ESTUDO DIRIGIDO 13 EVOLUÇÃO DO SISTEMA IMUNE INATO Adaptado do Capítulo 16 do Livro Imunobiologia de Janeway - 7ª Edição.

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1 1 ESTUDO DIRIGIDO 13 EVOLUÇÃO DO SISTEMA IMUNE INATO Adaptado do Capítulo 16 do Livro Imunobiologia de Janeway - 7ª Edição. Mariana Monezi Borzi (Estagiária de docência da Disciplina de Imunologia C. Biol. 2016) Prof. Helio José Montassier Devemos distinguir a imunidade inata e a adaptativa pela maneira que o organismo codifica as moléculas que reconhecem patógenos. A resposta imune inata usa receptores codificados diretamente no genoma, e nas espécies que consideramos tão distantes entre si humanos e camundongos o número destes receptores é limitado. O receptor semelhante ao Toll e as proteínas NOD são exemplos desse limitado repertório de receptores de reconhecimento de patógenos. A imunidade adaptativa vence essa limitação pela geração de um repertório muito maior de receptores clonais na forma de anticorpos e receptores de células T produzidos por meio de rearranjos somáticos, repertório grande o suficiente para antecipar o encontro com aparentemente uma infinita quantidade de antígenos. Quando estudamos a evolução de qualquer sistema biológico, como o sistema imune, fazse a suposição básica de que se um gene é encontrado na mesma forma (ou similar) em duas espécies diferentes, então esse gene também deve estar presente no ancestral comum àquelas espécies. Quanto mais uma espécie diverge, mais distante é o ancestral comum. Uma árvore evolutiva mostrando os organismos discutidos neste capítulo e a ordem na qual as diferentes linhagens divergiram é apresentada na Figura 1. Assim, a divergência de plantas, a partir do seu ancestral comum com os animais, ocorreu antes da divergência da linhagem de insetos e daquela que conduz para os deuterostomos (equinodermos e cordados). Os avanços no sequenciamento de DNA têm levado ao conhecimento de toda a sequência genética de uma série de organismos. Esta informação tem mostrado uma enorme similaridade nas estratégias da imunidade inata em todos os filos, revelando uma inesperada diversidade de resposta. Usando esta informação, somos capazes de traçar a evolução dos mecanismos de defesa do hospedeiro desde os nossos ancestrais mais remotos, como aqueles mecanismos que temos em comum com os insetos, por meio do nosso ancestral comum com os equinodermos e, finalmente, com nossos ancestrais comuns aos ascídios urocordados (tunicados ou ascídeas), um grupo irmão da linhagem que conduz aos vertebrados. Dentro dos vertebrados, podemos traçar o desenvolvimento das funções imunes dos agnatos (peixes não-mandibulados, como as lampreias e os peixes-bruxa), passando pelos peixes cartilaginosos (tubarões e arraias) até os peixes ósseos, então para os anfíbios, répteis e aves e, por fim, para os mamíferos.

2 2 Figura 1: A história evolutiva dos organismos mencionados neste texto. A ramificação da árvore evolutiva esquemática mostrada aqui representa a ordem de divergência das diferentes linhagens, de modo que a linhagem dos vegetais divergiu do seu último ancestral comum com os animais antes da separação da linhagem de insetos, e assim por diante. Note que a árvore não mostra os momentos relativos envolvidos. Os cordados (o filo que inclui os vertebrados) compreende os invertebrados urocordados (p. ex., tunicados) e os cefalocordados (p. ex., anfioxius) e os vertebrados agnatos (peixes não-mandibulados), os peixes cartilaginosos (Condricties), os peixes ósseos (Osteíctes), os anfíbios, os répteis, os pássaros e os mamíferos. Um sistema imune inato é bem desenvolvido na mosca das frutas, Drosophila melanogaster, um organismo-modelo favorito para muitos aspectos da pesquisa biológica, e em vários outros invertebrados. O que a Drosophila compartilha com vertebrados são os receptores invariáveis da superfície da célula os assim chamados receptores de padrões de reconhecimento, que reconhecem padrões moleculares comuns de patógenos, e as vias de sinalização intracelular,

3 3 que vão desde esses receptores até a ativação do fator de transcrição NFkB. Várias espécies animais multicelulares têm um cassete de genes que codificam para as proteínas dessa via. Isso nos faz acreditar que a ativação do NFkB é a via de sinalização original e central de ativação na imunidade inata, levando, por sua vez, à ativação de uma série de genes que dependem do NFkB para sua transcrição. Essa é uma via quase universal, que leva à ativação de vários sistemas diferentes de defesa do hospedeiro. Peptídeos antimicrobianos Uma forma de defesa do hospedeiro, encontrada tanto em plantas quanto em animais e, dessa forma, demarcando a separação das linhagens vegetal e animal, é a produção de peptídeos antimicrobianos. Existem vários peptídeos antimicrobianos diferentes com uma grande variedade de características físicas e químicas e efeitos sobre patógenos microbianos diferentes. Uma classe amplamente distribuída de peptídeos antimicrobianos são os pequenos peptídeos conhecidos como defensinas. Embora as defensinas sejam diferentes em mamíferos e em insetos e plantas, está claro que todas elas estão relacionadas estruturalmente e derivam do mesmo sistema ancestral de defesa do hospedeiro. A maioria dos organismos multicelulares produz diferentes defensinas a planta Arabidopsis thaliana produz 13, Drosophila, no mínimo 15, e, nos humanos, uma única célula do intestino pode produzir 21 defensinas diferentes. As várias defensinas possuem atividades distintas, algumas sendo ativas contra bactérias Gram-positivas e algumas contra bactérias Gram-negativas, ao passo que outras são específicas para patógenos de fungos. Organismos multicelulares também produzem outros tipos de peptídeos antimicrobianos. A produção de peptídeos antimicrobianos por plantas e animais sugere que esse meio de defesa deva ter evoluído antes que essas duas linhagens divergissem. O precursor comum dos vegetais e animais provavelmente foi um organismo unicelular. Várias das outras linhagens que divergiram por volta daquele tempo são organismos eucarióticos unicelulares conhecidos como protistas (alguns dos quais, como protozoários parasitas, atualmente causam doenças em humanos). Não se sabe se peptídeos antimicrobianos estão presentes nos protistas existentes, assim como não está claro se peptídeos como estes teriam necessariamente uma função protetora nesses organismos. Vários protistas de vida livre consideram bactérias mais como uma fonte de alimento do que propriamente como uma ameaça ao seu bem-estar. Entretanto, quando consideramos o comportamento das células fagocíticas em organismos multicelulares, como os macrófagos nos invertebrados, não é irracional especular que no mínimo alguns aspectos da imunidade inata evoluíram a partir dos mecanismos de alimentação fagocítica

4 4 dos eucariotos unicelulares. Todos os vertebrados e vários invertebrados têm células fagocíticas que patrulham seus vasos sanguíneos e tecidos e que têm muito em comum com protistas, como as amebas. É possível que células fagocíticas em animais possam ter derivado de uma população de células que conservaram uma morfologia e um comportamento unicelular ancestral. Receptores semelhantes ao Toll Se peptídeos antimicrobianos são considerados uma forma de defesa mais primitiva contra infecção, então receptores que reconhecem patógenos e induzem a produção de peptídeos antimicrobianos são bons candidatos para estar entre os primeiros receptores dedicados à defesa do hospedeiro. Esses receptores foram descobertos e também parecem ser conservados por um longo período evolucionário. O receptor Toll, primeiramente descoberto na Drosophila, induz a expressão de vários mecanismos de defesa do hospedeiro, incluindo peptídeos antimicrobianos (drosomicina, em Drosophila), atuando principalmente contra os patógenos de bactérias Gram-positivas e fungos patogênicos. Genes homólogos ao Toll foram encontrados em outras espécies, de plantas a mamíferos, nos quais estão associados à resistência a infecções por vírus, bactérias e fungos. Nas plantas, assim como nos insetos, as proteínas semelhantes ao Toll estão envolvidas na produção de peptídeos antimicrobianos, indicando a sua antiga associação a esses meios de defesa do hospedeiro. Seres humanos e camundongos têm em torno de 10 receptores semelhantes ao Toll, que reconhecem componentes de patógenos como bactérias, leveduras e a parede celular de fungos, flagelo bacteriano, RNA viral e DNA bacteriano. O primeiro receptor semelhante ao Toll identificado, agora conhecido como receptor 4 semelhante ao Toll (TLR-4), é necessário para produzir a resposta imune inata ao lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), um componente da superfície celular das bactérias Gram-negativas. A sequência do genoma do ouriço-do-mar S.purpuratus revela uma complexidade sem precedentes de reconhecimento da imunidade inata. Ao todo, o genoma do ouriço-do-mar contém 222 genes TLR diferentes; as especificidades das proteínas codificadas continuam a ser determinadas. Alguém poderia perguntar se esta enorme diversificação de reconhecimento de TLR implica uma forma primitiva de imunidade adaptativa no ouriço-do-mar. Não sabemos ainda como todos esses genes TLR são expressos em um tipo de célula imune, ou se são expressos em uma forma clonal restrita. No sistema imune adaptativo de mamíferos, receptores de antígenos de diferentes especificidades são expressos em clones individuais de linfócitos. Essa expressão clonal permite a característica da resposta imune mude, ao longo de toda a vida do organismo por seleção clonal de linfócitos, com particular especificidade. Nós não podemos dizer como a diversificação de

5 5 receptores semelhantes ao Toll no ouriço-do-mar simplesmente tem levado a um aumento da capacidade de reconhecimento do patógeno, ou se existem seleção e expansão clonal de células expressando receptores especiais semelhantes ao Toll, o que seria o começo de uma verdadeira imunidade adaptativa. Sistema Complemento ancestral Um outro meio antigo da defesa do hospedeiro é representado pelo Sistema Complemento. A função mais primitiva do complemento foi provavelmente a opsonização, que significa um aumento da eficiência de captação de patógenos pelos fagócitos que verificam os espaços do corpo animal. Antes mesmo dos componentes do Complemento terem sido descobertos nos invertebrados, foi sugerido que um Sistema Complemento primitivo poderia conter um mínimo de três componentes: o componente central C3, que seria ativado espontaneamente, já que ele está na via alternativa da ativação de complemento nos mamíferos atualmente. C3 ativado seria ligado ao fator B equivalente, formando uma C3 convertase, que amplificaria o sinal original pela clivagem e ativação de muitas outras moléculas de C3. O terceiro componente desse sistema seria um receptor C3 expresso por fagócitos e capaz de ativar a fagocitose dos patógenos revestidos por C3. Essa previsão tornou-se real com a descoberta dos componentes do complemento nos invertebrados, como mostrado na Figura 2. Um homólogo de C3 foi encontrado em equinodermos: ele é produzido por celomócitos de amebas, células fagocíticas no líquido celomático de equinodermos, sendo que sua expressão aumenta na presença de bactérias. Um homólogo do fator B também foi identificado em equinodermos. Nos mamíferos, o fator B é ativado por uma outra protease fator D, e, embora nenhum equivalente ao fator D tenha sido ainda identificado em equinodermos, o sítio no qual o fator D cliva é conservado no fator B de equinodermos. Assim, os equinodermos parecem possuir os componentes da alça de amplificação da via alternativa de ativação do complemento, na qual o C3 ativado espontaneamente se liga ao fator B, que é, então, clivado pelo fator D para criar uma C3 convertase ativa, que cliva mais C3. No que diz respeito à função do C3 clivado, apesar de nenhum receptor C3 de equinodermo ter sido identificado até agora, sabe-se que as células recobertas com C3 são captadas mais eficientemente do que as não-recobertas pelos fagócitos dos equinodermos, e, por isso, parece que existe nesses invertebrados um sistema do complemento opsonizante funcional equivalente ao sistema ancestral predito que não existe nos vertebrados.

6 6 Figura 2: Os componentes de um Sistema Complemento simples estão presentes nos equinodermos. O Sistema Complemento de equinodermos assemelha-se à via alternativa de ativação do complemento de mamíferos. Os equinodermos possuem equivalentes dos componentes do complemento C3 e do fator B, que são produzidos pelos celomócitos, e também se acredita que possuam equivalentes do fator D e da proteína reguladora do complemento fator I. Nesse sistema, C3 ativado espontaneamente seria ligado à superfície de patógenos, onde, por sua vez, seria ligado ao fator B. A clivagem do fator B por uma protease no líquido celomático, um equivalente do fator D ainda não identificado, criaria a convertase de C3, C3bBb, que pode clivar e ativar muitas outras moléculas de C3. Como os celomócitos de equinodermos são fagócitos que prontamente captarão células revestidas com C3, acredita-se que eles devam expressar um receptor de C3. Finalmente, a convertase C3 é inativada por uma outra protease humoral não-identificada, que se acredita ser equivalente ao fator I. A ativação espontânea de C3 e a sua amplificação pelo fator B apresentam o mesmo problema para equinodermos e mamíferos: como um sistema desses pode ser regulado para prevenir dano tecidual? Como isso é alcançado em equinodermos não se sabe, embora exista uma evidência indireta para a presença de um fator I que pode inativar C3, e é possível que os genes relevantes e seus produtos reguladores do complemento estejam presentes, mas não tenham sido ainda identificados. O sítio de clivagem do fator I é conservado no C3 de equinodermos, e fragmentos de C3 consistentes com a clivagem naquele sítio podem ser encontrados no líquido celomático. Entretanto, nos equinodermos, as proteínas C3 e o fator B são produzidos pelas próprias células fagocíticas (Figura 2), e é possível que eles sejam secretados diretamente nas superfícies dos microorganismos, tanto quanto as células T de mamíferos secretam suas moléculas efetoras diretamente na interface entre a célula T e o seu alvo. Nesse caso, a necessidade por proteínas reguladoras que previnem que o complemento ataque as próprias células do organismo seria menor.

7 7 Com o aparecimento dos cordados, os principais componentes do Sistema Complemento parecem estar bem estabelecidos. No urocordado Ciona, para o qual a sequência completa do genoma foi determinada, foram identificados homólogos de C3 e fator B, assim como vários genes homólogos à integrinas, que poderiam codificar para receptores do complemento. Em outro urocordado, Halocynthia, sabe-se que um receptor semelhante a CR3 da família das integrinas tem uma função na fagocitose mediada por C3. O marcador característico de várias proteínas reguladoras do complemento de mamíferos é um pequeno domínio chamado de repetição consenso curta (SCR) ou repetição da proteína-controle do complemento (CCP). Vários genes que codificam para proteínas que contêm esses domínios SCR foram identificados no genoma de Ciona, e esperase que alguns tenham funções reguladoras do complemento. Não se sabe o quão antigo é esse Sistema Complemento opsonizante. Homólogos de C3 têm sido encontrados em invertebrados mais distantemente relacionados aos vertebrados do que são os equinodermos ou urocordados, notavelmente carangueijos-ferradura e Drosophila, mas suas funções não foram definidas. C3, que é clivado e ativado por serina proteases, está claramente relacionado evolutivamente e parece ter duplicado a partir do inibidor de serina proteases α 2 - macroglobulina. Em Drosophila, parecem existir, no mínimo, quatro homólogos a C3 contendo a ligação tioéster característica dessa família de proteínas; essa ligação permite que a proteína ativada se ligue covalentemente à superfície do patógeno. Essas moléculas são conhecidas como proteínas que contêm tioéster (TEPs). Acredita-se que as TEPs tenham alguma função imune na Drosophila, pois a expressão de no mínimo três delas aumenta quando este inseto está infectado por bactérias. A Drosophila tem células fagocíticas (hemócitos) na hemolinfa, mas até agora não existe evidência para sugerir que exista qualquer atividade opsonizante na hemolinfa. Além disso, as TEPs são sintetizadas pelo corpo gorduroso do inseto, o equivalente ao fígado nos mamíferos, mais propriamente pelas próprias células fagocíticas, como é o caso para o homólogo de C3 de equinodermos. Assim, embora as TEPs de Drosophila estejam claramente relacionadas evolutivamente a C3, elas podem ter alguns papéis completamente diferentes. Uma representação mais clara é revelada em outro inseto, o mosquito Anopheles gambiae, no qual uma proteína (TEP-1) é produzida pelos hemócitos e é induzida em resposta à infecção. Em Anopheles também existe evidência direta da ligação da TEP-1 à superfície da bactéria e do envolvimento das TEPs na fagocitose de bactérias Gramnegativas. A origem do Sistema Complemento pode, dessa forma, datar a separação remota dos Bilateria (animais multicelulares diferentes de esponjas e celenterados) em protostomos, que incluem os insetos, e em deuterostomos, que incluem os equinodermos e os cordados (e assim os vetebrados).

8 8 Depois do seu aparecimento inicial, o Sistema Complemento parece ter evoluído pela aquisição de novas vias de ativação, permitindo que as superfícies microbianas fossem marcadas especificamente. O primeiro desses novos sistemas de ativação do complemento a aparecer foi a via da ficolina, que está presente tanto nos vertebrados estreitamente relacionados quanto em alguns invertebrados como os urocordados. As ficolinas estão relacionadas às colectinas, família à qual pertence a lectina que se liga à manose (MBL). Como as colectinas, as ficolinas têm um domínio semelhante ao colágeno e um domínio de ligação a carboidrato e formam uma estrutura multimérica semelhante a um buquê de tulipas. Entretanto, o domínio de ligação a carboidrato das ficolinas não está relacionado às lectinas do tipo C, como em MBL, mas é similar ao fibrinogênio. O domínio de ligação a carboidrato das ficolinas é capaz de ligar a N-acetilglucosamina como as MBL, embora esta última também seja capaz de ligar carboidratos contendo manose, os quais as ficolinas não reconhecem. Evolutivamente, as ficolinas parecem antedatar as colectinas, que foram primeiro vistas nos urocordados. Tanto MBL quanto homólogos do componente C1q da via clássica do complemento, uma outra colectina, foram identificados no genoma de Ciona. Isso sugere que, na evolução da via clássica de ativação do complemento mediada por anticorpos, a molécula ancestral de imunoglobulina, que não apareceu até muito mais tarde na evolução, tomou vantagem de uma família de colectinas já diversificada, mais propriamente do que dirigiu a diversificação de C1q a partir de um ancestral semelhante à MBL. A ativação do complemento por ficolinas e colectinas é mediada por serina proteases chamadas de MASPs (serina proteases associadas à MBL), que são capazes de clivar e ativar C2, C4 e C3. Nos vertebrados, duas MASPs diferentes MASP1 e MASP2 estão associadas às ficolinas e colectinas, o que também parece ser verdadeiro para as ficolinas de invertebrados. Dois homólogos de invertebrados distintos das MASPs de mamíferos foram identificados nas mesmas espécies ascídias a partir das quais as ficolinas foram identificadas. A especificidade das MASPs de invertebrados não foi determinada, mas é provável que elas sejam capazes de clivar e ativar C3. Esse Sistema Complemento da ficolina de invertebrados é funcionalmente idêntico às vias mediadas por ficolina e MBL encontradas nos mamíferos. Assim, o Sistema Complemento mínimo dos equinodermos foi suplementado nos urocordados pelo recrutamento de um sistema de ativação específico, capaz de direcionar a deposição de C3 na superfície de micróbios. O sistema de ativação do complemento evoluiu ainda mais pela diversificação de uma colectina semelhante a C1q e suas MASPs associadas para se tornarem os componentes de iniciação (C1q, C1r e C1s) da via clássica do complemento. Isso somente poderia ocorrer depois da evolução das moléculas específicas de reconhecimento do antígeno do sistema imune adaptativo.