INFLUÊNCIA DA INCLUSÃO DE ISOLADO LOCAL NA SENSIBILIDADE DO ENSAIO DE SORO AGLUTINAÇÃO MICROSCÓPICA PARA LEPTOSPIROSE: UM ESTUDO EM CÃES

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1 INFLUÊNCIA DA INCLUSÃO DE ISOLADO LOCAL NA SENSIBILIDADE DO ENSAIO DE SORO AGLUTINAÇÃO MICROSCÓPICA PARA LEPTOSPIROSE: UM ESTUDO EM CÃES PEREIRA, Sergiane Baes 1 ; LIMA, Camila Moura de 2 ; FONTOURA, Eduardo Garcia 3 ; FORLANI, Gustavo 4 ; SEIXAS NETO, Amilton C.P. 5 ; NOBRE, Márcia de Oliveira 6 ; SILVA, Everton Fagonde 7 ; FELIX, Anelize de O. Campello 8 ; FELIX, Samuel Rodrigues 9 Resumo: A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial, acometendo homens e outros animais, com destaque para os animais de companhia e produção. O ensaio de soro aglutinação microscópica (SAM) é o padrão ouro para diagnosticar e avaliar a distribuição da doença em uma população. O objetivo deste estudo foi avaliar a inclusão de um isolado local na bateria de triagem epidemiológica e o seu efeito sobre a sensibilidade do teste. De 72 amostras sanguíneas coletadas de cães domiciliados da cidade de Pelotas (RS), uma prevalência inicial de 45,83% (n=33) de soropositivos foi detectada contra um painel de 9 antígenos. Após a inclusão de um isolado local (sorogrupo Pomona), a prevalência observada passou à 56,94% (n=41). Esse estudo reitera a importância da busca ativa por novos isolados das populações susceptíveis, e a inclusão destes nas baterias de diagnóstico da leptospirose, aumentando a sua sensibilidade e garantindo a verossimilhança dos dados gerados. Palavras- Chave: Leptospirose. Epidemiologia. Soroprevalência. Cães. Leptospira. Abstract: Leptospirosis is a zoonosis of worldwide occurrence, affecting humans and other animals especially pets a livestock. The microscopic agglutination test (MAT) is the gold standard to diagnose and assess the disease s distribution in a population. The purpose of this study was to assess the inclusion of a local isolate in the screening battery of an epidemiological survey, and its effect in the test s sensibility. Out of 72 blood samples collected from housed dogs in the city of Pelotas (RS), an initial sero prevalence of 45.83% (n=33) was observed against a panel of 9 antigens. After the inclusion of a local isolate (serogroup Pomona) the observed prevalence grew to 56.94% (n=41). This study shows the importance of actively searching for new isolates, and the inclusion of these in diagnostic panels, increasing their sensibility and guaranteeing the truthfulness of the results. Keywords: Leptospirosis. Epidemiology. Sero-prevalence. Dogs. Leptospira 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9 Clinpet Grupo de Pesquisa, Ensino e Extensão em Pequenos Animais, Universidade Federal de Pelotas, clinpet.ufpel@gmail.com 5, 7 Grupo de Estudo em Doenças Transmitidas por Animais; Universidade Federal de Pelotas, fagondee@gmail.com.br Apoio financeiro ao projeto: CNPq, processo /

2 INTRODUÇÃO A leptospirose, doença de distribuição mundial com ocorrência em humanos estimada em mais de casos por ano (WHO, 1999; 2011), é hoje considerada uma das zoonoses mais difundidas do planeta (ADLER e MOCTEZUMA, 2010). A doença é causada por espiroquetas do gênero Leptospira, o qual possui 20 espécies e 24 sorogrupos, com mais de 300 sorovares descritos, sendo mais de 250 patogênicos (CERQUEIRA e PICARDEAU, 2009). Apesar de ser uma doença cosmopolita, ela é mais prevalente em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento, principalmente devido a fatores ambientais, climáticos, socioeconômicos, de saneamento básico e pela diversidade de hospedeiros suscetíveis domésticos e silvestres (LEVETT, 2001; KO et al., 2009). No Brasil, assim como em outros países, a doença é amplamente negligenciada e a qualidade do controle varia de estado para estado (Ministério da Saúde, 2012). Dados oficiais referentes à ocorrência da enfermidade em animais no Brasil são escassos. Em um estudo que abrangeu vários estados brasileiros, Favero et al. (2002) relataram prevalência média nacional de 17,7%, 29% e 24,5% de soropositivos para caninos, equinos e suínos, respectivamente. A circulação de leptospiras no ambiente é mantida principalmente por espécies ditas hospedeiras de manutenção. Essas espécies são adaptadas a determinados sorogrupos, dos quais dificilmente sofrem doença severa, tornando-se portadores renais (KO et al., 2009) e eliminando as bactérias por longos períodos. Os humanos são hospedeiros acidentais da enfermidade, manifestando a doença na forma subclínica ou clínica, mas dificilmente tornando-se portadores renais crônicos (ADLER e MOCTEZUMA, 2010). Na forma subclínica, cerca de 5 a 10% dos casos tornam-se graves, com hemorragias, icterícia, falência renal e/ou hemorragias pulmonares, nesses casos o risco de morte pode ser de até 74% (BHARTI, et al., 2003; McBRIDE, et al., 2005; GOUVEIA et al., 2008). A leptospirose canina possui sintomatologia similar à leptospirose humana, como icterícia, mialgia, êmese e morte (BOUTELIER, CARR e SCHULMAN, 2003). De acordo com a doença clínica e o sorovar causador, são descritas quatro síndromes associadas à leptospirose canina: ictérica, urêmica, hemorrágica e reprodutiva (ADLER e MOCTEZUMA, 2010). Assim como os cães, animais de produção podem tornar-se carreadores renais da bactéria, perpetuando a doença dentro dos rebanhos (LEVETT, 2001). 209

3 De acordo com Favero et al. (2002) os resultados dos testes sorológicos aplicados a leptospirose dependem de diversos fatores, dentre os quais pode-se destacar a coleção de antígenos utilizada. Em trabalho realizado por Brod et al. (2005) o isolamento de um sorovar de Leptospira patogênico da urina de um cão sintomático, e sua utilização para testar amostras de soro de casos de leptospirose humana e canina, evidenciou a importância da utilização de isolados locais na coleção de antígenos utilizados para teste. Em vista disso, deve-se realizar o isolamento de novos sorovares e sua inclusão na coleção de antígenos utilizados sempre que possível, uma vez que os resultados dos testes sorológicos podem ser alterados em função de tempo e espaço (FAVERO et al., 2002). Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a inclusão de um isolado local na bateria de triagem epidemiológica e o seu efeito sobre a sensibilidade do teste. MATERIAL E MÉTODOS Amostragem e animais estudados A amostragem se deu por conglomerados através de consulta aos setores censitários do IBGE, de tal forma a permitir uma amostragem aleatória e homogênea dos diferentes setores da 19ª zona administrativa da cidade de Pelotas, que incluí os bairros: Balneário dos Prazeres; Laranjal-Santo Antônio; Laranjal-Valverde; e Recanto de Portugal. No presente estudo foram considerados apenas os animais coletados no bairro Balneário dos Prazeres. Foram incluídos nesse estudo apenas cães domiciliados, hígidos, sem histórico de doença febril recente. Idade, sexo e raça não foram fatores de exclusão. Foi solicitado aos proprietários que concordassem em participar da pesquisa que assinassem um termo de consentimento para que os dados gerados a partir de suas respostas ao questionário e/ou do material biológico coletado de seus cães pudesse ser usado em comunicações cientificas. Coleta e processamento de sangue Amostras do sangue total dos cães foram coletadas através de punção venosa da veia cefálica ou jugular. O soro foi separado através de centrifugação a RPM durante 5 minutos, identificado e acondicionado em microtubos em freezer a -20 ºC até o uso. Cepas e condições de cultivo Neste estudo foram utilizadas 10 cepas de Leptospira interrogans, dos sorogrupos Automnalis, Australis, Ballum, Canicola, Icterohaemorrhagiae, Pomona e Patoc. Foram 210

4 utilizadas duas cepas do sorogrupo Pomona, sendo uma do sorovar Pomona e outra do sorovar Mozdok. Essa ultima foi isolada de um cão errante da cidade de Pelotas (RS), nominada Seu isolamento, caracterização molecular e caracterização imunológica está em processo de publicação (dados não publicados). As cepas foram cultivadas em meio EMJH (Difco) enriquecido com 10% de suplemento comercial (Difco) a 29ºC. Serão realizados repiques semanais, acompanhados de contagem de células bacterianas em câmara de Petroff- Hausser. Soro aglutinação microscópica (SAM) O teste de aglutinação microscópica (SAM) foi realizado conforme recomendação da organização mundial da saúde (OMS). Brevemente, o MAT foi feito utilizando como antígeno cepas dos sorogrupos, Automnalis, Australis, Ballum, Canicola, Icterohaemorrhagiae, Pomona (sorovar Pomona), e Patoc, para triagem, sendo também realizada com o isolado local 3759, do sorogrupo Pomona, sorovar Mozdok. Os soros dos cães foram diluídos 1:25 em tampão PBS e esse foi usado como titulo de triagem. Se permitiu que esse soro reagisse com volume igual de cultivo vivo de cada uma das cepas citadas, sendo essas utilizadas em uma concentração de ~1 a 2 x 10 8 células/ml. Quando houve 50% ou mais de aglutinação a reação foi considerada positiva. Soros positivos contra cada cepa foram titulados. A mesma reação descrita foi repetida com o soro em diluições seriadas de até 1:3200. RESULTADOS E DISCUSSÕES De março a abril de 2015 foram coletadas, de março a abril de 2015, um total de 72 amostras dos oito setores censitários que representam o bairro Balneário dos Prazeres, na cidade de Pelotas, RS. Nos ensaios de soro-aglutinação iniciais, se obteve uma prevalência geral de soropositivos de 45,83% (33 positivos), com títulos que variaram de 50 a Após a inclusão dos ensaios de soro aglutinação utilizando como antígeno o isolado local 3759, a soro prevalência subiu para 56,94% (41 positivos) conforme figura 1. O numero de soropositivos para o isolado 3759 foi de 15 animais, com títulos variando de 50 a 400, sendo que 8 animais não eram reagentes para nenhum outro antígeno, aumentando assim a sensibilidade do teste. Ainda que no geral, não houveram títulos muito elevados contra o isolado, dos 15 animais reagentes, 11 tiveram maior título contra esse do que qualquer outro usado na bateria. 211

5 Figura 1. Gráfico apresentando o numero de animais inicialmente positivos na triagem epidemiológica utilizando 9 cepas; e aqueles positivos após a inclusão do isolado local Barras solidas representam o numero nominal de animas, barras listradas indicam o percentual da população. O isolado local foi caracterizado como pertencente ao sorovar Mozdok através de sequenciamento do gene secy e MLST (Multilocus sequence typing) (dados não publicados). Este é um sorovar comum à animais silvestres do leste europeu e Russia (Majetic et al., 2014), porém ainda não havia sido implicado em leptospirose canina no Brasil. Assim, dificilmente esse sorovar seria incluído em levantamentos epidemiológicos de rotina. Nosso estudo ressalta a importância de se conduzir ativamente a busca por novos isolados nas populações susceptíveis, sejam elas de humanos, animais de companhia, e/ou animais de produção, bem como a caracterização e inclusão destes novos isolados nas baterias de diagnóstico. A importância da inclusão de novos isolados já é conhecida na região (Brod et al., 2005), que é notória pela diversidade de sorogrupos causando leptospirose em humanos e animais (Silva et al., 2007). Da mesma forma, essa busca por novos isolados deve ocorrer em todos os locais, visto que conforme Favero et al. (2002), os resultados de teste sorológicos aplicados ao diagnóstico da leptospirose dependem de diversos fatores, tais como: técnica empregada; coleção de antígenos utilizada; ponto de corte da reação; variáveis relacionadas a localização das propriedades, período do ano em que as colheitas foram realizadas e da movimentação do animal. Henebelle, Sykes e Foley (2014) destacaram que a epidemiologia 212

6 da leptospirose pode ter sido alterada ao longo das últimas décadas devido às mudanças do clima, uso da terra e atividades dos cães, tais como caminhadas, caçadas, e realização de vacinação. Essa mudança é constante, e pede a atualização permanente das baterias de diagnostico. Levantamentos epidemiológicos, particularmente aqueles com caráter de triagem, são muitas vezes conduzidos apenas com os sorogrupos mais prevalentes em determinada região (BIER et al., 2013). Isso se da pelo alto custo da manutenção dos antígenos vivos, que crescem com o tamanho da bateria. Em Pelotas, mais de 80% dos casos de leptospirose canina são causados pelos sorogrupos Icterohaemorrhagiae e Canicola (AVILA et al., 1998). De fato, neste estudo, das 33 amostras positivas antes da inclusão do isolado local, 31 (93.94%) eram positivas para um destes dois sorogrupos. Entende-se, portanto, que, quando conveniente, pode-se usar baterias de antígenos reduzidas, desde que todas as informações disponíveis indiquem que o resultado será representativo da situação epidemiológica real da região. Assim, sugerimos que além dos dois sorogrupos supracitados, o isolado do sorogrupo Pomona sorovar Mozdok aqui descrito seja incluído nos levantamentos epidemiológicos na cidade de Pelotas (RS). CONCLUSÃO Neste estudo se descreveu a inclusão de um isolado local de sorovar inédito na região como um fator que aumentou consideravelmente a sensibilidade do teste de soro aglutinação microscópica para leptospirose canina na cidade de Pelotas (RS). A soro prevalência observada de 45,83% subiu para 54,83% após a inclusão do novo isolado na bateria de antígenos utilizados. Recomenda-se, portanto, a busca ativa por isolados locais de leptospiras, seja de humanos ou animais, e a sua inclusão como antígeno diagnóstico para aumentar a sensibilidade dos testes. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ADLER, B.; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, A. Leptospira and leptospirosis. Veterinary icrobiology, Amsterdam, v. 140, n. 3/4, p , AVILA, M. O.; et al. Aglutininas anti-leptospíricas em cães na área de influência do Centro de Controle de Zoonoses, Pelotas, RS, Brasil, no ano de Ciência Rural, v. 28, n. 1, p ,

7 BARTHI, A.R.; et al. Leptospirosis: a zoonotic disease of global importance. Lanct Infectious Diseases, v. 3, n. 12, p , BIER, D.; et al. Análise espacial do risco de leptospirose canina na Vila Pantanal, Curitiba, Paraná. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 33, n. 1, p , BOUTILIER, P.; CARR, A.; SCHULMAN, R. L. Leptospirosis in Dogs: A Serologic Survey and Case Serier 1996 to Veterinary Therapeutics, vol. 4, n. 2, Summer BROD, C. S.; et al. Evidência do cão como reservatório da leptospirose humana: isolamento de um sorovar, caracterização molecular e utilização em inquérito sorológico. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, Brasilia, v. 38, n. 4, p , jul-ago, CERQUEIRA, G. M.; PICARDEAU, M. A century of Leptospira strain typing. Infection, Genetics and Evolution, v. 9, n. 5, p , DELLAGOSTIN, O. A.; et al. Recombinant vacines against Leptospirosis Hyman Vaccines & Immunotherapeutics, v. 7. p , FAVERO, A. C. M.; et al. Sorovares de Leptospiras predominantes em exames sorológicos de bubalinhos, ovinos, caprinos, equinos, suínos e cães de diversos estados brasileiros. Ciência Rural, v. 68, n. 32, p , GOUVEIA, E. L.; et al. Leptospirosis associated severe pulmonar hemorrhagic syndorme, Salvador, Brazil. Emerging Infectious Diseases, v. 14, p , HENEBELLE, J. H.; SYKES, J. E.; FOLEY, J. Risk Factors Associated with Leptospirosis in Dogs from Northern California: Vector-Borne and Zoonotic Diseases, v. 14, n. 10, p , KO, A. I.; GOARANT, C.; PICARDEAU, M. Leptospira: the dawn of the molecular genetics era for an emerging zoonotic pathogen. Nature Reviews Microbiology, v. 7, p , LEVETT, P. N. Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews, v. 14, n. 2, p , MAJETIC, Z. S.; et al. Epizootiological survey of small mammals as Leptospira spp. Reservoirs in Eastern Croatia. Acta Tropica, v. 131, p , McBride, A.J.; et al. Leptospirosis. Current Opinion in Infectious Diseases, v. 18. n. 5, p , MINISTÉRIO DA SAÚDE, Disponível em: < Acesso em: 10 mai

8 SILVA, E.F.; et al. Characterization of virulence of Leptospira isolates in a hamster model. Vaccine, v. 26, n. 31, p , WHO. World Health Organization. Leptospirosis world wuide. Weekly Epidemiology Records, v. 86, p , WHO. World Health Organization. Leptospirosis world wuide. Weekly Epidemiology Records, v. 86, p ,