Vacinas de DNA contra dengue combinadas a outras estratégias. Ada M. B. Alves (ada@ioc.fiocruz.br)
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- Manuel Camelo Faro
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1 Vacinas de DNA contra dengue combinadas a outras estratégias Ada M. B. Alves (ada@ioc.fiocruz.br)
2 DENGUE Hospedeiro invertebrado - mosquito Aedes Hospedeiro vertebrado - humanos Vírus: Arbovírus Família Flaviviridae Quatro Sorotipos: DENV1, DENV2, DENV3, DENV4
3 Países/áreas de risco de transmissão de dengue
4 DF DHF San Martin et al. Am J Trop Med Hyg (1):128-35
5 Susceptibilidade e Imunidade - Imunidade permanente para o mesmo sorotipo - Imunidade temporária para outro sorotipo
6 O VÍRUS DA DENGUE Modelo esquemático M E C RNA Modificado de Lindenbach & Rice 2001 RNA
7 INFECÇÃO VIRAL Célula infectada Lindenbach & Rice 2001
8 VÍRUS DA DENGUE
9 Vacinas de subunidades: E Vacinas contra dengue Maior dificuldade: Vacina contra os 4 sorotipos - Proteína E dos 4 sorotipos (produzida em células de Drosófila) - Hawaii Biotechnology/Merck (ensaios clínicos) - Baixa imunogenicidade (necessidade de várias doses), adjuvantes Vacinas inativadas: - Vírus produzido em cultura de células e inativados (GSK) - Baixa imunogenicidade (adjuvantes) Vacinas atenuadas: Obtidas por passagens em cultura de células (de macaco e cachorro) Problemas: - Conseguir uma dose ideal com diferentes concentrações dos diversos sorotipos - Walter Reed Army Institute / GSK ensaios clínicos Fase II
10 Vacinas com Vírus Quiméricos: - Vírus vacinal da Febre Amarela com alguns genes dos vírus da dengue (BioManguinhos testes em primatas; Sanofi-Pasteur ensaios clínicos Fase III) - Vírus DENV4 atenuado (DEN4 30) contendo genes dos outros sorotipos (NIH ensaios clínicos) - Vírus DENV2 atenuado contendo genes dos outros sorotipos (Inviragen ensaios clínicos Fase I) Vacinas de DNA: - Proteínas prm/e (Navel Medical Research Center, USA ensaios clínicos Fase I) - Proteína C - Proteína NS1 - Proteína NS3
11 Vacinas de DNA contra dengue
12 Proteína E e prm/m Anticorpos Neutralizantes
13 Proteína do Envelope Modis et al., 2003 Protein E: três domínios (I, II and III); Domínio III - Interação com receptores presentes na superfície das células hospedeiras (internalização do vírus); - Anticorpos neutralizantes.
14 Construções plasmidiais 80% Envelope Protein (pe1d2) amino acids stem-anchor region 493 Domain I Domain II Domain III (pe2d2) pe1d2 t-pa E80% pe2d2 t-pa E Dom III
15 Expressão in vitro das proteínas recombinantes (células BHK) Imunofluorescência pe1d2 pe2d2 pctpa Marcação metabólica e imunoprecipitação (sobrenadante das culturas) KDa pe1d2 pe2d2 pctpa Azevedo et al., Plos One 2011, 6: e20528
16 TESTES DE DESAFIO Inoculação por via intracerebral (i.c.) de DENV-2 neuroadaptado a camundongos
17 % of Survival Imunicação (i.m.) de camundongos Balb/c e desafio (i.c.) com DENV-2 Sobrevivência pe1d2 pe2d2 pctpa DENV Days after challenge Azevedo et al., Plos One 2011, 6: e20528
18 % of Morbidity Degree of Morbidity Morbidade (Paralisia dos membros posteriores e comprometimento da coluna vertebral) ** *** * 100 pe1d2 + DENV pe2d2 + DENV-2 pctpa + DENV-2 DENV Days after Challenge 0 pe1d2 pe2d2 pctpa DENV-2 Azevedo et al., Plos One 2011, 6: e20528
19 (PRNT 50 titer) Anticorpos neutralizantes contra DENV ** pe1d2 * pe2d2 pe1d2 after challenge pe2d2 after challenge Azevedo et al., Plos One 2011, 6: e20528
20 Imunizações Combinadas Vacina de DNA + Vírus Quimérico YF17D-D2 17DD2 C prm E NS1 NS2a NS2b NS3 NS4a NS4b NS5
21 Vacina Tetravalente (CYD) Sanofi Pateur Cerca de crianças na Tailândia (4-11 anos) Três doses (0, 6 e 12 meses) Acompanhamento 25 meses
22 Casos de dengue Anticorpos Neutralizantes Sabchareon et al Lancet 380:
23 Imunizações Combinadas Vacina de DNA + Vírus Quimérico YF17D-D2 17DD2 C prm E NS1 NS2a NS2b NS3 NS4a NS4b NS5
24 Desafio com DENV2 pe1d2 + 17DD2 Dose / Reforço (prime/boost) Azevedo et al Plos One 8: e58357
25 Desafio com DENV2 pe1d2 + 17DD2 Imunização Simultânea (mix) Azevedo et al Plos One 8: e58357
26 Anticorpos neutralizantes Dose / Reforço Imunziação Simultânea
27 Elispot IFN-g Azevedo et al Plos One 8: e58357
28
29 Proteína NS1
30 Altamente imunogênica: pacientes convalescentes apresentam altos níveis de anticorpos contra NS1 Anticorpos com fixação de complemento, lise de células infectadas Sem o risco de ADE Proteção Resposta imune de células citotóxicas T CD8+ Patogênese Ativação do complemento aumento da permeabilidade vascular (DHF/DSS) Anticorpos que reagem com proteínas do organismo (fibrinogênio, trombócitos, células endoteliais)
31 Vacinas de DNA com o gene que codifica a NS1 de DENV-2 pctpans1anc t-pa NS1 ANC pctpans1 t-pa NS1 C prm E NS1 NS2a NS2b NS3 NS4a NS4b NS5 5 3 pcens1 E NS1 pcens1anc E NS1 ANC
32 Western Blot Extrato celulares Sobrenadantes das culturas kda kda Costa et al., Virology 358: , 2007
33 Titers Especificidade dos anticorpos anti-ns pctpans1 / intact NS1 pctpans1 / denatured NS1 pcens1 / intact NS1 pcens1 / denatured NS Weeks Costa et al., Virology 358: , 2007
34 Produção de IFN-g (Elispot)
35 Desafio I com DENV-2 Inoculação por via intracerebral (i.c.) de DENV-2 neuroadaptado a camundongos
36 % of Morbidity % of Survival % of Morbidity % of Survival pctpans1 (a) pctpans1 + DENV-2 pctpa + DENV-2 DENV-2 (b) pctpans1 + DENV-2 pctpa + DENV-2 DENV Days Days pcens1 (c) pcens1 + DENV-2 pcdna3 + DENV-2 DENV-2 (d) pcens1 + DENV-2 pcdna3 + DENV-2 DENV Days Days Costa et al., Virology 358: , 2007
37 Desafio II com DENV-2 Inoculação por via i.p. ou i.v. de DENV-2 isolado de um paciente no Rio de Janeiro e não adaptado a camundongos
38 Histopatologia (fígado) Paes et al., Laboratory Investigation 89: , 2009
39 Níveis séricos de enzimas hepáticas (ALT e AST) Paes et al., Laboratory Investigation 89: , 2009
40 % hemorragia Imunização com pctpans1 ou pcens1 e quantificação das alterações hepáticas Hemoragia 1.2 * pctpans1 pcens1 pcdna3 DENV2 GL 200x Costa et al., to be submited
41 Tumefação Esteatose 5 * 4 *** ** 5 * 4 ** pctpans1 pcens1 pcdna3 DENV2 0 pctpans1 pcens1 pcdna3 DENV2 HE 200x HE 400x Costa et al., to be submited
42 U/L U/L ALT AST Non-infected pctpans1 pcens1 pcdna3 DENV2 0 Non-infected pctpans1 pcens1 pcdna3 DENV Plaquetas / mm Non-infected pctpans1 pcens1 pcdna3 DENV2 Costa et al., to be submited
43 Lab. Biotecnologia e Fisiologia de Infecções Virais Ada M. B. Alves Simone M. Costa, PhD Antônio J.S. Gonçalves, PhD Marciano V. Paes, PhD Adriana S. Azevedo, PhD Ana Cristina Nogueira, PhD Edson R.A. de Oliveira, PhD student Márcio M. Barradas, M.Sc Kíssela Rabelo, M.Sc student Juliana F.A. da Silva, M.Sc student Paolla Beatriz A. Pinto, graduate student Eduardo R.P. Veltri, graduate student Rafael L.C. Silva, graduate student
44 COLABORATIONS BioManguinhos/ FIOCRUZ, Brazil Dr. Ricardo Galler Dr. Marcos S. Freire IOC/FIOCRUZ, Brazil Dra. Cecília J. Almeida UFRJ Dr. Ronaldo Mohana Borges Hospital Gafrée Guinle/UNIRIO Brazil Dr. Carlos Alberto Basílio de Oliveira USP, Brazil Dr. Luis Carlos S. Ferreira Dra. Silvia Boscardin Ohio State University Medical Center, USA Dr. Gerard J. Nuovo
45 Financial Support FIOCRUZ PDTIS PRONEX - DENGUE
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