O Genoma dos Suínos Mapas genômicos

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1 O Genoma dos Suínos Simone Eliza Facioni Guimarães 1 Paulo Sávio Lopes 2 Amauri Arias Wenceslau 3 Aldrin Vieira Pires 3 Maria Amélia Menck Soares 3 Fausto Moreira da Silva Carmo 4 A avaliação de animais para características quantitativas de importância econômica tem sido feita usando o valor genético predito com base nas observações fenotípicas do indivíduo e/ou de seus parentes. A partir do início da década de 90 este panorama começou a ser alterado pelo início de grandes projetos de mapeamento genômico em animais domésticos cujo objetivo principal é aplicar técnicas moleculares na identificação e clonagem de genes de características quantitativas (QTLs). De acordo com ARCHIBALD et al. (1994) o mapeamento genético em animais domésticos permite o entendimento do controle genético de características complexas. O mapeamento genético, ou a varredura genômica apresenta várias vantagens na identificação da base molecular de um fenótipo em particular. Com os métodos bioquímicos é necessário predizer os mecanismos envolvidos na geração do fenótipo; enquanto que pela tecnologia genética molecular pode-se varrer o genoma inteiro a procura de regiões cromossômicas cuja variação pode esta correlacionada com o fenótipo em estudo. Mapas genômicos O propósito dos projetos de mapeamento é encontrar marcadores genéticos que cubram o genoma produzindo um mapa em dois níveis: um mapa genético e um mapa físico. O mapa genético mostra as distâncias estimadas entre marcadores a partir da quantidade de recombinações em cruzamentos experimentais. Não é possível saber quais grupos de ligação representam cada cromossomo, isso depende do mapa físico, que permite identificar a localização de grupos de ligação em cromossomos específicos. Em um mapa, os marcadores genômicos só têm valor quando são polimórficos, pois desta forma permitem identificar a posição e acompanhar a herança de genes que possuem efeito fenotípico e que estão ligados àqueles. 1 Pesquisadora visitante. Departamento de Zootecnia/UFV 2 Professor adjunto. Departamento de Zootecnia/UFV 3 Aluno de doutorado em Genética e Melhoramento/UFV 4 Aluno de doutorado em Zootecnia/UFV

2 Mapeamento de QTLs e genes candidatos Por definição, QTLs (quantitative trait loci) são regiões cromossômicas relacionadas com a variação fenotípica das características quantitativas. Como poucos locos economicamente importantes são conhecidos, e os QTLs não têm suas bases moleculares definidas, estes têm sido referidos mais como uma associação estatística do que como entidade biológica, sendo sua herança acompanhada pelos marcadores. Portanto, QTLs podem ser melhor definidos como associações estatísticas entre dados relativos a uma região genômica e a variabilidade fenotípica existente entre populações segregantes (LI, 1998). O mapeamento em animais domésticos envolve duas estratégias básicas: 1) cruzamento entre duas populações divergentes que tenham fixado, ou estejam próximas da fixação para diferentes alelos; 2) utilização de populações comerciais com grandes pedigrees que possuam dados completos de acasalamentos. De acordo com ANDERSSON et al. (1998), o cruzamento entre populações divergentes tem como vantagens: 1) alelos de grande efeito podem estar segregando; 2) maior poder nas análises estatísticas, devido a alta heterozigosidade nos QTLs; 3) o poder das análises estatísticas aumenta, pois a fase de ligação entre marcadores e dentro de QTLs devem ser consistentes entre toda F1; 4) o aumento na heterozigosidade aumenta o número de marcadores e cruzamentos informativos. Como principal desvantagem, um QTL detectado por meio deste delineamento não estará necessariamente controlando a variação genética em populações comerciais, devendo ser testado antes de qualquer introgressão. Apesar desta desvantagem, este tem sido o método de eleição nos projetos de mapeamento nos animais domésticos. Com relação aos marcadores utilizados nos programas de mapeamento genômico tem-se também tradicionalmente duas opções: os microssatélites e os genes candidatos, embora outros possam ser utilizados. Os microssatélites têm sido considerados os principais marcadores em programas de varredura genômica, pois apresentam todas as qualidades requeridas em um bom marcador: são altamente polimórficos, apresentam baixo índice de mutação e sua herança é Mendeliana (ao contrário da herança poligênica dos QTLs). Os genes candidatos por sua vez são genes sequenciados de função biológica conhecida e são diretamente responsáveis pela expressão de determinada característica. Podem ser genes estruturais ou genes regulatórios em uma via bioquímica. ROTHSCHILD e SOLLER (1999) citam que a metodologia de estudo de genes candidatos não tem alto custo e apresenta as seguintes vantagens: alto poder estatístico, ampla aplicabilidade, simplicidade operacional e conveniente aplicação à seleção assistida por marcadores, MAS (Marker Assisted Selection). De acordo com estes autores, quando existem informações a respeito de sítios polimórficos, cria-se a base para a genotipagem de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) por meio de técnicas rápidas e fáceis de implementar para a varredura de grandes populações. De acordo com FAHRENKRUG (2001), o uso desta classe de marcadores SNPs - poderá refinar os mapas genéticos e comparativos, provendo uma fonte de marcadores própria

3 para uso em grande escala e de baixo custo. Concordando com esta afirmativa, MYAKISHEV et al. (2001), desenvolveram um novo método para genotipagem em grande escala de SNPs que envolve apenas uma amplificação por SNP e é feita em um único tubo, não havendo necessidade de manuseio das amostras pós-pcr. De acordo com estes autores as possibilidades são basicamente análise de genes candidatos, varreduras genômicas e diagnósticos médicos. A utilidade destes sistemas já se encontra descrita na literatura. VENTA et al (2001) utilizaram os SNPs na identificação de mais de 70 genes em suínos, cães, cavalos, gatos e gado sendo que mais de 50 foram confirmados por análise de restrição. Um dado que reforça o uso destes sistemas foi a inexistência de falsos positivos. ERNST et al. (2001) citam que pode-se usar os SNPs aliados a técnicas tradicionais na identificação de novos marcadores no genoma suíno. Estes autores têm utilizado pools de DNA na identificação de SNPs obtendo seqüências de alta qualidade. Quando há suspeita de SNPs, as amostras daquele pool são sequenciadas individualmente. Outra técnica que tem sido utilizada na geração de marcadores é o sequenciamento de cdnas expressos. A identificação de sequências expressas pode trazer um volume de informações nunca visto para a detecção dos genes relacionados com a variação dos fenótipos e descoberta de QTLs. A identificação dos ESTs (Expressed sequence tags) tem sido facilitada nos últimos anos pela disseminação das técnicas de extração e manipulação do RNA, além da possibilidade de comparação entre os ESTs gerados na ciência animal com os existentes nos vastos bancos de dados humanos. Isso faz com que o mapeamento comparativo e também a similaridade gênica permitam a identificação de novos genes candidatos. Neste sentido, técnicas como o ddpcr (differencial display PCR) tem permitido a descoberta de novos genes expressos em condições diversas. De acordo com CLUTTER (1999), as possibilidades de estudo das sequências expressas irão aumentar nos próximos anos com o refinamento das tecnologias dos microarrays e a maior oferta dos chips de sequências suínas. Ainda de acordo com este autor, a quantidade de informação obtida dependerá apenas da originalidade e da eficiência do delineamento experimental utilizado na geração das amostras. Projetos de Mapeamento do Genoma Suíno Pode-se dizer que o estudo do genoma suíno tem dois alicerces básicos: primeiro estaria na importância comercial da produção suinícola, visto ser a carne suína a mais consumida no mundo, respondendo por um total de 45% de toda carne comercializada; o segundo seria a possibilidade de desenvolver animais para xenotransplantes de órgãos para humanos. O genoma suíno é composto por 19 pares cromossômicos, com comprimento de cerca de três bilhões de pares de bases de DNA, o que gera, tal como em humanos, um mapa em torno de 3000 cm (centimorgans). De acordo com ROTHSCHILD e PLASTOW (1999), os esforços da comunidade científica internacional têm sido significativos para que o mapeamento genômico das espécies domésticas

4 possa ser utilizado em programas comerciais. O PigMap Project (ARCHIBALD et al., 1994) iniciouse na Europa, financiado pela Comunidade Econômica Européia. Atualmente, o PigMap conta com cerca de 20 laboratórios europeus, além de outros laboratórios na América do Norte, Ásia e Oceania. O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), deu início a dois processos: um desenvolvido no Meat Animal Research Center no Clay Center, Nebraska; o outro é o National Animal Genome Research Program, desenvolvido sob direção do USDA a partir de Este foi desenhado para promover uma estrutura que estimule a colaboração para o mapeamento genético em todas as espécies, incluindo suínos. A partir de então, cientistas de entidades privadas e governamentais criaram o Swine Genome Technical Committee. Além destes, outros projetos têm sido desenvolvidos, e um resumo de cada um deles pode ser verificado no site A associação destes projetos, fez com que o status do mapa genético suíno evoluísse rapidamente, sendo hoje um dos mais completos. Em 1989, 50 genes e marcadores estavam mapeados, atualmente mais de 2000 genes e/ou marcadores já foram localizados, apesar de nem todos terem sido publicados. Identificação de QTLs em populações de suínos geneticamente divergentes Em animais domésticos, o primeiro estudo que identificava QTLs foi publicado na revista Science, em que ANDERSSON et al (1994), relatavam a presença de QTL para deposição de gordura no cromossomo 4 de suínos, estes autores se valeram de cruzamentos divergentes entre linhas comerciais de suínos e o porco selvagem europeu. De modo geral, em suínos os projetos de mapeamento têm se valido da estratégia de cruzamentos entre linhas geneticamente divergentes para produção de populações experimentais. Nos EUA, têm sido utilizadas as raças chinesas, e as equipes européias continuam utilizando o porco selvagem europeu e também as raças chinesas para seus cruzamentos divergentes. No Brasil, em 1998, iniciou-se no Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa a construção de uma população segregante de suínos, utilizando como base genética fêmeas de linhagens comerciais e machos da raça nativa Piau. Estes cruzamentos permitiram a seleção de animais F1, que por acasalamentos inter se produziram a geração F2, onde estão em análise mais de 500 animais. O DNA de todos os animais (parentais, F1 e F2) está sendo extraído e armazenado. Tecidos orgânicos da geração parental foram coletados no momento do abate para análise da expressão de mrnas. Na granja, os animais F2 têm sido avaliados para crescimento, ganho de peso, consumo alimentar individual e conversão alimentar, espessura de toucinho e área de olho de lombo (Tabela 1).

5 Tabela 1 - Média e desvio padrão dos dados obtidos de 70 a 105 dias de idade nos animais F2 Característica Média Desvio padrão Peso aos 77 dias (kg) 20,74 4,15 Ração consumida (kg) 36,78 8,30 Peso aos 105 dias (kg) 33,18 6,89 Ganho de peso (kg) 12,47 4,13 Ganho de peso diário (kg) 0,44 0,14 Espessura de toucinho aos 105 dias (cm)* 1,17 0,26 Área de olho de lombo aos 105 dias (cm 2 )* 9,27 7,35 Dados parciais de 123 animais avaliados; * animais vivos. Em torno dos 65 quilos de peso vivo os animais têm sido abatidos e suas carcaças avaliadas de acordo com os cortes utilizados na indústria. Basicamente, as características mensuradas são: comprimento da carcaça, peso das vísceras, comprimento do intestino delgado, espessura de toucinho, ph inicial (45 minutos), peso de pernil, lombo, carré, copa, costela, paleta, cabeça, papada, barriga, bacon e rim. Mensura-se também a área do olho do lombo e a espessura da gordura subcutânea na altura da 11 º costela e do bacon (Tabela 2). Tabela 2 Média e desvio padrão dos dados coletados ao abate e na avaliação da carcaça e no rendimento dos cortes dos animais F2. Característica Média Desvio Padrão Peso da meia carcaça resfriada (kg) 25,18 1,69 Peso total do pernil (kg) 6,76 0,85 Peso do pernil limpo (kg) 4,82 0,43 Peso total da copa (kg) 2,20 0,35 Peso da copa limpa (kg) 1,62 0,26 Peso total da paleta (kg) 4,44 0,52 Peso da paleta limpa (kg) 2,63 0,31 Peso total do carré (kg) 3,40 0,41 Peso do lombo (kg) 1,12 0,17 Peso total do bacon (kg) 2,50 0,36 Espessura do bacon (mm) 24,87 5,90 Peso da costela (kg) 1,61 0,28 Peso total da papada (kg) 0,74 0,19 Peso total da cabeça (kg) 1,47 0,19 Comprimento do intestino (m) 18,88 1,57 Dados parciais de 123 animais. A qualidade da carne esta sendo avaliada principalmente pela cor (valores L, a e b), perda d água por gotejamento e cozimento, grau de maciez e ph 24 horas (tabela 3). Tabela 3 Média e desvio padrão dos dados obtidos pela análise da qualidade da carne em animais F2. Característica Média Desvio padrão PH 45 minutos pós abate 6,56 0,28 PH 24 horas pós abate 5,66 0,12 Valor L 52,58 2,50 Valor a 1,41 0,75 Valor b 9,74 0,70 Perda de água por gotejamento (%) 2,81 1,90 Perda de água por cozimento (%) 33,28 2,88 Maciez (gr) 5563,55 851,01 dados parciais de 123 animais.

6 O genoma dos animais tem sido estudado por três estratégias básicas: 1) Varredura genômica com microssatélites espalhados aleatoriamente pelos cromossomos suínos, de acordo com aqueles utilizados pelo US Pig Genome Project, que cedeu os primers fluorescentes ao Laboratório de Biotecnologia Animal do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa. 2) Genes candidatos, escolhidos de acordo com a função de suas proteínas expressas. 3) Expressão diferencial de mrnas em diferentes órgãos. Os primers para ddpcr foram também cedidos pelo US Pig Genome Project. Varredura Genômica Num ensaio preliminar feito com os animais parentais e geração F1, foram encontrados novos alelos para diferentes loci de microssatélites (Tabela 4), o que parece mostrar a divergência genética entre as linhagens e raças escolhidas para a geração das famílias segregantes. Pode-se observar que não apenas nos animais da raça nativa foram encontrados novos alelos, mas também nas fêmeas comerciais. Deve ser lembrado que uma nova variante alélica representa não apenas uma troca no locus que se estuda, mas pode estar indicando a presença de um bloco cromossômico até então não identificado, cujo tamanho em cm dependerá do grau de desequilíbrio de ligação em que se encontra a população estudada. TABELA 4 Dados relativos aos alelos dos marcadores microssatélites encontrados nos animais parentais. CROMOSSOMO 05 Microssatélite Alelos encontrados (pb) Alelos ainda não descritos (pb) S , 223, 225, 231, 233, 237, 239, 241, 243, 245 e , 225 e 243 Piau e F1 233, 237, 245 e 253 Comerciais e F1 IGF1 CROMOSSOMO 06 Microssatélite SW122 SW1057 CROMOSSOMO , 199, 201, 203, 205, 207 e 209 Alelos encontrados (pb) 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122 e , 150, 156, 162, 166, 174, 176, 180, 184 e 188 Alelos ainda não descritos (pb) 116 Piau, Comerciais e F1 142, 162, 176 e 180 Piau e F1 Microssatélite Alelos encontrados (pb) Alelos ainda não descritos (pb) S , 158, 160, 162 e e 166 Piau e Comerciais SW , 203, 205, 207, 209 e 211

7 Inicialmente, a varredura genômica será feita utilizando 100 a 110 marcadores espalhados pelo genoma. Numa segunda etapa, será feito o mapeamento fino (fine mapping) em que maior número de marcadores será utilizado, enriquecendo as regiões de QTLs. Genes candidatos Como a diferença fenotípica básica entre as linhagens parentais está na deposição de gordura e no crescimento, selecionou-se alguns genes envolvidos no desenvolvimento destas características para serem inicialmente estudados. Entre estes são citados: leptina (Lep); receptor da leptina (rlep), hormônio de crescimento (GH) e fator de crescimento semelhante a insulina I (IGF-I). Para todos os genes foram construídos primers baseados nas sequências depositadas em bancos de dados, incluindo não apenas os exons, mas também introns e sequências reguladoras upstream. Após as amplificações para os quatro genes citados buscou-se na literatura descrições de RFLPs, que possibilitassem a detecção de polimorfismos por meio de enzimas de restrição nos animais parentais. Entretanto, esta alternativa de análise se mostrou infrutífera e o sequenciamento dos amplificados para busca de SNPs mostrou-se necessária. O sequenciamento foi feito a partir de pools de DNA amplificado, sendo um pool para os machos parentais e três para as fêmeas. O hormônio de crescimento participa de diferentes formas no metabolismo, podendo ter ações tanto anabólicas quanto catabólicas. Sua ação nos tecidos se dá por vias diretas ou indiretas. No tecido adiposo, por exemplo, sua ação é direta, entretanto na maioria dos tecidos, o GH exerce um papel indireto, mediado pelas somatomedinas, principalmente o IGF-I. Apesar de ser um gene muito conservado, não apenas dentro da espécie mas também entre as diferentes espécies de mamíferos, encontrou-se no GH um fragmento, que após amplificação e análise em gel de poliacrilamida apresentou padrão heteromórfico de migração, o que caracteriza um SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism). Este fragmento foi encontrado não apenas entre os machos nativos, mas também em algumas fêmeas comerciais, por esta razão o sequenciamento deste fragmento foi feito individualmente. Verificou-se após a edição da sequência que uma deleção era a razão para o padrão heteromórfico. Além desta deleção, alguns SNPs foram também encontrados. Nos outros três genes, após a edição das seqüências, foram detectados SNPs tanto para os machos quanto para as fêmeas parentais. Tem sido realizada busca de enzimas de restrição que detectem estas trocas o que permitirá o estabelecimento de um teste diagnóstico eficiente para uso em grande escala, para que o valor fenotípico destas substituições seja testado na geração segregante F2. Expressão gênica diferencial em tecido adiposo Após a extração, limpeza e quantificação do RNA total, as análises têm sido feitas por dois protocolos. Quando destinada a ddpcr, o cdna é gerado por primers âncora, e a amplificação

8 ocorre pelo uso dos mesmos âncoras que geraram o cdna, acrescidos de primers arbitrários. Caso o mrna seja utilizado para amplificação de genes específicos, RT-PCR, o cdna é gerado pelo uso de oligo (dt) 12-18, e a amplificação feita por primers gerados a partir da seqüência do gene em questão. Para uso em ambos os protocolos, foram preparados quatro pools de RNA total dos animais parentais, sendo: 1) pool dos machos nativos; 2) 1º pool de fêmeas comerciais sem Pietran (a raça Pietran não entra na composição genética); 3) 2º pool de fêmeas sem Pietran; 4) pool de fêmeas com genética Pietran. Pôde-se verificar que o nível geral de expressão gênica no tecido adiposo é muito baixo. Apesar disto, algumas sequências diferencialmente expressas entre os pools dos animais parentais foram identificadas. Estas sequências têm sido extraídas do gel de poliacrilamida, reamplificadas e sequenciadas. A identificação das sequências diferencialmente expressas tem sido feita por confronto com o banco de dados disponível no GenBank, por meio do programa BLAST. Têm sido encontradas homologias com genes já descritos para humanos e camundongos, mas principalmente as sequências têm mostrado similaridade a ESTs já descritos. Com relação a amplificação de cdnas específicos, tem se buscado a identificação de expressão do receptor da leptina. Existe consenso de que este gene não se expressaria no tecido adiposo, entretanto, alguns autores tem proposto uma ação parácrina para a leptina (SIEGRIST- KAISER et al. 1997) o que implicaria na existência de receptores também no tecido adiposo. Foi possível obter a amplificação do cdna do gene do receptor da leptina em todos os pools de cdna. A possibilidade deste fragmento resultar da amplificação de DNA genômico contaminante pode ser descartada, pois nesta situação o fragmento seria de maior tamanho, 297 pb contra 145 pb. O próximo passo será o sequenciamento deste fragmento amplificado e a comparação com a seqüência depositada no GenBank para confirmação dos achados. A execução de Northern Blots poderia ser outra alternativa, mas a quantidade de RNA extraída a partir de tecido adiposo não tem se mostrado suficiente. Considerações finais Pouco se sabe a respeito da origem das raças suínas nativas brasileiras. Estes animais vinham sendo criados em pequenas propriedades rurais onde pela rusticidade e grande adaptação às condições de manejo precário exigiam poucos cuidados alimentares e sanitários, fornecendo às populações além da carne, a banha de que necessitavam (FRANÇA, 1991). Entretanto, esta tendência foi invertida durante a década de 90. Poucos são os remanescentes destas raças em todo o país. Além do seu fenótipo relativo a deposição de gordura/carne ser o oposto das raças comerciais, as raças nativas apresentam extrema resistência a condições precárias de manejo e doenças. IRGANG (1986) cita que a preservação do potencial genético destas raças poderia ser útil, para eventuais cruzamentos destinados a aumentar a rusticidade de animais derivados exclusivamente de raças importadas.

9 Somando-se a divergência existente entre as raças escolhidas para originar a população de referência, com o imenso conhecimento existente sobre o genoma suíno, fica claro o potencial multiplicador destas pesquisas genômicas. Na formação de populações referência para estudos de mapas de ligação e efeitos de QTLs e genes candidatos, estes animais parecem apresentar um grande potencial que só agora começa a ser explorado, e pelos primeiros resultados que estão sendo obtidos, pode se dizer que muito há ainda para ser investigado. Agradecimentos Os autores agradecem ao Dr. Max F. Rothschild, coordenador do US Pig Genome Project por ceder os primers para as genotipagens dos microssatélites e para as análises de expressão diferencial; Ao Prof. Luiz L. Coutinho (ESALQ/USP) pelo auxílio nos sequenciamentos; Ao CNPq, à CAPES e à FAPEMIG pelo auxílio financeiro. Referências Bibliográficas ANDERSSON, L. HALEY,C.S.; ELLEGREN, H. et al. Genetic mapping of quantitative trait loci for growth and fatness in pigs. Science, 263: , ANDERSSON, L.; ANDERSSON, K. EKLUND.L.A. et al. Mapping of QTLs for growth and fatness in the pig. In: Molecular Dissection of Complex Traits. 1 º Ed. CRC, p ARCHIBALD, A.L., BURT, D.W., WILLIAMS, J.L. Gene mapping in farm animals and birds: na overview. Proceedings of the 5 th World Congress on Genetics Applied to Livestock production, Vol 21: Gene Mapping, pgs 5-12, 6 13 de Agosto de 1994, Guelph, Canada. CLUTTER,A. Developing tools for marker-assisted selection in pigs. Anais do Simpósio Internacional de Genética e Melhoramenbto Animal, pg , de Setembro de 1999, Viçosa-MG ERNST, C., RANEY, N.F, FARBER, C.R. et al. Identification of new gene markers in the pig genome using both traditional methods and modern techniques. Plant & Animal Genome IX Conference, abst. W188, de Janeiro de 2001, San Diego-CA. FAHRENKRUG, S.C. Pig genetic compararive mapping with EST-associated SNPs. Plant & Animal Genome IX Conference, abst. W56_3, de Janeiro de 2001, San Diego-CA. FRANÇA, L.R. Analise morfofuncional da espermatogênesede suínos adultos da Raça Piau. Tese de Mestrado. ICB UFMG. 185pgs IRGANG, R. Suinos de Raças Nativas: o interesse da pesquisa. Suinocultura Industrial. 87: LI, Z. Molecular analysis of epistasis. In: Molecular Dissection of Complex Traits. 1 º Ed. CRC, p

10 MYAKISHEV,M.V., KHRIPIN, Y., HU, S. et al. High throughput SNP genotyping by allele-specific PCR with Universal energy-transfer-labeled primers. Genome Research, 11: , ROTHSCHILD,M.F., PLASTOW, G.S. Advances in pig genomics and industry applications. AgBiotechNet, 1:1-8, ROTHSCHILD,M.F., SOLLER, M. Candidate gene analysis to detect genes controlling traits of economic importance in domestic livestock. Anais do Simpósio Internacional de Genética e Melhoramenbto Animal, pg , de Setembro de 1999, Viçosa-MG SIEGRIST-KAISER, C.A.; PAULI, V. et al. Direct effects of leptin on brown and white adipose tissue. J.Clin.Invest. 100: , VENTA, P.J., BROUILLETTE, J.A., SHUBITOWSKI, D.M. et al. Identification of SNPs in multiple species using gene-specific universal primers and pool and sequence analysis. Plant & Animal Genome IX Conference, abst. W3e_09, de Janeiro de 2001, San Diego-CA.