar os serovares mais prevalentes em 21 estados do Brasil. Os resultados demonstraram 84,1% dos rebanhos com pelo menos um animal sororeativo, tendo pelo menos um rebanho positivo por estado. Neste estudo, o estado do Mato Grosso do Sul apresentou animais sororeativos em 100% dos rebanhos testados. Houve grande predominância de Hardjo (51,5%) frente aos outros serovares testados. Em 2001, Homem e colaboradores realizaram inquérito sorológico em rebanhos da região amazônica e encontraram 61,2% de sororeatividade para Hardjo, confirmando sorologicamente a presença deste serovar na região norte do país. Araújo e colaboradores (2005) realizaram novo inquérito em Minas Gerais e encontraram como serovares mais freqüentes: Hardjo, amostra Norma, Hardjo amostra hardjoprajitno, Hardjo amostra hardjobovis e Wolffi. Segundo os autores, estes resultados mostraram a grande relevância de Hardjo como problema prioritário nas leptospiroses em bovinos no estado de Minas Gerais. No ano de 2007, Mineiro e colaboradores no estado do Piauí e Figueiredo no estado do Mato Grosso também relataram a predominância de Hardjo em bovinos, encontrando 39,5 e 65,6% de sororeatividade respectivamente. Em amplo estudo realizado em todo o estado de São Paulo por Castro (2007), foi constatado que a infecção por Leptospira sp. estava presente em 49,4% das propriedades estudadas, sendo o serovar Hardjo (46%) o predominante. Além disso, o estudo também demonstrou que a distribuição deste serovar é praticamente homogênea em todas as regiões do estado de São Paulo.

29 27 Observa-se, portanto, que o panorama da leptospirose nos rebanhos bovinos nacionais segue o padrão encontrado em todo o mundo, com grande predominância do serovar Hardjo nas diferentes regiões do Brasil A enfermidade em bovinos Uma vez introduzido em um rebanho, o serovar Hardjo estabelece níveis variáveis de infecção, podendo persistir por longos períodos (ELLIS, 1994). Os bovinos infectados usualmente eliminam o agente pela urina por tempo prolongado, o que determina a contaminação de outros indivíduos e do ambiente. Desta forma, a leptospirose em bovinos deve ser encarada como doença coletiva, e não apenas como moléstia individual, que freqüentemente passa despercebida pelas dificuldades de diagnóstico verificadas a campo. Nos bovinos, as leptospiroses causam consideráveis perdas econômicas em decorrência das diversas manifestações de infertilidade, tais como repetições de cio, aumento do número de serviços por concepção, aumento do intervalo entre partos, mastites, abortamentos, natimortalidade, bezerros prematuros, nascimento de bezerros fracos e decréscimo na produção de leite e de carne (ARAÚJO et al, 2005). O abortamento, embora não seja o achado mais comum da enfermidade, frequentemente é o único sinal clínico observado (AMATREDJO & CAMPBELL, 1975). Em 1984, Ellis analisou a patogênese e controle da leptospirose bovina em países tropicais e a dividiu etiologicamente em dois grandes grupos: uma doença determinada por serovares adaptados ao gado bovino (Hardjo), e outra determinada por serovares incidentais, mantidos por outras espécies domésticas ou silvestres, mais dependentes da influência de fatores ambientais, tais como clima e índices pluviométricos. Infecções determinadas por Hardjo, um serovar adaptado e mantido pelos próprios bovinos, tem um caráter epidemiológico bem definido, pois sua transmissão é menos dependente da região geográfica ou de fatores climáticos e mais ligados a

30 28 fatores de risco como o manejo inadequado do rebanho e o grau de tecnificação da fazenda. O papel de Hardjo como a principal amostra patogênica para bovinos é aceito mundialmente (FAINE et al., 2000) e no Brasil inquéritos sorológicos feitos em Minas Gerais (MOREIRA et al., 1979; RIBEIRO et al., 1988; RIBEIRO et al., 2000), no Mato Grosso (MADRUGA et al., 1980), no Rio de Janeiro (LILENBAUM et al., 1995), em São Paulo (VASCONCELLOS et al., 1997; LANGONI et al., 2000), em Pernambuco (OLIVEIRA et al., 2001) e na região amazônica (AGUIAR et al., 2006) encontraram elevada freqüência de bovinos reagentes para este serovar. Teoricamente, qualquer serovar de Leptospira pode infectar um animal, no entanto o que se observa é que apenas um pequeno número de serovares é encontrado em uma determinada região e espécie (ELLIS, 1984). No caso de Hardjo, considera-se que a transmissão direta de bovino para bovino é o mecanismo mais importante para sua manutenção no rebanho (FAINE et al, 2000), o que explica sua alta prevalência em propriedades tecnificadas e com sistema intensivo de produção leiteira. No que diz respeito a outros serovares encontrados em nosso meio, tais como Bratislava e Pomona, estas caracterizam as chamadas infecções incidentais, e são atribuídas ao contato direto ou indireto do bovino com a urina de outras espécies, principalmente suínos. Sua ocorrência é fortemente influenciada por outras variáveis como índice pluviométrico, região geográfica e sistema de produção adotado na propriedade. No Brasil, foi demonstrado que a ocorrência de infecções incidentais está diretamente ligada ao manejo adotado na propriedade; quanto menos tecnificada a criação, maior as chances de infecções deste grupo (LILENBAUM e SANTOS, 1995) Patogenia A dinâmica da patogenia da leptospirose é complexa e multifatorial. A motilidade e morfologia das leptospiras favorecem a sua penetração através do contato direto da pele lesada ou mucosas íntegras com a urina ou órgãos de animais

31 29 portadores de leptospiras. As vias transplacentária e mamária também devem ser consideradas na transmissão da leptospirose. A via venérea, pela monta natural realizada entre animais infectados, também é considerada uma importante via de transmissão direta da leptospirose (FAINE et al., 2000). A possibilidade de transmissão da leptospirose pelo sêmen industrializado é minimizada, desde que sejam seguidos os critérios relativos à saúde do touro e da manipulação do ejaculado exigidos pelo Escritório Internacional de Epizootias (OIE) (HEINEMANN et al., 1999). Após a infecção segue-se uma rápida disseminação da bactéria na corrente sanguínea do hospedeiro, ocorrendo multiplicação ou leptospiremia com duração média de três a 10 dias. Este período compreende a primeira fase da doença, onde não resposta imune detectável e com sintomatologia branda e inespecífica. Após esta fase, ocorre o desenvolvimento de anticorpos específicos pelo sistema imune e as leptospiras irão migrar para seus órgãos alvo, principalmente, fígado, pulmões e musculatura esquelética e trato genital feminino, locais onde se desenvolverá toda sintomatologia clássica da leptospirose (ELLIS, 1984). Acredita-se que a explicação para a escolha de tais órgãos se deva ao aporte sanguíneo ser limitado nestas regiões o que leva a uma menor eficiência das imunoglobulinas nestes locais (FAINE et al., 2000). Segundo GUYTON (1981), o fluxo sanguíneo renal na cortical corresponde a 20% do débito cardíaco, enquanto na região medular externa e interna é de 9% e 1% respectivamente, corroborando com os achados de ATHANAZIO et al. (2008) que sugerem que as leptospiras encontrem nos rins um escape do sistema imune. A localização renal é a mais importante do ponto de vista epidemiológico (FAINE et al., 2000), pois a urina passa a ser a principal via de eliminação dos microrganismos. A leptospirúria é intermitente e pode persistir por meses ou anos e os animais tornam-se fontes de infecção junto ao rebanho. Os rins colonizados por leptospiras apresentam nefrite túbulo-intersticial, com a presença de focos inflamatórios, necrose tubular e hemorragias. As leptospiras são encontradas em grande número nos túbulos contorcidos proximais, glomérulos e interstício (BARNETT et al., 1999; NALLY et al., 2004; YANG et al., 2006), no citoplasma de macrófagos e em depósitos formados a partir de células degeneradas (MORRISON e WRIGHT, 1976). A lesão tecidual primordial da leptospirose parece ser a lesão endotelial, levando à vasculite e às hemorragias nos tecidos (LEVETT, 2001). Hemorragias,

32 30 anemia hemolítica, hemoglobinemia, hemoglobinúria e icterícia são achados decorrentes da hemólise e lesão endotelial (DAHER et al., 2002; WAGENAAR et al., 2007). A trombocitopenia é comumente observada nas formas graves da leptospirose, podendo ocorrer em decorrência de hemorragias, citotoxicidade e agregação plaquetária (NICODEMO et al., 1989; GREENE, 2004; YANG et al., 2006; WAGENAAR et al., 2007). A obstrução tubular originada a partir do edema intersticial e menor perfusão renal resulta em diminuição progressiva da filtração pelo glomérulo. O infiltrado celular observado nestes casos está associado à produção local de anticorpos e, secundariamente, à fagocitose (MORRISON e WRIGHT, 1976). O quadro de insuficiência renal provoca azotemia, aumento de creatinina, oligúria ou anúria, alterações do sedimento urinário, proteinúria, glicosúria, natriurese e caliurese (KO et al., 1999; DAHER et al., 2002; NALLY et al., 2004). A presença de leptospiras no fígado leva ao dano hepatocelular, provocando lesões hepáticas típicas tais como perda da arquitetura tecidual, focos de necrose hepatocitária, focos de inflamação, presença de células de Kupffer aumentadas e eventualmente presença de células apoptóticas (MERIEN et al., 1998; NALLY et al., 2004, YANG et al., 2006). As leptospiras localizam-se em sinusóides e canalículos biliares, levando à colestase e provocando um aumento de bilirrubina sérica, contribuindo para o quadro de icterícia (da SILVA et al., 2002). Observa-se ainda aumento das transaminases hepáticas, gama glutamil transferase e fosfatase alcalina (da SILVA et al., 2002; PEREIRA et al., 2005). O dano pulmonar principal na leptospirose ocorre devido à intensa hemorragia intra-alveolar (NALLY et al., 2004; PEREIRA et al., 2005; YANG et al., 2006), levando à insuficiência respiratória (GOUVEIA et al., 2008). Raras leptospiras são visualizadas nos pulmões (NALLY et al., 2004; YANG et al., 2006), sugerindo outro mecanismo de patogenia neste órgão que não a ação direta do microrganismo. A presença de imunocomplexos em membranas alveolares de cobaios sugere um processo auto-imune como etiologia da hemorragia pulmonar observada na leptospirose (NALLY et al., 2004). Em casos graves os pulmões apresentam grandes sufusões. Já no coração observa-se pericardite e petéquias no epicárdio e endocárdio (BALDWIN e AYKINS, 1987). A resposta imune contra leptospiras parece ser estimulada por componentes da membrana externa, como lipopolissacarídeos (LPS), proteínas e lipoproteínas. A resposta adquirida se desenvolve a partir da segunda semana de infecção e é

33 31 específica para o serovar infectante. A especificidade é conferida pelo LPS, que é altamente imunogênico (LEVETT, 2001). Os anticorpos específicos opsonizam as leptospiras, as quais são fagocitadas por macrófagos (MERIEN et al., 1997). WANG et al. (1984) observaram resistência de leptospiras à fagocitose por neutrófilos. Já SEBASTIAN (1994) verificou que na leptospirose a intensidade das lesões teciduais está intimamente relacionada à estirpe do serovar e a adaptabilidade do hospedeiro. A localização das leptospiras no trato reprodutivo das vacas resulta em infecção uterina, que pode persistir em vacas vazias por até 97 dias e nas prenhas por até 142 dias. A infecção uterina resulta em leptospirose congênita que pode determinar abortamento em qualquer momento da gestação (FAINE et al. 2000). Durante a fase de leptospiremia há morte fetal, com ou sem regeneração placentária, seguida de eliminação fetal entre 24 e 48 horas após a infecção (RADOSTITS et al., 2000). Após e expulsão do feto pode haver persistência das leptospiras nas tubas uterinas por até 22 dias após o parto, bem como a eliminação do microrganismo por descargas vaginais ou através dos anexos fetais (ELLIS, 1984). Fetos bovinos infectados no terço final da gestação que não são abortados podem desenvolver resposta imune humoral detectável (ELLIS, 1984). Na infecção pelo serovar Hardjo, além dos rins, o trato genital superior parece ser um importante sítio de localização das leptospiras. Particularmente na infecção de bovinos pelo serovar Hardjo a via venérea é bastante importante para a disseminação do agente no rebanho e no ambiente (CASTRO, 2006). O isolamento do serovar Hardjo do trato genital de touros naturalmente infectados sugere tal importância, pois a introdução do microrganismo por via intrauterina estabelece a infecção de fêmeas, que passam a excretá-lo pela urina por até 54 semanas (FAINE et al., 2000). Este microrganismo, assim como os serovares Pomona e Hebdomadis, também foi demonstrado em glândulas acessórias e em testículos de touros e no sêmen, inclusive com a presença de aglutininas anti-leptospira no plasma seminal (ELLIS, 1994). Nas fêmeas bovinas, a infecção por Hardjo parece ter efeito direto sobre a fertilização interferindo com a função do corpo lúteo, pela diminuição dos níveis de progesterona (DHALIWAL et al., 1996). Hardjo também tem sido relatado persistindo na glândula mamária de bovinos (THIERMANN, 1984). Estas infecções não são, normalmente, tão severas quanto àquelas determinadas por serovares não adaptados aos bovinos, que determinam surtos de abortamento no rebanho (DHALIWAL et al., 1996).

34 32 Investigações de Ellis e colaboradores (1986) com animais acometidos de infecção por Hardjo revelaram que este serovar pode colonizar diferentes estruturas do aparelho genital das fêmeas (ovários, ovidutos, útero e vagina) e dos machos (testículo, epidídimo e vesícula seminal) e com isto comprometer o desempenho reprodutivo destes animais. Mineiro e colaboradores (2007) realizaram um estudo sobre a relação entre o serovar infectante e a quantidade de transtornos reprodutivos observados nos animais e constataram que a maior relação entre transtornos reprodutivos e infecção foi observada para Hardjo, seguida por Icterohaemorrhagiae, Wolffi, Bratislava e Hebdomadis. A relação entre a presença de transtornos reprodutivos com a infecção por Hardjo tem sido observada em rebanhos bovinos do mundo todo (NIANG et al., 1995; LILENBAUM et al., 1995; VASCONCELLOS et al., 1997). Quanto aos demais serovares, não se encontrou relação entre prevalência da infecção e ocorrência de transtornos reprodutivos. Esses dados sugerem maior virulência do serovar Hardjo quanto aos transtornos reprodutivos, comparados aos demais serovares. Os sinais clínicos na leptospirose bovina podem ser divididos em duas fases distintas: a primeira, aguda, que coincide com a bacteremia é mais observada com maior frequencia em rebanhos jovens, enquanto a segunda fase, crônica, ocorre mais tardiamente e seus efeitos são mais aparentes no trato genital (ELLIS, 1984). Esta última fase está geralmente associada aos serovares Hardjo e Pomona, determinando abortamentos, natimortos, nascimento de prematuros fracos, ou aparentemente normais, mas portadores do agente (GUITIAN et al., 1999). No gado leiteiro, o aparecimento de mastite (Síndrome da Queda do Leite ou Milk Drop Syndrome), com agalactia e pequena quantidade de sangue presente no leite também tem sido relatada em alguns países. Há queda na produção de leite que perdura por dois a dez dias e se apresenta com cor amarelada, com consistência de colostro e elevada contagem somática, o que a diferencia das mastites normais (FAINE et al., 2000). A mastite pode ocorrer de forma epizoótica em rebanho não exposto e acometer cerca de 50% dos animais e perdurar por mais de dois meses, ou ainda mais comumente em rebanhos endêmicos na 1º e 2ª lactação. Nestes casos o retorno ocorre em torno de dez dias, mas os animais já não atingem mais a total potencialidade de produção de leite. Esta síndrome está particularmente ligada ao serovar Hardjo (ELLIS, 1984).

35 Profilaxia e Controle da leptospirose em bovinos O estudo soroepidemiológico de um rebanho permite não somente a identificação sorológica da ocorrência de uma enfermidade, como também o acompanhamento dos níveis de anticorpos específicos contra um determinado agente nos animais testados em diferentes momentos. Além disso, permite identificar animais portadores assintomáticos, bem como infecções latentes ou subclínicas, sempre visando o controle e a erradicação de uma enfermidade. O controle da leptospirose em bovinos é fundamental para prevenir as manifestações clínicas da enfermidade e minimizar os transtornos reprodutivos e as perdas econômicas. Para isso, seu controle depende primariamente de um método de diagnóstico em que se procure identificar na propriedade qual o serovar infectante, além da adoção de medidas que visem corrigir fatores envolvidos na manutenção e transmissão da doença no rebanho. A leptospirose em bovinos e seu controle dependem de uma variedade de fatores, sejam eles inerentes ao hospedeiro, ao agente ou ao ambiente, que podem estar favorecendo a ocorrência ou o controle da enfermidade num rebanho. Pouco se tem estudado sobre os variados fatores de risco envolvidos na ocorrência da leptospirose em bovinos. Uma variável será considerada contribuinte (fator de risco) para a ocorrência da leptospirose num rebanho se a freqüência da doença é aumentada pela sua presença ou reduzida pela sua ausência (CASTRO, 2006). Diante de infecções incidentais, determinadas por serovares que não são mantidos pelos bovinos, como Pomona ou Icterohaemorrhagiae, deve-se identificar falhas no sistema de criação e descobrir de que forma o rebanho está mantendo contato com reservatórios naturais destes serovares, como suínos, ratos e animais silvestres e o controle de tais infecções é baseado essencialmente em medidas de higiene e tecnificação do sistema de criação do rebanho (LILENBAUM e SOUZA, 2003). No entanto, quando a infecção é determinada por amostras mantidas por bovinos, (Hardjo), o seu controle se torna mais complexo, uma vez que a principal forma de transmissão no rebanho é a direta entre os animais. Protocolos baseados em vacinação e antibioticoterapia são amplamente sugeridos na literatura (MOREIRA, 1994), mas poucos levam em consideração as particularidades de cada

36 34 região ou as características individuais de cada rebanho. Desde que ELLIS (1984) afirmou que as infecções determinadas por amostras adaptadas aos bovinos (como Hardjo) seriam menos influenciadas por variáveis ambientais, tal aspecto do controle epidemiológico tem sido negligenciado. Não há descrição na literatura de métodos complementares de controle da leptospirose em condições tropicais, onde os índices pluviométricos e os sistemas de criação podem ser diferentes daqueles encontrados em países de clima temperado, onde encontramos a maior parte dos estudos sobre leptospirose em bovinos. Diante de rebanhos infectados por Hardjo, Lilenbaum (1996) sugeriu medidas de controle que envolvem três linhas básicas de atuação simultânea. (1) Proibir a incorporação de novos animais no rebanho, salvo quando negativos ao exame sorológico ou previamente tratados com dihidroestreptomicina; (2) Tratamento dos animais que apresentarem títulos <200 às reações sorológicas, ou que apresentaram sinais clínicos sugestivos de leptospirose recentemente. A droga de escolha é a dihidroestreptomicina, na dose de 25 mg/kg PV, sendo administrada usualmente em dose única, por via intramuscular. Opcionalmente pode-se utilizar penicilina ou tetraciclina, embora os resultados apresentados não sejam tão satisfatórios (AMATREDJO & CAMPBELL, 1975), e (3) Vacinação do rebanho todo com bacterinas, atentando para o fato de que o serovar identificado na sorologia deve estar presente na formulação da vacina, quando apresentações comerciais são empregadas.. A vacinação é relatada como uma medida essencial para o controle da leptospirose em bovinos, e diversos autores recomendam sua adoção em rebanhos infectados. Porém, apesar de largamente utilizada em vários países, a vacinação do gado contra leptospirose ainda não é uma prática comum no Brasil e poucos são os estudos neste tema. A literatura recomenda que a vacina contenha os principais serovares presentes na região, incluindo, se possível, amostras locais (LILENBAUM e SOUZA, 2003). Pode-se utilizar o esquema de dose única com reforço semestral, pelo período de dois anos. Em alguns casos, realiza-se uma dose de reforço 45 dias após a primeira aplicação. O emprego exclusivo da vacinação, sem antibioticoterapia, tem sido o método de escolha para rebanhos de corte (CASTRO, 2006). Muitas vacinas comerciais estão disponíveis no mercado nacional, sendo compostas por cinco a dez serovares. Por não possuírem papel curativo, seu emprego estaria mais indicado na prevenção da infecção, principalmente de novilhas

37 35 antes da entrada no serviço reprodutivo (GENOVEZ et al., 2001). Alguns autores indicam o uso de vacinas contra a leptospirose na redução da ocorrência de problemas reprodutivos causados pela variante sorológica Hardjo (BOLIN et al., 2001). No entanto, a vacinação contra leptospirose apresenta algumas limitações, pois é uma bacterina constituída por apenas alguns serovares considerados prevalentes na espécie em questão. Como a resposta é predominantemente contra o componente lipopolisacarídico da bactéria, a proteção é serovar-específica, o que não impede a infecção por outros serovares não presentes na vacina. Além disso, nem todas as vacinas encontradas comercialmente contêm os serovares de interesse para os veterinários de campo. No Brasil, várias vacinas disponíveis no mercado não atendem a esse pré-requisito (ARAÚJO et al, 2005). Nestes casos, a alternativa mais eficaz para controlar ou erradicar as leptospiroses em bovinos é o uso de vacina elaborada com o serovar específico prevalente no rebanho. Diversos autores recomendam o tratamento dos animais infectados com antibioticoterapia à base de estreptomicina (25 mg/kpv). Wikse (2006) sugere que rebanhos infectados por Hardjo devem ser submetidos ao tratamento para eliminar portadores, além da vacinação para prevenir uma reinfecção. No entanto, mesmo diante da adoção das medidas padrão de controle da leptospirose, como antibioticoterapia e vacinação, as medidas podem ser insuficientes para eliminar a infecção, reduzir os problemas reprodutivos do rebanho a níveis aceitáveis e produção dos animais. Kasimanickam e colaboradores (2007) não obtiveram sucesso no tratamento e vacinação de um rebanho infectado por Hardjo e os parâmetros reprodutivos dos animais estudados naquele experimento não apresentaram alterações satisfatórias após a adoção destas medidas de controle. Portanto, diante de um rebanho infectado por Hardjo, outros fatores podem estar envolvidos na transmissão e manutenção do agente entre os animais. Variáveis referentes ao ambiente, às características de manejo do rebanho e até mesmo variações genéticas das cepas de Hardjo provenientes de diferentes regiões geográficas podem determinar falhas nas medidas recomendadas na literatura para controle da leptospirose (ZUERNER et al., 2003). Em bovinos de produção leiteira, outros fatores relacionados ao manejo são identificados como capazes de aumentar o risco de infecção do rebanho pelo serovar Hardjo, como: introdução de animais infectados no rebanho, acesso de bovinos a fontes de água contaminada, como riachos, alagadiços e poças de água

38 36 (BENETT, 1993). Alterações no manejo do rebanho foram sugeridas como importantes ferramentas para reduzir a soroprevalência e a manutenção da leptospirose determinada por Hardjo em rebanhos bovinos (LILENBAUM e SOUZA, 2003). Visto que infecções determinadas pelo serovar Hardjo, adaptado e mantido pelos bovinos, são amplamente dependentes do contato direto entre os animais, sua transmissão não depende da região e de reservatórios silvestres, porém, naturalmente existem outros fatores que, mesmo em propriedades altamente tecnificadas, favorecem a ocorrência da leptospirose no rebanho, como acesso a poças de água contaminadas, aglomeração dos animais e introdução de animais infectados na propriedade (FAINE et al., 2000). No entanto, poucos estudos em nossas condições abordam a aplicação de medidas complementares à vacinação e antibioticoterapia para o controle da leptospirose. Lilenbaum e Santos (1996) estudaram possíveis influências de fatores envolvidos na ocorrência da leptospirose em rebanhos bovinos, como o tamanho do rebanho, o controle da reposição de animais, manejo dos animais e sistema de criação. A conclusão do estudo foi de que, independente da região geográfica e do clima, o grau de tecnificação das propriedades e o manejo dos animais tem uma grande influência no serovar infectante. Pomona foi mais importante em propriedades menos tecnificadas, enquanto Hardjo foi significativamente mais importante em propriedades classificadas como bastante tecnificadas. Um estudo de Lilenbaum e Souza (2003) indicou que nenhum rebanho está condenado a se infectar com determinado serovar por conseqüência direta da região geográfica ou condição climática em que se encontra. Além disso, o estudo sugere que não são necessários grandes investimentos na estrutura física da propriedade para se implantar um sistema eficaz de controle da leptospirose. Um aspecto importante abordado neste estudo foi a regularidade da assistência veterinária. Propriedades com maior regularidade de assistência apresentaram menores índices de sororeatividade. Segundo os autores, isso ocorre porque mesmo quando os médicos veterinários não aplicam diretamente programas de controle da leptospirose, sua presença faz com que medidas indiretas de higiene melhorem as condições gerais de manejo, resultando em uma diminuição da incidência de doenças infecciosas em geral, incluindo a leptospirose. No entanto, apesar de alguns estudos sugerirem alterações em certas práticas de manejo como ferramenta auxiliar à vacinação e antibioticoterapia para o

39 37 controle da leptospirose (BENNET, 1993), não há relatos da aplicação de medidas práticas de manejo no controle da leptospirose em rebanhos bovinos. Desta forma, mediante a ocorrência da infecção, torna-se fundamental que se conheça, ao menos por evidência sorológica, o serovar envolvido para que as medidas adequadas de controle e profilaxia da infecção sejam adotadas. A partir do melhor conhecimento das possíveis fontes de infecção e dos fatores associados que facilitam a transmissão e disseminação da enfermidade naquele rebanho específico, aumentam muito as chances de succeso dos programas de controle da enfermidade em regiões tropicais.

40 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Identificar fatores de manejo e ambientais associados à ocorrência da leptospirose em um rebanho bovino localizado no estado do Rio de Janeiro e avaliar a adoção de medidas complementares que visem a aperfeiçoar o protocolo atualmente preconizado para o controle desta enfermidade em bovinos mantidos em clima tropical. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS a) Testar sorologicamente bovinos com alterações reprodutivas presuntivamente determinadas por leptospirose quanto a sua etiologia e serovar envolvido; b) Identificar fatores de manejo e ambientais associados à ocorrência da leptospirose neste rebanho e avaliar a influência de mudanças no manejo dos animais na manutenção e transmissão da leptospirose bovina; c) Sugerir medidas complementares de controle da leptospirose em rebanhos bovinos mantidos em clima tropical, levando-se em consideração as particularidades ambientais e de manejo previamente descritas.

41 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 DESENHO DO ESTUDO No primeiro momento do estudo (maio de 2007), identificou-se um rebanho com transtornos reprodutivos, tais como repetições de cio e aumento no número de serviços, aumento do intervalo entre partos, abortamentos e natimortalidade, além do nascimento de bezerros fracos que permaneciam vivos por poucos dias após o nascimento. Procedeu-se então a colheita de sangue de todos os animais para realização de sorodiagnóstico da leptospirose. Após a análise dos parâmetros soroepidemiológicos e reprodutivos foi proposto e implementado um programa de controle com associação de vacina e antimicrobianos. Após 13 meses da aplicação do programa de controle (junho de 2008), realizou-se nova análise sorológica e reprodutiva do rebanho. Dada a persistência do elevado índice de sororeatividade, associado à permanência de transtornos reprodutivos nos animais, mudanças no manejo do rebanho foram sugeridas e adotadas, bem como alterações na estrutura física da propriedade, visando corrigir fatores ambientais que poderiam favorecer a manutenção da enfermidade no rebanho. Seis meses após a implantação do programa modificado de controle (dezembro de 2008) uma terceira análise sorológica e reprodutiva de todo o rebanho foi conduzida, quando então observou-se a redução a níveis aceitáveis tanto da sororeatividade quanto dos transtornos reprodutivos.

42 CARACTERIZAÇÃO DO REBANHO Estudou-se um rebanho com 432 bovinos adultos, sendo 206 de exploração leiteira e 226 de corte, mantidos em propriedade localizada na região dos lagos do estado do Rio de Janeiro, município de Saquarema. A propriedade era localizada em região de clima tropical úmido e apresentava topografia com algumas áreas montanhosas, onde eram mantidos os animais de exploração de corte, e várias áreas planas, sujeitas a constantes inundações, onde eram mantidos os animais de exploração leiteira. Este aspecto favorecia a formação de poças e pequenos alagadiços nos piquetes e em outros locais da propriedade onde, principalmente, os animais de aptidão leiteira permaneciam ao longo do dia e aonde os quais tinham livre acesso. Os animais de exploração de corte eram mantidos permanentemente a pasto mas, por serem mantidos principalmente em áreas com pequenos aclives, não se observavam alagadiços como aqueles presentes nos piquetes do gado leiteiro. Os animais de aptidão leiteira eram mantidos a pasto em áreas planas, recebiam suplementação no cocho e não eram divididos em lotes durante o manejo para a ordenha, permanecendo por longo período no curral de espera, aguardando seu momento para ordenha. Uma vez que se adotava a ordenha manual e apenas dois animais eram ordenhados por vez, o curral de espera permanecia por um longo período com grande número de vacas e bezerros, em estado de aglomeração. Este curral era de pequeno tamanho, sujeito a inundações e com o piso de terra, que com a urina, a aglomeração e o pisoteio dos animais, rapidamente tornava-se lama. Durante o longo período de espera para a ordenha, constantemente observavam-se várias vacas que urinavam e defecavam neste curral formando poças de urina. Outro aspecto importante observado na propriedade foi o baixo nível de higiene da sala de ordenha, onde havia grande acúmulo de urina e fezes, visto que sua limpeza era feita apenas uma vez por dia ao final da ordenha. Além disso, não apresentava piso em espinha de peixe, o que facilitava o acúmulo de fezes e urina no piso (Figura 15). O rebanho nos foi apresentado como livre de brucelose (Soroaglutinação Rápida com Antígeno Acidificado) e de infecção pelo vírus da Diarréia Viral Bovina BVD (ELISA), de acordo com exames sorológicos realizados previamente ao nosso contato. Além disso, o rebanho era fechado e nenhum animal foi introduzido no plantel durante o período do estudo.

43 ANÁLISE DA PROPRIEDADE E DO MANEJO DOS ANIMAIS Em vista da possibilidade da adoção de algumas medidas visando a correção do manejo dos animais e da estrutura física da propriedade para minimizar a transmissão e a manutenção da leptospirose no rebanho, a propriedade foi percorrida e avaliada mediante entrevista com o proprietário e seu veterinário assistente a fim de que fosse preenchido um questionário epidemiológico com informações relevantes sobre o rebanho estudado (Anexo 1). 4.4 ANÁLISE DOS PARÂMETROS REPRODUTIVOS Tanto o regime de monta natural como o de inseminação artificial eram adotados no rebanho estudado. Apesar da visita apenas esporádica do médico veterinário à propriedade, o proprietário do rebanho era bastante rigoroso com o registro dos dados reprodutivos de cada animal, possuindo um banco de dados constantemente atualizado e confiável. Portanto, todos os dados inerentes aos parâmetros reprodutivos utilizados neste estudo foram colhidos a partir do exame clínico do médico veterinário e das informações registradas pelo proprietário da fazenda. Os principais problemas reprodutivos relatados pelo proprietário foram a ocorrência de abortamentos em todas as fases da gestação; morte embrionária detectada pela repetição de cio em vacas previamente confirmadas como gestantes por palpação retal; morte neonatal; nascimento de bezerros fracos e ainda a ocorrência de mumificações e fetos macerados. O percentual de transtornos reprodutivos do rebanho em cada momento do estudo levou em consideração os últimos registros da avaliação reprodutiva realizada pelo proprietário junto com o médico veterinário. Este foi calculado considerando-se a porcentagem de vacas com as alterações reprodutivas em relação ao total de vacas em idade reprodutiva, tanto no total do rebanho como separadamente no gado de leite como no gado de corte. Para este estudo conceituou-se como falha reprodutiva toda situação em que uma vaca em idade reprodutiva não gerou um bezerro viável no intervalo de um ano.

44 ANÁLISE SOROLÓGICA Amostras sanguíneas foram colhidas de todos os animais do rebanho em tubos de vácuo pela punção na veia jugular ou veia paramamária de cada animal, antes do exame físico. Em seguida, estas foram transportadas até o laboratório, onde foram centrifugadas e o soro foi estocado em tubos plásticos do tipo Eppendorf a -20º para posterior análise. O diagnóstico sorológico para leptospirose foi realizado de acordo com a recomendação técnica da Organização Mundial de Saúde, pela técnica da soroaglutinação microscópica com antígenos vivos e leitura em microscópio equipado com condensador de campo escuro, conforme Lilenbaum e Santos (1995). Utilizou-se como antígenos a coleção do Laboratório de Bacteriologia Veterinária do Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal Fluminense, composta de 22 serovares distintos de leptospiras, representando 16 sorogrupos (Tabela 1). Todas as amostras com atividade aglutinante em diluição 1:50 foram posteriormente testadas contra o antígeno reativo usando diluições em série de razão dois até que o título mais alto fosse obtido, a fim de identificar o serovar infectante. Para caracterização de sororeatividade, foi adotado como ponto de corte o título mínimo de 200; portanto, consideraram-se como reativas as amostras com título 200, enquanto amostras com títulos de 100 foram consideradas fracamente reativas. Reações com títulos 50 foram consideradas inespecíficas e estas amostras classificadas para o presente estudo como negativas.

45 44 Tabela 1. Amostras de leptospiras utilizadas como antígenos para o diagnóstico sorológico de leptospirose em bovinos. Sorogrupo Serovar Amostra de Referência AUSTRALIS Australis Ballico Bratislava Jez bratislava AUTUMNALIS Autumnalis Akiyami A Butembo Butembo BALLUM Ballum Mus 127 Castellonis Castellon 3 BATAVIAE Bataviae Van Tienen CANICOLA Canicola Hond Utrecht IV CELLEDONI Whitcombi Celledoni CYNOPTERI Cynopteri 3522 C GRIPPOTYPHOSA Grippotyphosa Moskva V HEBDOMADIS Hebdomadis Hebdomadis ICTEROHAEMORRHAGIAE Icterohaemorrhagiae RGA Copenhageni M 20 JAVANICA Javanica Veldrat Batavia 46 PANAMA Panama CZ 214 K POMONA Pomona Pomona PYROGENES Pyrogenes Salinem SEJROE Hardjo Hardjoprajitno Hardjo Hardjobovis Wolffi 3705 TARASSOVI Tarassovi Perepelicin

46 ANTIBIOTICOTERAPIA E VACINAÇÃO Os animais sororeativos no rebanho estudado foram submetidos a um programa de controle da leptospirose baseado em antibioticoterapia e vacinação, baseado nas recomendações da literatura (FAINE et al., 2000). Instituiu-se a vacinação de todo rebanho com a duas doses da vacina (bacterina) preparada com cepa de Hardjo formolizada (UFMG). A primeira dose foi aplicada no dia zero e a segunda como reforço quinze após. Além disso, todos os animais reativos foram submetidos ao tratamento com dose única de diidroestreptomicina (Streptomax - 25mg/kg, Ourofino, Brasil), aplicada no mesmo dia do reforço vacinal (BOLIN e ALT, 2001). 4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA Com base nos dados analisados foram obtidos resultados relacionados às análise estatística descritiva (freqüências total e relativa) e para comparação dos percentuais foi utilizado o teste do qui-quadrado.

47 5. RESULTADOS 5.1 ANÁLISE SOROLÓGICA No primeiro momento do estudo (maio de 2007), dentre as 432 amostras testadas, sendo 206 de bovinos de leite e 226 de corte, 184 (42,6%) apresentaram títulos 200. Dentre estas amostras reativas, 102 (49,5% dos animais deste grupo) eram oriundas de bovinos de exploração leiteira e 82 (36,3% dos animais deste grupo), de corte. Cento e onze amostras (25,7%) apresentaram títulos de 100, sendo 68 (33% dos animais deste grupo) animais de produção leiteira e 43 (19% dos animais deste grupo) de bovinos de corte, e foram interpretadas como fracamente reativas. Já 137 animais (31,7% dos animais deste grupo) apresentaram títulos 50, sendo 36 (17,5% dos animais deste grupo) de bovinos de leite e 101 (44,7% dos animais deste grupo) de bovinos de corte, e foram considerados negativos. Desta forma, a soroprevalência do rebanho como um todo foi de 42,6%, ao passo que a soroprevalência entre os animais exploração leiteira (49,5%) foi maior (p<0,05) que a dos bovinos de corte (36,3%). Também entre os 111 animais fracamente reativos esta diferença se demonstrou significativa (p<0,01), pois 68 (61,2%) eram animais de produção leiteira e 43 (38,7%) animais de corte, conforme tabela 2. Em relação à distribuição dos serovares, Hardjo foi significativamente (p<0,01) o mais freqüente, sendo o serovar com mais altos títulos tanto nas amostras reativas (162-88%) quanto nas fracamente reativas (96-86,4%). Entre os animais sororeativos também observou-se sororeatividade perante os serovares Wolffi (6,5%), Pomona (3,4%) e Bataviae (2,1%), assim como entre as amostras fracamente reativas, respectivamente 7,2%, 3,6% e 2,7% (Tabela 3).

48 48 Ao avaliar-se separadamente a distribuição dos serovares entre os animais reativos de diferentes tipos de exploração, também observou-se sororeatividade significativamente maior (p<0,01) para Hardjo, tanto em animais de produção leiteira (94-92,2%), como em animais de corte (68-82,9%). Animais de aptidão leiteira também foram reativos para os serovares Wolffi (4,9%), Pomona (1,9%), e Bataviae (1%). Entre os animais criados para corte os percentuais observados foram Wolffi (8,5%), Pomona (4,9%) e Bataviae (3,7%), Tabela 3. Entre os animais fracamente reativos também houve predominância do serovar Hardjo, prevalente em 62 (91,1%) animais de exploração leiteira e 34 (79%) animais de exploração de corte. Entre os animais de produção leiteira fracamente reativos também foi observada reações para os serovares Wolffi (4,4%), Pomona (3%) e Bataviae (1,5%). Nos animais de corte os percentuais encontrados foram Wolffi (11,6%), Pomona (4,7%) e Bataviae (4,7%), conforme tabela 3. A partir dos resultados sorológicos obtidos, evidenciou-se Hardjo como o serovar infectante neste rebanho, e então foi aplicado um programa de controle da doença, baseado em antibioticoterapia e vacinação, segundo as recomendações da literatura e conforme descrito na metodologia deste estudo. Após 13 meses da aplicação das medidas de controle (junho de 2008), selecionou-se randomicamente 200 animais, sendo 100 de exploração leiteira e 100 de corte, para nova avaliação sorológica. Nesta ocasião - denominada segundo momento do estudo - 30 (15%) animais foram sororeativos, sendo 25 (25%) dentre os de exploração leiteira e cinco (5%) dentre os de corte (p<0,01). Vinte e três vacas (11,5%) foram fracamente reativas, sendo 21 (21%) dentre as de produção leiteira e duas (2%) dente as de corte (p<0,05). O restante dos animais, 147 no total (73,5%), foi negativo ao teste sorológico (Tabela 4). A Figura 1 mostra a comparação da soroprevalência do rebanho no 1º e 2º momentos. Ao realizar-se uma análise comparativa dos dados sorológicos do rebanho antes e depois da aplicação da primeira etapa do programa de controle, observou-se uma significativa (p<0,05) redução na sororeatividade total do rebanho, assim como entre os animais de corte. Já entre os animais de exploração leiteira, apesar da soroprevalência ter sido significativamente (p<0,05) reduzida, esta manteve-se na

49 49 Tabela 2. Soroprevalência de anticorpos anti-leptospira em animais de exploração leiteira e de corte no primeiro momento (maio 2007) do estudo de um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro. Título Aptidão dos animais Leiteira (N / %) Corte (N / %) Total (N / %) Interpretação /49,5* 82 /36,3* 184 /42,6 Reativo /33** 43 /19** 111 /25,7 Fracamente Reativo /17,5 101 /44,7 137 /31,7 Negativo Total * (p<0,05) ** (p<0,01)

50 50 Tabela 3. Distribuição de serovares de Leptospira no primeiro momento (maio 2007) do estudo de um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro. Serovar Leite Reativos (N/%) Corte Fracamente Reativos (N/%) Leite Corte Hardjo 94 /92,2* 68 /82,9* 62 / 91,1 34 /79 Wolffi 5 /4,9 7 /8,5 3 / 4,4 5 /11,6 Pomona 2 /1,9 4 /4,9 2 /3 2 / 4,7 Bataviae 1 /1 3 /3,7 1 / 1,5 2 / 4,7 Total *p< 0,01

51 51 faixa de 25% de animais sororeativos, índice ainda inaceitável após a implantação do programa de controle (Figura 1). Em relação à distribuição entre os serovares no segundo momento do estudo (junho 2008), Hardjo permaneceu como o serovar mais freqüente, presente em 26 das 30 amostras reativas (86,6%) e em 20 das 23 fracamente reativas (87,1%), diferença significativa (p<0,01) em relação aos outros serovares. Reatividade perante os serovares Wolffi (6,7%) e Pomona (6,7%) também foi observada entre os animais reativos, assim como entre as amostras fracamente reativas, respectivamente 8,6% e 4,3%, conforme tabela 5. Ao avaliar-se separadamente a distribuição dos serovares entre os animais reativos de diferentes tipos de exploração, observou-se sororeatividade para Hardjo em 23 (92%) dos animais de exploração leiteira e em três (60%) dos animais de corte. Também observou-se reatividade para os serovares Pomona (4%), e Wolffi (4%) entre os animais reativos de produção leiteira, assim como entre os animais criados para corte, com Pomona (20%) e Wolffi (20%), tabela 6. Entre os animais fracamente reativos também houve predominância do serovar Hardjo, prevalente em 19 (90,4%) animais de exploração leiteira e 1 (50%) dos animais de exploração de corte. Entre os animais de produção leiteira fracamente reativos também foi observada reações para os serovares Wolffi (4,8%) e Pomona (4,8%). 5.2 ANÁLISE DOS PARÂMETROS REPRODUTIVOS O primeiro levantamento dos registros relativos aos parâmetros reprodutivos (maio de 2007) evidenciou que 54 animais (12,5%) apresentaram episódios de abortamento, sendo 33 (61,1%) destes compostos por vacas de aptidão leiteira e 21 (38,9%) de corte. Morte embrionária (vacas detectadas como gestantes por palpação retal que repetiram cio) foi observada em 28 (6,5%) das vacas do rebanho, sendo 15 (53,6%) destas produtoras de leite e 13 (46,4%) de exploração de corte; a morte neonatal foi registrada em 12 (2,8%) animais, sendo seis (50%) de aptidão leiteira e seis (50%) animais de corte. A soma dos animais com falha reprodutiva, definida como toda situação em que uma vaca em idade reprodutiva não gerou um bezerro viável no intervalo de um ano, foi de 94 (21,8%), sendo 54 (57,4%) destes do gado leiteiro e 40 (42,6%) do gado de corte. Tal diferença entre os animais de

52 52 Tabela 4. Soroprevalência de anticorpos anti-leptospira em animais de exploração leiteira e de corte no segundo momento (junho 2008) do estudo de um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro. Título Aptidão dos animais Total (N/%) Interpretação (25)* 5 (5)* 30 (15) Reativo (21) 2 (2) 23 (11,5) Fracamente Reativo (54) 93 (93) 147 (73,5) Negativo Total * (p<0,01)

53 53 Figura 1 Comparação da soroprevalência de anticorpos anti-leptospira no rebanho e quanto ao tipo de exploração dos animais no 1º e 2º momentos do estudo ,6%* 49,5%** 36,3%** Total Leite Corte %* 25%** 5%** 0 maio-07 junho-08 *(p<0,05) ** (p<0,01)

54 54 Tabela 5. Distribuição de serovares de Leptospira no segundo momento (junho 2008) do estudo de um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro. Serovar Leite Reativos (N/%) Corte Fracamente Reativos (N/%) Leite Corte Hardjo 23/92 3 /60 19 / 90,4 1 / 50 Wolffi 1 /4 1 /20 1 / 4,8 1/ 50 Pomona 1 /4 1 /20 1 / 4,8 - Total 25* 5* 21 2 * (p<0,01)

55 55 diferentes tipos de exploração econômica mostrou-se significativa (p<0,05), conforme tabela 6. Avaliando-se separadamente o rebanho leiteiro e o rebanho de corte em relação aos percentuais de problemas reprodutivos, observamos que no primeiro momento 26,2% (54/206) dos animais de aptidão leiteira apresentavam falhas reprodutivas, sendo 16% (33/206) dos animais com abortamento, 7,3% (15/206) com morte embrionária e 2,9% (6/206) com morte neonatal. Já entre os animais de corte observamos 17,7% com falha reprodutiva, sendo 9,3% (21/226) dos animais com abortamento, 5,7% (13/226) com morte embrionária e 2,7% (6/226) com morte neonatal. A análise comparativa dos parâmetros reprodutivos 13 meses após a adoção do programa de controle, no segundo momento do estudo (junho de 2008), revelou uma significativa (p<0,01) redução nos problemas reprodutivos no rebanho, pois o número de animais apresentando falha reprodutiva foi reduzido de 94 (21,8%) para 62 (14,3%). O número de animais que apresentaram abortamento foi reduzido de 54 (12,5%) para 38 (8,8%), morte embrionária de 28 (6,5%) para 17 (4%) e morte neonatal de 12 (2,8%) para sete (1,6%), conforme figuras 2 e 3. No entanto, quando comparados os parâmetros reprodutivos dos animais de leite e corte, foi observada uma significativa diferença (p<0,01) entre os grupos, visto que, dos 62 (14,3%) animais que ainda apresentavam falha reprodutiva, 51 (82,3%) eram de exploração leiteira e 11 (17,7%) de corte. Avaliando-se separadamente cada forma de transtorno reprodutivo nos animais, verificou-se que dos 38 que apresentaram abortamento, 32 (84,2%) eram animais de exploração leiteira e seis (15,8%) eram animais de corte, diferença que se mostrou estatisticamente significativa (p<0,01). Entre os 17 animais que apresentaram morte embrionária, 15 (88,2%) eram de exploração leiteira e apenas dois (11,8%) de corte, o que também representa uma diferença significativa (p<0,01). Já em relação aos sete animais que apresentaram morte embrionária, verificou-se que quatro (57,1%) eram de exploração leiteira e três (42,9%) de corte, conforme figuras 2 e 3. Avaliando-se separadamente o rebanho leiteiro e o rebanho de corte em relação aos percentuais de falha reprodutiva, observamos que, no segundo momento, 24,7% (51/206) dos animais de aptidão leiteira apresentavam algum tipo de transtorno reprodutivo, sendo 15,5% (32/206) com abortamento, 7,3% (15/206)

56 56 com morte embrionária e 1,9% (4/206) com morte neonatal. Entre os animais de corte observamos 4,9% de transtornos reprodutivos, sendo 2,7% (6/226) com abortamento, 0,9% (2/226) com morte embrionária e 1,3% (3/226) com morte neonatal ANÁLISE DA PROPRIEDADE E MANEJO DOS ANIMAIS Diante do elevado percentual de animais de produção leiteira que permaneceram sororeativos para leptospirose e ainda apresentando transtornos reprodutivos mesmo após a aplicação do programa padrão de controle da enfermidade, baseado em antibioticoterapia e vacinação dos animais, buscou-se avaliar minuciosamente as práticas de manejo e a estrutura física da propriedade a fim de verificar a presença de fatores associados que pudessem explicar as diferenças observadas entre os animais de aptidão leiteira e de corte em relação a sororeatividade e aos problemas reprodutivos, bem como da persistência da enfermidade dentre os primeiros. Por meio das entrevistas realizadas com o proprietário do rebanho, com o médico veterinário prestador de serviços e pela análise da propriedade através do questionário epidemiológico e visita in loco, algumas características importantes foram observadas em vista de corrigir o manejo dos animais como ferramenta complementar no controle da leptospirose no rebanho. Observou-se que durante o manejo para a ordenha, os animais permaneciam por longo período no curral de espera. Uma vez que o tipo de ordenha adotada na propriedade era manual e apenas dois animais eram ordenhados por vez, tal curral de espera permanecia sempre com grande número de vacas e bezerros. Este curral era de pequeno tamanho e apresentava piso de terra, que com a aglomeração e o pisoteio dos animais tornava-se rapidamente lama. Observou-se também que durante o longo tempo de espera vários animais urinavam neste curral, por vezes formando poças de urina. Já a sala de ordenha era limpa apenas uma vez por dia, ao término do trabalho com os animais, e não apresentava piso em espinha de peixe, o que facilitava o acúmulo de fezes e urina no piso (Figura 4).

57 57 Tabela 6 - Comparação dos problemas reprodutivos observados no rebanho bovino estudado entre o 1º e 2º momentos do estudo. Transtorno Maio º momento Junho º momento reprodutivo Leite (N/%) Corte (N/%) Total (N/%) Leite (N/%) Corte (N/%) Total (N/%) Abortamento 33 / 61,1 21 / 38,9 54 / 12,5 32 * / 84,2 6 * / 15,8 38 / 8,8 Morte embrionária 15 / 53,6 13 / 46,4 28 / 6,5 15 / 88,2 2 / 11,8 17 / 4 Morte neonatal 6 / 50 6 /50 12 /2,8 4 / 57,1 3 / 42,9 7 / 1,6 Total 54 / 12,5 40 / 9,3 94 * / 21,8 51 * / 11,8 11 * / 2,5 62 * / 14,3 * (p<0,01)

58 58 Figura 2: Comparação da ocorrência de transtornos reprodutivos do gado leiteiro entre o 1º e 2º momentos do estudo. 30,0 25,0 26,2% 24,7% 20,0 16% 15,5% 15,0 10,0 5,0 7,3% 2,9% 7,3% 1,9% Total Abortamento Morte embrionária Morte neonatal 0,0 1º momento 2º momento Figura 3. Comparação da ocorrência de transtornos reprodutivos do gado de corte entre o 1º e 2º momentos do estudo ,7% 9,3% 5,7% 4,9% 2,7% 2,7% 0,9% 1,3% 1º momento 2º momento total Abortamento Morte embrionária Morte neonatal

59 59 No que se refere aos pastos, verificou-se em vários pontos da propriedade a presença de coleções de água parada e pequenos alagadiços aos quais os animais tinham livre acesso e onde constantemente urinavam, defecavam e bebiam água diversas vezes ao longo do dia (Figura 5). A partir da observação destas características ambientais e de manejo que favoreciam a transmissão da leptospirose entre os animais, foram sugeridas e implantadas mudanças na estrutura física da propriedade e no manejo dos animais em vista de complementar e aperfeiçoar o programa de controle previamente aplicado no rebanho. Em relação à propriedade, foi sugerida drenagem das poças e colocação de cercas ao redor dos alagadiços aos quais os animais tinham acesso e não se podia drenar. Além disso, recomendou-se acimentar o piso do curral de espera e a limpeza periódica da sala de ordenha, além da construção do piso em espinha de peixe para minimizar o acúmulo de fezes e urina. Em relação ao manejo dos animais, recomendou-se a divisão destes em pequenos lotes para minimizar o tempo de permanência e a aglomeração no curral de espera, bem como a cobertura do piso com cimento e espinha de peixe a fim de facilitar a limpeza periódica ANÁLISE FINAL DO REBANHO Seis meses após a correção de fatores relacionados ao manejo dos animais e das alterações na estrutura física da propriedade, em dezembro de 2008, novos dados foram obtidos dos animais para avaliação de parâmetros sorológicos e reprodutivos. Uma nova amostragem randômica de 100 animais, sendo 50 de exploração leiteira e 50 de corte revelou apenas 3% de sororeatividade no gado leiteiro e nenhum animal sororeativo entre os animais de corte. Com isso, realizando-se uma comparação entre os três momentos em que o rebanho foi estudado, pudemos observar que a sororeatividade dos animais de aptidão leiteira diminuiu do primeiro momento do estudo (maio de ,5%) para o segundo (junho de %), em vista da aplicação do programa padrão de controle. No entanto, o índice de sororeatividade dos animais de aptidão leiteira só atingiu níveis aceitáveis no terceiro momento

60 Figura 4. Vaca na sala de ordenha da propriedade, onde se formavam poças de urina. 60

61 Figura 5. Vacas em pequenos alagadiços na propriedade 61

62 62 (dezembro de %), após a correção de fatores associados à transmissão da leptospirose no rebanho (Figuras 6 e 7). Em relação às falhas reprodutiva, a partir da correção nos fatores de manejo, comparados aos 21,8% observados no primeiro momento do estudo e aos 14,3% relatados no segundo, o terceiro momento de análise demonstrou que estas foram reduzidas a níveis aceitáveis, de 4% (18/432) no rebanho. No gado leiteiro, que no primeiro momento do estudo havia apresentado 26,2% de falha reprodutiva e 24,7% no segundo momento, apresentou apenas 10 (4,8%) animais com falha reprodutiva e o gado de corte, que no primeiro momento havia apresentado 17,7% e no segundo momento já havia reduzido seu percentual para 4,9%, apresentou uma nova redução, pois apenas oito (3,5%) animais foram registrados com falhas reprodutivas, conforme Figuras 6 e 7.

63 63 Figura 6: Comparação da soroprevalência de anticorpos anti-leptospira entre os animais de exploração leiteira e de corte nos três momentos do estudo 70% 60% 49,5% 50% 40% 30% 20% 10% 25% 3% 36,3% 5% 0% mai/07 jun/08 dez/08 0% Leite Corte

64 64 Figura 7: Comparação do percentual de falhas reprodutivas nos animais de exploração leiteira e de corte nos três momentos do estudo 50% 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 26,2 24,7 leite 4,8 17,7 corte 4,9 3,5 mai/07 jun/08 dez/08

65 6. DISCUSSÃO A leptospirose, enquanto doença da esfera da reprodução em bovinos tem sido relatada em diversas partes do mundo como uma das principais causas de infertilidade em rebanhos bovinos (FAINE et al., 2000), incluindo regiões de clima tropical, onde as condições ambientais e de manejo variam muito em relação àquelas encontradas em países de clima temperado. No Brasil, a leptospirose em bovinos é uma doença endêmica e frequentemente descrita como importante causa de distúrbios reprodutivos, alterações congênitas, abortamentos e mesmo infecções subclínicas, que comprometem a eficiência reprodutiva dos nossos rebanhos (LILENBAUM e SANTOS, 1995; GENOVEZ et al. 2003). No rebanho estudado, a soroprevalência encontrada no primeiro momento (maio de 2007) sugere a leptospirose como a causa mais provável das falhas reprodutivas dos animais, visto que 42,6% deles apresentavam títulos 200 na reação de soroaglutinação microscópica. Esta soroprevalência está de acordo com àquela encontrada num amplo estudo realizado por Castro (2006) em sete diferentes regiões do estado de São Paulo, onde foi relatada a soroprevalência de 49,4%, confirmando o caráter endêmico da leptospirose em bovinos daquele estado. Considerando-se a importância da leptospirose como doença da esfera da reprodução e causa de falhas reprodutivas e prejuízos na pecuária bovina, verificase que há uma carência de mais estudos desta enfermidade em nossos rebanhos. O estudo mais recente abordando a leptospirose em bovinos no estado do Rio de Janeiro data de 2003, quando Lilenbaum e Souza relataram soroprevalência de 49,6% entre bovinos com alterações reprodutivas, confirmando a alta soroprevalência já relatada pelo mesmo autor e seus colaboradores (1995) oito anos antes. Nesta ocasião encontrou-se 68,4% de reatividade em rebanhos bovinos

66 66 suspeitos. Portanto, o presente estudo corrobora com as afirmações sugeridas por Lilenbaum e Souza (2003) sobre o caráter endêmico da leptospirose em bovinos neste estado. A soroprevalência encontrada no rebanho estudado apresentou diferenças significativas entre os animais sororeativos de produção leiteira e de corte. No primeiro momento do estudo o gado leiteiro demonstrou sororeatividade de 49,5% e o de corte 36,3%. Já no segundo momento, após a aplicação do programa preconizado internacionalmente para o controle da enfermidade, baseado em antibioticoterapia e vacinação, a diferença se acentuou, com o gado leiteiro apresentando 25% de sororeatividade e o de corte 5%. Não há relatos de soroprevalência comparativa entre gado leiteiro e de corte numa mesma propriedade na literatura. No entanto, no rebanho estudado, sugere-se que os fatores de manejo e ambientais envolvidos na transmissão da enfermidade facilitaram sua disseminação entre os animais de aptidão leiteira, visto que após a implantação de medidas corretivas de manejo também diminuíram consideravelmente a sororeatividade destes animais. Este achado corrobora o relato de Alonso- Andicoberry et al., (2001), que, em um estudo realizado na Espanha, afirmaram que o acesso do gado à fontes contaminadas de água, associadas a praticas de manejo inadequadas, são fatores essenciais na epidemiologia da leptospirose bovina. As últimas décadas foram de grande importância para o melhor conhecimento da leptospirose em bovinos (FAINE et al., 2000). Até o final dos anos 80 os principais serovares relatados mundialmente como causa de infecção em bovinos eram Pomona, Wolffi e Sejroe (MOREIRA et al., 1979; MADRUGA et al., 1980). Somente a partir do estudo de Ellis e colaboradores (1981), que isolaram e identificaram o serovar Hardjo nos rins de 57 vacas, foi confirmada a adaptação desta amostra aos bovinos e pesquisadores do mundo todo passaram então a incluíla nas baterias utilizadas para sorodiagnóstico. Assim, constatou-se a grande importância deste serovar em bovinos criados sob as mais diversas condições. Atualmente, Hardjo é mundialmente aceito como o mais importante serovar de leptospira que determina infecção em bovinos e tem sido relatado até mesmo em outros ruminantes (DHALIWAL et al., 1996; BOLIN e ALT, 2001; GROOMS, 2006; LILENBAUM et al., 2008).

67 67 Os índices de sororeatividade para Hardjo encontrados no rebanho estudado, tanto no primeiro momento do estudo (88%) como após a aplicação do programa de controle (86,6%) confirmam sua predominância e reforçam que este serovar foi a principal causa dos problemas reprodutivos apresentados pelos animais. Sabe-se que, a exemplo de diversas outras infecciosas, o isolamento do agente é considerado o padrão-ouro de confirmação diagnóstica (LEVETT, 2001). No presente estudo, apesar de esforços não terem sido realizados para seu isolamento, verificou-se ampla seroprevalência para esta amostra, o que, associada à fatores clínicos e reprodutivos condizentes com a infecção por este serovar, permite afirmar com boa margem de segurança que Hardjo era o agente determinante dos casos de leptospirose no rebanho estudado. Reforçam ainda este achado o alto ponto de corte adotado na sorologia ( 200) e a ausência de reações sorológicas importantes para outros serovares testados. Cabe ressaltar que alguns autores preconizam adotar títulos de 100 como ponto de corte na interpretação da soroaglutinação microscópica da leptospirose bovina (Faine et al., 2000). No entanto, no presente estudo, adotou-se como ponto de corte títulos de 200 para evitar a interferência de possíveis reações inespecíficas em vista do caráter endêmico da leptospirose em nossa região (LILENBAUM, 1996). Em amplo estudo realizado com animais que apresentavam problemas reprodutivos no estado de Minas Gerais, Araújo e colaboradores (2005) também relataram Hardjo como o serovar predominante entre os animais sororeativos. Além disso, o fato de Hardjo ter sido a amostra mais encontrada no rebanho no primeiro momento do estudo está em conformidade com a maioria dos inquéritos sorológicos realizados em rebanhos nacionais, assim como de outros países (ELLIS 1994; VASCONCELLOS et al., 1997; FÁVERO et al., 2001; HOMEM et al., 2000; ODONTSETSEG et al., 2005; AGUIAR, et al., 2006), que consideram Hardjo como o serovar mais difundido e maior causador de abortamentos nessa espécie. Os problemas reprodutivos encontrados no rebanho estudado eram compatíveis com infecção por Hardjo, visto que este serovar, além dos rins, também coloniza diferentes estruturas do aparelho genital das fêmeas (ovários, ovidutos, útero e vagina) e dos machos (testículo, epidídimo e vesícula seminal), comprometendo o desempenho reprodutivo dos animais (ELLIS et al., 1986).

68 68 Segundo Castro (2006), o aparelho genital dos bovinos é o mais importante sítio de localização das leptospiras, estando diretamente associado à disseminação do agente no rebanho e no ambiente. Mineiro e colaboradores (2007) realizaram um estudo sobre a relação entre o serovar infectante e a ocorrência de problemas reprodutivos nos animais e constataram que a maior relação entre problemas reprodutivos e infecção foi observada na amostra Hardjo, seguida por Icterohaemorrhagiae, Wolffi, Bratislava e Hebdomadis. A relação entre a presença de problemas reprodutivos com a infecção por Hardjo tem sido observada em rebanhos bovinos do mundo todo (NIANG et al., 1995; LILENBAUM et al., 1995; VASCONCELLOS et al., 1997) e no presente estudo pode-se confirmar a estreita relação entre a infecção por Hardjo e a presença de problemas reprodutivos, especialmente abortamentos. No segundo momento do estudo, 13 meses (junho de 2008) após a adoção do programa de controle internacionalmente recomendado no rebanho, observou-se importante redução nos índices de sororeatividade dos animais de corte (de 36,3% para 5%), acompanhado de importante redução na ocorrência de falhas reprodutivas nestes animais (de 17,7% para 4,9%). No entanto, ao estudar-se o gado leiteiro, verificou-se que, apesar da considerável redução verificada na soroprevalência (de 49,5% para 25%), ainda foi possível observar grande quantidade de animais sororeativos, em proporção incompatível com os resultados esperados, e diferente daquela verificada entre os animais de corte. Tal seroprevalência, que se manteve elevada, foi acompanhada da manutenção em níveis inaceitáveis da ocorrência de falhas reprodutivas, que foram reduzidas de 26,2% para 24,7%. Diferenças significativas na ocorrência de leptospirose entre gado de leite e de corte foram relatadas na Espanha (Alonso-Andicoberry et al., 2001). À semelhança do presente estudo, verificou-se que o gado de leite criado em áreas de topografia plana apresentava índices maiores de soroprevalência e de falhas reprodutivas do que o gado de corte, criado em áreas montanhosas, sem a presença de alagadiços e poças. Cabe ressaltar que o estudo dos autores foi conduzido em diferentes rebanhos, o que contrasta com o presente estudo, em que ambos os tipos de exploração econômica eram encontrados na mesma propriedade. No entanto, no referido estudo, mesmo tratando-se de rebanhos criados separadamente, observa-

69 69 se a possível influência do acesso a coleções de água como um fator importante na ocorrência da leptospirose. Um importante achado do presente estudo foi a observação de que a redução da soroprevalência verificada entre o 1º e 2º momentos não foi acompanhada da redução nos índices de falhas reprodutivas entre os animais de exploração leiteira. Baseado em tais achados, pode-se inferir que, no primeiro momento do estudo a maior parte dos animais estudados encontrava-se na fase aguda da infecção, quando títulos altos de anticorpos anti-leptospira podem ser evidenciados. No segundo momento do estudo, entretanto, os animais encontravam-se na fase crônica da infecção. Nesta fase, apesar da rápida queda nos títulos de anticorpos, os efeitos do microrganismo sobre a eficiência reprodutiva ainda se fazem presentes. Ellis et al., (1982) verificaram que, 60 dias após a infecção aguda por Hardjo, os títulos de anticorpos caem para níveis <100, embora abortamentos continuem a ocorrer. No desenho adotado para o presente estudo, em que priorizouse a especificidade do diagnóstico ao adotar-se um ponto de corte de 200, tais animais, embora cronicamente infectados, não seriam classificados como reativos. Por isso, pode-se observar que o programa adotado para o controle da leptospirose em bovinos, amplamente recomendado pela literatura, baseado em antibioticoterapia e vacinação (BENNET, 1993; BOLIN e ALT, 2001), apesar de reduzir a sororeatividade dos animais e diminuir a ocorrência de falhas reprodutivas, não foi suficiente para efetivamente controlar a infecção na forma esperada entre os animais de exploração leiteira. Resultados decepcionantes após a adoção do programa recomendado para o controle da leptospirose bovina não são raros. Kasimanickam e colaboradores (2007) não obtiveram sucesso no tratamento e vacinação de um rebanho infectado por Hardjo e os parâmetros reprodutivos dos animais estudados naquele experimento não apresentaram alterações satisfatórias após a adoção destas medidas de controle. Genovez et al. (2001), ao trabalharem com animais do estado de São Paulo, verificaram resultados decepcionantes de um programa de controle baseado em vacinação do rebanho, uma vez que a taxa de parição dos animais manteve-se baixa.

70 70 O controle da leptospirose em bovinos depende de uma variedade de fatores epidemiológicos inerentes ao hospedeiro, ao agente e ao ambiente. Diante de um rebanho infectado por Hardjo, outros fatores podem estar envolvidos na transmissão do agente entre os animais, tais como variáveis referentes ao ambiente, às características de manejo do rebanho e até mesmo variações genéticas das cepas de Hardjo provenientes de diferentes regiões (ZUERNER et al., 2003; LILENBAUM e SOUZA, 2003). No entanto, pouco se tem estudado sobre os fatores epidemiológicos que determinam o sucesso dos programas de controle da leptospirose determinada por Hardjo em rebanhos bovinos mantidos em condições tropicais. No presente estudo, uma minuciosa avaliação dos fatores ambientais e de manejo foi necessária para buscar possíveis melhorias no programa de controle da enfermidade. Uma vez que infecções determinadas pelo serovar Hardjo, adaptado e mantido pelos bovinos, tem sua transmissão independente da região e de reservatórios silvestres (ELLIS et al., 1981; FAINE et al., 2000), naturalmente outros fatores vão estar associados à sua ocorrência, como o acesso à poças de água contaminadas, manejo inadequado do rebanho, grau de tecnificação da fazenda, contato com outras espécies e introdução de animais infectados na propriedade (LILENBAUM E SANTOS, 1995; ALONSO-ANDICOBERRY et al., 2001; LILENBAUM E SOUZA, 2003). No entanto, não são encontrados estudos que abordam a correção de tais fatores associados á ocorrência da leptospirose em bovinos em condições tropicais como medidas complementares ao programa usualmente preconizado, que se baseia exclusivamente no uso de vacinas e antibióticos. No rebanho estudado, verificou-se clara e significativa diferença do impacto do programa de controle observado na soroprevalência e na ocorrência de falhas reprodutivas entre os animais de exploração leiteira e de corte, localizados na mesma propriedade. Apesar de ter apresentado o sucesso esperado nos animais de corte, os resultados verificados entre os animais de leite foram decepcionantes. Com base no conhecimento prévio dos fatores usualmente associados á ocorrência da leptospirose em ambientes tropicais, identificou-se fatores de manejo e ambientais exclusivos dos animais de leite, que favoreciam a transmissão da infecção entre os

71 71 animais e levando ao insucesso do programa adotado. Foi somente após a adoção de medidas corretivas amparadas no estudo epidemiológico realizado que se alcançou a desejada redução dos níveis de soroprevalência e das falhas reprodutivas no rebanho. Desta forma, mediante a ocorrência da infecção, mostrou-se fundamental o conhecimento do sorotipo envolvido e de seus mecanismos de transmissão para que as medidas adequadas de controle e profilaxia da infecção sejam adotadas. O conhecimento de fatores epidemiológicos associados á leptospirose em bovinos mantidos em condições tropicais, tais como as possíveis fontes de infecção e os fatores de risco que facilitam sua transmissão e disseminação, e sua aplicação em programas de controle são essenciais para o conhecimento e controle da enfermidade.

72 7. CONCLUSÕES A partir do presente estudo pode-se concluir que: a) Hardjo foi o serovar predominante, determinando falhas reprodutivas no rebanho estudado, tanto nos animais de exploração leiteira quanto nos de corte. b) O acesso a alagadiços, o tempo de espera para a ordenha em ambiente úmido e a aglomeração dos animais, associados as condições de higiene da sala de ordenha, favoreceram a transmissão da leptospirose entre os animais de exploração leiteira. c) A correção dos fatores de manejo e ambientais verificados foi de suma importância para o programa de controle da leptospirose no rebanho estudado e deve ser considerado para o sucesso do controle desta enfermidade em bovinos mantidos em condições tropicais.

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84 ANEXOS ANEXO I Produção científica Outras publicações no mesmo tema ANEXO II Questionário epidemiológico

85 Differences between seroreactivity to leptospirosis in dairy and beef cattle from the same herd in Rio de Janeiro, Brazil Gabriel Martins, Bruno Penna & Walter Lilenbaum Tropical Animal Health and Production ISSN Volume 44 Number 3 Trop Anim Health Prod (2012) 44: DOI /s x 1 23