Engenharia Genética: conceitos básicos, ferramentas e aplicações

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1 Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento ISSN Maio, Engenharia Genética: conceitos básicos, ferramentas e aplicações Plasmídeo Plasmídeo

2 ISSN Maio, 2003 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Cerrados Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento Documentos 86 Engenharia Genética: conceitos básicos, ferramentas e aplicações Maria Cristina Rocha Cordeiro Planaltina, DF 2003

3 Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na: Embrapa Cerrados BR 020, Km 18, Rod. Brasília/Fortaleza Caixa Postal CEP Planaltina - DF Fone: (61) Fax: (61) htpp\ sac@cpac.embrapa.br Comitê de Publicações Presidente: Dimas Vital Siqueira Resck Editor Técnico: Carlos Roberto Spehar Secretária-Executiva: Nilda Maria da Cunha Sette Supervisão editorial: Jaime Arbués Carneiro Revisão de texto: Maria Helena Gonçalves Teixeira Jaime Arbués Carneiro Normalização bibliográfica: Shirley da Luz Soares Tratamento das ilustrações: Leila Sandra Gomes Alencar Capa: Leila Sandra Gomes Alencar Editoração eletrônica: Leila Sandra Gomes Alencar Impressão e acabamento: Divino Batista de Souza Jaime Arbués Carneiro Impresso no Serviço Gráfico da Embrapa Cerrados 1 a edição 1 a impressão (2003): tiragem 100 exemplares Todos os direitos reservados. A reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610). CIP-Brasil. Catalogação-na-publicação. Embrapa Cerrados. C794e Cordeiro, Maria Cristina Rocha. Engenharia genética: conceitos básicos, ferramentas e aplicações / Maria Cristina Rocha Cordeiro. Planaltina, DF : Embrapa Cerrados, p. (Documentos / Embrapa Cerrados, ISSN ; 86) 1. Engenharia genética. I. Título. II. Série CDD 21 Embrapa 2003

4 Autora Maria Cristina Rocha Cordeiro Biomédica, Dra., Embrapa Cerrados,

5 Apresentação A Engenharia Genética tem-se destacado como prática para a geração de novas tecnologias. São inúmeros os exemplos em diversas áreas como a produção de vacinas, a terapia gênica, a transgenia, entre outras. Na agropecuária, a Engenharia Genética também encontra sítio para sua prática, desenvolvendo novos processos. Nessa área cita-se a utilização dessa ferramenta principalmente para melhoria dos processos como o melhoramento genético, manejo de pragas e o controle biológico. Este documento tem como finalidade introduzir estudantes de graduação e outros profissionais nessa área de conhecimento, de maneira a divulgar seu potencial e importância. Roberto Teixeira Alves Chefe-Geral da Embrapa Cerrados

6 Sumário Introdução... 9 Conceito de Engenharia Genética... 9 Estrutura dos Ácidos Nucléicos... 9 Replicação do DNA Expressão da Informação Gênica Histórico Ferramentas Técnicas da Engenharia Genética Extração de Ácidos Nucléicos Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) Eletroforese em gel Análises moleculares Sistemas de Restrição e Metilação Enzimas Modificadoras: polimerases, ligases Clonagem Molecular Técnicas Básicas para caracterização de genes Construção de Biblioteca genômica Construção de biblioteca de cdna... 29

7 Seqüenciamento de DNA Técnicas para estudo de caracterização e expressão de genes Southern blotting Hibridização subtrativa e Differential Display Northern blotting Análises em Microarranjos Aplicações da Engenharia Genética Agricultura Pecuária Referências Bibliográficas Abstract Apêndice 1. Código Genético - códons de aminoácidos para síntese de proteínas Apêndice 2. Algumas enzimas de restrição utilizadas em engenharia genética... 42

8 Engenharia Genética: conceitos básicos, ferramentas e aplicações Maria Cristina Rocha Cordeiro Introdução Conceito de Engenharia Genética A Engenharia Genética constitui um conjunto de técnicas de análises moleculares que permitem estudos de caracterização, expressão e modificações do material genético (DNA e RNA) dos seres vivos. A Engenharia Genética tem sido tema polêmico. A sua prática levanta aspectos relacionados à ética, pois baseia-se em modificação de material genético natural (produção de organismos geneticamente modificados OGMs) ou sua clonagem. A discussão é importante, uma vez que expressa a opinião pública à comunidade científica, suscitando reflexões para a solução de problemas. É necessário, portanto, conhecer o seu significado para saber como, e de que forma, ela pode contribuir como um efetivo benefício à vida. Esta síntese dos principais temas da engenharia genética tem como objetivo divulgar o conhecimento básico sobre suas possíveis contribuições na agropecuária, a estudantes, outros profissionais não familiarizados com a biologia molecular, e um apoio didático a professores. Estrutura dos Ácidos Nucléicos Os ácidos nucléicos são macromoléculas intracelulares de dois tipos: o ácido desoxirribonucléico (DNA) e o ácido ribonucléico (RNA). Apresentam constituição química e função biológica diferentes. O DNA é considerado o mais importante. Constitui o genoma dos seres vivos onde estão contidas todas as informações genéticas fundamentais para sua existência. A partir dele, essas informações se expressam nas células e se perpetuam na progênie. Assim, pode-se dizer que o DNA tem função de armazenar e manter a informação genética (código genético).

9 10 Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações O DNA é constituído por subunidades menores chamadas nucleotídeos, agrupadas em quatro tipos. Cada tipo subdivide-se em moléculas menores que são: bases nitrogenadas do tipo purinas (adenina e guanina) ou pirimidinas (timina e citosina); açúcar do tipo pentose (desoxirribose) e fosfato. As bases associam-se à pentose por uma ligação no carbono 1 da pentose e, o fosfato, associa-se ao carbono 5 da mesma pentose, e ao carbono 3 da pentose do nucleotídeo adjacente. Essa última ligação é chamada de fosfodiéster e constitui a cadeia de nucleotídeos. Este tipo de ligação confere uma polaridade a molécula do DNA que tem função na replicação e transcrição, chamada de sentido 5 3 (Figura 1). O P O O G 5 CH 2 O Ligação Fosfodiéster O H H 3 O P O 5 CH 2 H H O O H H H H H 3 O H O P O O C C CH 2 O H H H H 3 O H O P O O 5 CH 2 O A Figura 1. Esquema da ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos. C citosina; G guanina; A Adenina. Fonte: Modificado de Lehninger, H H H H 3 O H

10 Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações 11 O DNA é constituído por duas cadeias de nucleotídeos. A associação entre elas faz-se por pareamento das bases nitrogenadas. Estas não se pareiam ao acaso, mas a adenina sempre se associa à timina e a citosina à guanina. Isto deve-se a ligações do tipo ponte de hidrogênio (H) (Figura 2). Há duas possibilidades de pontes entre adenina e timina (envolvendo o nitrogênio (N) de uma base e o oxigênio (O) da base complementar) e três entre citosina e guanina (envolvendo dois N com O e um N com N). Essa constituição é universal nos seres vivos. Assim alguns vírus, as bactérias, os fungos, os vegetais e os animais contêm DNA estruturado da mesma maneira. As diferenças estão na seqüência em que os nucleotídeos se associam. Pontes de Hidrogênio H H H C Timina H C O C C Cadeia N N 50 C H O 1,11 nm 0,30 nm H 0,28 nm N C H N C N H C C Adenina N C H N 51 Cadeia Citosina H H Cadeia H C N 52 C N C N C O 0,29 nm H 1,08 nm N H H 0,29 nm H 0,30 nm N C O C N C C N N 54 Guanina C H Cadeia Figura 2. Esquema de ligações por pontes de hidrogênio entre adenina e timina ou citosina e guanina. Fonte: Modificado de Lehninger, 1985.

11 12 Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações As cadeias de nucleotídeos que, cada uma quando se formam, constituem um sentido (5 3 ), quando se associam, o fazem em sentido contrário. Sentido 5 3 com sentido 3 5. Essa associação vai ter função no momento da perpetuação da molécula (replicação) como também na sua função biológica de expressão genética (transcrição e regulação da transcrição). Existem vários tipos de DNA: o genômico, o mitocondrial, o de cloroplastos (células vegetais) e o plasmidial (Tabela 1). O primeiro está presente no núcleo das células eucarióticas ou no citoplasma das células procarióticas (bactérias). Nos seres eucarióticos, pode chegar a cerca de 2 m quando distendidos; porém, encontra-se restrito a um espaço extremamente reduzido: núcleo, com 0,006 mm de diâmetro. Como isto ocorre? O DNA associa-se com proteínas de carácter básico (histonas) constituindo a cromatina. As histonas (que podem ser de vários tipos: H1, H2A, H2B, H3, H4...) associam-se e formam nucleossomas (Figura 3) e, ao redor do qual a dupla cadeia do DNA dá voltas. Em conjunto, essa formação pode ser observada em microscópio eletrônico e é conhecida por colar de pérolas. Este pode se enrolar ainda mais sobre si mesmo, como se fosse um novelo. Assim, a grande molécula de DNA pode assumir tamanhos tão diminutos. Esse processo de espiralização da molécula do DNA ocorre por ação de enzimas como as topoisomerases, helicases entre outras. Tabela 1. Características dos Ácidos Nucléicos. Característica DNA RNA Principal Função Armazenar e perpetuar o Transcrever o código código genético do ser genético Tipos Genômico, plasmidial, Ribossômico, Mensageiro, mitocondrial, de cloroplasto Transportador Número de cadeias 2 1 em geral Tipo de bases nitrogenadas Adenina, Timina, Adenina, Uracila, Guanina, Citosina Guanina, Citosina Tipo de Açúcar Deoxiribose Ribose A outra molécula de ácido nucléico conhecida é a de RNA. Ao contrário do DNA, é constituído por somente uma cadeia de nucleotídeos que se associam por meio dos fosfatos em polaridade (sentido 5 3 ). Porém, no RNA as bases

12 Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações 13 que o constituem são: adenina, uracila, citosina, guanina, ligados por ribose. As principais características comparativas entre DNA e RNA podem ser observadas na Tabela 1. Histona H1 Histonas H2A, H2B, H3, H4 Histona H1 Fita de DNA Histonas H2A, H2B, H3, H4 Histona H1 Histonas H2A, H2B, H3, H4 Figura 3. Desenho esquemático dos nucleossomas. O RNA pode ser observado no núcleo e no citoplasma da célula. Na verdade, a molécula é formada no núcleo (células eucarióticas), mas sua função principal ocorre no citoplasma. São moléculas bem menores do que o DNA e menos estáveis. Existem três tipos de RNA: o ribossômico, o mensageiro e o transportador. O ribossômico pode ser observado no núcleo na região do nucléolo e no citoplasma, pois constitui o ribossoma. O transportador é formado no núcleo e sua função biológica ocorre no citoplasma; o RNA mensageiro é formado no núcleo e desempenha sua função também no citoplasma. Qual é a função dos diferentes tipos de RNA? A síntese de proteínas, que são os compostos finais da expressão de um caráter genético estocado no DNA. São elas que desempenham

13 14 Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações funções nas células: estruturais (queratina, colágeno), enzimas (polimerases, fosfatases, quinases) etc. e como componentes de sistemas como a hemoglobina e os anticorpos. O RNA mensageiro é o carreador da informação genética diretamente do DNA. A partir dele, temos a transcrição do código genético. O RNA ribossomal, constituído por subunidades menor e maior dos ribossomas, são o lócus da síntese de proteínas no citoplasma. Encontram-se livres no citoplasma ou associados ao retículo endoplasmático rugoso. E, finalmente, os RNAs transportadores são RNAs pequenos que têm função de ligar aminoácidos específicos e transportá-los para a região de síntese de proteínas. A transcodificação da mensagem do DNA para proteínas faz-se por meio de um código de trinca ou códon (três nucleotídeos). Cada trinca representa um aminoácido; estes porém, podem reconhecer mais de um códon. Assim, o código genético é dito degenerado. Essa característica é importante em atividades da engenharia genética, como a amplificação de seqüências gênicas a partir de iniciadores degenerados, que tem como base a seqüência de proteínas. No apêndice 1, estão relacionados os códons para os principais aminoácidos. Replicação do DNA A replicação ou duplicação é o processo que permite a perpetuação da molécula do DNA. Na divisão celular (mitose ou meiose). Subdivide-se em etapas que serão enumeradas a seguir (Figura 4): 1. O primeiro passo é a desespiralização da molécula por enzimas como as topoisomerases, helicases e outras; 2. Depois, ocorre a separação das cadeias de nucleotídeos com a ruptura das pontes de hidrogênio. Essa separação faz-se em vários pontos da molécula, formando forquilhas ou aberturas onde se origina a replicação; 3. Quando as cadeias estão separadas cada uma é associada a um pequeno RNA chamado iniciador. Este se liga às seqüências presentes em cada cadeia, sempre no sentido 5 3. A sua presença é fundamental para a posterior associação da enzima DNA polimerase I; 4. Com a associação da enzima, no ponto em que se ligou o iniciador, começa a polimerização das novas cadeias do DNA. A mesma fita onde o RNA iniciador se ligou, serve como molde para a adição, de forma complementar, dos novos nucleotídeos. A polimerização se faz no sentido 5 3. Enquanto uma das cadeias é polimerizada de forma contínua, forma-se a outra também no sentido

14 Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações porém de forma descontínua constituindo pequenas cadeias que se formam para constituir esta última cadeira. Essas cadeias são conhecidas como fragmentos de Okasaki em homenagem ao pesquisador que as observou pela primeira vez. Assim, a replicação do DNA é bidirecional e semiconservativa, pois cada molécula nova contém uma fita da molécula precursora. 3 5 B C Iniciador 5 3 A D Figura 4. Desenho esquemático das principais fases da replicação do DNA. A Desespiralização da cadeia; B Abertura de forquilhas (origem de replicação); C Polimerização de novas fitas e D Duas moléculas recém-formadas. Expressão da Informação Gênica Antes de comentar sobre expressão gênica, é importante conceituar o gene. Gene é uma unidade do DNA que é capaz de constituir ao menos uma cadeia polipeptídica. As exceções são os que transcrevem os RNAs ribossômico (subunidade maior e menor) e os RNAs transportadores. Cada unidade gênica está dividida nas seguintes regiões: promotora, EXON, INTRON, terminadora e reguladoras (Figura 5). A região promotora ou simplesmente promotor é aquela onde se associam proteínas como fatores de transcrição e também a enzima RNA

15 16 Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações polimerase. Essa região é uma seqüência geralmente rica em adenina e timina. A região de EXON é aquela que apresenta a informação para constituir cadeias polipeptídicas; a região de INTRON pode estar associada à regulação da expressão gênica. Na verdade, é incerta sua presença ou função nos genes, mas o fato é que elas existem em alguns casos. Início de transcrição Gene E I E E Promotor Região de término RNA-m recém-transcrito E I E E Regiões de splicing RNA-m processado Adição de Guanina metilada (cap) E E E Adição de cauda de poli-a Síntese de proteína Figura 5. Desenho esquemático indicando a estrutura gênica, formação e modificação pós-transcripcional do RNA-m. A região terminadora é aquela em que se pode observar o códon de término de tradução e transcrição. Esses códigos apresentam um padrão específico bastante conservado nos seres vivos.

16 Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações 17 Finalmente, as regiões reguladoras da expressão podem estar presentes em cis (áreas adjacentes ao gene, na região promotora, nas regiões de INTRON e terminadora) ou ainda, em trans (próximas ao gene desde o ponto de vista tridimensional, porém, afastadas quando observada pela estrutura linear do DNA). Os RNA-m, transcritos do DNA, nos eucariotos (organismos superiores ou com núcleo definido) passam por modificações (pós-transcripcionais) antes de serem traduzidos em proteínas. A primeira é a deleção das seqüências de INTRON. Esse mecanismo é chamado de splicing. A segunda é a adição da cauda de polia em seu extremo 3. Essa cauda não existe nos RNAs-m de procariotos (sem núcleo definido) e tem função de aumentar a estabilidade do RNA-m. No extremo 5, é adicionado um chapéu de guanosina metilada importante no direcionamento do RNA-m no momento da tradução. A expressão gênica é a principal função relacionada com os RNAs mensageiros (RNA-m) e o processo da transcrição. Ela define o perfil das proteínas nas células e sua diferenciação. Por exemplo, somente as células de tecido muscular expressam proteínas associadas ao sarcômero e, à contração muscular, como miosina e desmina, as células do fígado, enzimas responsáveis pela desintoxificação; os linfócitos tipo B, a síntese de anticorpos específicos. Nas células vegetais, ocorre a síntese de proteínas específicas da fotossíntese, da reação a estresses bióticos ou abióticos, da formação de compostos fenólicos específicos etc. A transcrição e a expressão gênica (Figura 5) têm grande importância na engenharia genética. A partir do seu estudo, pode-se isolar e caracterizar genes que são especificamente ativados em células e representam funções mais relevantes como, por exemplo, anticorpos (para produção de vacinas), proteínas de resistência a patógenos e a pragas da agricultura, crescimento celular, entre outros. É considerado dogma da biologia molecular que a informação genética contida no DNA é transcrita em RNA e este traduz uma mensagem que é expressa na forma de proteínas (Figura 6). Porém, hoje, é possível inverter esse mecanismo natural e realizá-lo ao contrário, ou seja, a partir de proteínas ou do RNA, podese obter os genes que os originaram. Esse fato tornou-se possível graças à descoberta da enzima transcriptase reversa em alguns vírus (retrovírus). Esta permite muitas estratégias da engenharia genética que serão vistas a seguir. Além da descoberta da enzima transcriptase reversa, também há a possibilidade de desenhar iniciadores in vitro.

17 18 Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações DNA 1 RNA 4 (transcriptase reversa) 2 3 (amplificação com primers degenerados) Proteína Figura 6. Desenho esquemático de estratégias de trabalho em Engenharia Genética. Histórico Até o século 18, a biologia estudava basicamente a relação dos seres vivos com a natureza. Essa época destacou-se pelas primeiras observações de células vivas. Havia grande questionamento de como estavam organizados morfologicamente os seres vivos. Nessa época, os nomes que se destacaram foram Leenwenhoek e Hooke por seus trabalhos de Microscopia. Além desses autores, Lammarck, com seus trabalhos, começava a questionar-se a respeito da evolução das espécies. No século 19, Charles Darwin consolida a teoria da evolução dizendo que os seres vivos evoluem de acordo com a seleção natural do ambiente onde, os mais adaptados sobrevivem em detrimento dos menos adaptados. Nesse século, apareceram também grandes personalidades como Louis Pasteur e Gregor Mendel. O primeiro, bioquímico, confirmou a presença de seres vivos invisíveis (microrganismos) demonstrando o princípio em que estava baseado os

18 Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações 19 processos de putrefação. Com seus estudos, a comunidade científica abandonou definitivamente a teoria de origem da vida baseada na geração espontânea. Louis Pasteur contribuiu, também, com os processos até hoje utilizados de assepsia, tanto em laboratórios de análises (utilizados hoje na cultura de tecidos e na biologia molecular) quanto em hospitais (salas de cirurgia, unidades de tratamento intensivo). Mendel ficou conhecido como o pai da genética. Realizou ensaios com ervilhas e descreveu que os caracteres morfológicos (cor das pétalas, textura da semente) são herdadas pelos descendentes seguindo leis bem definidas. Assim, elaborou duas leis, que são primordiais na genética até os dias de hoje: a da segregação e a da distribuição independente. Somente no início do século 20 foi caracterizado o material genético no núcleo das células (cromossomas) e em 1944, Avery; Mac Leod & Mac Carty, estudando cepas virulentas e avirulentas de Streptococcus pneumoniae descreveram que havia um princípio transformador que era passado da cepa virulenta para a avirulenta. Mais tarde, Hershey & Chase, em 1952, atribuíram aos ácidos nucléicos (DNA e RNA) esse princípio transformador. Estudos bioquímicos para determinar a constituição dos ácidos nucléicos realizados principalmente por Chargaff e estudos de difração de Raios-X, realizados pelo grupo de Wilkins, foram decisivos para que, em 1953, Watson & Crick deduzissem a estrutura do DNA em α-hélice. Essa década também foi marcada por descobertas importantes como a enzima DNA polimerase I (Kornberg, 1956), os primeiros experimentos de controle da expressão gênica (Jacob & Monod, 195-), e a descrição da replicação semiconservativa e bidirecional do DNA (Meselson & Stahl, 1957; J. Cairns, 195-). Na década de 1960, descreveu-se o RNA mensageiro como carreador da mensagem armazenada no DNA, expressa em proteínas no citoplasma. Na década de 1970, foram descobertas várias enzimas de restrição (endonucleases específicas), implementados avanços tecnológicos no estudo da bioquímica / biologia molecular como processos eletroforéticos de análises, desenvolvidas as técnicas de hibridação em colônias (Southern blotting) e os primeiros ensaios de clonagem. Em 1977, em função desse conhecimento prévio foi elaborada a técnica de seqüenciamento de DNA.

19 Tabela 2. Histórico das Principais Descobertas / Estudos de Bioquímica, Genética e Microscopia que permitiram o desenvolvimento da Engenharia Genética. Ano Pesquisador Pesquisa - Descoberta Leenwenhoek Estudos de Microscopia e observação de células 1665 R. Hooke Estudos de Microscopia observação da cortiça Lammarck Estudos de Evolução Defendeu a tese da herança dos caracteres adquiridos por modificações do ambiente Charles Darwin Teoria da Evolução das Espécies Louis Pasteur Demonstrou a existência de microrganismos Desenvolveu as bases dos processos de assepsia Gregor Mendel Considerado pai da genética Descreveu as teorias da herança de caracteres genéticos 1833 vários Descoberta das primeiras enzimas 1903 W. Sutton Observou e descreveu os cromossomas no núcleo das células 1944 O. Avery; C. Mac Leod; Descreveram o DNA como o princípio transformador que MacLyn; McCarty; carregava caracteres que se expressavam no fenótipo virulento F. Griffiths (Streptococcus pneumoniae) 1952 A.Hershey; M.Chase Descreveram os ácidos nucléicos (DNA e RNA) em vírus como os carregadores de mensagens genéticas 1953 Watson & Crick; E.Chargaff; Dedução da estrutura do DNA em α-hélice Wilkin & Colbs 1956 A. Kornberg Descoberta da enzima DNA polimerase I 195- Jacob & Monod Primeiros experimentos de Controle da Expressão Gênica por proteínas Continua Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações

20 Tabela 2. Continuação. Ano Pesquisador Pesquisa - Descoberta 1957 Meselson & Stahl Demonstraram que a replicação do DNA é semiconservativa 195- J. Cairns Demonstrou que a replicação do DNA é bidirecional originadoem forquilhas Descoberta do RNA mensageiro 1970 vários Descoberta das enzimas de restrição (nucleases específicas) 1973 Cohen & Boyer Desenvolvem o primeiro experimento de DNA recombinante utilizando genes bacterianos 1975 Southern Descreveu a técnica de hibridação em colônias e Southern blotting para detectar seqüências de DNA específicas, possibilitando o isolamento de genes individuais do genoma de organismos A hibridação molecular é utilizada para diagnose pré-natal de doença genética 1977 Sanger Determinação da primeira seqüência de DNA (Bacteriófago φ X174) Produção de insulina humana por engenharia genética em bactérias para tratamento de diabetes (primeiro produto da biotecnologia moderna a ser aprovado pelos órgãos competentes dos Estados Unidos da América) 1985 K.B. Mullins Descrição da técnica PCR 2000 (vários laboratórios no mundo) Seqüenciamento Completo do Genoma Humano Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações 21

21 22 Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações Em 1985 foi descrita pela primeira vez a técnica de reação de polimerase em cadeia também conhecida como PCR. Assim, a biologia molecular e a engenharia genética já demonstravam seu alto potencial na identificação de doenças genéticas, produção de medicamentos (insulina em bactérias), testes de paternidade etc. O início do século 21 é marcado pelo seqüenciamento completo do genoma humano. A perspectiva de trabalho em biologia molecular e engenharia genética é cada vez mais ampla. Talvez o maior questionamento da atualidade, seja objetivar os temas de pesquisa de forma que representem benefícios reais para a humanidade. Ferramentas Técnicas da Engenharia Genética Extração de Ácidos Nucléicos A extração de DNA e RNA são as duas primeiras etapas técnicas aos posteriores estudos. Existem inúmeros procedimentos adotados para sua extração. Nas células animais são diferentes daqueles utilizados nas células vegetais. A principal diferença é a ruptura da parede celular que é uma etapa comum nas células vegetais e não na das células animais. Para a extração do DNA, podem ser citados protocolos que utilizam o detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) ou o brometo de cetil trietil amôneo (CTAB). Esses procedimentos podem ser utilizados em pequena (minipreparações), média ou grande escalas. Os de pequena escala tendem a fornecer uma amostra mais suja (com presença de contaminantes fenólicos, proteínas, açúcares etc.). Em média e grande escala o DNA é purificado em gradientes de cloreto de césio ou em colunas de afinidade e são bastante puros. Porém, pode-se conseguir DNA com razoável pureza e quantidade para alguns experimentos de biologia molecular e engenharia genética em minipreparações. Ainda, os diferentes procedimentos de extração fornecem amostras que variam em peso molecular. Dependendo da finalidade ou do estudo, é necessário obtenção de DNA genômico de alto peso molecular ou um pouco mais fragmentado. A fragmentação do DNA genômico é causada pela ação dos agentes utilizados no processo de extração e, alguns deles, apresenta maior ação lesiva. Essa lesão também pode estar relacionada ao tipo de tecido utilizado. Apesar de determinado grau de fragmentação, o DNA extraído para

22 Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações 23 análises de engenharia genética ainda tem um peso molecular elevado ( KB). Em geral, o DNA genômico obtido nos diversos procedimentos deve ter uma pureza razoável e não deve estar degradado. Basicamente os protocolos de extração do DNA de células vivas apresentam as seguintes etapas: 1. Ruptura da parede celular (células vegetais) e membrana plasmática (todas as células). Nos tecidos vegetais inicia-se por meio de maceração do tecido congelado em gral & pistilo. A ruptura da membrana plasmática, é feita com a utilização de detergentes como o SDS e o CTAB; 2. Extração de proteínas. Com a ruptura da membrana plasmática, saem para o meio extracelular todos os componentes intracelulares como DNA, RNA, proteínas, polissacarídeos e organelas. As organelas e os restos celulares (membranas, debris) são eliminados por meio de centrifugação em velocidades de X g. Como são mais pesadas, tendem a se precipitar enquanto as moléculas de DNA, RNA e proteínas permanecem no sobrenadante. As proteínas são removidas por agentes tais como o fenol, o clorofórmio e o álcool isoamílico. Esses agentes desnaturam as proteínas que tendem, também, a precipitar em soluções aquosas. Em seguida, as amostras são novamente submetidas à centrifugação; 3. Precipitação do DNA em solução aquosa com agentes desidratantes (sais e álcoois). Nessa fase, geralmente, são utilizados álcoois e os mais freqüentes são o isopropanol e o etanol na presença de sal. Os sais realizam um efeito precipitante do tipo salting out parecido com aquele que ocorre com soluções de proteínas. Os principais são: o cloreto de sódio, o acetato de sódio e o cloreto de amôneo; 4. Degradação do RNA residual. O RNA restante nas amostras de DNA genômico pode ser eliminado pela ação de ribonucleases (RNAses) que o degradam. A presença de RNA nas amostras interferem em sua quantificação espectrofotométrica, bem como no processo de amplificação gerando fragmentos amplificados inespecíficos; Na extração de RNA, algumas medidas adicionais devem ser tomadas tendo em vista que essa molécula é mais instável que a do DNA. Essa molécula pode ser facilmente degradada pela ação de RNAses e assim não pode ser utilizada em

23 24 Engenharia Genética: Conceitos Básicos, Ferramentas e Aplicações nenhuma análise. A principal causa da degradação da molécula de RNA é a presença de contaminação com RNAses em vidraria e soluções. Essas enzimas são muito estáveis mesmo quando submetidas a altas temperaturas que são normalmente desnaturantes para outras proteínas. Ainda que se alterem, ao término do aquecimento podem retornar à sua estrutura tridimensional de enzima ativa. Um dos únicos agentes que garante a desnaturação irreversível da RNAse é o dietilpirocarbonato (DEPC). Assim, toda a vidraria e solução usadas nas extrações de RNA devem ser previamente tratadas com este produto. Além disso, durante a manipulação deve-se utilizar luvas, pois, a RNAse pode estar presentes nas mãos do operador. Os procedimentos prévios são análogos aos empregados na extração do DNA. Uma das principais diferenças é que, em geral, o RNA é precipitado com soluções de acetato de lítio ou cloreto de lítio. Esses agentes permitem uma precipitação diferencial de RNA em relação ao DNA, de forma que a amostra resultante, em geral, obtida por centrifugação, será enriquecida em RNA. Porém, se a análise prescinde da eliminação completa de DNA residual, faz-se necessário o tratamento posterior da amostra com desoxiribonuclease (DNAse) livre de RNAse. Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) A reação de polimerase em cadeia (PCR) é uma ferramenta metodológica muito utilizada na biologia molecular e na engenharia genética. Aplica-se em muitos trabalhos tais como: amplificação de seqüências gênicas total ou parcialmente homólogas a uma conhecida, identificação genotípica (fingerprinting), testes de paternidade, análises de dissimilaridade entre genomas, caracterização de germoplasma, mapeamento genético, seleção diferencial de genes expressos em sistemas entre outros. A PCR é uma técnica que imita a duplicação do DNA in vitro. Ela é realizada em três etapas fundamentais: desnaturação da dupla fita do DNA, hibridação de oligonucleotídeos iniciadores e polimerização das novas cadeias de DNA. A primeira é realizada à temperatura de 92 o C a 95 o C para separar completamente a dupla cadeia (quebra das pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas). A segunda é variável de acordo com a seqüência do oligonucleotídeo iniciador (primer) que pode ser específico ou não. Assim, a temperatura de anelamento do primer pode variar de 35 o C a 52 o C ou mais conforme T m (temperatura de melting) que depende da sua seqüência. Finalmente submete-se à temperatura de 72 o C, ótima para o funcionamento da DNA polimerase (Taq polimerase ou Pfu).