Vacinologia na Biotecnologia - UFPel

Transcrição

1 Vacinologia na Biotecnologia - UFPel

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4 Janeiro 1989

5 Agosto 1989

6 Agosto 1989

7 Abril 1991

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10 Mycobacterium bovis BCG - Vacina largamente utilizada em humanos no mundo todo; - Administrada em qualquer época após o nascimento; - Efeito imunoestimulante e adjuvante; - Resposta imune humoral e celular; - Única dose; - Vacina replicante muito estável; - Apresenta um baixo custo de produção.

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13 Janeiro 1995

14 Agosto 1996

15 Agosto 1996

16 Agosto 1996

17 Agosto 1996

18 Agosto 1996

19 Outubro 1996

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21 02 de agosto de 2001

22 03 de dezembro de 2001

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25 01 de março de 2003

26 BCG - PRRS

27 BCG - Anaplasmose

28 BCG - Babesiose

29 BCG - Leptospirose

30 BCG recombinante...

31 Por que não é utilizada em animais? Porque a vacina interfere com o teste de tuberculina!

32 Um teste capaz de diferenciar animais infectados de animais vacinados (DIVA) permitirá introduzir mudanças na atual legislação e possibilitará o uso de vacina contra TB bovina.

33 BCG recombinante... Maior eficácia contra tuberculose bovina do que a cepa convencional Possibilidade de construção de uma vacina multivalente

34 Zoonose Leptospirose Agente etiológico: Leptospira sp. Infecta diversos animais e humanos Infecção através de contato direto ou água ou solo contaminado com urina de portadores Doença febril aguda TAMANHO -0,1 a 0,2 m de diâmetro -6 a 20 m de comprimento

35 Vacinas Células inteiras inativadas (Bacterinas) Imunidade pouco duradoura (6 a 12 meses) Efeitos colaterais Sorovares específicas L. hardjo; L. icterohaemorrhagiae; L. wolffi; L. bratislava; L. pomona. Leptospira interrogans: hardjo, wolffi, pomona, icterohaemorrhagiae, grippotyphosa e canicola. Vacinas recombinantes

36 O genoma de L. interrogans Fonte: Nascimento et al., Braz J et Med al., Biol J Res Bacteriol. 37(4) Apr;186(7):

37 Purificação das proteínas ÄKTAPrime Gel de poliacrilamida 15% Proteínas purificadas

38 Resposta Imune Humoral 0,8 Resposta Imune Humoral Absorbâncias (OD450) 0,6 0,4 0,2 rlic11058 rlic10054 rlic20172 rlic13059 rlic11567 rlic10091 rlic10009 rlic13305 Controle tempo (dias) Resposta imune humoral apresentada pelos animais inoculados com as proteínas recombinantes e do grupo controle negativo salina/al(oh)3. A medida das respostas imunes está expressa em absorbância (OD450).

39 DESAFIO Vacinação dos Hamsters Inoculação de doses letais de Leptospiras patogênicas Taxa de Sobrevivência

40 2005 Parceria Fiocruz/UFPel Reunião no Mercosul

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42 2006 Primeira produção científica do laboratório Canadian Journal of Microbiolog

43 2007 SEIXAS, F. K. ; SILVA, E. F.; HARTWIG, Daiane D ; CERQUEIRA, Gustavo M ; AMARAL, M. ; FAGUNDES, Michel Q ; DOSSA, Robson G ; DELLAGOSTIN, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing the Lipl32 antigen of Leptospira interrogans protects hamsters from challenge. Vaccine (Guildford), v. 26, p , SILVA, E. F. ; MEDEIROS, M. A. ; MCBRIDE, Alan J A ; STEVES, G. S. ; RAMOS, J. G. R. ; SANTOS, C. S. ; CRODA, J. ; HOMMA, A. ; DELLAGOSTIN, O. A. ; HAAKE, D. A. ; REIS, Mitermayer G ; KO, Albert I. The terminal portion of leptospiral immunoglobulin-like protein LigA confers protective immunity against lethal infection in the hamster model of leptospirosis. Vaccine (Guildford), v. 25, p , FERNANDES, Claudia P H; SEIXAS, Fabiana K; COUTINHO, Mariana L; VASCONCELLOS, Flavia A; SEYFFERT, Nubia; BROD, Claudiomar S; MCBRIDE, Alan J A; DELLAGOSTIN, O. A.; ALEIXO, Jose A G Monoclonal antibodies against LipL32, the major outer membrane protein of pathogenic leptospira: production, characterization and testing in diagnostic applications. Hybridoma (Larchmont), v. 21, p , SILVA, Everton F; BROD, Claudiomar S; CERQUEIRA, Gustavo M; BOURSCHEIDT, Debora; SEYFFERT, Núbia; QUEIROZ; SANTOS, Cleiton S; KO, Albert I; DELLAGOSTIN, O. A.. Isolation of Leptospira noguchii from sheep. Veterinary Microbiology (Amsterdam), v. 121, p , SEIXAS, Fabiana K; FERNANDES, Claudia P H; HARTWIG, Daiane D; CONCEIÇÃO, Fabricio R; ALEIXO, José A G; DELLAGOSTIN, O. A.. Evaluation of different ways of presenting LipL32 to the immune system with the aim of developing a recombinant vaccine against leptospirosis. Canadian Journal of Microbiology, v. 54, p , 2007.

44 2008 SILVA, E. F.; SANTOS, C. S.; ATHANAZIO, Daniel A; SEYSSERT, N.; SEIXAS, F. K.; CERQUEIRA, Gustavo M; FAGUNDES, Michel Q; BROD, Claudiomar S; REIS, Mitermayer G; DELLAGOSTIN, O. A.; KO, Albert I. Characterization of virulence of Leptospira isolates in a hamster model. Vaccine (Guildford), v. 26, p , FERNANDES, Claudia P H; SEIXAS, F. K.; COUTINHO, Mariana L; VASCONCELLOS, Flavia A; MOREIRA, Angela N; CONCEIÇÃO, F. R.; DELLAGOSTIN, O. A.; ALEIXO, José A G. An immunomagnetic separation-pcr method for detection of pathogenic leptospira in biological fluids. Hybridoma (Larchmont), v. 27, p. 1-6, MIRAGLIA, F.; MORENO, A. M.; PAIXAO, R.; LIUSON, E.; MORAIS, Z. M.; MAIORKA, P.; SEIXAS, F. K.; DELLAGOSTIN, O. A.; VASCONCELLOS, S. A. Isolation and characterization of Leptospira interrogans from pigs slaughtered in São Paulo State, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v. 39, p , 2008.

45 CERQUEIRA, Gustavo M; MCBRIDE, Alan J A; Picardeau, M.; RIBEIRO, Samuel G; MOREIRA, A. N.; Morel, V.; REIS, Mitermayer G; KO, Albert I; DELLAGOSTIN, O. A.. Distribution of the Leptospiral immunoglobulin-like (Lig) genes in pathogenic Leptospira spp. and application of ligb to typing leptospiral isolates. Journal of Medical Microbiology, v. 58, p , MCBRIDE, Alan J A; CERQUEIRA, Gustavo M; SUCHARD, M. A.; MOREIRA, A. N.; REIS, Mitermayer G; HAAKE, D. A.; KO, Albert I; DELLAGOSTIN, O. A.. Genetic diversity of the Leptospiral immunoglobulin-like (Lig) genes in pathogenic Leptospira spp.. Infection, Genetics and Evolution, v. 9, p , SILVA, E. F.; CERQUEIRA, Gustavo M; SEYFFERT, Núbia; SEIXAS, F. K.; HARTWIG, Daiane D; ATHANAZIO, Daniel A; PINTO, Luciano S; QUEIROZ; KO, Albert I; BROD, Claudiomar S; DELLAGOSTIN, O. A.. Leptospira noguchii and Human and Animal Leptospirosis, Southern Brazil. Emerging Infectious Diseases, v. 15, p , Murray, G. L.; Morel, V.; Cerqueira, G. M.; CRODA, J.; Srikram, A.; Henry, R.; Ko, A. I.; DELLAGOSTIN, O. A.; Bulach, D. M.; Sermswan, R.; Adler, B.; Picardeau, M.. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infection and Immunity, v. 77, p , 2009.

46 2010 Cerqueira, G. M.; McBride, A. J. A.; Queiroz, A.; Pinto, L. S.; SILVA, E. F.; HARTSKEERL, R. A.; Ko, A. I.; DELLAGOSTIN, O. A.. Monitoring Leptospira Strain Collections: The Need for Quality Control. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 82, p , VASCONCELLOS, Flávia Aleixo; COUTINHO, Mariana L; SILVA, Everton F; FERNANDES, Claudia P H; Monte, Leonardo G.; SEYFFERT, Núbia; DELLAGOSTIN, O. A.; ALEIXO, José A G. Testing different antigen capture ELISA formats for detection of Leptospira spp. in human blood serum. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 104, p , SEIXAS, F. K.; BORSUK, S.; FAGUNDES, Michel Q; HARTWIG, Daiane D; SILVA, E. F.; CERQUEIRA, Gustavo M; DELLAGOSTIN, O. A.. Stable expression of Leptospira interrogans antigens in auxotrophic Mycobacterium bovis BCG. Biological Research (Print), ESLABAO, M. R.; DELLAGOSTIN, O. A.; CERQUEIRA, Gustavo M. LepBank: a Leptospira sequence repository and a portal for phylogenetic studies. Infection, Genetics and Evolution (Print),

47 VACINA CONTRA PNEUMONIA MICOPLÁSMICA SUÍNA

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50 Produção e Avaliação de Outros Antígenos

51 Clonagem Direcional CACC NRDF 429 bp Stop codon T7 promoter RBS 6xHis EK recognition pet200d-topo 5741 bp T7 termination Kanamycin pbr322 Ori - Seleção de genes de M. hyopneumoniae - Amplificação por PCR - Clonagem

52 Mutação sítio dirigida 1 0 PCR A For Rev mut For mut Rev T7 promoter RBS 6xHis EK recognition pet200d-topo 5741 bp T7 termination Kanamycin For TGG Rev pbr322 Ori

53 Seleção de clones recombinantes DNA recombinante Transformação em E. coli Bactérias recombinantes Plasmídio Transformação em cepa de expressão BL21(DE3)

54 Purificação de Proteínas Multiplicação Purificação ÄKTA_Prime Expressão Proteína Purificada 42 kda

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57 Antigenicidade das proteínas -10 soros de suínos SPF - 37 soros de suínos convalescentes 50 ng 1:100 1: proteínas recombinantes testadas no ELISA

58 Resultados SDS-PAGE corado com Commassie Blue, mostrando 9 proteínas recombinantes purificadas por cromatografia de afinidade ao níquel.

59 Resultados Médias calculadas com os soros avaliados em triplicata Análise estatística - GraphPad Prism 4 (GraphPad Software) Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando o P 0,05 * * * * * * * * * *

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63 Projetos em andamento Avaliação de antígenos recombinantes de Mycoplasma hyopneumoniae: desenvolvimento de vacinas e testes diagnósticos (Edital CNPq/MAPA/SDA Nº 64/2008) Valor: R$ ,00 Início em fevereiro 2009 Núcleo de excelência em desenvolvimento de vacinas veterinárias (PRONEX FAPERGS/CNPq) Valor: R$ ,00 Início em abril de 2010 Produção e avaliação de uma vacina recombinante contra tuberculose bovina e de teste de diagnóstico diferencial (DIVA) (CNPq e Biotecsur) Valor: ,00 Início em janeiro de 2009

64 OUTROS PROJETOS...

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