FORMAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PMMA- PRAZIQUANTEL USANDO DIFERENTES TÉCNICAS DE POLIMERIZAÇÃO EM MINIEMULSÃO

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1 FORMAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PMMA- PRAZIQUANTEL USANDO DIFERENTES TÉCNICAS DE POLIMERIZAÇÃO EM MINIEMULSÃO Laís B. da Fonseca 1*, Diego Costa Dominguez 2, Nadia M. Volpato 3, Márcio Nele 4, José Carlos Pinto 1 1 Programa de Engenharia Química/COPPE, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Cidade Universitária, CP:68502, Rio de Janeiro, RJ lfonseca@far.fiocruz.br 2 Fiocruz / Farmanginhos EQFAR 040 Rio de Janeiro-RJ 3 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Faculdade de Farmácia Porto Alegre-RG 4 Departamento de Engenharia Química/Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro O praziquantel (PZQ) é o fármaco utilizado para o tratamento da esquistossomose. O objetivo deste trabalho foi a formação de nanopartículas de poli(metacrilato de metila) e PZQ pela técnica de polimerização em miniemulsão, comparando-se os resultados obtidos em dois equipamentos distintos usados para fazer a emulsificação: um misturador de alto cisalhamento (ultra-turrax) e um homogenizador de alta pressão. As nanopartículas foram caracterizadas por calorimetria diferencial de varredura, cromatografia líquida, espalhamento de luz dinâmico e microscopia eletrônica de varredura. O trabalho mostrou que a incorporação de PZQ nas nanopartículas de PMMA ocorre em todos os casos analisados e indicou que o homogenizador de alta pressão é o equipamento mais indicado para preparação das partículas, por resultar em emulsão mais estável, partículas com faixa estreita de distribuição de tamanhos de partícula e maior taxa de incorporação de PZQ. Palavras-chave: Nanopartículas, praziquantel, miniemulsão, ultra-turrax, homogenizador de alta pressão. Production of nanoparticles of PMMA and praziquantel using different miniemulsion polymerization techniques Praziquantel (PZQ) is the primary drug for treatment of schistosomiasis. The main objective of this work was the preparation of nanoparticles of poly(methyl methacrylate) and PZQ using different miniemulsion polymerization techniques. The efficiencies of two types of emulsifying reactors, a high shear mixer (ultra-turrax) and a high pressure homogenizer, were compared to each other. The obtained nanoparticles were analyzed by differential scanning calorimetry, high pressure liquid chromatography, dynamic light scattering and scanning electron microscopy. The obtained results indicate the successful encapsulation of PZQ into PMMA nanoparticles in all runs. Obtained results also showed that the high pressure homogenizer presents the best performance, leading to formation of stable emulsions, narrower particle size distributions and higher encapsulation efficiency. Keywords: nanoparticles, praziquantel, miniemulsion, ultra-turrax, high-pressure homogenizer. Introdução O praziquantel (PZQ) é o fármaco de escolha no tratamento da esquistossomose, doença que acomete 200 milhões de pessoas no mundo, estando na lista de fármacos essenciais da Organização Mundial da Saúde [1, 2]. A esquistossomose é a segunda maior doença em termos sócio-econômicos e de saúde pública no mundo, sendo superada apenas pela malária [3]. O PZQ apresenta como vantagem um amplo espectro terapêutico, pois atua nas três espécies de Schistossoma nas suas formas adultas e imaturas [4-6]. Nanopartículas poliméricas vêm sendo amplamente estudadas na área de medicamentos, usando como matrizes polímeros biodegradáveis ou não-biodegradáveis. As nanopartículas dividem-se basicamente em nanocápsulas e nanoesferas. Nanoesferas são estruturas matriciais, nas

2 quais os compostos ativos podem estar adsorvidos na superfície, aprisionados ou dissolvidos na matriz. Já as nanocápsulas, por sua vez, apresentam uma capa polimérica e um núcleo interno. Normalmente, as substâncias ativas ficam dissolvidas no núcleo, mas também podem estar adsorvidas na superfície [7,8]. A polimerização em miniemulsão vem sendo amplamente difundida na síntese de nanopartículas. Essa técnica é caracterizada por ocorrer em sistemas heterogêneos, onde as gotas de monômero constituem o locus primário da polimerização e cada gota se comporta como um nanoreator [9]. Assim, na polimerização em miniemulsão o monômero encontra-se pré-disperso em gotas nanométricas ( nm), estabilizado pela combinação de um surfactante e de um coestabilizador, insolúvel em água [9, 10]. Nesta técnica, é necessário um mecanismo eficiente de cisalhamento (homogeneização) para alcançar um estado estacionário, onde é atingido o equilíbrio da taxa de rompimento e coalescência das gotas. As técnicas mais comuns de agitação são ultraturrax, ultrasom e homogenizadores de alta pressão. A polimerização em miniemulsão apresenta como vantagens a alta estabilidade (quando comparada as emulsões clássicas), maior controle do tamanho das partículas e maior reprodutibilidade dos métodos de fabricação, além da preparação de um látex com menor viscosidade [7, 9-12]. Este trabalho tem como objetivo principal a produção de nanopartículas poliméricas de PMMA com PZQ através da técnica de polimerização em miniemulsão, usando para isso diferentes processos de homogeneização: ultra-turrax e homogenizador de alta pressão. Os resultados obtidos são comparados, mostrando que o homogenizador de alta pressão deve ser preferível, por resultar em emulsão mais estável, partículas com faixa estreita de distribuição de tamanhos de partícula e maior taxa de incorporação de PZQ. Experimental Materiais Os materiais empregados nas reações foram: metacrilato de metila (MMA) da Sigma- Aldrich, peróxido dissulfato de potássio da Merck, lauril sulfato de sódio da Proquímios, óleo mineral da Isofar, bicarbonato de sódio da Isofar e praziquantel (doação Farmanguinho). Todos os materiais foram usados como recebidos. A água empregada nas reações foi água destilada.

3 Caracterização da Matéria-prima A matéria-prima de PZQ foi submetida a testes de pureza e de estabilidade térmica. Os testes de pureza foram realizados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) no cromatógrafo Lachrom da Merck, segundo a monografia descrita na Farmacopéia Americana de 2008 [13]. O teste de estabilidade térmica foi realizado pela técnica de termogravimetria (TGA) no equipamento TGA SDTA851e da Mettler Toledo, as amostras foram submetidas a uma faixa de temperatura de 25 a 700ºC com vazão de aquecimento de 10ºC/min. Nestas análises foi utilizado nitrogênio como gás de purga na vazão de 50 ml/min. Teste de Solubilidade O teste de solubilidade do PZQ frente ao monômero MMA foi realizado para avaliar a quantidade de fármaco que poderia ser adicionado às reações. Este ensaio foi realizado em triplicata nas seguintes temperaturas, 25, 37, 55, 75 e 90 C. Foram adicionados 20 ml de monômero volumetricamente em erlenmeyer de 50 ml com tampa, sob agitação magnética. O PZQ foi adicionado até saturação do meio. Após 3 horas, as amostras foram filtradas em membrana de 0,45 µm, diluídas e analisadas por CLAE. As condições cromatográficas foram: coluna C18, (4 mm x 25 cm, 10µm), fase móvel acetonitrila : água (50:50), fluxo de 1,5 ml/min e detector de ultravioleta em 210 nm. Preparação das Nanopartículas As nanopartículas de PMMA com PZQ foram preparadas pela técnica de polimerização em miniemulsão. As reações de polimerização do MMA foram realizadas solubilizando o PZQ no monômero e o óleo mineral (co-estabilizador) com o uso de um agitador magnético. Após essa etapa, adicionou-se a água, o lauril sulfato de sódio (LSS - tensoativo) e o bicarbonato de sódio, ambos previamente diluídos. O sistema ficou sob agitação por 5 minutos. As misturas obtidas eram imediatamente levadas ao ultra-turrax T25 Basic da Ika Labortechnik numa agitação de 9500 min -1 e ao homogeneizador de alta pressão APLAB-10 / Bar da Artepeças, numa pressão de 800 bar onde permaneciam por 10 minutos. A composição das fases é apresentada na Tabela 1. Após a etapa de homogenização, a emulsão era levada ao reator, onde era adicionado o iniciador para iniciar a reação de polimerização. O reator era mantido a 60 C sob agitação de 1000 rpm por 180 minutos. As emulsões obtidas foram posteriormente submetidas ao processo de liofilização para secagem e obtenção das nanopartículas.

4 Tabela 1 Formulações de polimerização em miniemulsão de MMA. Reagentes Composição (g) Ultra-Turrax Homogeneizador de alta pressão MMA PZQ Óleo mineral LSS NaHCO 3 0,3 0,3 0,3 0,3 K 2 S 2 O 8 0,3 0,3 0,3 0,3 Água Caracterização das Nanopartículas As nanopartículas foram caracterizadas quanto à incorporação de PZQ, tipo de associação fármaco nanopartícula, distribuição de tamanhos de partícula e morfologia das partículas produzidas. A taxa de incorporação foi avaliada por HPLC. As amostras foram devidamente diluídas em metanol, usando condições cromatográficas similares às empregadas no teste de solubilidade. A determinação da forma de associação foi realizada por calorimetria diferencial de varredura (DSC), onde as amostras foram submetidas a uma faixa de aquecimento de 25 ª 200 C com vazão de aquecimento de 10ºC/min em cadinho de alumínio com tampa furada. Nitrogênio foi utilizado como gás de purga numa vazão de 80 ml/min, um cadinho de alumínio vazio foi empregado como referência, as análises foram realizadas em equipamento DSC 1822e damettler Toledo. As análises de tamanho de partícula foram realizadas por espalhamento dinâmico de luz em um equipamento Zetasizer Malvern. As emulsões foram diluídas adequadamente em água ultra pura previamente filtrada em membrana de 0,45µm. A análise de morfologia foi realizada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) em equipamento MEV Quanta 200 da FEI Company, o detector empregado foi elétrons secundários (ETD). Resultados e Discussão As análises da qualidade da matéria-prima de PZQ foram satisfatórias, uma vez que o teor de PZQ foi estimado em 100,00% (DPR = 0,98), não havendo detecção de qualquer outra substância durante a análise. O ensaio de TGA (Figura 1) demonstrou que o PZQ tem uma boa estabilidade térmica, sofrendo degradação apenas a temperaturas superiores a 258 C. Essa informação é importante porque mostra que o fármaco em questão não se degrada nas temperaturas usadas para conduzir as reações de polimerização.

5 Signal Value -1,07e-03 L/min at 257,94ºC Figura 1 Termograma do fármaco praziquantel Os resultados do teste de solubilidade foram satisfatórios. Os resultados estão ilustrados na Figura 2. A concentração de saturação do PZQ no monômero a 25 C é de 42,8 mg/ml. Esse ensaio mostra que quantidades expressivas de PZQ podem ser adicionadas ao meio reacional, sem que ocorra precipitação do fármaco. A solubilidade atinge 250 mg/ml nas temperaturas mais elevadas de reação. Solubilidade do PZQ em MMA 300,0 Concentração de saturação (mg/ml) 250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 MMA 0, Temperatura ( C) Figura 2 Gráfico demonstrativo da solubilidade de PZQ em MMA em diferentes temperaturas. As reações de polimerização realizadas sempre levaram à formação de nanopartículas nas diferentes condições analisadas. O processo de secagem por liofilização se mostrou apropriado para a secagem desse tipo de material (Figura 3), permitindo obter um pó fino e seco para a condução das análises. As emulsões formadas no ultra-turrax foram instáveis, ocorrendo a separação de fases em prazo inferior a 24 horas. Por outro lado, as amostras preparadas homogenizador de alta pressão se mostraram altamente estáveis, não sendo observada quebra de estabilidade mesmo após 4 meses

6 de armazenamento. A taxa de encapsulamento foi calculada em percentual peso por peso. Os resultados estão expostos na Tabela 2 e demonstram a presença do PZQ nas nanopartículas. De acordo com os resultados da Tabela 2, observou-se uma maior taxa de incorporação nas amostras preparadas no homogenizador de alta pressão, quando comparadas com amostras de mesma composição submetidas ao ultra-turrax. Tabela 2 Taxa de incorporação de PZQ nas nanopartículas. Resultados Amostras Média (n=3) DPR Homogenizador - PMMA (70:30) 4,42% (p/p) 1,46 Turrax - PMMA (70:30) 2,71% (p/p) 1,14 Homogenizador - PMMA (50:50) 3,55% (p/p) 1,57 Turrax - PMMA (50:50) 2,14% (p/p) 0,48 Figura 3 Amostra liofilizada A determinação da forma de associação fármaco nanopartícula por DSC foi capaz de provar que o PZQ realmente foi incorporado na forma de nanoesferas. A Figura 4 apresenta as curvas do PZQ puro e das misturas físicas (MF) com PMMA, óleo mineral e PMMA com óleo mineral. A Figura apresenta também as curvas de DSC do PMMA (curva 2) e do óleo mineral (curva 3), ambos isolados, e das amostras poliméricas preparadas (curvas 8-11). De acordo com os resultados apresentados nota-se em todas as misturas físicas (curvas 4-6) a transição endotérmica referente a fusão do PZQ, observa-se também que o PMMA, o PMMA com óleo mineral e o óleo mineral sozinho não apresentam eventos endotérmicos na faixa do PZQ. A menor intensidade da faixa de fusão do PZQ ocorre devido à menor massa de fármaco presente e o deslocamento da mesma é normal por se tratar de uma mistura. As curvas das nanopartículas preparadas (8-11) não apresentam a transição endotérmica característica do PZQ, esse ensaio demonstra que o PZQ não está presente como uma fase distinta, mas como uma solução diluída na matriz polimérica provando a incorporação do mesmo

7 ^exo tmp praziquantel : PMMA - DSC :52:37 Module: DSC822e/700/951/FRS5, :47:00 Sample Holder: Aluminum Standard 40ul Method: Dyn @10 - N2=80mL dt 1,00 s 25,0-200,0 C 10,00 C/min, N2 80,0 ml/min Synchronization enabled (1) Sample: Sample: PZQ praziquantel - T FG N2, 3,0400 mg Sample: PMMA - TFG N2, 3,1800 mg (2) Sample: PMMA (3) Sample: óleo vaselina mineral - TFG N2, 3, 1900 mg (4) Sample: MF MF PZQ:PMMA prazi : PMM A (50:50)-TFG N2, 3,1800 mg 5 Wg^-1 (5) Sample: Sample: MF MF PZQ:óleo prazi : vaselina mineral (50:50)-TFG N2, 3,1800 mg (6) Sample: Sample: MF MF PZQ:PMMA prazi : PMM A+vaselina com óleo (50:50)-T mineral FG N2, 3,3400 mg (7) Sample: PMMA PMMA+vaselina com óleo (branco)-tfg mineral (branco) N2, 3,2700 mg (8) Sample: Sample: Nanopartículas PMMA (50:50) homogeneizador - TFG (50:50) N2, 3,3600 mg Sample: PMM A (50:50) turrax - TFG N2, 3,0700 mg (9) Sample: Nanopartículas ultra-turrax (50:50) (10) Sample: Sample: Nanopartículas PMM A (70:30) homogeneizador turrax - TFG N2, 3,2300 (70:30) mg (11) Sample: Sample: Nanopartículas PMM A (70:30) ultra-turrax turrax EtOH - (70:30) TFG N2, 3,1700 mg C min FIOCRUZ:CTM:PMA: LEES S TAR e S W 9.10 Figura 4 Resultados da análises de DSC; (1) PZQ; (2) PMMA; (3) óleo mineral; (4) MF PZQ:PMMA; (5) MF PZQ: óleo mineral; (6) PZQ:PMMA com óleo mineral; (7) PMMA com óleo mineral ; (8) nanopartículas homogeneizador (50:50); (9) nanopartículas ultra-turrax (50:50); (10) nanopartículas homogeneizador (70:30); (11) nanopartículas ultra-turrax (70:30) As análises de tamanhos de partícula das amostras preparadas com o homogenizador estão ilustradas nas Figuras 5 e 6, enquanto as análises das amostras preparadas com o ultra-turrax estão apresentadas na Figura 7. O diâmetro médio (Dm) das partículas obtidas no homogenizador é de aproximadamente 80 nm. Essas amostras apresentam uma faixa homogênea de tamanhos, apresentando uma distribuição unimodal. Entretanto, as amostras do ultra-turrax apresentaram Dm de 760 nm e uma faixa de distribuição granulométrica bem ampla e bimodal, com diâmetros variando na faixa entre 30 nm a 2000 nm. Figura 5 Distribuição granulométrica amostra Homogeneizador (50:50) Figura 6 - Distribuição granulométrica amostra Homogeneizador (70:30)

8 Figura 7 - Distribuição granulométrica amostra Ultra-turrax (50:50) As análises de MEV são apresentadas nas Figuras 9 e 10. Conforme pode ser observado, as nanopartículas apresentaram morfologia esférica. Entretanto, foi possível observar que o processo de secagem ocasiona uma compactação das partículas, o que não é desejado. Esse aspecto do processamento será investigado com maior detalhe no futuro próximo. Figura 9 Microscopia, (A) Amostras Homogeneizador (50:50); (B) Amostras Homogeneizador (70:30) Figura 10 Microscopia, (A) Amostras Ultra-turrax (50:50); (B) Amostras Ultra-turrax (70:30)

9 A relação monômero:óleo mineral num primeiro momento e de acordo com os resultados aqui expostos não apresentou diferenças significativas, porém as nanopatículas ao serem trituradas manualmente em gral com pistilo, as amostras, tanto do ultra-turrax como as do homogeneizador, na proporção 50:50 (MMA:óleo) apresentaram baixíssima resistência mecânica formando um filme já nas amostras com proporção MMA:óleo (70:30), esse fato não ocorreu. Conclusões No presente estudo, nanopartículas de PMMA contendo PZQ foram preparadas pela técnica de miniemulsão em ultra-turrax e em homogenizador de alta pressão. Em todos os casos, obteve-se incorporação de PZQ e produção de nanoesferas poliméricas impregnadas com PZQ. O desempenho obtido a partir dos ensaios realizados com o homogenizador foi muito melhor que no ultra-turrax, resultando em emulsões mais estáveis, distribuições de tamanhos de partícula mais homogêneas e maior incorporação de fármaco. Agradecimentos Os autores agradecem ao CNPq pelo apoio financeiro e pelas bolsas de estudo. A Farmanguinhos pela doação de matéria-prima e realização das análises de DSC, TGA e CLAE. Referências Bibliográficas 1. L. Chitsulo; D. Engels; A. Montresor; L. Savioli Acta Tropica. 2000, 77, M. Lindenberg; S. Kopp; J. B. Dressman European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2004, 58, World Health Organization. Preventive chemotherapy in human helminthiasis. 2006,1. 4. A. Harder Parasitol. Res. 2002, 88, Z. Xiaonong; C. Minggag; D. Mcmanus; R. Bergquist Acta Tropica. 2001, 82, S.C. Mourão; P.I. Costa; H.R.N. Salgado; M.P.D. Gremião International Journal of Pharmaceutics. 2005, 295, C. Vauthier; K. Bouchemal Pharmaceutical Research F. Kesisoglou; S. Panmai; Y. Wu. Advanced Drug Delivery Reviews. 2007, 59, M. Antonietti; K. Landfester Progress in Polymer Science. 2002, 27, J.M. Asua Progress in Polymer Science. 2002, 27, A. López; A. Chemtob; J.L. Milton; M. Manea; M. Paulis; M.J. Barandiaran; S. Theisinger; K. Landfester; W.D. Hergeth; R. Udagama; T. McKenna; F. Simal; J. M. Asua Ind. Eng. Chem. Res. 2008, 47, P. H. H. Araújo, Tese de Doutorado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, United States Pharmacopeia 31. ed. Rockville: United States Pharmacopeial Convention,