ARTIGO. Camila Domingues Mendonça Raphael Teixeira Verbinnen Paulo Roberto Brasil de Oliveira Marques Gilvanda Silva Nunes

Transcrição

1 ARTIGO CONSTRUÇÃO DE BIOSSENSORES AMPEROMÉTRICOS À BASE DA ENZIMA ACETILCOLINESTERASE CONTENDO MACROALGA DE AMBIENTE ESTUARINO PARA A DETECÇÃO DO AGENTE ANTICOLINESTERASE PARATION METÍLICO* CONSTRUCTION OF AMPEROMETRIC BIOSENSORS BASED ON ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE CONTAINING MACROALGAE OF ESTUARY ENVIRONMENT FOR DETECTION OF THE ANTICHOLINESTERASE AGENT METHYL PARATHION CONSTRUCCIÓN DE BIOSENSORES AMPEROMÉTRICOS BASADO EN LA ENZIMA ACETILCOLINESTERASA CONTENIENDO MACROALGAS ESTUARINAS PARA LA DETECCIÓN DEL AGENTE ANTICOLINESTERÁSICO PARATIÓN-METILICO Camila Domingues Mendonça Raphael Teixeira Verbinnen Paulo Roberto Brasil de Oliveira Marques Gilvanda Silva Nunes Resumo: Biossensores amperométricos à base da enzima AChE foram desenvolvidos para detecção do inseticida organofosforado (OP) paration metílico, muito utilizado na agricultura brasileira. Foram empregadas enzimas AChE comerciais extraídas de eritrócito bovino (EB) e da enguia elétrica (EE), incorporadas a uma pasta de grafite, em presença da macroalga (Cladaphropsis membranácea) obtida de regiões estuarinas de São Luís, MA, e do álcool polivinílico contendo grupamentos estirilpiridínicos (PVA-SbQ). Na presença da macroalga e do mediador TCNQ, foi possível realizar as medidas de corrente a um potencial relativamente baixo (60 mv). Foram realizadas leituras cronoamperométricas e registradas as respostas da corrente elétrica, determinando a concentração ideal do substrato (cloreto de acetiltiocolina, ATChCl) (0,4 mmoll -1 para AChE (EB) e 0,05 mmoll -1 para AChE (EE) com uma carga de 8,68 mu/eletrodo), de forma a se obter uma corrente de aproximadamente 200 na. No estudo de reprodutibilidade do sensor, foi obtido coeficiente de variação de 17,3%. A linearidade do biossensor para o pesticida OP paration metílico foi de 0,01 a 1,0 µgl -1, e o limite de detecção, baseado em 10% de IR, foi de 0,41 µgl -1. O sensor desenvolvido neste trabalho mostrou-se sensível e reprodutível, podendo ser empregado na detecção futura de agentes anticolinesterase em diferentes matrizes. Palavras-chave: Biossensores Amperométricos. Acetilcolinesterase. Pesticidas Organofosforados. Abstract: Amperometric biosensors based on enzyme AChE were developed for detection of organophosphate insecticide (OP) parathion, widely used in agriculture. Commercial enzyme AChE extracted from bovine erythrocyte (EB) and the electric eel (EE) were used, incorporated into a graphite paste in the presence of macroalgae (Cladaphropsis membranacea) obtained from the estuarine regions of São Luís, MA, and from polyvinyl alcohol containing estirilpiridínicos groups (PVA-SBQ). In the presence of the mediator TCNQ and macroalgae was possible to perform measurements of current at a relatively low potential (60 mv). Cronoamperometrics readings were taken and the responses of the electric current were recorded, determining the optimal concentration of substrate (acetylthiocholine chloride, ATChCl) (0.4 mmoll -1 for AChE (EB) and 0.05 mmoll -1 for AChE (EE) and load of 8.68 mu / electrode), in order to obtain a current of 200nA. In the study of reproducibility of the sensor was obtained coefficient of variation of 17.3%. The linearity of the biosensor for the OP pesticide parathion was 0.01 to 1.0 μgl -1, and the detection limit, based on 10% IR was 0.41 μgl -1. The sensor developed in this study was sensitive and reproducible and can be used in future detection of anticholinesterase agents in different matrices. Keywords: Amperometric Biosensors. Acetylcholinesterase. Organophosphate pesticides. Resumen: Biosensores amperométricos basados en la enzima AChE fueron desarrollados para la detección del insecticida organofosforado (OP) metil paratión, ampliamente utilizado en la agricultura. Se utilizó la enzima comercial AChE de eritrócitos bovinos(eb) y de la anguila eléctrica (EE), mesclados en una pasta de grafito en presencia de macroalgas (Cladaphropsis membranacea) obtenido a partir de las regiones del estuario de la ciudad de São Luis, MA, y del alcohol polivinílico conteniendo grupos estirilpiridínicos (PVA- SBQ). En la presencia del mediador TCNQ y de la macroalga fue posible hacer mediciones de corriente a un potencial relativamente bajo (+ 60 mv). Medidas cronoamperométricas fueron realizadas y se registraron las respuestas de la corriente eléctrica, para determinar la concentración óptima del sustrato (cloruro de acetiltiocolina, ATChCl) (0,4 mmoll -1 para la AChE (EB) y 0,05 mmoll -1 para la AChE (EE) con una carga de * Trabalho premiado durante o XXIII Encontro do SEMIC realizado na UFMA entre os dias 08 a 11 de novembro de Artigo recebido em fevereiro 2012 Aprovado em abril Cad. Pesq., São Luís, vol. 19, n. especial, jul. 2012

2 Construção de biossensores amperométricos 8,68 mu/electrodo), de modo a obtener una corriente de na. En el estudio de la reproducibilidad del sensor se obtuvo un coeficiente de variación de 17,3%. La linealidad del biosensor para el plaguicida paratión OP fue de 0,01 a 1,0 μgl -1, y el límite de detección, basado en 10% de IR fue de 0,41 μgl -1. El sensor desarrollado en este estudio resultó ser sensible y reproducible y se puede utilizar en la detección futura de agentes anticolinesterasa en distintas matrices. Palabras clave: Biosensores Amperométricos. Acetilcolinesterasa. Pesticidas Organofosforados. 1 INTRODUÇÃO Os pesticidas da última geração têm sido amplamente usados ao redor do mundo e são altamente tóxicos, permanecendo no ambiente e causando sérios problemas aos ecossistemas e à saúde humana. Entre os pesticidas, os inseticidas organofosforados (OPs) e carbamatos (CBs) representam importante classe de compostos tóxicos, sendo que sua toxicidade é baseada na inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE), que catalisa a hidrólise do neurotransmissor acetilcolina (ACh), responsável pelos impulsos nervosos. Apesar dos inseticidas OPs e CBs serem menos persistentes no ambiente quando comparados aos inseticidas organoclorados, seu intenso uso tem levado à contaminação de águas e alimentos (RAWN et al., 2004; BLASCO et al., 2003). Daí a grande necessidade de um controle. Os pesticidas podem entrar no meio aquático por diversas formas, sendo com isso direcionados a vários destinos, podendo até atingir o sedimento, importante compartimento do meio aquático. A entrada por uso agrícola depende, em grande parte, da sua dinâmica no solo. Portanto, os pesticidas podem ser sorvidos por partículas, sofrer volatilização, ser absorvidos por raízes ou organismos vivos, ser carreados por água de chuva ou sofrer decomposição biológica (MARQUES, 2001). Esses pesticidas podem ser detectados em amostras ambientais e de alimentos, através de métodos de referência baseados em separação por cromatografia. Essas técnicas têm notáveis limites de detecção e seletividade, mas são caras e tomam muito tempo. Além disso, não são técnicas adaptadas à detecção de poluentes in situ (CAMPÀS et al., 2005). Nas últimas décadas, biossensores baseados na enzima acetilcolinesterase (AChE) têm emergido como uma técnica promissora para investigações de toxicidade, monitoramento ambiental, controle de qualidade de alimentos e investigações militares. A principal aplicação de biossensores baseados nas enzimas AChE tem sido na detecção de pesticidas organofosforados e carbamatos, mediante inibição Cad. Pesq., São Luís, vol. 19, n. especial, jul enzimática (SINHA et al., 2010). Estes dispositivos são projetados para complementar ou substituir os métodos analíticos de referência já existentes (cromatográficos), simplificando ou eliminando a preparação da amostra, diminuindo, assim, o tempo e o custo de análise. Devido à natureza do processo de inibição e às dificuldades de regeneração da superfície do sensor, eletrodos descartáveis do tipo serigrafados (SPE) são muitas vezes preferidos (SINHA et al., 2010). Os biossensores representam, portanto, uma alternativa viável a ser utilizada durante estudos envolvendo monitoramento ambiental, pois são relativamente sensíveis e seletivos, apresentam rápida resposta, baixo custo, além de serem de fácil manuseio e portáteis (DONDOI et al., 2006). Os organofosforados, assim como os carbamatos, atuam na inibição da bioatividade da enzima acetilcolinesterase. A acetilcolina é um neurotransmissor natural sintetizado pela célula transmissora ou pré-sináptica. Ela é armazenada em vesículas sinápticas até que um potencial de ação leve a uma despolarização da membrana plasmática das células pré-sinápticas (SOUSA; REBELO, 2008). Com a inibição da AChE, a acetilcolina é acumulada, dando origem a efeitos sinápticos descontrolados, até a morte dos insetos e até dos mamíferos, dependendo da exposição. Deste modo, torna-se extremamente importante o desenvolvimento de metodologias analíticas mais simples e que sejam utilizadas como métodos de alarme da presença desses contaminantes, tanto em amostras ambientais, como biológicas e de alimentos. Este trabalho mostra resultados de construção e caracterização de sensores do tipo serigrafados à base da enzima AChE para detecção de pesticidas organofosforados (OPs). Foram efetuados estudos de procedimentos de imobilização da enzima de forma a resultar em menor perda de atividade enzimática. Também foram avaliadas as melhores condições para a realização dos ensaios de inibição, tais como concentração do substrato, mediadores ele- 129

3 Camila Domingues Mendonça et al. troquímicos e presença de uma macroalga na pasta sensível, depositada no eletrodo de trabalho, originando sensores altamente sensíveis ao inseticida OP paration metílico. 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Material e reagentes Enzimas acetilcolinesterases (AChE), extraídas de enguia elétrica e do eritrócito bovino (Sigma/Aldrich), foram escolhidas para a construção do biossensor amperométrico. As soluções estoques das enzimas foram preparadas diretamente nos frascos Eppendorf (1mL), por dissolução em solução de NaCl 0,9% (m/v). As soluções estoques foram, então, armazenadas a uma temperatura aproximada de -18 C, em freezer. A partir de sua diluição em solução tampão fosfato 0,1molL -1, ph 7,2 (PBS), as demais soluções de trabalho foram preparadas e pequenas alíquotas foram acondicionadas em frasco Eppendorf e armazenadas em temperatura inferior a 10 C em refrigerador. Usou-se cloreto de acetiltiocolina (ATChCl, Sigma Aldrich/Alemanha) como substrato da enzima. Soluções de ATChCl foram preparadas em tampão fosfato, ph 7,2. Soluções de ácido ditiobisnitrobenzóico (DTNB) (Sigma Co, St Louis, MO) foram preparadas em tampão fosfato. O agente de imobilização enzimático, álcool polivinílico, contendo grupo estirilpiridínico (PVA-SbQ SSP US 130) (Bio Lab, Japão 3500), foi estocado sob refrigeração a 4ºC. Foram utilizadas também solução de hidroxietil celulose (HEC, da Aldrich Co, Steinheim, Alemanha) a 3% e de soroalbumina bovina (BSA, da Sigma) a 30% na incorporação da pasta, juntamente com a macroalga de ambiente estuarino, previamente hidrolisada e seca, da espécie Cladophoropsis membranácea. Obteve-se padrão do pesticida paration metílico da Sigma, sendo a solução estoque do pesticida preparada em metanol e estocada a -4ºC. Prepararam-se soluções de trabalho a partir de diluições da soluçãoestoque em água destilada. Apenas reagentes de grau analítico foram utilizados nas análises. 2.2 Instrumentação As medidas eletroanalíticas empregando os biossensores foram efetuadas em um potenciostato/galvanostato (Micro-AUTOLAB Tipo III, Methrom) e as medidas espectrofotométricas, realizadas para determinação da atividade enzimática, foram feitas em um espectrofotômetro UV/Vís (Biospectro SSP-220, NARP/ UFMA), antes da imobilização da enzima. Foi utilizada lâmpada de neônio customizada para a etapa de fotopolimerização a frio da enzima na superfície do eletrodo. 2.3 Determinação da atividade enzimática A atividade da enzima foi medida espectrofotometricamente antes de cada imobilização. Empregou-se a metodologia cinética de Ellman (ELLMAN et al., 1961), modificada por Nunes et al. (2001). Resumidamente, foi tomado um volume de 50 μl da enzima a ser analisada e misturado a 200 μl de 5,5 - ditiobis (2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) 2,5 x 10-3 moll -1, 350 μl de solução tampão fosfato (PBS) e, por último, 200 μl de solução do substrato cloreto de acetiltiocolina (ATChCl) 2 mmoll -1, em uma célula espectrofotométrica. A hidrólise do substrato (ATChCl), catalisada pela enzima, produz a tiocolina (TCh), que reage posteriormente com o DTNB, ocasionando a formação de complexo amarelo que absorveu em 412nm. Monitorou-se a reação, medindo-se a absorbância em função do tempo, seguindo a lei de Beer, para crescentes concentrações do produto formado. Medidas espectrofotométricas do branco (sem a presença de enzima) foram também obtidas em 412nm e subtraídas da medida com a solução enzimática. 2.4 Imobilização enzimática Preparo da pasta sensível de AChE com e sem macroalga estuarina a) coleta e hidrólise da macroalga - a macroalga da espécie Cladophoropsis membranacea foi coletada durante período chuvoso no estuário do Rio Anil, próximo ao bairro Jaracati, em São Luís, MA. O material foi acondicionado em um recipiente plástico, após leve raspagem da raiz do mangue. A macroalga foi tratada como segue: misturou-se bem cerca de 500mg do material, previamente seco ao ar por um período de aproximadamente 48h, seguida de exposição ao nitrogênio gasoso (N 2 ) por 10min. Em sequência, foi selecionado um volume de 2mL de uma solução de papaína 1:10 (m/v), preparada em tampão acetato de sódio 0,1molL -1 (ph 5,0), contendo EDTA e cisteína, ambos com concentração de 5mmolL -1. Em seguida, a mistura foi 130 Cad. Pesq., São Luís, vol. 19, n. especial, jul. 2012

4 Construção de biossensores amperométricos levada a banho-maria, em temperatura de aproximadamente 50 C por 3h. Após a hidrólise, a solução foi filtrada em funil de Buckner com papel de filtro qualitativo, sendo o resíduo retirado, secado ao ar por um período de 5h e então pulverizado em gral de ágata. b) preparo da pasta enzimática em PVA-SbQ - foi preparada 500mg da pasta pela mistura de PVA-SbQ com a solução da enzima AChE (EB), preparada em tampão fosfato (PBS, ph 7,2), na proporção de 30% do agente de imobilização e 70% da solução stock da enzima. Esta pasta foi, então, utilizada no preparo dos sensores de carbono, contendo ou não o mediador ftalocianina de cobalto. Para o sensor contendo a solução da enzima AChE (EE), foi preparada a pasta com as mesmas proporções, porém com quantidades diferentes, 32mg de PVA-SbQ, diluída em 75 µl da solução stock da enzima. Este sensor foi utilizado para os ensaios de inibição. c) preparo da pasta para o sensor de carbono contendo a macroalga primeiramente, foi otimizado o procedimento de preparação da pasta para o sensor de carbono e obtido, como melhor resposta eletroquímica, o seguinte processo: foi retirado 50mg da pasta de carbono contendo 100mg de grafite em pó, 25µL de uma solução de BSA (3,2% m/v) e 100 µl da solução de HEC (3% m/v), sendo em seguida misturado e homogeneizado com 100mg da pasta enzimática AChE (EB) em PVA-SbQ, seguindo da adição de 2,5mg da macroalga. Para a enzima AChE (EE) segue o mesmo procedimento para o preparo da pasta de grafite, retirando 45mg e em seguida misturando e homogeneizando com 90mg da pasta enzimática AChE (EE) em PVA-SbQ e 2,5mg da macroalga, previamente hidrolisada e seca. 2.5 Construção e caracterização do biossensor O biossensor foi preparado adicionando-se 5 mg da pasta sensível de AChE, descrita no Cad. Pesq., São Luís, vol. 19, n. especial, jul item 2.4.1, na área de trabalho dos sensores serigrafados (Figura 1). Para as pastas contendo PVA-SbQ, este procedimento foi seguido da aplicação da luz de neônio (15W), durante um período de 18h, iniciando-se no final da tarde, em refrigerador (4 C). Este procedimento foi realizado de forma a favorecer a fotopolimerização da enzima. Figura 1 - Aplicação da pasta sensível de AChE com e sem macroalga no sensor, seguido da exposição à luz de neônio (para o caso do uso do PVA-SbQ), como agente de polimerização e fixação da enzima Após o preparo dos sensores, iniciou-se a caracterização eletroquímica do biossensor. O biossensor foi acoplado ao potenciostato e, em seguida, mediu-se a intensidade da corrente mediante imersão do biossensor em solução do substrato de concentração conhecida, em um béquer de 5mL da capacidade. Inicialmente, o sinal relativo ao tampão PBS foi cronoamperometricamente registrado, sendo estabelecido como linha de base. O sinal de corrente relativo à resposta enzimática com o substrato foi posteriormente obtido, empregando-se potencial de trabalho fixo e monitorando-se a intensidade de corrente com o tempo (NUNES et al., 2001). Em presença do substrato, a enzima imobilizada apresentou um sinal de corrente I (μa), relativo a uma determinada atividade específica da enzima. O eletrodo foi cuidadosamente lavado com solução de trabalho e seco com papel ultramacio a cada medida. Foram efetuados, assim, ensaios de repetitividade de sinal e analisada a melhor concentração de substrato, para posterior otimização da carga da enzima e reprodutibilidade/repetitividade dos procedimentos de imobilização. 2.6 Ensaios de inibição Primeiramente, o sinal obtido a partir da adição do substrato foi registrado, tendo sido proporcional à atividade enzimática. Posteriormente, o biossensor foi lavado e seco, sendo procedida a incubação do sensor pela sua imersão em uma solução contendo o pesticida (inibidor). O tempo de incubação foi de

5 Camila Domingues Mendonça et al. min, seguindo-se o protocolo previamente otimizado (SKLÁDAL, 1991; NUNES et al., 1999; NUNES et al., 2001). Após a incubação, o eletrodo foi novamente lavado e seco, medindo-se, então, o sinal da atividade enzimática com o substrato. A inibição relativa foi determinada pelo decréscimo da corrente, que foi proporcional à concentração do inibidor, por comparação dos valores de correntes obtidos antes e depois da inibição. Esta relação foi testada por meio de curvas de calibração com pesticidas que, de acordo com a Equação 1, corrige o sinal inicial pela razão absoluta, independente da configuração do biossensor. Onde: IR: inibição relativa, dada em porcentagem; S 0 : sinal de corrente gerado pela reação enzima - substrato antes da inibição com o pesticida; S 1 : sinal de corrente gerado pela reação enzima - substrato após a inibição com o pesticida. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO no presente trabalho, o eletrodo à base de grafite contendo o TCNQ também demonstrou sensibilidade e estabilidade no sinal eletroquímico. O TCNQ foi empregado como mediador eletroquímico da reação enzimática, transferindo os elétrons gerados da superfície do eletrodo para o potenciostato, e ocasionando a redução do potencial de trabalho. A enzima AChE atuou como elemento de biorreconhecimento, também modificando o eletrodo de trabalho. Primeiramente foram otimizadas as condições operacionais para a determinação do potencial de trabalho. No gráfico 1, pode-se confirmar o aumento da corrente com a adição da macroalga em um potencial inferior, de ~80 mv. Aqui, a adição da macroalga provavelmente favoreceu um microambiente propício à interação E-S. Neste caso, o potencial analisado se aproxima do potencial do mediador TCNQ (100mV). Desta forma, para os demais estudos de otimização de potencial, foi monitorado um potencial em torno de 100mV, com uma carga enzimática de 1,2mU/eletrodo (AChE EB). Gráfico 1 - Sensor modificado com TCNQ e pasta contendo AChE (EB) (1,2 mu/eletrodo)/bsa, em solução de Substrato ATChCl (1 mm) (- ). Sensor modificado com TCNQ e pasta contendo AChE (EB) (1,2 mu/ Eletrodo)/BSA/Macroalga, em solução de Substrato ATChCl (1 mm) ( --). 3.1 Procedimento de imobilização enzimática O principal problema durante a imobilização enzimática pode ser a perda parcial ou total da atividade enzimática, que pode ser atribuída às condições experimentais. Assim, nesse trabalho comprovou-se que ainda é melhor proceder à imobilização com PVA-SbQ, conforme procedimentos recomendados (NUNES et al., 2008; MARQUES; MARQUES; NUNES, 2006; NUNES et al., 2005). Como mostra o Quadro 1, existem muitos outros métodos para imobilização enzimática, em que a maioria deles é comparada em relação à sua eficiência no capítulo de livro publicado por Nunes e Marty (2006). 3.2 Seleção do potencial de trabalho e otimização da concentração do substrato Em concordância com os resultados reportados por Marques, Marques e Nunes (2006), Os sensores foram posteriormente avaliados pela técnica de voltametria de pulso diferencial, em faixas de potencial de -100 mv a 400 mv e de 0,0 mv a 500 mv, para AChE (EB) e para AChE (EE), respectivamente. Para tal, os sensores foram imersos em soluções do substrato (ATChCl) com concentrações crescentes (0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 132 Cad. Pesq., São Luís, vol. 19, n. especial, jul. 2012

6 Construção de biossensores amperométricos Quadro 1: Comparação de Quatro Métodos Básicos de Imobilização Enzimática Características (A)Adsorção (B)Aprisionamento (C)Acoplamento Covalente (D) Ligação-cruzada Suporte inorgânico: resinas Reagentes: glutaral- de troca de íons, carvão Alginato, carra- deído, bis-isocianato, ativo, sílica gel, argila, genina, coláge- bis-diazobenzidina, Material da Matriz óxido de alumínio, titânio, terra diatomácea, hidroxiapatita, cerâmica, celite, vidros porosos tratados. no, policrilamida, gelatina, borracha de silicone, poliuretano, álcool polivi- Agarose, celulose, PVC, resinas de troca iônica, vidro poroso. sais de diazônio. Proteínas funcionalmente inertes, tal como ovoalbumina e Suporte orgânico: amido, nílico com grupos BSA, são frequente- colágeno, sepharose mo- estirilpiridínicos. mente usados como dificada, celulose CM. elementos ligantes. Ligação química Natureza da ligação Reversível: muda com ph, temperatura e força iônica pode separar a enzima. Aprisionamento físico (diazonação, ligação peptídica, alquilação, ligação com agentes Aprisionamento polifuncionais). Carga enzimática Pouca Pouca Alta Alta Vazamento de enzima Algum Algum Muito baixo Baixo Perda de enzima Atividade desprezível Desprezível Significante Pequeno Custo Baixo Baixo Alto Baixo Alta salinidade; Operacional Técnica simples e nãodestrutiva; alguma instabilidade (atribuída à dessorção enzimática). Técnica de fácil controle e não-destrutiva; possíveis barreiras de difusão; perda de algumas enzimas. ausência de barreiras de difusão; baixo tempo de resposta; alta carga enzimática, baixa Maior perda de atividade enzimática; facilidade operacional; alta carga enzimática. reprodutibilidade. Fonte: Nunes e Marty, ,45; e 0,6mM), em PBS ph 7,2. O biossensor modificado com AChE (EB) apresentou um pico bem definido de potencial na faixa de mv versus Ag/AgCl. A combinação enzima-mediador-macroalga permitiu, então, trabalhar em um potencial fixo de 60 mv versus Ag/AgCl para as medidas crono- Cad. Pesq., São Luís, vol. 19, n. especial, jul amperométricas. O biossensor modificado com AChE (EE) apresentou um pico em um potencial mais elevado (324 mv); assim, o sensor à base da enzima AChE (EE) foi utilizado para os ensaios de inibição. Os gráficos 2 e 3 mostram os voltamogramas gerados pelos dois sistemas. 133

7 Camila Domingues Mendonça et al. Gráfico 2 - Voltamograma de pulso diferencial gerado nos testes de otimização do sistema empregando biossensores, modificado com TCNQ e pasta contendo AChE extraída de eritrócito bovino (1,2 mu/eletrodo)/ PVA-SbQ/ BSA/ HEC/ Macroalga, em solução de 0,1mM de ATChCl. Velocidade de varredura: 25mV s -1 Gráfico 3 - Voltamograma de pulso diferencial gerado nos testes de otimização do sistema empregando biossensores, modificado com TCNQ e pasta contendo AChE (EE) (8,68 mu/eletrodo)/pva-sbq/ BSA/HEC/Macroalga, em solução de 0,05 mm de ATChCl. Velocidade de varredura: 25mV s -1 Gogol e seus colaboradores (2000), utilizando um sensor eletroquímico similar e imobilizando enzimas BChE s em náfion, mediante ligação cruzada com vapores de glutaraldeído, trabalharam com potenciais em torno de 400 mv versus Ag/AgCl, durante os ensaios de inibição de colinesterases. Biossensores com suporte de cerâmica contendo o eletrodo-compósito à base de grafite modificado com ftalocianina de cobalto (CoPC) também trabalharam em potenciais variando de 250 a 400 dmv, durante detecções de agentes anticolinesterases (SKLÁDAL, 1991; NUNES et al., 1999; NUNES et al., 2001). O potencial de trabalho é uma função do mediador. Como já foi discutido, biossensores contendo mediadores são menos susceptíveis a interferências eletroquímicas e até da composição da amostra, pois o potencial de oxidação aplicado é menor. Os mediadores são imobilizados na superfície do eletrodo, na mesma matriz que a enzima que será inibida, ou em matriz diferente, objetivando uma rápida transferência eletrônica. Biossensores à base de enzimas aceticolinesterase (AChE) funcionaram pela inibição enzimática por um pesticida ou outro inibidor qualquer. Quando a enzima AChE é imobilizada na superfície do eletrodo, há interação com o substrato, produzindo uma espécie eletroativa. Nessa estratégia, o substrato acetiltiocolina substituiu o substrato original da AChE, a acetilcolina. Assim, o novo substrato (acetiltiocolina) foi hidrolisado da mesma forma como o substrato original, produzindo tiocolina e o ácido carboxílico correspondente (ácido acético, no caso) (Figura 2). Os elétrons gerados durante a reação eletroquímica foram então coletados, e a corrente final corresponde à medida quantitativa da atividade da enzima (NUNES, JEANTY; MARTY, 2004). Figura 2 - Esquema de detecção direta da tiocolina, utilizando mediador eletroquímico Fonte: (MARQUES; YAMANAKA, 2008) O sensor de grafite modificado com TCNQ apresentou excelente resposta, mesmo em concentrações do substrato relativamente baixas. Antes da incorporação da macroalga, foram registrados valores de correntes na ordem de nA, em [ATChCl] próxima a 10 mmoll -1 (NUNES et al., 2008). Na presença da macroalga, o valor da corrente obtida durante a reação enzimática cresceu cerca de 25 vezes. Isto significa que, para se atingir valores de corrente na ordem de 200nA, torna-se necessária uma solução com [S] próxima a 0,4 mmoll -1, o que torna o processo mais econômico. Além disso, a macroalga possibilitou rapidez na estabilização da corrente gerada durante a reação enzimática. 3.3 Determinação do melhor tempo para medidas cronoamperométricas Para análise do sinal cronoamperométrico, foi tomado o tempo de 55s (Gráfico 4), quando houve uma maior estabilidade no sinal da corrente gerada pela enzima. 134 Cad. Pesq., São Luís, vol. 19, n. especial, jul. 2012

8 Construção de biossensores amperométricos Gráfico 4 - Curva analítica para monitoramento da resposta da corrente elétrica com a adição do substrato em um tempo de 55s, para AChE (EB) outra, o sensor foi lavado com tampão PBS (ph 7,2). O gráfico 6 mostra a reprodutibilidade de um único sensor, que apresentou um coeficiente de variação de 17,3%, evidenciando boa estabilidade do sistema eletroquímico. Contudo, testes objetivando melhorar o procedimento de imobilização podem ser ainda realizados, de forma a evitar perda da camada sensível entre uma medida eletroquímica e outra. Gráfico 6 - Estabilidade do biossensor modificado com TCNQ e pasta à base de AChE (EB) (1,2 mu/ Eletrodo)/PVA-SbQ/grafite/BSA/HEC/Macroalga. [S] ideal = 0,4 mm. (-) Medida de corrente objetivada Um tempo de 55s foi então tomado como padrão para todas as medidas cronoamperométricas, inclusive durante os ensaios de inibição enzimática pelos agentes anticolinesterase. O gráfico 5 apresenta as linhas de base após estabilidade da corrente em concentrações crescentes do substrato. Gráfico 5 - Sobreposição dos gráficos cronoamperométricos, em tampão PBS (ph 7,2) e em concentrações pré-estabelecidas do substrato acetiltiocolina para sensores contendo a enzima AChE (EB) 3.5 Ensaios de inibição e sensibilidade dos biossensores Foram realizados ensaios de inibição da enzima AChE para o inseticida paration metílico (OP) e uma curva de inibição foi construída. Os ensaios de inibição foram realizados com concentrações crescentes do inseticida (0,01; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 10; 50; 100; 500; 750; 1000 e 1500 µgl -1 ), por incubação dos sensores em solução do inibidor por 10 min. O gráfico 7 mostra a curva analítica do paration metílico, construída a partir dos ensaios de inibição relativa da enzima AChE (EE) pelo inibidor. Concentrações crescentes do pesticida ocasionaram percentuais de inibição enzimática também crescentes. Gráfico 7 - Curva de inibição relativa (IR) da enzima AChE EE pelo inseticida OP paration metílico. Carga enzimática: 8,68 mu/eletrodo; [S] = 0,05 mm. Em destaque, faixa de linearidade do método 3.4 Estabilidade dos sensores Após a determinação da concentração ideal do substrato (0,4 mmoll -1 ), através do cálculo de regressão linear para uma corrente de aproximadamente 200nA, foram realizadas dez medidas cronoamperométricas, com o mesmo sensor, de forma a verificar a sua estabilidade. A concentração do substrato foi fixa, assim como o tempo para a finalização da medida (55s). Entre uma medida e Cad. Pesq., São Luís, vol. 19, n. especial, jul

9 Camila Domingues Mendonça et al. A curva original de inibição enzimática apresentou um comportamento logarítmico bem definido, com um coeficiente de correlação de 0,992. O biossensor otimizado para AChE (EE) apresentou-se sensível, tendo faixa de trabalho de 0,01 a 1,0 μgl -1 e limite de detecção de 0,42 μgl -1, baseado em 10% de inibição relativa (MARTORELL, 1997; SKLÁDAL, 1991; NUNES et al., 2001). Para a enzima AChE (EE) foi obtida uma concentração ideal do substrato de 0,05 mm, que favoreceu uma corrente de ~ 200nA, o que significa economia na utilização desse reagente. Marques (2001), utilizando o mesmo sensor com imobilização da AChE (EE) por fotopolimerização, obteve um limite de detecção de 90µgL -1 para o metamidafós. Silva (2010) obteve um limite de detecção de 10µgL -1 para o paration metílico, imobilizando também a AChE (EE). Neste último caso, o sensor foi preparado mediante a imobilização da enzima com glutaraldeído e posterior adição a uma pasta de carbono. Em estudos já realizados (BACHMANN et al., 2000; MARQUES, 2001; NUNES et al., 2005; SILVA, 2010), foi verificada a eficiência das enzimas geneticamente modificadas que, em comparação com as comerciais, mostram- -se bem mais sensíveis. A utilização de técnicas de maior sensibilidade é de fundamental importância para a realização de pesquisas relacionadas ao controle ambiental, sobretudo em águas naturais. Tais pesquisas exigem limites de detecção instrumental se possível abaixo dos limites máximos recomendados (LMRS) pela legislação. 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS Os biossensores amperométricos surgem como uma alternativa viável para detecção de agentes anticolinesterase, pois poderão complementar as técnicas já existentes para condução de estudos ambientais. Como métodos de alarme, os biossensores já têm sido bastante utilizados, devido a sua rapidez, simplicidade, seletividade e sensibilidade. A técnica de imobilização utilizada, baseada na fotopolimerização com PVA-SbQ, foi de fundamental importância, pois proporcionou uma boa estabilidade da enzima, reduziu custos e diminuiu o tempo para o procedimento de fixação da enzima no sensor. O biossensor foi construído com a enzima acetilcolinesterase, seguindo procedimentos já estabelecidos, mas tendo, como novidade, a incorporação de uma macroalga estuarina à camada sensível do eletrodo de trabalho. Este processo pode se tornar mais viável e econômico a partir da realização de estudos mais aprofundados, a fim de diminuir o limite de detecção (aumentar a sensibilidade). Contudo, o sensor desenvolvido nesse trabalho poderá ser empregado para detecção futura de agentes inibidores de enzimas acetilcolinesterase, como outros organofosforados e carbamatos, podendo as enzimas serem substituídas por outras provenientes de diferentes fontes, incluindo enzimas geneticamente modificadas. AGRADECIMENTOS Agradecemos à UFMA e ao CNPq, que financiaram e apoiaram esse projeto de pesquisa. REFERÊNCIAS BACHMANN, T.T. et al. Improved multianalyte detection of organophosphates and carbamates with disposable multielectrode biosensors using recombinant mutants of Drosophila acetylcholinesterase and artificial neural networks. Bios. Bioelectr. v. 15, p , BLASCO, C. et al. Assessment of pesticide residues in honey samples from Portugal and Spain. J. Agric. Food Chem., v. 51, p , CAMPÀS, M. et al. Towards the protein phosphatase-based biosensor for microcystin detection. Bios. Bioelectr., v. 20, p , DONDOI, M. P. et al. Organophosphorus insecticides extraction and heterogeneous oxidation on column for analysis with an acetylcholinesterase (AChE) biosensor. Anal. Chim. Acta, v. 578, p , ELLMAN, G.L. et al. A new and rapid colorimetric determination of acethylcholinesterase active. Biochem. Pharmacol., v. 7, p , GOGOL, E.V. et al. Amperometric biosensors based on nafion coated screen-printed electrodes for the determination of cholinesterase inhibitors. Talanta, v. 53, p , MARQUES, P. R. B. O.; YAMANAKA, H. Biossensores baseados no processo de inibição enzimática. Quim. Nova, v. 31, p , MARQUES, C. V. V. C. O.; MARQUES, P. R. B. O.; NUNES, G. S. Biossensores 136 Cad. Pesq., São Luís, vol. 19, n. especial, jul. 2012

10 Construção de biossensores amperométricos amperométricos para detecção screening de inseticidas carbamatos em águas de abastecimento. Pesticidas: R. Ecotoxicol. M. Amb., Curitiba, v. 16, p , MARQUES, P. R. B. O. Metodologias analíticas envolvendo cromatografia gasosa e biossensores enzimáticos para controle de resíduos de Pesticidas em amostras ambientais. Dissertação (Mestrado em Química Analítica), Universidade Federal do Maranhão, São Luís, Brasil, MARTORELL, D. Determination of organophosphorus carbamates pesticides use a biosensor based on a polishabe, 7,7,8,8,-tetracyanoquinodimethanemodified, graphite epoxy biocomposite. Anal. Chim. Acta, v. 337, p , NUNES, G. S. et al. Ultrasensitive biosensors for the detection of insecticide residues in fruit juices. Bul. Transilvania Univ. Brasov, v. 1, p , NUNES, G. S. et al. Evaluation of highly sensitive amperometric biosensor with low cholinesterases charge immobilized on a chemically modified carbon paste electrode for trace determination of carbamates in fruit, vagetable and water samples. Anal. Chim. Acta, v. 399, p , NUNES, G.S. et al. Acetylcholine enzyme sensor for determining methamidophos insecticide: evaluation of some genetically modified acetylcholinesterases from Drosophila melanogaster Anal. Chim. Acta, v. 434, p. 1-8, NUNES, G.S. et al. Determinação de resíduos de inseticidas carbamatos em alimentos infantis utilizando biossensores amperometricos à base de enzimas acetilcolinesterase mutantes. Acta Toxicol. Arg., v. 13, p. 1-7, NUNES, G. S.; JEANTY, G.; MARTY, J.-L. Enzyme immobilization procedures on screenprinted electrodes used for the detection of anticholinesterase pesticides comparative study. Anal. Chim. Acta, v.523, p , NUNES, G.S.; MARTY, J-L. Immobilization of enzymes and sells. In: Methods in Biotechnology. Guisan, J.M. (Ed.). New Jersey: Humana Press Ed, 464 p., RAWN, D. F. et al. N-methyl carbamate concentrations and dietary intake estimates for apple and grape juices available on the retail market in Canada. Food Addit. Cont., v.21, p , SILVA, D. F. Desenvolvimento de métodos empregando spme-gc/ms e biossensores amperométricos para análise do inseticida paration metílico em amostras de arroz in natura. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Maranhão, São Luís, Brasil, SINHA, R. et al. AChE biosensor based on zinc oxide sol-gel for detection of pesticides. Anal. Chim. Acta, v. 661, p , SKLÁDAL, P. Determination of organophosphate and carbamates pesticides using a cobalt phthalocyanine-modified carbon paste electrode and a cholinesterase enzyma membrane. Anal. Chim. Acta, v. 252, p , SOUSA, S. C. A.; REBELO, M. J. F. Acetylcholinesterase- Choline Oxidase Biosensor for Pirimicarb determination. Port. Electroch. Acta, v.26, p , Cad. Pesq., São Luís, vol. 19, n. especial, jul