ANATOMIA DA FERRUGEM ASIÁTICA DA SOJA EM DIFERENTES PATOSSISTEMAS

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1 ANATOMIA DA FERRUGEM ASIÁTICA DA SOJA EM DIFERENTES PATOSSISTEMAS 1 Henrique Spaulonci Silveira (PIBIC/Fundação Araucária), 1 Gabriela Rastelli Bermejo, 1 Heloisa Cerri de Soza,, 1 Fernada Machado Castanho, 1 Larissa de Assis Carretts. 1 Profa Dra. Mayra Costa da Cruz Gallo de Carvalho (Orientadora), hspaulonci@gmail.com. Universidade Estadual do Norte do Paraná/Campus Luiz Meneghel Botânica Anatomia Vegetal Palavras-chave: FAS, morfologia, anatomia. Resumo O fungo causador da ferrugem asiática da soja (FAS), Phakopsora pachyrhizi Syd. & P. Syd., é um fungo biotrófico obrigatório. Sua penetração no hospedeiro ocorre em dois momentos, um inicial onde a folha é invadida e um mais tardio onde o ambiente intracelular do mesofilo é ocupado e a fase biotrófica estabelecida. Os uredósporos do P. pachyrhizi são dispersos pelo vento e germinam em condições apropriadas sobre a superfície adaxial das folhas. Os eventos chave no processo de infecção da FAS são: formação do apressório, desenvolvimento da hifa de penetração, formação do haustório e esporulação. O apressório é formado cerca de 2-5hrs após a inoculação, em 7-12hrs a hifa de penetração, e em 24-48hrs haustórios são observados. Novos uredósporos são produzidos sete a dez dias após a inoculação e sua produção pode ser observada por até três semanas. Em genótipos suscetíveis este ciclo de infecção pode se manter por várias semanas, mas em genótipos resistentes é possível observar pouca ou até nenhuma esporulação. Parece claro que as alterações morfológicas ou grandes alterações são cruciais no estabelecimento da doença. Importantes trabalhos nesse sentido foram conduzidos sobre a caracterização inicial da infecção, e demonstraram haver diferenças morfológicas importantes quando considera-se a inoculação do fungo sobre diferentes genótipos de soja. Estes resultados sugerem que a interação molecular entre os genótipos em cada patossistema pode ser mensurada através da observação morfológica. Introdução O estabelecimento do patógeno em uma planta hospedeira depende de uma intrincada rede de interações entre moléculas do patógeno e da planta que culminam em alterações morfológicas em ambos, as quais, dependendo dos genótipos envolvidos, poderão culminar ou não no desenvolvimento da doença. O fungo causador da ferrugem asiática da soja (FAS), Phakopsora pachyrhizi Syd. & P. Syd., é um fungo biotrófico obrigatório, ou seja, sua penetração no hospedeiro ocorre em dois momentos, um inicial onde a folha é invadida e um mais tardio onde o ambiente intracelular do mesofilo é ocupado e a fase biotrófica estabelecida. Os uredósporos do P. pachyrhizi são dispersos pelo vento e germinam em condições apropriadas sobre a superfície adaxial das folhas. Os eventos chave no processo de infecção da FAS são: formação do apressório, desenvolvimento da hifa de penetração, formação do haustório e esporulação. Tais eventos ocorrem rapidamente, em cerca de sete dias após a inoculação. O apressório é formado cerca de 2-5hrs após a inoculação, em 7-12hrs a hifa de penetração alcança o mesofilo, e em 24-48hrs haustórios já podem ser observados. Novos uredósporos são produzidos sete a dez dias após a inoculação e sua produção pode ser observada por até três semanas.

2 Em genótipos suscetíveis este ciclo de infecção pode se manter por várias semanas, mas em genótipos resistentes é possível observar pouca, nas plantas resistentes, ou até nenhuma esporulação, nas imunes. Parece claro que as alterações morfológicas ou grandes alterações são cruciais no estabelecimento da doença e, no entanto, impressiona a pequena quantidade de informação disponível na literatura sobre os eventos morfológicos que desencadeiam a infecção da soja pelo fungo P. pachyrhizi. Importantes trabalhos nesse sentido foram conduzidos sobre a caracterização inicial da infecção, e que demonstraram haver diferenças morfológicas importantes quando considera-se a inoculação do fungo sobre diferentes genótipos de soja. Estes resultados sugerem que a interação molecular entre os genótipos em cada patossistema (soja x fungo) pode ser de alguma forma mensurada através da observação morfológica. Nesse sentido, pretendemos com este projeto avaliar as características morfológicas microscópicas da interação soja- P. pachyrhizi partindo de uma população de esporos coletados em Londrina na safra de 2014, e diferentes genótipos de soja. Material e métodos Avaliação Morfo-anatômica: Para avaliar a reação dos genótipos de soja aos esporos de P. pachyrhizi, 4 genótipos foram selecionados como diferenciadores (Quadro 1). A seleção do conjunto de diferenciadoras foi baseada no conhecimento prévio da presença de pelo menos um dos genes de resistência à ferrugem da soja já mapeados Rpp1 (Hartwig e Bromfield, 1983), Rpp1b (Kim et al., 2012), Rpp2 (Hartwig e Bromfield, 1983) Rpp3 (Hartwig e Bromfield, 1983), Rpp4 (Hartwig, 1986), Rpp5 (Garcia et al., 2008) e Rpp6 (Li et al., 2012). O experimento foi desenvolvido utilizando a técnica de folhas destacadas em placa de petri. Para tanto, coletou-se folhas dos diferentes genótipos, as quais foram lavadas em água destilada por uma hora e cultivadas em meio ágar-água a 1% em câmara de crescimento com temperatura controlada em 22 e fotoperíodo de 18 horas. Para facilitar as análises microscópicas das folhas destacadas em placa de petri, foram desenhados quadrados de 1cm de lado com uma caneta de marca permanente na face abaxial dos folíolos a serem inoculados. No centro de cada um foi realizada a inoculação com uma suspensão de urediniósporos de P. pachyrhizi ajustada para uma concetração de 5,5 x 10-3 esporos/ml. As coletas foram realizadas 6, 12, 24 e 48 horas após a inoculação com auxílio de um bisturi. Cada segmento cortado foi fixado em solução fixativa de FAA. Para a determinação do número de urediniósporos germinados e apressórios formados foi utilizada a técnica de clareamento descrita por Ryan & Clare (1974) e modificada por Magnani ET AL. (2007). As amostras foram submetidas ao clareamento, em uma mistura de ácido acético 100% e etanol absoluto (1:1, v/v) por 48 horas. Após esse período, os segmentos foliares foram colocados em lâminas para microscopia, corados com azul de algodão e observados em microscópio de luz. Os registros anatômicos foram efetuados com o auxílio de ocular micrometrada e Sistema MOTIC de captura de imagens. Quadro 1 Quatro genótipos de diferenciadoras de soja, com seus respectivos genes de resistência, utilizadas para a avaliação da patogenicidade de P. pachyrhizi. Genótipos Gene Referência PI Rpp1b Kim et al. (2012) BRS231 PI Kinoshita Suscetível Rpp1 Rpp5 Kato e Yorinori (2008) Hartwig e Bromfield (1983) Yamanaka et al. (2013) Análises estatísticas O experimento foi conduzido em um modelo inteiramente casualizado com 4 genótipos de soja x 1 população de esporos x 4 tempos de coleta (16 tratamentos) x 3 plantas por genótipo x 4

3 epetições.os dados foram estatisticamente avaliados (ANOVA), pelo coeficiente de variação e teste de médias de tukey ao nível 5%. Resultados e Discussão Após uma análise dos dados obtidos foi possível observar que para apenas um dos parâmetros avaliados, a taxa de germinação (Tabela 1), é necessário o emprego de um número maior de repetições no sentido de reduzir o coeficiente de variação que neste caso foi superior a 30, enquanto nos demais casos, o coeficiente de variação não atingiu 12%. Com relação a formação do apressório (Figura 2) foi possível observar que existem diferenças significativas no tempo necessário para o desenvolvimento do apressório e não na habilidade de desenvolvê-lo, sendo que na cultivar BRS231, como esperado, observa-se o desenvolvimento maior de apressórios em 6 horas pós-inoculação. No tempo de 12 horas não existe uma variação significativa na formação do apressório. Em relação às medidas dos tubos germinativos (Figura3) houve diferenças significativas entre os 4 genótipos de soja sendo que, no genótipo BRS231, que não é resistente ao patógeno, o tamanho desse tubo em média foi o menor encontrado dentre os demais. Segundo a análise dos dados obtidos foi possível observar que a PI (Rpp1) apresentou a maior resistência à infecção dentre os genótipos de soja quando foi analisada a taxa de germinação do fungo, a formação do apressorio no qual a PI obteve a menor formação dentre os demais genótipos e quantidade de esporos encontrados por amostra (Figura 1). Tais resultados corroboram aos previamente encontrados por Magnani et al. (2007) ao passo que comprova haver diferenças importantes na morfologia da infecção com a FAS quando considera-se diferentes genótipos de soja. Ainda, segundo os dados apresentados no Jircas Newsletter (2014) os genes Rpp1 e Rpp5 mostraram-se mais eficientes na promoção da resistência contra isolados Sul Americanos coletados de 2007 a 2010 no Brasil e Paraguai o que também corrobora com os resultados aqui obtidos. Além disso, o desenvolvimento de grandes tubos germinativos também está relacionado a resposta de genótipos resistentes ou mais tolerantes a FAS, acredita-se que esta observação esteja relacionada a dificuldade que o fungo encontra nessas plantas, para a penetração (Bonde et al., 1976). Tabela 1: Germinação dos esporos de diferentes genótipos de soja: dois tempos (6 e 12 horas) Germinação dos esporos 6 Horas 12 horas Brs 98.12% 99.1% Kinoshita 95.28% 94.29% PI % 94.57% PI % 93.34% Figura 1: Número total de esporos encontrados nas amostras recolhidas em diferentes genótipos de soja, em dois tempos s de coleta das amostras, Bandeirantes, 2015.

4 Figura 2: Número total de esporos que apresentaram formação do apressório nos diferentes genótipos de soja em dois tempos de coleta de amostras, Bandeirantes, Figura 3: Medida do tubo germinativo em diferentes genótipos de soja em dois tempos de coleta das amostras, Bandeirantes, Conclusões As características microscópicas do processo de infecção da FAS variam em função do patossistema estabelecido, uma vez que diferentes genótipos de soja inoculados com o mesmo inóculo do fungo apresentam diferenças importantes no processo de infecção. Os tubos germinativos são mais curtos na cultivar suscetível a FAS, onde os apressórios já são observados em grande quantidade com apenas 6 horas pós-inoculação. Já nos genótipos resistentes, os tubos germinativos permanecem em crescimento por um período maior o que resulta em tubos maiores e em um atraso na formação dos apressórios. E possível ainda perceber que os genótipos da soja que possuem a resistência a ferrugem asiática possuem genes de resistência distintos e existe uma influencia dos mesmos nos resultados obtidos. Estamos agora reproduzindo o experimento para checar diferenças macroscópicas no processo como a lesão foliar e nível de esporulação para saber se os resultados aqui demonstrados indicam que no campo a diferença entre tais genótipos de daria apenas em função do tempo necessário para o estabelecimento da infecção ou se os genótipos introduzidos de soja portadores dos genes de resistência ainda são capazes de promover alguma resistência a FAS. Será também interessante observar se quando inoculados outros genótipos de isolados do fungo nas mesmas diferenciadoras, haverá ou não diferenças no desenvolvimento do fungo nos diferentes patossistemas.

5 Agradecimentos Primeiramente à Fundação Araucária que tornou possível a realização desse projeto. Á UENP/Campus Luiz Meneghel que deu todo o suporte técnico e estrutural para que fosse possível realizar todas as análises. Agradeço e a minha orientadora Profa. Dra. Mayra Costa da Cruz Gallo de Carvalho que me auxiliou desde o início e se fez sempre presente durante a pesquisa. Referências BEDENDO, I. P. Manual de Fitopatologia: Principios e conceitos. 3. Ed. São Paulo. Editora Agronomica Ceres Ltda, v. 1, p , BONDE, M.R., MELCHING, J.S. & BROMFIELD, K.R. Histology of the suscept-pathogen relationship between Glycine max and Phakopsora pachyrhizi the cause of soybean rust. Phytopathology 66: BONDE, M.R.; NESTER, S.E.; AUSTIN, C.N.; STONE, C.L.; FREDERICK, R.D.; HARTMAN, G.L.; MILES, M.R. Evaluation of virulence of Phakopsora pachyrhizi and P. meibomiae isolates. Plant Disease, 90: , DARBEN, L.M Obtenção e caracterização molecular e fenotípica de isolados monourediniais de Phakopsora pachyrhizi coletados em diferentes regiões do Brasil. Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento da Universidade Estadual de Maringá. pp. 81. GARCIA, A.; CALVO, E.S.; SOUZA KIIHL, R.A.; HARADA, A.; HIROMOTO, D.M.; VIEIRA,L.G. Molecular mapping of soybean rust (Phakopsora pachyrhizi) resistance genes: discovery of a novel locus and alleles. Theoretical and Applied Genetics, 117: , GOELLNER, K.; LOEHRER, M.; LANGENBACH, C.; CONRATH, U.; KOCH, E.; SCHAFFRATH, U. Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of Asian soybean rust. Molecular Plant Pathology, 11: , HARTWIG, E.E.; BROMFIELD, K.R. Relationships among three genes conferring specific resistance to rust in soybeans. Crop Science, 23: , HARTWIG, E.E. Identification of a fourth major gene conferring resistance to soybean rust. Crop Science, 26: , KIM, K.S.; UNFRIED, J.R.; HYTEN, D.L.; FREDERICK, R.D.; HARTMAN, G.L.; NELSON, R.L.; SONG, Q.; DIERS, B.W. Molecular mapping of soybean rust resistance in soybean accession PI and NSP haplotype analysis of the Rpp1 region in diverse germplasm. Theoretical and Applied Genetics, 125: , KOCH, E.; EBRAHIN-NESBAT, F.; HOPPE, H.H. Light and electron microscopic studies on the development of soybean rust (Phakopsora pachyrhizi Syd.) in susceptible soybean leaves. Journal of Phytopathology, 106: , KOLMER J.A.; Ordonez M.E.; Groth J.V. The Rust Fungi. Chichester: John Wiley & Sons, Ltd; LI, S.; SMITH, J.R; RAY, J.D.; FREDERICK, R.D. Identification of a new soybean rust resistance gene in PI567102B. Theoretical Applied Genetics, 125: , MAGNANI, E.B.Z.; ALVES, E.; ARAÚJO, D.V. Eventos dos processos de pré penetração, penetração e colonização de Phakopsora pachyrhizi em folíolos de Soja. Fitopatologia Brasileira, 32: , MARCHETTI, M.A.; UECKER, F.A.; BROMFIELD, K.R. Uredial development of Phakopsora pachyrhizi in soybean. Phytopathology, 65: , RYAN, C.C. & CLARE, B.G. Coating of leaf surfaces with agarose to retain fungal inoculum in situ for staining. Stain Technology 49: JIRCAS NEWSLETTER MAY 2015 NO.71. Japan international center of agricultural sciences. Disponível em:< acesso em: 15 de julho de 2015.