HEMÓLISE HEMÓLISE IN VIVO

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1 HEMÓLISE Hemólise é o resultado do rompimento da membrana da hemácia, causando liberação de hemoglobina. Hemólise pode ocorrer no paciente (in vivo) ou fora do paciente em algum ponto entre a retirada da amostra e sua análise (in vitro). Em geral pode ser identificada a olho nu, pela observação do aspecto avermelhado presente no soro ou plasma. A hemólise pode interferir na fase analítica por diferentes maneiras. Primeiro, a hemoglobina livre apresenta absortividade alta em comprimentos de onda variando entre 415 e 570 nanômetros. Dessa forma, a hemoglobina provoca uma elevação aparente na concentração dos analitos medidos nestas escalas de comprimento de onda (por exemplo, ALT, FA, proteínas totais) por elevar a absorbância das amostras. Nos testes imunológicos pode interferir na aderência de anticorpos, aglutinação ou imunofluorescência de forma imprevista. Por isso amostras hemolisadas são muitas vezes recusadas no setor técnico. Para garantir resultados confiáveis, a qualidade da amostra tem que ser avaliada. Amostras com alterações pré-analíticas comprometem os resultados, e consequentemente, a interpretação clínica. A hemólise pode causar serio impacto sobre o atendimento ao paciente e a reputação de um laboratório por meio de seu efeito sobre os resultados dos testes, sendo a principal causa para rejeição de amostras. HEMÓLISE IN VIVO Distinguir hemólise in vivo da in vitro é de crítica importância para a segurança do paciente e tratamento clínico. Um achado da hemólise in vivo não apenas é clinicamente importante por ele mesmo, mas, além disso, as concentrações de plasma dos analitos no tubo da coleta de sangue são as concentrações de plasma no paciente e desse modo são importantes e devem ser relatadas. Em contraste, na hemólise in vitro, certos valores laboratoriais não devem ser relatados, porque eles não refletem as concentrações no paciente e podem ser enganadores. Os fenômenos que levam à hemólise in vivo podem ser categorizados como hemólise intravascular e extravascular com base no local da destruição das hemácias. Dependendo do tipo de dano à membrana das hemácias, as células podem se destruir imediatamente (intravascular) ou serem destruídas pelo sistema monócito macrófago no baço, fígado, ou medula óssea (extravascular). Testes laboratoriais são essenciais para se determinar a presença e a causa da hemólise. Alterações que sugerem a ocorrência de hemólise in vivo incluem: Elevada desidrogenase lactica (LDH), reduzida haptoglobina (presente na fração alfa-2 das globulinas séricas determinadas por eletroforese), e hemoglobina livre na urina são sinais de hemólise in vivo. Esferócitos em um esfregaço de sangue periférico e um teste positivo de antiglobulina direta (Coombs) ou a presença de teste de hemoaglutinação positivo, são achados que indicam a ocorrência de hemólise in vivo mediada por anticorpos (AHIM ou AHAI). Esquistócitos em um esfregaço de sangue periférico indicam hemólise microangiopática (raro em cães). Um elevado número de reticulócitos significa uma resposta fisiológica à anemia e pode indicar hemólise in vivo. Persistente hemólise em múltiplas amostras em diferentes tempos de coleta e em múltiplos tipos de tubos, sugere hemólise in vivo.

2 A comunicação entre o laboratório e a equipe clínica, para correlação com o histórico do paciente, é crítica para determinar se há razão para se suspeitar de hemólise in vivo e investigar. A hemólise in vivo pode ser concluída por causa de sua persistência em coletas consecutivas, das concentrações de haptoglobina, presente na fração alfa-2 globulina observada no fracionamento por eletroforese das proteínas, e a redução na hemoglobina. HEMÓLISE IN VITRO A hemólise in vitro tem sido desde sempre uma grande preocupação para os laboratórios clínicos em todo o mundo. Tem como principio a quebra dos glóbulos vermelhos e a liberação de hemoglobina e conteúdo intracelular para o plasma. Alguns fatores que afetam a hemólise in vitro podem ocorrer inicialmente na obtenção da amostra e continuar através do processamento e da análise (vide tópico principais fatores que podem ocasionar a hemólise, adiante). Há aspectos que são fundamentais para se coletar uma amostra de qualidade, que produz resultados desejados (vide no tópico cuidados para evitar a hemólise, a seguir). Havendo hemólise recorrente, a coleta de dados (indicadores) ajudará a identificar os locais onde a hemólise ocorre com mais freqüência, o que por sua vez, pode orientar uma análise sobre por que está ocorrendo. Uma vez que estes elementos são conhecidos, práticas e procedimentos podem ser implementados para reduzir drasticamente a hemólise e evitar resultados laboratoriais errôneos que afetam a assistência ao paciente e aumentam os custos do laboratório. EFEITO DA HEMÓLISE NOS TESTES LABORATORIAIS Hemólise é uma importante fonte de erro pré- analítico e tem sido relatada por influenciar muitos resultados laboratoriais, incluindo potássio, sódio, cálcio, fósforo, magnésio, bilirrubina, haptoglobina, proteína total, aldolase, amilase, LDH, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina, fosfatase ácida, γ-glutamil transferase, folato, e ferro. Hemólise pode afetar a validade do teste químico específico (interferência analítica) através de interferência espectrofotométrica ou química. Alternativamente, a liberação de conteúdos intracelulares afeta a concentração de plasma de certos compostos (p. ex.: enzimas, ferro, fosfato); desse modo hemólise in vivo possui um efeito fisiológico no paciente. A contribuição de cada uma dessas fontes de erro varia de analito e método. Por exemplo, as concentrações de potássio, magnésio, fosfato, LDH, AST, e ALT são muito mais altas nas hemácias do que no plasma, e desse modo a hemólise aumenta suas concentrações no plasma. Em contraste, interferência espectral da hemoglobina é a questão dominante para testes espectrofotométricos comuns para fosfatase alcalina, ferro, lipase, e γ-glutamil transferase. É possível que ambos mecanismos sejam operativos, por exemplo, se AST for medida por um método colorimétrico, sobreposição espectral poderá causar um aumento artificial no resultado da AST além do verdadeiro aumento da AST no plasma devido à liberação dos conteúdos intracelulares.

3 Principais fatores que podem ocasionar a hemólise: 1. patologias que causam hemólise in vivo, e outras condições do paciente que favorecem a hemólise in vitro 2. coleta através de cateter 3. coleta de sangue capilar 4. calibre da agulha 5. local da venopunção 6. punção imediatamente após a antissepsia (contaminação por álcool) 7. tempo de garroteamento 8. coleta traumática 9. tipo do tubo a vácuo 10. volume abaixo do indicado no tubo 11. homogeneização vigorosa pós coleta 12. não homogeneizar a amostra 13. transferência do sangue da seringa para o tubo 14. origem da amostra (pacientes de difícil coleta) 15. tempo e temperatura de transporte 16. tempo entre coleta e centrifugação do sangue 17. velocidade de centrifugação 18. presença de lipemia na amostra 19. choque durante o transporte Cuidados para evitar a hemólise: Na pré-coleta e coleta: Pergunte ao acompanhante do paciente sobre a alimentação. Amostras obtidas entre 1 e 4 horas após ingestão de alimento podem apresentar lipemia variável, o que induz à hemólise. Deixe o álcool secar antes de iniciar a punção. Evite usar agulhas de menor calibre. Usar esse tipo de material somente quando a veia do paciente for fina ou em casos especiais. Evite colher o sangue de área com hematoma. Nunca bata sobre a veia para visualizar sua posição Procure manter a relação correta de volume para o tubo utilizado. Tubos com volume de sangue insuficiente ou em excesso alteram a proporção correta de sangue/aditivo, levando à hemólise e a resultados incorretos, principalmente porque os tubos são preparados com ativador de coagulação para um volume de 4 ml de sangue. Quanto menor o volume de amostra, maior o risco de hemólise; Em coletas com seringa e agulha, verifique se a agulha está bem adaptada à seringa, para evitar a formação de espuma. Ainda em coletas com seringa, descarte a agulha e passe o sangue deslizando-o cuidadosamente pela parede do tubo Não execute o procedimento de espetar a agulha na tampa de borracha do tubo para a transferência do sangue da seringa para o tubo, pois poderá criar uma pressão positiva, o que provoca, além da hemólise, o deslocamento da rolha do tubo, levando à quebra da probe de equipamentos. Evite pressão negativa na seringa. Ao puxar o êmbolo com força (mais de 1 ml de ar na seriga), a pressão exercida provoca rompimento das hemácias.

4 Boas práticas de pós-coleta para prevenção de hemólise: Homogenize o tubo suavemente por inversão (os tubos com anticoagulante e os de tampa vermelha, com ativador de coagulação); Mantenha os tubos na temperatura ambiente por 20 a 30 minutos, na posição vertical ou inclinados para permitir a completa formação do coágulo; Proteja a amostra de sangue total da exposição a temperaturas muito elevadas ou baixas. Mantenha em temperatura entre 20 e 26ºC (temp. ambiente) até formação do coágulo e após, conserve refrigerado em torno de 8 C, não deixe o sangue em contato direto com gelo, ou com a placa de refrigerador em geladeiras; Não deixar o sangue armazenado por muito tempo refrigerado antes de fazer os exames. Caso não seja possível enviar a amostra em menos de 24h, é recomendado separar o soro livre e transferir para outro tubo seco. Em casos específicos, a separação do soro antes de enviar a amostra é a melhor forma de evitar a hemólise, e isso pode ser feito com a maioria das amostras, mesmo sem centrifugar, sobretudo em volumes maiores (3 ml) de sangue (consulte o procedimento na seção de protocolos de coleta, na área restrita do site). PONTOS A SEREM LEMBRADOS Hemólise pode ocorrer in vitro e in vivo e é difícil de se distinguir por análise laboratorial apenas; Portanto diretrizes para identificação da hemólise e ampla comunicação entre o laboratório e os clínicos são necessárias. Uma investigação sistemática deve ser feita para determinar a causa da hemólise no interesse da segurança do paciente. Hemólise pode afetar os valores laboratoriais de uma maneira específica do método e do analito, e se a hemólise in vivo for suspeitada esses valores são clinicamente importantes e devem ser relatados se interferência analítica da hemólise puder ser excluída.

5 Por que ocorre hemólise durante o transporte? Durante o transporte as amostras sofrem impacto, inevitavelmente, por mais apropriado que seja o recipiente e o meio de transporte utilizado. Na rotina diária do laboratório observamos uma média de rejeição de amostras por hemólise (condição em que não é possível realizar nenhum exame) inferior a 1%. Mas o índice de hemólise em baixo grau chega a mais de 30%. Em levantamentos realizados em conjunto com clínicas que apresentavam hemólise recorrente, foi observada a condição da amostra antes de entregar ao transportador, sendo já observado certo grau de hemólise, sugerindo hemólise in vivo, ou in vitro, pós coleta, mas não relacionada ao transporte. Em levantamentos realizados no laboratório observamos que graus elevados de hemólise ocorrem com maior frequência em amostras com volume reduzido, inferior a 2 ml de sangue, acondicionadas em tubos padrão com ativador de coagulação e capacidade para 4 ml de sangue. Coletas de pequenos volumes sugerem dificuldade na obtenção da amostra, podendo ocorrer hemólise já no procedimento de coleta por diferentes fatores, além disso, acondicionar volume inferior à capacidade do tubo é outra condição predisponente, e para culminar, o pequeno volume de sangue faz com que o coágulo fique solto em um grande espaço vazio no tubo, sofrendo muito mais impacto do que uma amostra em volume adequado à capacidade do tubo. Esta tem sido a principal causa de hemólise de acordo com levantamento realizado ao longo de vários meses. Temos avaliado a utilização de tubos com menor capacidade, porém, não há no mercado fornecedor tubos apropriados, com custo acessível e distribuição regular para coleta de amostras veterinárias. Outro aspecto preocupante é que, reduzindo o tubo, sejam enviados volumes cada vez menores de amostra, inviabilizando a realização dos exames, como observamos com os microtubos com EDTA, que são padronizados para 0,5 ml de sangue, e recebemos com frequência com volume abaixo de 0,2 ml. Em razão das condições de coleta especiais dos pacientes veterinários, é preciso que clinicas/veterinários e o laboratório trabalhem em conjunto tentando minimizar a ocorrência de hemólise, pois trata-se de uma condição multifatorial, que o laboratório sozinho não poderá eliminar com uma ação isolada. Coletas em locais distantes: Apesar de seguir as orientações de embalagem das amostras (instruções estão disponíveis na seção de protocolos de coleta - Remessa de amostras embalagem), as caixas são transportadas como carga "comum", e inevitavelmente sofrem impacto durante o transporte. Por isso recomendamos utilizar o isopor dentro da caixa de papelão fornecida, e internamente, preencher o espaço vazio com jornal, para que o gelo reciclável não fique solto dentro do isopor, causando impacto nas amostras. Infelizmente, ainda não é economicamente viável estruturar um sistema de coleta específico para amostras em locais distantes, e o sistema atual é o único acessível, por isso, é preciso um trabalho conjunto entre as clínicas/veterinários e o laboratório, para garantir a qualidade das amostras e dos resultados. Em casos específicos, a separação do soro antes de enviar a amostra é a melhor forma de evitar a hemólise, e isso pode ser feito com a maioria das amostras, mesmo sem centrifugar, sobretudo em volumes maiores (3 ml) de sangue (consulte o procedimento na seção de protocolos de coleta, na área restrita do site).