Estudo da expressão de filagrina e claudinas 1 e 4 em indivíduos adultos com dermatite atópica

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1 MARIANA COLOMBINI ZANIBONI Estudo da expressão de filagrina e claudinas 1 e 4 em indivíduos adultos com dermatite atópica Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Programa de Dermatologia Orientadora: Profa. Dra. Valéria Aoki São Paulo 2015

2 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo reprodução autorizada pelo autor Zaniboni, Mariana Colombini Estudo da expressão de filagrina e claudinas 1 e 4 em indivíduos adultos com dermatite atópica / Mariana Colombini Zaniboni. -- São Paulo, Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Programa de Dermatologia. Orientadora: Valéria Aoki. Descritores: 1.Epiderme/fisiopatologia 2.Dermatite atópica 3.Filagrina 4.Claudina-1 5.Claudina-4 6.Imuno-histoquímica 7.Adulto USP/FM/DBD-105/15

3 Aos meus pais, Mariley e João Roberto, pelo amor e apoio incondicionais, e por me ensinarem a importância do conhecimento. À minha irmã, Milena, por sua amizade, carinho e por estar sempre pronta a me oferecer a palavra certa na hora certa. Aos meus queridos sobrinhos, Julia e Nicolas.

4 AGRADECIMENTOS À minha orientadora, Profa. Dra. Valéria Aoki, pelo apoio, orientação e paciência. Agradeço pela oportunidade e acolhimento. Foi uma honra partilhar de sua sabedoria e receber seus ensinamentos que ultrapassam a vida acadêmica. À Dra. Raquel Leão Orfali, pela amizade e pela imensa ajuda nas partes mais árduas do meu trabalho. Ao Dr. Roberto Takaoka pelo carinho e agradável convivência no ambulatório de Dermatite Atópica. À Naiura Vieira Pereira, do LIM56 por sua atenção, trabalho e paciência e à Fernanda Guedes por compartilhar seus conhecimentos. Às técnicas do laboratório de Histopatologia, Maria Cristina Galhardo e Jaqueline Maria Cruz Meneghin, pela ajuda inestimável. Ao Dr. Luiz Fernando Ferraz da Silva pela paciência e disponibilidade. Ao Prof. Dr. José Antônio Sanches Junior, coordenador do curso de Pós-Graduação, pela oportunidade. Aos funcionários do ambulatório de Dermatologia que me acolheram e se mostraram sempre prontos a ajudar. Aos pacientes do ambulatório de Dermatite Atópica pela colaboração, sem a qual este trabalho não teria sido possível.

5 NORMALIZAÇÃO ADOTADA Esta dissertação está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação: Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver). Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A.L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3 a Ed. São Paulo: Serviços de Biblioteca e Documentação; Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus.

6 SUMÁRIO LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS LISTA DE FIGURAS RESUMO ABSTRACT 1 INTRODUÇÃO A barreira cutânea Proteínas de relevância funcional da barreira cutânea Filagrina Tight junctions Corneodesmossomas Lipídeos da barreira O ph ácido da camada córnea Objetivos Objetivo geral Objetivos específicos CASUÍSTICA E MÉTODOS Casuística Critérios de exclusão Métodos Imuno-histoquímica Técnica de imuno-histoquímica para a demonstração de claudinas 1 e 4, e filagrina Análise das lâminas Análise estatística RESULTADOS Análise da expressão de filagrina na DA Expressão da filagrina na pele com lesão de DA e sua relação com: a gravidade da doença (EASI), a espessura da epiderme, eosinofilia e IgE sérica Expressão da filagrina na epiderme do grupo controle, e na pele de doentes de DA (pele com lesão X sem lesão)... 30

7 4.2 Análise da expressão de claudina -1 na DA Expressão da claudina -1 na pele com lesão de DA e sua relação com: a gravidade da doença, a espessura da epiderme, a eosinofilia e níveis séricos de IgE Expressão da claudina -1 na epiderme do grupo controle, e na pele de doentes de DA (pele com lesão X sem lesão) Análise da expressão de claudina -4 na DA Expressão da claudina-4 na pele com lesão de DA e sua relação com: a gravidade da doença, a espessura da epiderme, a eosinofilia e a dosagem de IgE Expressão da claudina -4 na epiderme do grupo controle, e na pele de doentes de DA (pele com lesão X sem lesão) Análises da espessura da epiderme na DA Avaliação da espessura epidérmica (μm) e sua relação com a gravidade da DA, IgE sérica e eosinofilia Análise da espessura da epiderme e expressão das proteínas de barreira filagrina, claudina -1 e claudina -4 nas amostras de pele atópica sem lesão DISCUSSÃO CONCLUSÃO ANEXO Anexo A Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Anexo B: tabelas com os resultados obtidos no estudo REFERÊNCIAS APÊNDICE APÊNDICE A Artigo: Profile of skin barrier proteins (filaggrin, claudins 1 and 4) and Th1/Th2/Th17 cytokines in adults with atopic dermatitis

8 LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS BC CLDN 1 CLDN 4 CLDN DA EVK EASI FLG FMUSP HCV HIV HPV HSV IgE IL JAM-1 MCV Barreira Cutânea Claudinas-1 Claudinas-4 Claudinas Dermatite Atópica Erupção Variceliforme de Kaposi Eczema Area and Severity Index Filagrina Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo Vírus da Hepatite C Vírus da Imunodeficiência Humana Papiloma Vírus Humano Herpes simplex Imunoglobulina E Interleucinas Molécula de Adesão Juncional-1 Molluscum contagiosum MUPP-1 Proteína Multi-PDZ -1 NMF OC PBS PCA Fatores Naturais de Hidratação Ocludina Solução Salina Tamponada Ácido 5-Carboxílico-Pirrolidone S. aureus Staphylococcus aureus TEWL TJ Perda de Água Transepidérmica Tight Junctions

9 TLR-2 UCA ZO-1 ZO-2 Toll-Like Receptor-2 Ácido Urocânico Zonnula Occludens-1 Zonnula Occludens-2

10 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Representação esquemática do modelo parede de tijolos da camada córnea Figura 2 Imuno-histoquímica de epiderme humana com marcador para filagrina Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Representação da estrutura básica dos componentes das tight junctions (TJ)... 9 Representação do corneodesmossoma ligando duas células adjacentes Representação dos corpos lamelares (CL) presentes nos ceratinócitos Resumo das alterações da barreira cutânea que podem ser encontradas na dermatite atópica e suas possíveis implicações na etiopatogenia da doença Dados demográficos dos indivíduos incluídos neste estudo...21 Imuno-histoquímica de fragmentos de pele normal obtidos de biópsias Expressão da filagrina (FLG) na pele com lesão de doentes de dermatite atópica Imuno-histoquímica com marcação para filagrina (FLG) em pele Expressão da claudina -1 (CLDN 1) na pele com lesão de doentes de dermatite atópica Figura 12 Imuno-histoquímica com marcação para claudina Figura 13 Expressão da claudina -4 (CLDN-4) na pele com lesão de doentes de dermatite atópica Figura 14 Imuno-histoquímica com marcação para claudina Figura 15 Análise da espessura epidérmica (μm) na pele de doentes de dermatite atópica

11 Figura 16 Tabela 1 Análise da espessura epidérmica (μm) e medidas de filagrina (FLG), claudina -1 (CLDN 1) e claudina -4 (CLDN 4) na pele sem lesão (SL) de indivíduos com dermatite atópica Resumo dos resultados obtidos com a análise dos dados encontrados após o estudo do material fornecido pelas biopsias

12 RESUMO Zaniboni MC. Estudo da expressão de filagrina e claudinas 1 e 4 em indivíduos adultos com dermatite atópica. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; Introdução: A dermatite atópica (DA) é uma doença cutânea inflamatória crônica que cursa em surtos. Possui manifestação clínica variável, mas o prurido e a xerose são características frequentes, e pode estar associada a outras manifestações extra-cutâneas de atopia. Pacientes com DA apresentam maior risco de infecções por bactérias e vírus, destacando-se a erupção variceliforme de Kaposi, causada por herpes simples. A DA mostrase como exemplo de dermatose com comprometimento da barreira cutânea, aliado a disfunção imunológica. São descritas alterações das proteínas da barreira cutânea na DA (filagrina e claudinas ), relacionadas ao maior risco de infecção. Objetivo: Avaliar a expressão de proteínas relacionadas à barreira cutânea como a filagrina, e as claudinas -1 e -4 na pele de pacientes adultos com dermatite atópica, acompanhados no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Métodos: 32 indivíduos com diagnóstico de DA (estabelecido pelos critérios de Hanifin & Rajka) e 23 controles (indivíduos sem DA), maiores de 18 anos, foram submetidos a biópsias cutâneas. Os indivíduos com DA foram biopsiados em dois pontos, tanto na pele lesada, quanto na pele não-lesada. O material obtido foi analisado por imuno-histoquímica, através de marcadores específicos para filagrina, claudina-1 e claudina-4. As lâminas foram digitalizadas pelo Panoramic Scan - 3DHistech Hungria, e as imagens analisadas pelo software Image Pro Plus 4,5, quanto à intensidade da expressão do marcador. A espessura média da epiderme do local estudado foi também avaliada. O grupo com DA foi também analisado quanto à gravidade da doença (EASI), níveis séricos de IgE e grau de eosinofilia. Resultados: Houve redução da expressão da filagrina na pele de doentes de DA em relação aos controles, tanto na pele com lesão quanto na pele sem lesão. Demonstrou-se correlação inversa na expressão da filagrina, tanto com relação à gravidade da doença quanto à espessura da epiderme. A análise das claudinas -1 e -4 demonstrou redução de ambas na pele dos doentes de DA, mas não houve correlação com a gravidade, espessura da epiderme, níveis de IgE sérica ou eosinofilia. Conclusão: No adulto com dermatite atópica, existe redução da expressão das proteínas relacionadas à barreira cutânea, como a filagrina e as claudinas -1 e -4. A redução da expressão da filagrina relacionou-se inversamente com a gravidade da doença, e com a espessura da epiderme, sugerindo

13 cronicidade das lesões. Houve redução da expressão das claudinas -1 e -4, sem relação com a gravidade da doença, espessura da epiderme, eosinofilia ou com os níveis séricos de IgE. Descritores: Fisiopatologia epiderme; Dermatite atópica; Filagrina; Claudina -1; Claudina -4; Imuno-histoquímica; Adultos.

14 ABSTRACT Zaniboni MC. Study of expression of filaggrin and claudin 1 and 4 in adults with atopic dermatitis [Dissertation]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo ; Introduction: Atopic dermatitis (AD) is a chronic, inflammatory dermatosis with ocasional flares. Its clinical features are variable, but pruritus and xerosis are frequent, and the disease may be associated to extracutaneous atopy. Patients with AD have increased risk for bacterial or viral infection, with emphasis on eczema herpeticum due to herpes simplex. AD is an example of a compromised skin barrier, allied to na imune dysfunction. There are reports on efective proteins of the skin barrier (filaggrin and claudins), related to increased risk for infection. Objectives: To evaluate the expression of proteins related to the skin barrier, such filaggrin and claudins-1 and-4 in the skin of adults with AD, followed at the Department of Dermatology, University of Sao Paulo Medical School. Methods: 32 individuals diagnosed as AD, according to Hanifin & Rajka s criteria, and 23 non-atopic controls, above the age of 18, were biopsied. Individuals with AD were biopsied in two different sites (lesional and nonlesional skin). The specimens were analyzed by immunohistochemistry through specific markers for filaggrin, claudins 1 and 4. The slides were scanned utilizing Panoramic Scan - 3DHistech Hungary, and images analyzed by Image Pro Plus 4,5 for the intensity of each marker. The mean epidermal thickness was also evaluated. AD patients were also analyzed for disease severity (EASI), circulating IgE levels and eosinophilia. Results: In lesional and nonlesional skin of AD patients there was a reduced expression of filaggrin, when compared to nonatopic controls. There was an inverse correlation of filaggrin expression with disease severity and epidermal thickness. In the skin of AD individuals, there was reduced expression of claudins 1-and-4, which did not correlate with disease severity, epidermal thickness or eosinophilia. Conclusion: In adults with AD, there is reduced expression of skin barrier proteins, such as filaggrin, claudins 1 and 4. The reduction of filaggrin expression had an inverse correlation with disease severity and epidermal thickness, suggesting disease chronicity. There was reduction of claudins 1 and 4, with no relation with disease severity, epidermal thickness, circulating IgE levels or eosinophilia. Descriptors: Epidermis physiopathology; Dermatitis, atopic; Filaggrin; Claudin-1; Claudin-4; Immunohistochemistry; Adults.

15 1 INTRODUÇÃO

16 1 Introdução 2 1 INTRODUÇÃO A dermatite atópica (DA) é uma dermatose inflamatória, pruriginosa, de caráter crônico e com morfologia e distribuições típicas, que variam de acordo com a faixa etária. Possui alta prevalência na população geral, especialmente na infantil. A DA acomete cerca de 10 a 20% da população (1, 2) durante a infância, e por volta de 3% dos adultos. No Brasil, a prevalência de história de eczema relacionado à DA em crianças de 6 a 7 anos é de 12,5% e de 10,1% entre 13 e 14 anos. (3) Cerca de 85% dos pacientes de DA apresentam as manifestações clínicas iniciais nos primeiros cinco anos de vida, e apenas 2% dos casos novos ocorrem acima dos 45 anos de idade. Ao redor de 40% dos pacientes com DA mantêm os sintomas ao longo da vida adulta.(4) Em estudo realizado no Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo com adultos portadores de DA, demonstrou-se que 56% dos indivíduos estudados tiveram, pelo menos, uma internação durante a vida, e 88,75% desses apresentavam associação com, pelo menos, um tipo de atopia respiratória. (5) A DA possui componente genético importante,(6) mas a influência do meio ambiente sobre a evolução da doença também possui papel relevante. (4, 7) Seu diagnóstico é exclusivamente clinico, feito pela distribuição característica e pelo caráter inflamatório crônico e pruriginoso de suas lesões, o histórico pessoal e familiar para atopia, os períodos de agudização da doença, além do maior risco a infecções cutâneas. Indivíduos com DA são mais susceptíveis a certas infecções, como as bacterianas, causadas pelo Staphylococcus aureus (S. aureus) (8, 9), e as virais, como as ocasionadas por Molluscum contagiosum (MCV) e Herpes simplex (HSV).(10) Não existem marcadores laboratoriais específicos para DA; portanto, critérios clínicos diagnósticos, como os de Hanifin e Hajka(11), são utilizados para a realização e padronização do seu diagnóstico. A DA apresenta uma variedade de lesões clínicas, que variam entre xerose, eczema e liquenificação, podendo ter mais de uma manifestação clínica num mesmo

17 1 Introdução 3 indivíduo. Em alguns casos, indivíduos com início da dermatite após os 18 anos podem apresentar distribuição atípica das lesões(12) o que dificulta o diagnóstico correto. A DA pode estar associada a outras manifestações de atopia, como asma e rinite, além de aumento de imunoglobulina E (IgE) e eosinofilia, que ocorre com maior frequência em casos graves ou de difícil controle.(1, 4) A resposta imunológica alterada na DA, evidenciada por altos níveis séricos de IgE encontrados em cerca de 80% dos indivíduos, pelo predomínio do padrão de resposta imunológica tipo Th2 em lesões agudas e Th1 em lesões crônicas,(13, 14) foi, por muito tempo, considerada como o principal mecanismo responsável pela formação das lesões e alterações da permeabilidade cutânea (teoria inside-outside ). Entretanto, algumas evidências mostram que alterações próprias da barreira cutânea podem contribuir, ou mesmo desencadear este processo inflamatório, a saber: 1- indivíduos com DA que apresentam mutações do gene da filagrina costumam ter quadros mais graves e maior associação com asma;(15, 16) 2- alterações significativas nos lipídeos epidérmicos foram descritos na pele de doentes de DA, e consequente alterações de permeabilidade, tal como o aumento de perda de água transepidérmica (TEWL), que pode ser observado em pele clinicamente sem lesão;(17-19) 3- a maior colonização da pele do atópico pelo S. aureus, e consequente exposição aos seus superantígenos, pode estar relacionada às alterações do ph encontradas na pele de indivíduos portadores de DA;(20-22); 4- o ph ligeiramente mais alcalino encontrado na superfície epidérmica dos portadores de DA pode, além de alterar a composição da microbiota cutânea, como citado acima, interferir na excreção dos corpos lamelares, alterando os lipídeos intercelulares e a excreção de peptídeos do sistema imune inato, como a β2 defensina.(22, 23) O uso de hidratantes é fundamental no tratamento da DA, tanto nas crises como na prevenção dessas, por contribuir para a reparação da barreira cutânea. Assim, alguns autores desenvolveram a teoria outsideinside, em que a barreira cutânea passa a ter papel fundamental na

18 1 Introdução 4 fisiopatologia da DA, e não mais representa mera consequência das alterações imunológicas.(4, 7, 24-28) Portanto, uma melhor caracterização da barreira cutânea na dermatite atópica, incluindo a variação da expressão de determinadas proteínas que a compõem, como a filagrina (FLG) e as claudinas -1 (CLDN-1) e -4 (CLDN-4), faz-se necessária, uma vez que alterações destas impactam direta ou indiretamente na resposta imune, tanto inata quanto adaptativa. 1.1 A barreira cutânea Proteção do hospedeiro contra agentes agressores físicos, químicos ou biológicos corresponde a uma das funções mais relevantes da pele. A camada córnea é o principal agente desta barreira, organizando-se por meio do modelo parede de tijolos,(29) em que os tijolos seriam os ceratinócitos, com sua estrutura protéica e hidrofílica, e o cimento corresponderia aos lipídeos cutâneos, hidrofóbicos e de características únicas (Figura 1).(30, 31) C Figura 1 - Representação esquemática do modelo parede de tijolos da camada córnea, mostrando os corneócitos (C), entremeados pelos lipídeos intercelulares (indicado pela seta).

19 1 Introdução 5 Proteínas presentes na epiderme, como a filagrina (invólucro córneo)(32, 33), e um grupo de proteínas expressas na membrana celular, como as claudinas, (tight junctions ou TJ),(34) estão implicadas com as alterações da barreira cutânea em animais experimentais e em humanos.(28, 34-36) Alterações da claudina -1, proteína da família das TJ, estão relacionadas a aumento da TEWL e a infecções virais na pele e em outros órgãos,(35, 37-41), enquanto que a deficiência da filagrina já foi bem determinada na ictiose vulgar e pode estar alterada em diversas enfermidades relacionadas às alterações da barreira cutânea (BC).(42-45) A defesa da pele, seja ela relacionada ao corneócito, como na proteção contra radiação ultravioleta, ou à matriz extracelular, como, por exemplo, na barreira antimicrobiana do sistema imune inato, associada aos lipídeos de superfície, confere uma característica filmógena ao estrato córneo e define a localização específica de cada mecanismo desta defesa.(46) Proteínas de relevância funcional da barreira cutânea Filagrina A filagrina é uma proteína formada pelo ceratinócito, a partir da prófilagrina. É a principal proteína dos grânulos de querato-hialina, presentes nas camadas mais superficiais de ceratinócitos vivos da epiderme. Estes grânulos podem ser visualizados através da microscopia óptica a partir da camada granulosa, daí a origem do seu nome. A conversão da pró-filagrina em filagrina, ambas proteínas intracelulares, (Figura 2) se dá por meio da desfosforilação e proteólise por serino-proteases, liberando múltiplos monômeros ativos de filagrina. (33, 47) Com a diminuição do gradiente hídrico nas camadas mais externas da epiderme, ocorre a hidrólise da filagrina em aminoácidos higroscópicos. Interessante ressaltar que ambientes extremamente secos, com umidade relativa abaixo de 40%, levam à

20 1 Introdução 6 diminuição da hidrólise da filagrina, com consequente aumento do ressecamento epidérmico.(48-52) Os aminoácidos formados, como arginina, glutamina e histidina, são encontrados no espaço intercelular. A partir destes aminoácidos, serão formados alguns dos fatores naturais de hidratação (NMF), como o ácido urocânico (UCA) nas formas cis e trans, e o ácido 5-carboxílico-pirrolidone (PCA), importantes para a hidratação da camada córnea e manutenção do ph (32, 33, 47, 49). Já foi demonstrado que estes dois subprodutos da filagrina possuem efeitos inibitórios sobre o crescimento do S. aureus, independentemente da sua ação sobre o ph.(53) Figura 2 - Imuno-histoquímica de epiderme humana com marcador para filagrina, mostrando o padrão intracelular da expressão dessa proteína e sua expressão nas camadas mais superficiais da epiderme. O gene da filagrina está localizado no cromossoma 1q21, no chamado complexo de diferenciação epidérmica. (54) Em 1996, Seguchi et al. (55) demonstram a diminuição da expressão da filagrina na pele de indivíduos atópicos. Mais recentemente, mutações com perda de função do gene da filagrina (FLG), à semelhança das encontradas na ictiose vulgar(44), foram

21 1 Introdução 7 descritas em indivíduos com dermatite atópica.(45, 56, 57) Nestes doentes, há maior risco de início precoce da doença, persistência da DA na idade adulta, maior risco de alergias, associação com altas taxas de IgE e com (15, 16, 58-60) outras manifestações de atopia, como a asma. Ainda, Brown et al., em 2011(61), mostram relação entre pacientes de DA com a mutação do FLG e alergia ao amendoim mediada por IgE. Esta relação parece ser resultado da maior permeabilidade cutânea, com consequente aumento à exposição a alérgenos. (62) Também já foi relatado que a deficiência do FLG aumenta o risco à infecção pelo HSV, sob a forma de erupção variceliforme de Kaposi (EVK).(63) Em 2007, Howell et al.(64) reportam que as interleucinas (IL) -4 e -13, presentes nas lesões inflamatórias da DA, levariam à diminuição na expressão da filagrina nos ceratinócitos. Em 2012, Kezic et al.(65) correlacionam a diminuição do NMF no estrato córneo de indivíduos com DA e mutações no FLG, ao aumento de citocinas da família da IL-1, na pele sem lesões. Esta família de interleucinas possui elementos com características pró-inflamatórias, como a IL-1α, sugerindo que o início da inflamação possa decorrer das alterações da barreira cutânea. Portanto, pacientes que apresentam DA associada à deficiência de expressão do FLG exibem menor hidratação do estrato córneo, maior perda de água transepidérmica em relação ao grupo controle, (58) e maior risco de desenvolver alergias, asma e rinite alérgica. Além disso, as alterações da BC causadas pela deficiência de filagrina podem levar a quadros inflamatórios, (66) e à inflamação, que, por sua vez, reduz a expressão desta proteína pelos ceratinócitos.(65)

22 1 Introdução 8 DERMATITE ATÓPICA E FILAGRINA: diminuição da expressão da filagrina. mutações do gene da filagrina: maior risco de início precoce da doença; persistência da DA na idade adulta; maior risco de alergias; associação com altas taxas de IgE e com outras manifestações de atopia; maior risco de infecção pelo HSV-erupção variceliforme de Kaposi Tight junctions As junções intercelulares do tipo tight junctions (TJ) são proteínas transmembranosas, encontradas nos epitélios simples e estratificados de mamíferos. Na epiderme, são encontradas na região apical dos ceratinócitos, sempre próximas às junções aderentes, concentrando-se na camada granulosa. (34) São proteínas de expressão ativa, podendo aumentar rapidamente após agressões à epiderme e por ação de bactérias, como o Staphylococcus aureus, via ativação do toll-like receptor-2 (TLR-2).(67) As TJ são essenciais para a diferenciação celular e queratinização das células epidérmicas. (68, 69) Em doenças com alterações da queratinização, como psoríase e ictiose vulgar, podem ser encontradas inclusive nas camadas mais profundas da epiderme. (70, 71) Apresentam papel importante na permeabilidade seletiva epidérmica, controlando o fluxo paracelular de substâncias, como hormônios, citocinas e eletrólitos, funcionando como porteiras.(70) A permeabilidade depende diretamente do tamanho e da especificidade iônica da molécula. Esta função parece estar localizada, principalmente, na segunda camada mais externa de células granulosas da

23 1 Introdução 9 epiderme. (72) Além da função de controlar a permeabilidade intercelular, estas estruturas são importantes na manutenção do microambiente epidérmico, funcionando como marcadores de território celular, controlando a proliferação das células e metástases tumorais.(73-76) A porção intracelular das TJ liga-se às proteínas plasmáticas do citoesqueleto, enquanto a porção extracelular forma alça no espaço intercelular, conectando-se com a alça da célula adjacente. São formadas pelas ocludinas, as claudinas (CLDN), zonnula occludens-1 (ZO-1) e -2 (ZO- 2), molécula de adesão juncional-1 (junctional adhesion molecule-1 ou JAM- 1), e a proteína multi-pdz -1 (MUPP-1) (Figura 3).(34, 71) Figura 3 - Representação da estrutura básica dos componentes das Tight Junctions (TJ): claudina (CLDN), ocludina (OC), zonnula occludens-1 e -2 (ZO), junctional adhesion molecule-1 (JAM-1), e a proteína multi-pdz -1 (MUPP-1). Das proteínas pertencentes à família das TJ, as claudinas são as mais estudadas; mais de 20 subtipos de claudinas já foram descritos em diversos

24 1 Introdução 10 epitélios. Estas proteínas são tecido-específicas, ou seja, cada epitélio possui sua claudina característica. São essenciais para a diferenciação celular, queratinização e descamação das células epidérmica. (69, 77) Na pele, já foi demonstrada a importância das claudinas-1 e 4 (CLDN 1 e CLDN 4) para manutenção da barreira epidérmica.(74, 78, 79) Em 2002, Furuse et al.(74) demonstram que a deficiência de claudina 1 em camundongos leva a grandes perdas de água transepidérmica e alterações hepáticas, culminando em óbito. Estes animais apresentam epiderme estruturalmente normal, mas com perda importante na função da barreira cutânea. Quadro clínico semelhante, mas sem óbito, foi descrito em humanos neonatos portadores da síndrome ictiose-esclerose-colangite, em que foram demostradas mutações na claudina-1.(80) Na pele sem lesão de indivíduos com dermatite atópica, a claudina-1 aparece significantemente reduzida, quando comparada à pele de indivíduos não atópicos e portadores de psoríase. (38) No mesmo estudo, demonstrou-se relação inversa entre a expressão da claudina-1 e a presença dos marcadores de resposta imunológica padrão Th2, sugerindo que esta proteína pode afetar a resposta imunológica a possíveis alérgenos ambientais.(38) As proteínas das TJ, claudinas-1, 4, ocludina e ZO-1 são importantes na permeabilidade paracelular epidérmica a grandes moléculas; portanto, sua redução levaria a aumento da permeabilidade cutânea a alérgenos de grandes moléculas.(81) Ainda, muito se tem estudado sobre a relação entre as claudinas e a invasão viral em diversos órgãos. A associação mais estudada é o vírus da hepatite C (HCV) e a claudina. A claudina-1 teria importância no mecanismo de invasão viral dos tecidos, mas seu papel ainda não está bem estabelecido; há controvérsias com relação à expressão da CLDN 1 na vigência da (39, 82) infecção. Também há descrições da relação entre outras infecções causadas por vírus e as claudinas, como no caso dos vírus da imunodeficiência humana (HIV),(83) papiloma vírus humano (HPV)(41) e

25 1 Introdução 11 vírus da dengue.(84) Na DA, a redução da claudina-1 poderia levar a aumento do risco pelo HSV-1.(38, 63) DERMATITE ATÓPICA E TIGHT JUNCTION: diminuição da expressão na pele sem lesão. favorece infecção pelo Herpes Vírus tipo I, e outras infecções virais cutâneas; aumento da permeabilidade paracelular; aumento do risco a alergias a grandes moléculas. proteínas de expressão ativa: aumentam com a colonização do Staphylococcus sp, via Tool Like Receptor 2; diminuem com aumento de citocinas padrão Th Corneodesmossomas: Entre a camada granulosa e córnea da epiderme, os desmossomas sofrem modificações na desmoglea e perdem sua ligação com a queratina do invólucro córneo, transformando-se em corneodesmossomas (Figura 4). Os corneodesmossomas são os principais responsáveis pela adesão dos corneócitos. Proteases e inibidores de proteases, excretados pelos corpos lamelares, estão envolvidos no controle da quebra dos corneodesmossomas. O equilíbrio entre ambos determina a velocidade de descamação das células epiteliais e alterações em seu transporte, sua secreção e sua estrutura. (85)

26 1 Introdução 12 Figura 4 - Representação do corneodesmossoma ligando duas células adjacentes. Caso a degradação dos corneodesmossomas esteja aumentada, ocorrerá diminuição da espessura da camada córnea, e aumento da permeabilidade cutânea, enquanto que o retardo na sua degradação levará à hiperceratose.(85) Além das substâncias produzidas pelos ceratinócitos, fatores externos, tais como o ph, uso de sabões e proteases bacterianas, também influenciam na quebra dos corneodesmossomas.(86) As TJ presentes nas camadas granulosa e córnea parecem proteger os corneodesmossomas da quebra precoce.(77) Na dermatite atópica, a alteração do ph, (20) o aumento da ação da serino-protease, a diminuição da claudina-1 e ação das proteases do S.aureus poderiam interferir na quebra dos corneodesmossomas, e modificar a descamação das células epidérmicas, definindo alterações de barreira e, também, influenciando na clínica das lesões.

27 1 Introdução 13 DERMATITE ATÓPICA E CORNEODESMOSSOMAS aumento da quebra pela diminuição da CLDN 1, elevação do ph, proteases; alteração na descamação; maior permeabilidade epidérmica Lipídeos da barreira A camada córnea possui dois grupos de lipídeos distintos: os lipídeos de superfície, compostos por ácidos graxos livres de cadeia longa, que formam o manto lipídico ácido da superfície cutânea e são excretados pelas glândulas sebáceas, e os lipídeos intercelulares, em que são armazenados água e eletrólitos, compostos por 50% de ceramidas, 25% de colesterol e 15% de ácidos graxos livres de cadeia curta.(19, 31, 87) São excretados pelos ceratinócitos por meio dos corpos lamelares,(87) e se distribuem no espaço intercelular paralelamente, formando estrutura multilamelar. Os corpos lamelares contêm fosofolipídeos, glucosilceramidas, esfingomilelinas e sulfato de colesterol, além de substâncias que os converterão nos lipídeos lamelares do espaço extracelular (ex. β glucoceribrosidase). A partir destes precursores, serão formados ceramidas, ácidos graxos livres de cadeia curta, glicerol e colesterol. Também estão presentes nos corpos lamelares peptídeos do sistema imune inato como a β2 defensina e proteases. (Figura 5) Estas últimas, dentre outras ações, atuam na quebra dos corneodesmossomas.(19, 21) Algumas destas proteases e lipases possuem sua atuação ligada ao ph.(23, 88)

28 1 Introdução 14 Figura 5 - Representação dos corpos lamelares (CL) presentes nos ceratinócitos, com os lipídeos precursores dos lipídeos intercelulares ( ) suas enzimas conversoras, ( ) e peptídeos do sistema imune inato ( ) Indivíduos com dermatite atópica apresentam alterações nos lipídeos cutâneos, tanto em quantidade quanto em qualidade. Os lipídeos de superfície estão diminuídos e os intercelulares apresentam diminuição de lipídeos totais, principalmente de ceramidas, de fosfolípides e ésteres de esterol, com aumento de ácidos graxos livres e esterol(18). As ceramidas, em especial a ceramida 1, encontra-se diminuída tanto na pele lesada como na pele aparentemente sem lesão dos indivíduos atópicos.(89-92) Estas alterações modificam a barreira cutânea, aumentando a TEWL, e gerando ressecamento dessa. Ocorre, também, alteração da hidrólise da filagrina, que é dependente do gradiente hídrico, e pode estar reduzida em ambientes com umidade abaixo de 40%.(51)

29 1 Introdução 15 DERMATITE ATÓPICA E LIPÍDEOS: alteração na excreção dos corpos lamelares; redução global dos lipídeos epidérmicos, em especial, ceramidas; desarranjo das lamelas pela alteração do ph; maior ação de proteases e maior quebra corneodesmossomas maior descamação; aumento da TEWL; redução da hidrólise filagrina O ph ácido da camada córnea O ph nas camadas mais externas da pele varia entre 5.0 e 5.5, ao contrário das mais profundas, em que é de, aproximadamente, 7.0. A acidez da superfície tem se mostrado importante mecanismo de proteção contra a colonização e invasão de patógenos (S. aureus possui ph de crescimento ideal em 7.0).(93) O ph atua na recuperação contra os danos causados à integridade cutânea, favorece a manutenção dos lipídeos lamelares por meio da ativação de hidrolases de lipídeos, como a β-glucocerebrosidase e fosfolipase, importantes para a formação das ceramidas e ácidos graxos livres, e participa, ainda, da manutenção da integridade e coesão da camada córnea. O ph 7.0 estimula a ação de proteases, que resulta na maior quebra dos desmossomas.(23, 94, 95) Além disso, a simples elevação do ph é capaz de promover a liberação de citocinas pró-inflamatórias como IL-12 e a IL-1β.(96, 97)

30 1 Introdução 16 Diversos mecanismos parecem participar do processo de acidificação da pele, como a cobertura cutânea pelos ácidos graxos livres de cadeia longa, produzidos pelas glândulas sebáceas, a excreção de ácido lático pelas glândulas écrinas, a formação dos lipídeos intercelulares e a hidrólise da filagrina, com liberação de histidina e produção do ácido urocânico na sua forma cis. (94, 98) Esta via filagrina-histidina-ácido urocânico, apesar de diminuir o ph, parece não ser fundamental na manutenção da acidez cutânea, como demonstrado por Fulhr et al. em 2010.(99) Na DA, o ph da superfície cutânea costuma ser mais alcalino que o tradicionalmente encontrado.(100) Isto gera diminuição da produção de ceramidas, e desarranjo dos lipídeos intercelulares, desencadeando a xerose pelo aumento da TEWL. O ph elevado pode, ainda, provocar o aumento da descamação pela ativação de protease, maior quebra dos desmossomas, além de desencadear inflamação ao ativar interleucinas. Há maior colonização e risco de infecção pelo S. aureus, facilitada pela elevação do ph, mais próximo ao seu ph de crescimento ideal.(88, 101) DERMATITE ATÓPICA E ph: ph elevado; maior risco de infecção pelo Staphylococcus aureus; desarranjo dos lipídeos intercelulares com aumento da perda de água transepidérmica; ativação e perpetuação do processo inflamatório; aumento da quebra dos corneócitos.

31 1 Introdução 17 Pacientes com dermatite atópica apresentam xerose, maior permeabilidade cutânea, susceptibilidade a infecções cutâneas, maior risco de sensibilização a alérgenos externos e resposta imunológica inadequada. A barreira cutânea parece exercer, cada vez mais, importante papel na fisiopatologia da DA, deixando de ser apenas consequência, para ter papel ativo no aparecimento das lesões cutâneas (Figura 6). Figura 6 - Resumo das alterações da barreira cutânea que podem ser encontradas na dermatite atópica e suas possíveis implicações na etiopatogenia da doença.

32 2 OBJETIVOS

33 2 Objetivos 19 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Avaliar a expressão de proteínas relacionadas à manutenção da barreira cutânea como a filagrina, e as claudinas -1 e -4 na pele com lesão e sem lesão de pacientes adultos com dermatite atópica e na pele sã de controles não atópicos. 2.2 Objetivos específicos Os seguintes objetivos específicos foram estabelecidos: 1. Avaliar a relação entre a expressão das proteínas filagrina, claudinas-1 e -4 com a gravidade da doença (índice de gravidade EASI = eczema area and severity index); 2. Avaliar a relação entre a expressão das proteínas filagrina, claudinas-1 e -4 com a espessura da epiderme da DA; 3. Avaliar a relação entre a expressão das proteínas filagrina, claudinas-1 e -4 e níveis séricos de IgE; 4. Avaliar a relação entre a expressão das proteínas filagrina, claudinas-1 e -4 e eosinofilia; 5. Avaliar a expressão das proteínas filagrina, claudinas-1 e -4 na pele com lesão versus pele sem lesão dos indivíduos com DA.

34 3 CASUÍSTICA E MÉTODOS

35 3 Casuística e Métodos 21 3 CASUÍSTICA E MÉTODOS 3.1 Casuística Foram selecionados 32 doentes adultos, 22 do sexo masculino e 10 do sexo feminino, do Ambulatório de Dermatite Atópica da Clínica de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP). O diagnóstico de DA foi realizado através dos critérios maiores e menores de Hanifin e Rajka, 11, e avaliados clinicamente quanto à gravidade segundo o EASI (Índice de gravidade e área de eczema)(102). Também foram incluídos 23 controles acima de 18 anos, 13 do sexo masculino e 10 do sexo feminino sem diagnóstico de dermatite atópica ou outro quadro de atopia (Figura 7). Figura 7 - Dados demográficos dos indivíduos incluídos no estudo. SL=se lesão; M=masculino; F=feminino; EASI=eczema area and severity index.

36 3 Casuística e Métodos 22 Os sujeitos da pesquisa foram incluídos no estudo, após lerem e concordarem com o termo de consentimento e livre esclarecido (Anexo A) Critérios de exclusão Para o grupo de DA, foram excluídos os indivíduos com idade menor que 18 anos, gestantes, e aqueles que não preenchiam os critérios diagnósticos de Hanifin & Rajka.

37 3 Casuística e Métodos Métodos Os pacientes com DA foram submetidos à biópsia de pele em área com lesão, com punch de 4 mm em cada indivíduo, sob anestesia local com lidocaína 1%, e, posteriormente, suturadas com fio mononylon 5-0. Quando o paciente apresentava área clinicamente sem lesão, foram realizadas 2 biopsias, uma em área com lesão e a outra em área aparentemente sã, aleatória, na mesma região, a, pelo menos, 5 cm da lesão clínica mais próxima. As amostras coletadas foram emblocadas em parafina e, posteriormente, analisadas por imuno-histoquímica para determinar a expressão de filagrina e claudinas 1 e 4 em cada grupo. Foi feito o controle positivo e negativo para testar cada um dos marcadores imunohistoquímicos. (Figura 8) Imuno-histoquímica Cortes histológicos de quatro µm de espessura foram obtidos a partir de material embebido em parafina e colhidos em lâminas previamente preparadas com solução adesiva de 3 amino-propyltriethoxy-silane (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO/USA, cód. A3648) a 2%. A seguir, os cortes histológicos foram desparafinizados em três banhos de xilol à temperatura ambiente durante 20 minutos cada e, posteriormente, hidratados em sequência decrescente de etanol (absoluto, 95% e 70%) e água corrente durante cinco minutos cada.

38 3 Casuística e Métodos 24 Figura 8 - Imuno-histoquímica de fragmentos de pele normal obtidos de biópsias: controles positivos para filagrina (A), claudina-1 (B), claudina-4 (C), coradas em marrom, e controle negativo para filagrina (D). Aumento de 100X.

39 3 Casuística e Métodos 25 Realizado bloqueio de peroxidase endógena em câmara escura com seis incubações em água oxigenada 3% por 10 minutos cada, e, em seguida, as lâminas foram lavadas em água corrente e água destilada por cinco minutos cada e submersas em solução salina tamponada (PBS) ph 7.4. Posteriormente, as lâminas foram submetidas a tratamento para exposição dos sítios antigênicos em calor úmido (panela a vapor) no tampão TRIS/EDTA 10mM/1mM ph 9.0, durante 25 minutos após o aquecimento do tampão a 95 C. As lâminas foram lavadas em água corrente e água destilada por cinco minutos cada, e submersas em PBS ph 7.4. Após esta etapa, foi feito o bloqueio de proteínas inespecíficas do tecido com incubação em solução de leite desnatado (Molico, Nestlé ) a 10% durante 30 minutos à temperatura ambiente. As reações foram visualizadas por meio do cromógeno diaminobenzidina (3,3-diaminobenzidine, SIGMA Chemical Co., St. Louis, MO/USA, código D5637) 0,03% acrescida de 1,2 ml de água oxigenada 3%. A intensidade da cor foi controlada ao microscópio óptico por meio dos controles positivos que acompanham as reações. Os controles positivos aos antígenos estudados foram: pele normal para células com expressão de claudinas 1 e 4, e filagrina. Os controles negativos das reações foram obtidos por meio da omissão do anticorpo primário, que foram substituídos por PBS. Após feito o controle de cor, as lâminas foram lavadas em água corrente por cinco minutos, contracoradas com Hematoxilina de Harris por 10 segundos e, a seguir, foram lavadas em água corrente, e secadas à temperatura ambiente. A montagem das lâminas foi feita com resina Permount (FISHER Scientific, Fair Lawn, NJ/USA, cód. SP15-100).

40 3 Casuística e Métodos Técnica de imuno-histoquímica para a demonstração de claudinas 1 e 4, e filagrina As lâminas foram incubadas com os anticorpos primários policlonal anticlaudina 1 (Zymed - Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA, cód ) diluído a 1:400, policlonal anti-claudina 4 (NeoMarkers, Fremont, CA, USA, cód. RB-9266-PO) diluído a 1:200, e monoclonal antifilagrina (Novocastra, Newcastle, UK, cód. NCL-Filaggrin) diluído a 1:150 em BSA fração V (SERVA. 1930) 1% acrescida de azida sódica 0,1% em PBS, ph 7, Análise das lâminas Depois de coradas, as lâminas foram digitalizadas pelo Panoramic Scan - 3DHistech Hungria. Os cortes foram fotografados em 3 campos de 760 x 1192 μm cada, com aumento de 100X e as imagens salvas no formato JPEG. As imagens obtidas foram analisadas pelo software Image Pro Plus 4,5. Para a análise, demarcou-se uma área de epiderme a ser avaliada, com posterior mensuração da densidade do pigmento usado para corar as proteínas do estudo presentes nesta área. A seguir, calculou-se o valor da área demarcada, e, a partir destes dados, foi calculada a porcentagem de marcador em relação à área previamente demarcada. Para se determinar a espessura da epiderme, foi traçada uma linha no limite superior da camada granulosa, e outra no limite entre a camada basal e a derme. A espessura (em micrômetros) foi obtida pela média das distâncias entre linhas traçadas no limite superior da camada granulosa e o limite entre a camada basal e derme.

41 3 Casuística e Métodos Análise estatística Foram utilizados o teste não paramétrico de Mann Whitney e o teste não paramétrico de correlação Spearman. A diferença entre os grupos foi considerada com significância estatística quando p 0,05. Foi utilizado o programa Prisma Graphics para análise dos dados.

42 4 RESULTADOS

43 IgE (UI/mL) EOSINOFILIA (%) EASI ESPESSURA ( m) 4 Resultados 29 4 RESULTADOS Os valores obtidos nas análises das lâminas podem ser encontrados no Anexo B. Os resultados gerais das análises dos dados estão resumidos na Tabela Análise da expressão de filagrina na DA Expressão da filagrina na pele com lesão de DA e sua relação com: a gravidade da doença (EASI), a espessura da epiderme, a eosinofilia e IgE sérica Quando comparamos a expressão da filagrina na pele com lesão de DA com gravidade (EASI), espessura da epiderme, níveis de IgE sérica e eosinofilia, encontramos correlação inversa entre a expressão de filagrina e o EASI (p=0,0078 e r=-0,4618), bem como com a espessura da epiderme (p=0,0138 e r=-0,4311). Não houve diferença significativa entre a expressão de filagrina com a eosinofilia ou níveis séricos de IgE (Figura 9) A 80 p=0,0078 r= -0, p= 0,0138 r= -0, B FLG C p=0,8154 r=-0, FLG D p=0,8923 r=-0, FLG FLG Figura 9 - Expressão da filagrina (FLG) na pele com lesão de doentes de dermatite atópica e sua relação com: índice de gravidade EASI (p=0,0078) (A); espessura epidérmica (μm) (p=0,0138)(b); IgE sérica (UI/ml) (p=0,8154) (C) e eosinofilia (%) (p=0,8923) (D).

44 4 Resultados Expressão da filagrina na epiderme do grupo controle, e na pele de doentes de DA (pele com lesão X sem lesão) A Figura 10 mostra a expressão da filagrina na pele dos controles sadios e dos doentes de DA (pele com lesão e sem lesão). Houve diferença significativa da expressão da filagrina cutânea entre os controles (p<0,001) e os doentes de DA (p=0,0198), mas não houve diferença entre os grupos de DA (pele com lesão X sem lesão). Figura 10 - Imuno-histoquímica com marcação para filagrina (FLG) em pele de controles sadios (A), doentes de dermatite atópica com lesão (B), dermatite atópica sem lesão (C), aumento de 100x. Expressão da FLG na pele dos controles sadios (CO), em comparação com: (D) pele de dermatite atópica com lesão (L) (p<0,001); (E): pele de dermatite atópica sem lesão (SL) (p=0,0198); (F): dermatite atópica com lesão (L) e sem lesão (SL) (p=0,1791).

45 IgE (UI/mL) EOSINOFILIA (%) EASI ESPESSURA ( m) 4 Resultados Análise da expressão de claudina -1 na DA Expressão da claudina -1 na pele com lesão de DA e sua relação com: a gravidade da doença, a espessura da epiderme, a eosinofilia e níveis séricos de IgE. A avaliação da expressão da claudina -1 (CLDN-1) na pele com lesão de DA e sua relação com parâmetros como EASI, espessura epidérmica, IgE sérica e eosinofilia não mostrou significância para nenhuma das análises realizadas (Figura 11). A B 80 p=0,4121 r=-0, p=0,7972 r=0, CLDN 1 C CLDN 1 D p=0,0840 r=-0, p=0,9609 r=0, CLDN CLDN 1 Figura 11 - Expressão da claudina -1 (CLDN 1) na pele com lesão de doentes de dermatite atópica e sua relação com: índice de gravidade EASI (p=0,4121) (A); espessura epidérmica (μm) (p=0,7972) (B); IgE sérica (UI/ml) (p=0,0840) (C) e eosinofilia (%) (p=9609) (D).

46 4 Resultados Expressão da claudina-1 na epiderme do grupo controle, e na pele de doentes de DA (pele com lesão X sem lesão) A Figura 12 mostra a expressão da claudina-1 na pele dos controles sadios e nos doentes de DA (pele com lesão e sem lesão). Houve diferença significativa da expressão da claudina-1 entre os controles (p<0,001) e os doentes de DA com pele com lesão e sem lesão (p=0,009), mas não houve diferença entre os grupos de DA de pele com lesão e sem lesão. Figura 12 - Imuno-histoquímica com marcação para claudina -1 em pele de controles sadios (A), doentes de dermatite atópica com lesão (B), dermatite atópica sem lesão (C), aumento de 100x. Expressão da claudina -1 (CLDN 1) na pele dos controles sadios (CO), em comparação com: (D) pele de dermatite atópica com lesão (L) (p<0,001); (E): pele de dermatite atópica sem lesão(sl) (p=0,009); (F): dermatite atópica com lesão (L) e sem lesão (SL) (p=0,7677).

47 IgE (UI/mL) EOSINOFILIA (%) EASI ESPESSURA ( m) 4 Resultados Análise da expressão de claudina -4 na DA Expressão da claudina-4 na pele com lesão de DA e sua relação com: a gravidade da doença, a espessura da epiderme, a eosinofilia e a dosagem de IgE A avaliação da expressão da claudina -4 (CLDN-4) na pele com lesão da DA e sua relação com parâmetros como EASI, espessura epidérmica, IgE sérica e eosinofilia não mostrou significância para nenhuma das análises realizadas (Figura 13) A p=0,4506 r=-0,1382 B 200 p=0,3724 r=-0, CLDN 4 C CLDN 4 D p=0,2648 r=0, p=0,2648 r=0, CLDN CLDN 4 Figura 13 - Expressão da claudina -4 (CLDN-4) na pele com lesão de doentes de dermatite atópica e sua relação com: índice de gravidade EASI (p=4506) (A); espessura epidérmica (μm) (p=0,3724) (B); IgE sérica (UI/ml) (p=0,2648) (C) e eosinofilia (%) (p=0,2648) (D).

48 4 Resultados Expressão da claudina-4 na epiderme do grupo controle, e na pele de doentes de DA (pele com lesão X sem lesão) A Figura 14 mostra a expressão da claudina-4 na pele dos controles sadios e nos doentes de DA (pele com lesão e sem lesão). Houve diferença significativa da expressão da claudina-1 entre os controles (p<0,001) e os doentes de DA (p<0,001), mas não houve diferença entre os grupos de DA (pele com lesão X sem lesão). Figura 14 - Imuno-histoquímica com marcação para claudina -4 em pele de controles sadios (A), doentes de dermatite atópica com lesão (B), dermatite atópica sem lesão (C), aumento de 100x. Expressão da claudina -4 (CLDN 4) na pele dos controles sadios (CO), em comparação com: (D) pele de dermatite atópica com lesão (L) (p<0,001); (E): pele de dermatite atópica sem lesão(sl) (p<0,001); (F): dermatite atópica com lesão (L) e sem lesão (SL) (p=0,0568).

49 ESPESSURA ( m) ESPESSURA ( m) ESPESSURA ( m) 4 Resultados Análises da espessura da epiderme na DA Avaliação da espessura epidérmica (μm) e sua relação com a gravidade da DA, IgE sérica e eosinofilia A avaliação da espessura epidérmica média (μm) e sua relação com a gravidade da DA, IgE sérica e eosinofilia não mostrou significância para nenhuma das análises realizadas (Figura 15). 200 p=0,1275 r=0, A B C p=0,1228 r=0, p=0,2914 r=0, EASI IgE (UI/ml) EOSINOFILIA (%) Figura 15 - Análise da espessura epidérmica (μm) na pele de doentes de dermatite atópica e sua relação com o índice de gravidade EASI (p=01275) (A), IgE sérica (UI/ml) (p=0,1228) (B), e eosinofillia (%) (p=0,2914) (C) Análise da espessura da epiderme e expressão das proteínas de barreira filagrina, claudina -1 e claudina -4 nas amostras de pele atópica sem lesão A Figura 16 mostra a análise da espessura da epiderme e sua relação com as proteínas filagrina, claudina -1 e claudina -4 nas amostras de pele de doentes de DA sem lesão aparente. Não houve correlação entre espessura epidérmica e alteração da expressão destas proteínas de barreira.

50 ESPESSURA ( m) ESPESSURA ( m) ESPESSURA ( m) 4 Resultados 36 A B C p=0,3487 r=-0, p=0,1912 r=0, p=0,7330 r=-0, FLG SL CLDN 1 SL CLDN 4 SL Figura 16 - Análise da espessura epidérmica (μm) e medidas de filagrina (FLG) (p=0,3487) (A), claudina -1 (CLDN 1) (p=0,1912) (B) e claudina -4 (CLDN 4) (p=0,7330) (C) na pele sem lesão (SL) de indivíduos com dermatite atópica. FILAGRINA CLAUDINA-1 CLAUDINA-4 CO/DA LESÃO CO/DA SEM LESÃO DA LESÃO/ SEM NÃO NÃO NÃO LESÃO EASI CORRELAÇÃO NÃO NÃO INVERSA ESPESSURA/DA CORRELAÇÃO NÃO NÃO LESÃO INVERSA ESPESSURA/DA SEM NÃO NÃO NÃO LESÃO IGE NÃO NÃO NÃO EOSINOFILIA NÃO NÃO NÃO Tabela 1 - Resumo esquemático dos resultados obtidos referentes à expressão das proteínas de barreira (filagrina, claudinas-1 e -4). CO=controle; DA=dermatite atópica, EASI=eczema area and severity index.

51 5 DISCUSSÃO

52 5 Discussão 38 5 DISCUSSÃO A etiopatogenia multifatorial da dermatite atópica representa, ainda, um dos maiores desafios a serem desvendados. Distúrbios da barreira cutânea podem facilitar a penetração de micro-organismos através da pele, bem como ocasionar perda do balanço hídrico e agir como promotor da inflamação. Na DA, ocorrem diversas alterações epidérmicas relacionadas à barreira cutânea como: elevação do ph, alteração em quantidade e qualidade dos lipídeos cutâneos, maior ação de proteases, descamação irregular dos corneócitos e redução de proteínas como a filagrina, além do rompimento de sua estrutura mecânica por meio do ato de coçar. 26 Mutações do gene da filagrina relacionam-se ao maior risco de asma, início precoce da doença e dificuldade de controle da DA.(16, 42, 60) Entretanto, além da filagrina, recentes achados na redução da expressão de outras proteínas que compõem a barreira cutânea, como a claudina-1, foram descritos em indivíduos com DA por De Benedetto et al. em (36) O presente estudo demonstrou redução da expressão da filagrina na pele de doentes de DA em relação aos controles, tanto na pele com lesão quanto na pele sem lesão. 65 Ainda, demonstrou-se correlação inversa entre a gravidade da doença e a expressão cutânea de filagrina, corroborando os dados encontrados na literatura. 15,58 Um dado de interesse seria o encontro de espessura epidérmica aumentada na pele de pacientes com DA, relacionado à cronicidade da doença.(103) Em nossas amostras, quando avaliamos a espessura da epiderme e a expressão da filagrina, também encontramos correlação inversa entre os dados, sugerindo que a expressão da filagrina estaria relacionada à cronicidade das lesões.

53 5 Discussão 39 Com relação a outras proteínas relacionadas à função de barreira cutânea, destacamos as proteínas das tight junctions, importantes na manutenção da permeabilidade intercelular, especialmente para moléculas grandes. 79 A expressão destas proteínas, inclusive claudinas -1 e -4, alterase rapidamente quando ocorrem lesões da epiderme,(34) mostrando a variabilidade de sua expressão e sua importância na formação da barreira cutânea. Ativação do toll-like receptor (TLR) leva ao aumento da expressão das claudinas -1 e -4. (67) Kirschner et al., em 2009(104) mostra a redução da claudina -4 e o aumento da claudina -1 em placas de psoríase. Na dermatite atópica, ocorre redução da expressão da claudina -1, 36 mas há pouca ou nenhuma informação sobre a expressão da claudina -4 na DA. 36 Quanto à avaliação da expressão das proteínas das tight junctions na DA, especialmente das claudinas -1 e -4, demonstrou-se redução de ambas na pele dos doentes de DA analisados neste estudo. (Figura 17) Entretanto, ao analisarmos as proteínas da TJ em relação à gravidade da doença, e à espessura da epiderme, não encontramos correlação, como as encontradas com a filagrina. Nossos resultados sugerem que as claudinas, por serem proteínas de expressão ativa que respondem a estímulos diferentes, como presença do S. aureus,(105) histamina(106) e uso de corticosteróides, (81) devem ter sua expressão modificada por diversos fatores locais em conjunto, não avaliados neste estudo. Futuros estudos envolvendo a análise de mutações genéticas das proteínas da barreira cutânea em doentes de dermatite atópica, pertinentes à população brasileira, deverão ser conduzidos. Ainda, a relação entre barreira cutânea alterada e a inflamação existente na DA, por meio da dosagem dos níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias e inflamatórias, tais como interleucinas 17 e 22, deverá ser investigada.

54 6 CONCLUSÃO

55 6 Conclusão 41 6 CONCLUSÃO Nossos resultados mostram que: 1) Na pele com e sem lesão do adulto com dermatite atópica, existe redução da expressão das proteínas relacionadas à barreira cutânea, como a filagrina e as claudinas -1 e 4; 2) A expressão da filagrina na pele com lesão do paciente com dermatite atópica correlacionou-se de forma inversa com a gravidade da doença, utilizando-se o escore EASI, e com a espessura da epiderme, sugerindo cronicidade das lesões. Não houve diferença significativa entre a expressão de filagrina com a eosinofilia ou níveis séricos de IgE; 3) Houve redução da expressão das proteínas das tight junctions na DA, especialmente das claudinas -1 e -4, sem relação com a gravidade da doença, espessura da epiderme, eosinofilia ou níveis séricos de IgE.

56 7 ANEXOS

57 7 Anexos 43 7 ANEXO 7.1 Anexo A Termo de Consentimento Livre e Esclarecido HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL 1. NOME: DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº SEXO: M F DATA NASCIMENTO:.../.../... ENDEREÇO: Nº: APTO: BAIRRO: CIDADE: CEP: TELEFONE: DDD ( ) 2.RESPONSÁVEL LEGAL: NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.): DOCUMENTO DE IDENTIDADE: SEXO: M F DATA NASCIMENTO:.../.../... ENDEREÇO: Nº: APTO: BAIRRO: CIDADE: CEP: TELEFONE:DDD ( )

58 7 Anexos 44 ESTUDO COMPARATIVO DA EXPRESSÃO DE FILAGRINA E CLAUDINAS 1 E 4 EM INDIVÍDUOS ADULTOS COM DERMATITE ATÓPICA DADOS SOBRE A PESQUISA 1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: ESTUDO COMPARATIVO DA EXPRESSÃO DE FILAGRINA E CLAUDINAS 1 E 4 EM INDIVÍDUOS ADULTOS COM DERMATITE ATÓPICA 2. PESQUISADOR: Valéria Aoki CARGO/FUNÇÃO: Médica INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº: UNIDADE DO HCFMUSP: Departamento de Dermatologia 3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA: RISCO MÍNIMO (X) RISCO MÉDIO ( ) RISCO BAIXO ( ) RISCO MAIOR ( ) 4.DURAÇÃO DA PESQUISA: 2 anos. HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP Objetivos da pesquisa: O estudo tem como objetivo estudar e entender melhor os diferentes padrões das lesões da dermatite atópica. A dermatite atópica ou eczema é uma doença crônica que geralmente começa na infância, que causa coceiras e feridas na pele. Geralmente está associada com asma e rinite alérgica. Tem fases de melhora e piora. Pode piorar no inverno, onde há um maior ressecamento da pele, o que é agravado pelos banhos quentes. A maioria dos pacientes melhora com a idade, mas uma minoria continua a ter a dermatite durante a vida adulta. A doença apresenta vários padrões de lesões, e geralmente cada indivíduo apresenta um tipo de lesão com maior frequência que os outros. Assim, vamos estudar os portadores de dermatite atópica que apresentes lesões diferentes, para tentar melhor esclarecer o porquê destas diferenças numa mesma doença.

59 7 Anexos 45 Procedimentos a serem realizados: O paciente selecionado para participar do estudo deverá concordar com a sua participação. Durante a consulta de rotina do ambulatório, após ter consentido em fazer parte do estudo, serão feitas algumas perguntas, como: se tem outros casos de eczema, rinite ou asma na família, quando começaram as primeiras feridas na pele, qual a frequência das feridas, quais os medicamentos que já foram utilizados. Será ainda feito um exame geral para verificar quais as partes do corpo estão mais comprometidas. Serão ainda pedidos aos pacientes do estudo, a realização de biopsias de pele, a partir das quais será realizado o estudo. Os procedimentos serão feitos no próprio hospital das clínicas sem nenhum custo para o paciente, que pode aproveitar o dia das consultas para realizar as biopsias. Os pacientes continuarão a ser acompanhados como sempre no ambulatório de dermatite atópica. Se houver a necessidade de mais algum exame, o paciente que concordar com o estudo poderá ser ainda convocado via telefone ou carta para vir a uma consulta, mesmo antes do seu retorno e terá todos os esclarecimentos e assistência que precisar. Todos os pacientes terão acesso aos resultados de seus exames no momento em que quiserem e com as explicações necessárias para seu entendimento. O paciente pode em qualquer momento não concordar em fazer os exames que serão pedidos. Possíveis desconfortos e riscos esperados: Será realizado biopsia na pele sob anestesia local. Durante o procedimento o paciente poderá sentir dor mínima no momento da aplicação da anestesia, parecida com uma picada de formiga. Algumas pessoas podem às vezes sentir tonturas ou até desmaio durante o procedimento e, mais raramente pode haver infecção no local em que foi realizado a biopsia. Benefícios que poderão ser obtidos: O paciente que participar do estudo poderá beneficiar-se ou não do estudo. Pode ser que sejam obtidas respostas para algumas dúvidas que existem sobre o eczema atópico ou simplesmente descobrirmos algum dado novo que possa contribuir com futuras pesquisas sobre este assunto. Procedimentos alternativos: O paciente não é obrigado a realizar estes procedimentos específicos se não quizer, o que não implica que sofrerá alguma penalidade. Mesmo o paciente que não concordar em participar do

60 7 Anexos 46 estudo, terá todos os benefícios de atendimento e de informações sobre novas descobertas com relação à doença, do que qualquer outro paciente que participar do estudo. Garantia de acesso: em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas. O principal investigador é a Dra. Valéria Aoki e o pesquisador executante a Dra. Mariana Colombini Zaniboni, que podem ser encontradas no endereço Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 155, 5 o. Andar, PAMB- Dermatologia CEP: , Telefone(s) (11) Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) Rua Ovídio Pires de Campos, 225 5º andar tel: ramais 16, 17, 18 ou 20, FAX: ramal 26, cappesq@hcnet.usp.br. Confidencialidade e liberação dos registros médicos: Apenas os médicos envolvidos no estudo terão, além do próprio paciente, acesso aos resultados das biopsias, bem como à identificação dos mesmos. Em nenhum momento do estudo o paciente será identificado pelo nome e também em nenhuma publicação resultante do estudo em questão. Os dados e materiais obtidos serão utilizados única e exclusivamente para esta pesquisa. Participação: A sua participação neste estudo é totalmente voluntária. Você está ciente que não é obrigado (a) a participar deste estudo e se em algum momento não quiser mais partipar ou fazer os exames, deverá entrar em contato com a equipe do estudo, sem nenhuma penalidade por isto. Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo: ESTUDO COMPARATIVO DA EXPRESSÃO DE FILAGRINA E CLAUDINAS 1 E 4 EM INDIVÍDUOS ADULTOS COM DERMATITE ATÓPICA Eu discuti com a Dra. Mariana Colombini Zaniboni sobre a minha decisão em participar nesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar o meu

61 7 Anexos 47 consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço Assinatura do paciente/representante legal Data / / Assinatura da testemunha Data / / Para casos de pacientes menores de 18 anos, analfabetos, semianalfabetos ou portadores de deficiência auditiva ou visual. (Somente para o responsável do projeto) Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste estudo Assinatura do responsável pelo estudo Data / /

62 7 Anexos Anexo B: Tabelas com os resultados obtidos no estudo A. Tabela de dados das amostras de pele obtidas de controles sem diagnóstico de dermatite atópica. S ID CLDN 1 ESP CLDN 1 CLDN 4 ESP CLDN 4 FLG ESP FLG CO01 CO02 CO03 CO04 CO05 CO06 CO07 CO08 CO09 CO10 CO11 CO12 CO13 CO14 CO15 CO17 CO18 CO19 CO20 CO21 CO22 CO23 CO24 F 47 M 60 M 64 F 23 F 78 M 66 F 48 M 58 M 57 M 23 M 66 M 60 M 44 F 47 F 38 F 52 M 80 M 66 F 33 F 64 M 79 F 80 M 67 12, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,6139 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,5791 2, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,51791 MÉDIA 56, , , , , , ,14786 CO= controle, SL= sem lesão, S= sexo, ID = idade, EOS= eosinofilia, ESP= espessura, CLDN= claudina, FLG=filagrina. CO16- excluído por problema técnico na confecção das lâminas.

63 7 Anexos 49 B. Tabela de dados das amostras de pele obtidas em áreas com lesão de doentes de dermatite atópica S ID EASI IgE EOS CLDN 1 ESP CLDN 1 CLDN 4 ESP CLDN 4 PC2 F ,7 5, , , , , , PC3 F 29 40, ,4 1, , , ,5915 0, ,07713 PC4 M 21 PC5 F 43 PC6 M 28 PC7 M 24 PC8 F 22 PC9 M 37 PC10 M 43 PC11 F 39 PC12 M 22 PC13 M PC14 M 39 35,4 PC15 M 20 PC16 M 19 PC17 M 34 PC18 M PC19 M 20 14,4 PC20 M 29 11,2 PC21 M 21 38,5 PC22 F 42 PC23 M 37 PC24 M 19 PC25 F 61 PC26 M 24 PC27 F 48 PC28 M 48 PC29 F 20 PC30 M 28 PC31 M 19 PC32 F 31 PC33 M 19 FLG ESP FLG 47, ,3 5, , , , , , , ,7 4, , , , , , , ,7 3, , , , , , , ,1 7, , , ,9917 1, , , ,8 4, , , , , , , ,6 5, , , , , , , ,7 5, , , , , , ,6 6, ,1749 2, ,034 0, , , ,7 2, , , , , , ,1 7, , , , , , ,7 3, , , , , , , ,1 11, , , , , , ,9 4,1 5, , , , , , , ,1 11, , , , , , ,2 10, , , ,2407 2, , ,6 9, , , , , , ,2 3, , , , , , ,8 9, , , , , , , ,5 9, , , , , , ,3 6, , , , , , ,9 14, , , , , , , ,8 3, , , , , , , ,5 5, , , ,02 1, , , ,1 11, , , , , , , ,9 15, ,7651 1, , , , , , , , , , , , ,6 6, , , , , , , ,2 3, , , , , , , ,9 13, , , , , , , ,7 9, ,6439 3, , , , MÉDIA 30 31, ,3 7, , , , , , PC= paciente, S= sexo, ID = idade, EOS= eosinofilia, ESP= espessura, CLDN= claudina, FLG=filagrina. PC1- excluído durante o estudo por problemas técnicos com a imuno-histoquímica

64 7 Anexos 50 C. Tabela de dados das amostras de pele obtidas em áreas sem lesão de doentes de dermatite atópica. S ID EASI IgE EOS CLDN 1 ESP CLDN 1 CLDN 4 ESP CLDN 4 FLG ESP FLG PC05 F 43 33, ,7 5, ,7612 0, , , ,96334 PC06 M 28 40, ,7 1, , , , , ,37409 PC10 M 43 18, ,7 6, ,3187 0, , , ,1775 PC11 F 39 31,6 5, , , , ,80842 PC12 M 22 17, ,7 7, , , , , ,78979 PC13 M ,1 5, ,4259 1, , , ,5764 PC15 M 20 24, ,1 12, ,4 2, , , ,6262 PC20 M 29 11, ,2 3, , , ,0124 6, ,37759 PC26 M 24 45, ,5 8, , , , , ,92992 PC28 M 48 47, ,9 9, ,6681 3, , , ,19777 MÉDIA 32 32, ,31 6, , , , , ,9821 PC= paciente, SL= sem lesão, S= sexo, ID = idade, EOS= eosinofilia, ESP= espessura, CLDN= claudina, FLG=filagrina.

65 8 REFERÊNCIAS

66 8 Referências 52 8 REFERÊNCIAS 1. Kapoor R, Menon C, Hoffstad O, Bilker W, Leclerc P, Margolis DJ. The prevalence of atopic triad in children with physician-confirmed atopic dermatitis. J Am Acad Dermatol. 2008;58: Peroni DG, Piacentini GL, Bodini A, Rigotti E, Pigozzi R, Boner AL. Prevalence and risk factors for atopic dermatitis in preschool children. British Journal of Dermatology.2007;158(3): Odhiambo JA, Williams HC, Clayton TO, Robertson CF, Asher MI, Grp IPTS. Global variations in prevalence of eczema symptoms in children from ISAAC Phase Three. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2009;124(6): Schmitz R, Atzpodien K, Schlaud M. Prevalence and risk factors of atopic diseases in German children and adolescents - a nationwide health report. Pediatric Allergy and Immunology. 2012;23(8): Orfali RL, Shimizu MM, Takaoka R, Zaniboni MC, Ishizaki AS, Costa AA, et al. Atopic dermatitis in adults: clinical and epidemiological considerations. Rev Assoc Med Bras. 2013;59(3): Dold S, Wjst M, von Mutius E, Reitmeir P, Stiepel E. Genetic risk for asthma, allergic rhinitis, and atopic dermatitis. Arch Dis Child. 1992;67(8): Flohr C, Yeo L. Atopic dermatitis and the hygiene hypothesis revisited. Curr Probl Dermatol. 2011;41: Park HY, Kim CR, Huh IS, Jung MY, Seo EY, Park JH, et al. Staphylococcus aureus Colonization in Acute and Chronic Skin Lesions of Patients with Atopic Dermatitis. Ann Dermatol. 2013;25(4): Abeck D, Mempel M. Staphylococcus aureus colonization in atopic dermatitis and its therapeutic implications. Br J Dermatol. 1998;139 Suppl 53: Wollenberg A, Wetzel S, Burgdorf WH, Haas J. Viral infections in atopic dermatitis: pathogenic aspects and clinical management. J Allergy Clin Immunol. 2003;112(4): Hanifin JM, Rajka G. DIAGNOSTIC FEATURES OF ATOPIC-DERMATITIS. Acta Dermato-Venereologica. 1980: Ozkaya E. Adult-onset atopic dermatitis. J Am Acad Dermatol. 2005;52(4): Leung DY, Geha RS. Immune mechanisms in atopic dermatitis. Springer Semin Immunopathol. 1981;4(3): Novak N, Bieber T, Leung DY. Immune mechanisms leading to atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol. 2003;112(6 Suppl):S Rodriguez E, Baurecht H, Herberich E, Wagenpfeil S, Brown SJ, Cordell HJ, et al. Meta-analysis of filaggrin polymorphisms in eczema and asthma: robust risk factors in atopic disease. J Allergy Clin Immunol. 2009;123(6): e O'Regan GM, Irvine AD. The role of filaggrin in the atopic diathesis. Clinical and Experimental Allergy. 2010;40(7): Addor FAS, Takaoka R, Rivitti EA, Aoki V. Atopic dermatitis: correlation between non-damaged skin barrier function and disease activity. International Journal of Dermatology. 2012;51(6): Proksch E, Jensen JM, Elias PM. Skin lipids and epidermal differentiation in atopic dermatitis. Clinics in Dermatology. 2003;21(2):

67 8 Referências KR F. Thematic review series: skin lipids. The role of epidermal lipids in cutaneous permeability barrier homeostasis. J Lipid Res. 2007;48(12): Rippke F, Schreiner V, Doering T, Maibach HI. Stratum corneum ph in atopic dermatitis: impact on skin barrier function and colonization with Staphylococcus Aureus. American Journal Of Clinical Dermatology. 2004;5(4): Drake DR, Brogden KA, Dawson DV, Wertz PW. Thematic review series: skin lipids. Antimicrobial lipids at the skin surface. J Lipid Res. 49. United States2008. p Elias PM. The skin barrier as an innate immune element. Seminars in Immunopathology. 2007;29(1): Hachem JP, Crumrine D, Fluhr J, Brown BE, Feingold KR, Elias PM. PH directly regulates epidermal permeability barrier homeostasis, and stratum corneum integrity/cohesion. Journal of Investigative Dermatology. 2003;121(2): Fahy CM, McLean WH, Irvine AD, Fallon PG. Environmental influences on a model of atopic dermatitis. Journal of Investigative Dermatology. 2011;131:S61-S. 25. Elias PM, Feingold KR. Does the tail wag the dog? Role of the barrier in the pathogenesis of inflammatory dermatoses and therapeutic implications. Archives of Dermatology. 2001;137(8): Cork MJ, Robinson D, Vasilopoulos Y, Ferguson A, Moustafa M, Tazi-Ahnini R, et al. Skin barrier damage: Cause or consequence of atopic dermatitis? Journal of Investigative Dermatology. 2005;125(3): Cork MJ, Danby SG, Vasilopoulos Y, Hadgraft J, Lane ME, Moustafa M, et al. Epidermal Barrier Dysfunction in Atopic Dermatitis. Journal of Investigative Dermatology. 2009;129(8): Wolf R, Wolf D. Abnormal epidermal barrier in the pathogenesis of atopic dermatitis. Clinics in Dermatology. 2012;30(3): Nemes Z, Steinert PM. Bricks and mortar of the epidermal barrier. Exp Mol Med. 1999;31(1): Elias PM, Goerke J, Friend DS. MAMMALIAN EPIDERMAL BARRIER LAYER LIPIDS - COMPOSITION AND INFLUENCE ON STRUCTURE. Journal of Investigative Dermatology. 1977;69(6): Elias PM. Epidermal Lipids, Barrier Function, and Desquamation. Journal of Investigative Dermatology. 1983;80:S44-S McGrath JA. Filaggrin and the great epidermal barrier grief. Australas J Dermatol. 2008;49(2):67-73; quiz Brown SJ, McLean WH. One remarkable molecule: filaggrin. J Invest Dermatol. 2012;132(3 Pt 2): Yuki T, Haratake A, Koishikawa H, Morita K, Miyachi Y, Inoue S. Tight junction proteins in keratinocytes: localization and contribution to barrier function. Experimental Dermatology. 2007;16(4): Sugawara T, Iwamoto N, Akashi M, Kojima T, Hisatsune J, Sugai M, et al. Tight junction dysfunction in the stratum granulosum leads to aberrant stratum corneum barrier function in claudin-1-deficient mice. J Dermatol Sci De Benedetto A, Rafaels NM, McGirt LY, Ivanov AI, Georas SN, Cheadle C, et al. Tight junction defects in patients with atopic dermatitis. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2011;127(3):773-U Yamashita T, Akamatsu H, Tomitaka A, Ogawa Y, Sugawara N, Matsunaga K. IP-10 in atopic dermatitis. Allergy. 2003;58(3): De Benedetto A, Slifka MK, Rafaels NM, Kuo IH, Georas SN, Boguniewicz M, et al. Reductions in claudin-1 may enhance susceptibility to herpes simplex virus 1 infections in atopic dermatitis. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2011;128(1):242-U407.

68 8 Referências Si Y, Liu S, Liu X, Jacobs JL, Cheng M, Niu Y, et al. A human claudin-1-derived peptide inhibits hepatitis C virus entry. Hepatology. 2012;56(2): Gao PS. Reductions in claudin-1 may enhance susceptibility to herpes simplex virus 1 infections in atopic dermatitis (vol 128, pg 242, 2011). Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2011;128(4): Kondoh A, Takano K, Kojima T, Ohkuni T, Kamekura R, Ogasawara N, et al. Altered expression of claudin-1, claudin-7, and tricellulin regardless of human papilloma virus infection in human tonsillar squamous cell carcinoma. Acta Otolaryngol. 2011;131(8): Stemmler S, Parwez Q, Petrasch-Parwez E, Epplen JT, Hoffjan S. Two common lossof-function mutations within the filaggrin gene predispose for early onset of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 2007;127(3): Irvine AD, McLean WHI, Leung DYM. MECHANISMS OF DISEASE Filaggrin Mutations Associated with Skin and Allergic Diseases. New England Journal of Medicine. 2011;365(14): Smith FJD, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, Sandilands A, Campbell LE, Zhao YW, et al. Loss-of-function mutations in the gene encoding filaggrin cause ichthyosis vulgaris. Nature Genetics. 2006;38(3): Nomura T, Akiyama M, Sandilands A, Nemoto-Hasebe I, Sakai K, Nagasaki A, et al. Prevalent and rare mutations in the gene encoding filaggrin in Japanese patients with ichthyosis vulgaris and atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 2009;129(5): Elias PM. Stratum corneum defensive functions: An integrated view. Journal of Investigative Dermatology. 2005;125(2): Sandilands A, Sutherland C, Irvine AD, McLean WH. Filaggrin in the frontline: role in skin barrier function and disease. J Cell Sci. 2009;122(Pt 9): Harding CR, Scott IR. Histidine-rich proteins (filaggrins): structural and functional heterogeneity during epidermal differentiation. J Mol Biol. 1983;170(3): Rawlings AV, Harding CR. Moisturization and skin barrier function. Dermatol Ther. 2004;17 Suppl 1: Candi E, Schmidt R, Melino G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005;6(4): Scott IR, Harding CR. Filaggrin breakdown to water binding compounds during development of the rat stratum corneum is controlled by the water activity of the environment. Dev Biol. 1986;115(1): Katagiri C, Sato J, Nomura J, Denda M. Changes in environmental humidity affect the water-holding property of the stratum corneum and its free amino acid content, and the expression of filaggrin in the epidermis of hairless mice. J Dermatol Sci. 2003;31(1): Miajlovic H, Fallon PG, Irvine AD, Foster TJ. Effect of filaggrin breakdown products on growth of and protein expression by Staphylococcus aureus. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2010;126(6):1184-U Osawa R, Akiyama M, Shimizu H. Filaggrin gene defects and the risk of developing allergic disorders. Allergol Int. 2011;60(1): Seguchi T, ChangYi C, Kusuda S, Takahashi M, Aisu K, Tezuka T. Decreased expression of filaggrin in atopic skin. Archives of Dermatological Research. 1996;288(8): Palmer CNA, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, Zhao YW, Liao HH, Lee SP, et al. Common loss-of-function variants of the epidermal barrier protein filaggrin are a major predisposing factor for atopic dermatitis. Nature Genetics. 2006;38(4):441-6.

69 8 Referências Nomura T, Akiyama M, Sandilands A, Nemoto-Hasebe I, Sakai K, Nagasaki A, et al. Specific filaggrin mutations cause ichthyosis vulgaris and are significantly associated with atopic dermatitis in Japan. J Invest Dermatol. 2008;128(6): Nemoto-Hasebe I, Akiyama M, Nomura T, Sandilands A, McLean WH, Shimizu H. Clinical severity correlates with impaired barrier in filaggrin-related eczema. J Invest Dermatol. 2009;129(3): Enomoto H, Hirata K, Otsuka K, Kawai T, Takahashi T, Hirota T, et al. Filaggrin null mutations are associated with atopic dermatitis and elevated levels of IgE in the Japanese population: a family and case-control study. J Hum Genet. 2008;53(7): McLean WHI, Palmer CNA, Henderson J, Kabesch M, Weidinger S, Irvine AD. Filaggrin variants confer susceptibility to asthma. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2008;121(5): Brown SJ, Asai Y, Cordell HJ, Campbell LE, Zhao Y, Liao H, et al. Loss-of-function variants in the filaggrin gene are a significant risk factor for peanut allergy. The Journal of allergy and clinical immunology. 2011;127(3): McAleer MA, Irvine AD. The multifunctional role of filaggrin in allergic skin disease. J Allergy Clin Immunol. 2013;131(2): Gao PS, Rafaels NM, Hand T, Murray T, Boguniewicz M, Hata T, et al. Filaggrin mutations that confer risk of atopic dermatitis confer greater risk for eczema herpeticum. J Allergy Clin Immunol. 2009;124(3):507-13, 13.e Howell MD, Kim BE, Gao P, Grant AV, Boguniewicz M, Debenedetto A, et al. Cytokine modulation of atopic dermatitis filaggrin skin expression. J Allergy Clin Immunol. 2007;120(1): Kezic S, O'Regan GM, Lutter R, Jakasa I, Koster ES, Saunders S, et al. Filaggrin lossof-function mutations are associated with enhanced expression of IL-1 cytokines in the stratum corneum of patients with atopic dermatitis and in a murine model of filaggrin deficiency. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2012;129(4):1031-U Howell MD, Kim BE, Gao P, Grant AV, Boguniewicz M, DeBenedetto A, et al. Cytokine modulation of atopic dermatitis filaggrin skin expression. J Allergy Clin Immunol. 2009;124(3 Suppl 2):R7-R Yuki T, Yoshida H, Akazawa Y, Komiya A, Sugiyama Y, Inoue S. Activation of TLR2 enhances tight junction barrier in epidermal keratinocytes. J Immunol. 2011;187(6): Lee SE, Choi Y, Kim SE, Noh EB, Kim SC. Differential effects of topical corticosteroid and calcineurin inhibitor on the epidermal tight junction. Exp Dermatol. 2013;22(1): Morita K, Miyachi Y, Furuse M. Tight junctions in epidermis: from barrier to keratinization. Eur J Dermatol. 2011;21(1): Turksen K, Troy TC. Barriers built on claudins. J Cell Sci. 2004;117(Pt 12): Niessen CM. Tight junctions/adherens junctions: Basic structure and function. Journal of Investigative Dermatology. 2007;127(11): Yoshida K, Yokouchi M, Nagao K, Ishii K, Amagai M, Kubo A. Functional tight junction barrier localizes in the second layer of the stratum granulosum of human epidermis. J Dermatol Sci. 2013;71(2): Tsukita S, Furuse M. Claudin-based barrier in simple and stratified cellular sheets. Current Opinion in Cell Biology. 2002;14(5): Furuse M, Hata M, Furuse K, Yoshida Y, Haratake A, Sugitani Y, et al. Claudin-based tight junctions are crucial for the mammalian epidermal barrier: a lesson from claudin-1- deficient mice. Journal of Cell Biology. 2002;156(6): Tsukita S, Yamazaki Y, Katsuno T, Tamura A. Tight junction-based epithelial microenvironment and cell proliferation. Oncogene. 2008;27(55):

70 8 Referências Shang X, Lin X, Alvarez E, Manorek G, Howell SB. Tight junction proteins claudin-3 and claudin-4 control tumor growth and metastases. Neoplasia. 2012;14(10): Igawa S, Kishibe M, Murakami M, Honma M, Takahashi H, Iizuka H, et al. Tight junctions in the stratum corneum explain spatial differences in corneodesmosome degradation. Exp Dermatol. 2011;20(1): Yuki T, Hachiya A, Kusaka A, Sriwiriyanont P, Visscher MO, Morita K, et al. Characterization of tight junctions and their disruption by UVB in human epidermis and cultured keratinocytes. J Invest Dermatol. 2011;131(3): Kirschner N, Rosenthal R, Furuse M, Moll I, Fromm M, Brandner JM. Contribution of Tight Junction Proteins to Ion, Macromolecule, and Water Barrier in Keratinocytes. J Invest Dermatol Hadj-Rabia S, Baala L, Vabres P, Hamel-Teillac D, Jacquemin E, Fabre M, et al. Claudin-1 gene mutations in neonatal sclerosing cholangitis associated with lchthyosis: A tight junction disease. Gastroenterology. 2004;127(5): Kirschner N, Rosenthal R, Furuse M, Moll I, Fromm M, Brandner JM. Contribution of tight junction proteins to ion, macromolecule, and water barrier in keratinocytes. J Invest Dermatol. 2013;133(5): Padmanabhan P, Dixit NM. Viral kinetics suggests a reconciliation of the disparate observations of the modulation of claudin-1 expression on cells exposed to hepatitis C virus. PLoS One. 2012;7(4):e András IE, Toborek M. HIV-1-induced alterations of claudin-5 expression at the blood-brain barrier level. Methods Mol Biol. 2011;762: Che P, Tang H, Li Q. The interaction between claudin-1 and dengue viral prm/m protein for its entry. Virology. 2013;446(1-2): Ishida-Yamamoto A, Kishibe M. Involvement of corneodesmosome degradation and lamellar granule transportation in the desquamation process. Med Mol Morphol. 2011;44(1): Ishida-Yamamoto A, Igawa S, Kishibe M. Order and disorder in corneocyte adhesion. J Dermatol. 2011;38(7): Wertz PW. Lipids and barrier function of the skin. Acta Dermato-Venereologica. 2000: Ali SM, Yosipovitch G. Skin ph: from basic science to basic skin care. Acta Derm Venereol. 2013;93(3): Melnik B, Hollmann J, Plewig G. Decreased Stratum-Corneum Ceramides in Atopic Individuals - A Patho-Biochemical Factor in Xerosis. British Journal of Dermatology. 1988;119(4): Janssens M, van Smeden J, Gooris GS, Bras W, Portale G, Caspers PJ, et al. Increase in short-chain ceramides correlates with an altered lipid organization and decreased barrier function in atopic eczema patients. Journal of Lipid Research. 2012;53(12): Novotný J, Hrabálek A, Vávrová K. Synthesis and structure-activity relationships of skin ceramides. Curr Med Chem. 2010;17(21): Choi MJ, Maibach HI. Role of ceramides in barrier function of healthy and diseased skin. Am J Clin Dermatol. 2005;6(4): HC K, A L, N V, J U, W E, G R. Influence of the ph-value on the growth of Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus and Propionibacterium acnes in continuous culture. Zentralbl Hyg Umweltmed. 1992;193(1): Fluhr J, Jain M, Feingold K, Kao J, Elias P. Generation of free fatty acids from epidermal phospholipids regulates stratum corneum acidification and integrity. Journal of Investigative Dermatology. 2001;117(2):416-.

71 8 Referências Elias PM. Epidermal Barrier Function - Intercellular Lamellar Lipid Structures, Origin, Composition and Metabolism. Journal of Controlled Release. 1991;15(3): Elias PM, Schmuth M. Abnormal skin barrier in the etiopathogenesis of atopic dermatitis. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 2009;9(5): Murphy JE, Robert C, Kupper TS. Interleukin-1 and cutaneous inflammation: A crucial link between innate and acquired immunity. Journal of Investigative Dermatology. 2000;114(3): Feingold KR, Schmuth M, Elias PM. The regulation of permeability barrier homeostasis. Journal of Investigative Dermatology. 2007;127(7): Fluhr JW, Elias PM, Man MQ, Hupe M, Selden C, Sundberg JP, et al. Is the Filaggrin- Histidine-Urocanic Acid Pathway Essential for Stratum Corneum Acidification? Journal of Investigative Dermatology. 2010;130(8): Rippke F, Schreiner V, Doering T, Maibach HI. Stratum corneum ph in atopic dermatitis. American Journal of Clinical Dermatology. 2004;5(4): Dahl MV. Staphylococcus aureus and atopic dermatitis. Arch Dermatol. 1983;119(10): Hanifin JM, Thurston M, Omoto M, Cherill R, Tofte SJ, Graeber M. The eczema area and severity index (EASI): assessment of reliability in atopic dermatitis. EASI Evaluator Group. Exp Dermatol. 2001;10(1): Gittler JK, Shemer A, Suárez-Fariñas M, Fuentes-Duculan J, Gulewicz KJ, Wang CQ, et al. Progressive activation of T(H)2/T(H)22 cytokines and selective epidermal proteins characterizes acute and chronic atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol. 2012;130(6): Kirschner N, Poetzl C, von den Driesch P, Wladykowski E, Moll I, Behne MJ, et al. Alteration of tight junction proteins is an early event in psoriasis: putative involvement of proinflammatory cytokines. Am J Pathol. 2009;175(3): Kuo IH, Carpenter-Mendini A, Yoshida T, McGirt LY, Ivanov AI, Barnes KC, et al. Activation of epidermal toll-like receptor 2 enhances tight junction function: implications for atopic dermatitis and skin barrier repair. J Invest Dermatol. 2013;133(4): Gschwandtner M, Mildner M, Mlitz V, Gruber F, Eckhart L, Werfel T, et al. Histamine suppresses epidermal keratinocyte differentiation and impairs skin barrier function in a human skin model. Allergy. 2013;68(1):37-47.

72 9 APÊNDICES

73 9 Apêndice 9 APÊNDICES APÊNDICE A - Artigo: Profile of skin barrier proteins (filaggrin, claudins 1 and 4) and Th1/Th2/Th17 cytokines in adults with atopic dermatitis

74 9 Apêndice

75 9 Apêndice

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