AVALIAÇÃO DE HIDROCARBONETOS EM AMOSTRAS DE SEDIMENTOS E ÁGUA NA RESERVA BIOLÓGICA MARINHA DO ARVOREDO E ENTORNO, SC

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS FÍSICAS E MATEMÁTICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA AVALIAÇÃO DE HIDROCARBONETOS EM AMOSTRAS DE SEDIMENTOS E ÁGUA NA RESERVA BIOLÓGICA MARINHA DO ARVOREDO E ENTORNO, SC Pedro Vieira Neto de Rolan Teixeira Florianópolis Novembro/2014

2 Pedro Vieira Neto de Rolan Teixeira AVALIAÇÃO DE HIDROCARBONETOS EM AMOSTRAS DE SEDIMENTOS E ÁGUA NA RESERVA BIOLÓGICA MARINHA DO ARVOREDO E ENTORNO, SC Relatório apresentado ao Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial da disciplina de Estágio Supervisionado II (QMC 5512) Orientador: Luiz Augusto dos Santos Madureira Florianópolis Novembro/2014

3 AVALIAÇÃO DE HIDROCARBONETOS EM AMOSTRAS DE SEDIMENTOS E ÁGUA NA RESERVA BIOLÓGICA MARINHA DO ARVOREDO E ENTORNO, SC Prof. Dr. Luiz Augusto dos Santos Madureira Coordenador de Estágio do Curso de Química-Bacharelado Banca Examinadora: Prof. Dr. Luiz Augusto dos Santos Madureira Orientador Dr. Eduardo Zapp Prof. Dr. Dilson Roque Zanette Florianópolis Novembro/2014

4 Dedico este trabalho aos meus pais.

5 Agradecimentos Em primeiro lugar, agradeço à minha família por todo o apoio e carinho. A todos os professores que passaram pela minha graduação, em especial ao professor Santiago Yunes. Ao meu orientador, Prof. Dr. Luiz Augusto dos Santos Madureira, pela paciência, pelo conhecimento transmitido e pela oportunidade de iniciar na pesquisa. Muito obrigado. À Morgana Frena pelas horas de ajuda, muita paciência e ensinamentos, sou muito grato. A todos os colegas do LQAG e do LARES, Martinho Rau, Vânia, Michele, Mayara, Maira, Guilherme, Rosito, Milena, Marina e Jéssica por suas contribuições, apoio e incentivo. Aos amigos de fiz durante o curso, Luciano Portz, Felipe Schneider, William Milani, Igor Nunes, Nathan Adílio e a todos os amigos que fizeram esses anos passarem rápido. Sentirei saudades. À Fernanda Alves pelo companheirismo, carinho e ajuda para enfrentar os momentos difíceis com mais alegria. A UFSC, CNPq, CAPES e FAPEU pelo amparo financeiro.

6 Os dados [Parte dos dados] e/ou imagens apresentados neste trabalho foram obtidos no âmbito do Projeto MAArE. A realização do projeto MAArE é uma condicionante indicada pelo ICMBio no âmbito do processo de licenciamento ambiental do IBAMA. The data and/or images included in this work were obtained within the framework of the Monitoramento Ambiental do Arvoredo e Entorno (MAArE) Project. The carrying out of the project MAArE is a condition set by the ICMBio in the context of IBAMA s environmental licensing process.

7 SUMÁRIO 1 Introdução Revisão da Literatura Reserva Biológica Marinha do Arvoredo Geoquímica Orgânica Biomarcadores Geoquímicos Hidrocarbonetos Alifáticos n-alcanos Esteróis Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos Cromatografia à Gás GC-FID GC-MS Objetivos Objetivo Geral Objetivos específicos Metodologia Amostragem Equipamentos e Reagentes Equipamentos Reagentes Limpeza da Vidraria Extrações Amostras de água... 28

8 4.4.2 Amostras de sedimento Ativação do cobre Extração Fracionamento por cromatografia líquida em coluna Silanização Análise, quantificação e identificação Resultados e Discussão Hidrocarbonetos Alifáticos Esteróis Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos Conclusão Referências... 42

9 5 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Localização da Reserva Biológica Marinha do Arvoredo e Áreas Costeiras Adjacentes, Estado de Santa Catarina, Brasil...9 FIGURA 2. Cromatograma parcial de uma amostra típica não contaminada por derivados de petróleo, ilustrando a predominância de n-alcanos ímpares sobre pares...12 FIGURA 3. Cromatograma com uma elevação da linha base, linha tracejada, devido a uma UCM...14 FIGURA 4. Estrutura química geral dos esteróis com a respectiva numeração dos carbonos...15 FIGURA 5. Conversão em três estágios do colesterol (I) para o coprostanol (IV), tendo como intermediários a colestenona (II) e a coprostanona (III)...16 FIGURA 6. Lista dos 16 HPA prioritários segundo a USEPA...18 FIGURA 7. Imagem da área de estudo e todos os pontos de coleta...22 FIGURA 8. Gráfico de superfície para os valores de TPH em amostras de água coletadas no verão...32 FIGURA 9. Gráfico de superfície para os valores de TPH em amostras de sedimento coletadas no verão...33 FIGURA 10. Gráfico de superfície para os valores de TPH em amostras de água coletadas no inverno...34 FIGURA 11. Cromatograma da amostra de água P4 coletada no verão, ilustrando a formação de uma UCM...36

10 6 FIGURA 12. Gráfico de superfície para os valores da razão de IPC para todas as amostras coletadas, valores próximos a 1 indicam contaminação por petróleo e valores acima de 1 indicam origem biogênica da matéria orgânica...38 FIGURA 13. Gráfico de superfície para os valores da razão FLUO/PIR para todas as amostras coletadas...39 LISTA DE TABELAS TABELA 1: Posição geográfica das amostras coletadas no RBMA durante a campanha de verão...24 TABELA 2: Posição geográfica das amostras coletadas no RBMA durante a campanha de inverno...25 TABELA 3: Equipamentos utilizados, seus fabricantes e seu modelo...26 TABELA 4: Reagentes e solventes utilizados, seus fabricantes e sua pureza...27 TABELA 5: Condições cromatográficas usadas no GC- FID...31 TABELA 6: Condições cromatográficas empregadas no GC- MS...32 TABELA 7: Valores de TPH para as amostras de água coletadas no verão...33 TABELA 8: Valores de TPH para as amostras de sedimento coletadas no verão...34 TABELA 9: Valores de TPH para amostras aquosas coletadas no inverno...35

11 7 TABELA 10: Valores para o IPC e RTA para todas as amostras...37 TABELA 11: Valores para os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos detectados e da razão FLUO/PIR...39 RESUMO Amostras de água e sedimento foram coletadas na Reserva Marinha Biológica do Arvoredo e entorno. A composição química do extrato orgânico foi analisada pelas técnicas de cromatografia gasosa (GC-FID) e cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massas (GC-MS) para a avaliação e quantificação da origem da matéria orgânica. As concentrações dos hidrocarbonetos totais de petróleo variaram entre 0,033 e 58,44 mg kg -1. Foram aplicados alguns índices como o Índice Preferencial de Carbono (IPC) e a Razão Terrestre Aquática e a partir desses observou-se um aporte misto de matéria orgânica de origem terrestre e aquática com predomínio de matéria orgânica de origem terrestre. Pelo cálculo do IPC, verificou-se valores muito próximos a 1 na maioria das amostras, indicando uma

12 8 fonte petrogênica dos hidrocarbonetos. Através da razão dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos fluoranteno/pireno, foi possível traçar um perfil bem definido de fontes pirolíticas e petrogênicas. Como nenhum esterol foi identificado pode-se concluir que não há contaminação por esgoto não tratado. Palavras-chave: biomarcadores, hidrocarbonetos, HPA, Reserva Biológica Marinha do Arvoredo 1 INTRODUÇÃO A Reserva Biológica Marinha do Arvoredo (RBMA) localiza-se a 11 km ao Norte da Ilha de Santa Catarina. A região abrange uma extensa área do Oceano Atlântico com hectares e compreende um pequeno arquipélago composto pelas Ilhas do Arvoredo. A ilha é cercada por costões de rochas graníticas e sem praia arenosa e abriga muitas espécies marinhas ameaçadas como, estrelas do mar, tartarugas, pepinos do mar e ouriços do mar (MMA/IBAMA, 2004). Como parte do projeto MAArE, um programa de monitoramento contínuo e sistematizado na Reserva Biológica Marinha do Arvoredo, dividido em várias

13 9 subáreas de pesquisa, o Laboratório de Análise de Resíduos da Universidade Federal de Santa Catarina é responsável pelas análises de hidrocarbonetos e biomarcadores geoquímicos. Esses permitem, através de cálculos de diversos índices entre a concentração desses compostos, distinguir entre fontes petrogênicas e antropogênicas. 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Reserva Biológica Marinha do Arvoredo A Reserva Biológica Marinha do Arvoredo (RBMA) teve sua criação estabelecida em 12 de março de 1990 através do Decreto Federal n /90. A grande importância da reserva deve-se por seus fatores que incluem sua arqueologia, ecologia, ordem social e estratégia além da presença de Mata Atlântica bem preservada. A RBMA possui localização a 11 km ao Norte da Ilha de Santa Catarina, nas coordenadas à S e W, região que compreende grande área do Oceano Atlântico ( hectares) e abrange um

14 10 pequeno arquipélago composto pelas Ilhas: Galé, Deserta, do Arvoredo e Calhau de São Pedro, Figura 1 (MMA/IBAMA, 2004). Figura 1: Localização da Reserva Biológica Marinha do Arvoredo e Áreas Costeiras Adjacentes, Estado de Santa Catarina, Brasil, adaptado de (MARTINS; MEDEIROS; HANAZAKI, 2014). A Reserva Biológica Marinha do Arvoredo foi criada para proteger uma significativa proporção da biodiversidade marinha e ecossistemas costeiros da região. Esta região também foi escolhida como uma área marinha protegida porque é um importante berçário para diversas espécies de peixes, moluscos, crustáceos entre outras espécies marinhas ameaçadas e exóticas (MMA/IBAMA, 2004). Qualquer atividade é proibida, exceto para pesquisa científica e educação ambiental quando for expressamente autorizada pela administração (MARTINS; MEDEIROS; HANAZAKI, 2014). Na área que compreende a reserva existe também, uma região definida como zona de uso conflitante, a qual constitui-se de espaços localizados dentro de uma unidade de conservação, cujos usos e finalidades, estabelecidos antes da criação da reserva, conflitam com os objetivos de conservação da área protegida. A fiscalização deste espaço precisa ser intensa no entorno e dentro da área de uso conflitante (MMA/IBAMA, 2004).

15 Geoquímica Orgânica Segundo (KILLOPS; KILLOPS, 2004) a geoquímica orgânica é uma ciência que visa esclarecer o estudo dos compostos orgânicos na geosfera. Tais compostos possuem a capacidade de incorporar-se em rochas sedimentares, mantendo-se preservados durante eras geológicas, regressando de maneira natural ao ambiente ou através da ação humana Biomarcadores Geoquímicos Os compostos orgânicos encontrados na geosfera são denominados de biomarcadores geoquímicos, pois são moléculas orgânicas com especificidade química e quando sofrem reações durante processos diagenéticos podem ainda ser utilizados como indicador de seu percursor biológico. Essas moléculas auxiliam de forma eficaz na elucidação de informações sobre eventos ocorridos no passado nos locais onde as mesmas foram coletadas. Entre a classe de indicadores moleculares mais preservados, encontram-se os biomarcadores lipídicos, encontrados em maior parte na forma de hidrocarbonetos. Os hidrocarbonetos frequentemente encontrados em sedimentos aquáticos, na forma de misturas complexas oriundas de múltiplas fontes, são passíveis de distinção através de estudos combinados entre hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos (KILLOPS; KILLOPS, 2004). Biomarcadores geoquímicos têm uma importância distinta devido à sua alta resistência ao processo de biodegradação, que por ação de microorganismos (bactérias), sofrem degradação seletiva de determinados compostos orgânicos com uma série preferencial os hidrocarbonetos saturados lineares, ramificados, cicloalcanos e aromáticos (COLOMBO et al., 1989; PARRISH et al., 2000).

16 12 Uma variedade de parâmetros independentes tem que ser usados para avaliar a natureza da matéria orgânica, a fim de se realizar uma análise comparativa, pois um único parâmetro não seria conclusivo para indicar a origem da mesma Hidrocarbonetos Alifáticos Os hidrocarbonetos presentes no petróleo estão divididos em hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos. Em um nível molecular, estas duas classes se diferem pelo tipo de ligação entre carbonos adjacentes. Os hidrocarbonetos alifáticos são os principais constituintes da composição do petróleo, cerca de 57%, e os compostos mais persistentes no meio ambiente, principalmente os hidrocarbonetos alifáticos de cadeias longas. Devido a essas propriedades, é possível utilizar esses compostos como indicadores dos níveis e origens do material orgânico no ambiente (POTTER; SIMMONS, 1998). Esses são divididos em alcanos lineares (n-alcanos), alcanos ramificados (alcanos isopreniodes) e compostos cíclicos como os esteranos e hopanos. Os hidrocarbonetos também podem ser sintetizados por plantas terrestres, fitoplâncton, animais e bactérias (EGLINTON; HAMILTON, 1967). Em relação à toxicidade dos hidrocarbonetos alifáticos, ocorre uma variação conforme o tamanho e o tipo de cadeia hidrocarbônica, sendo que compostos de maior massa molar são relativamente mais tóxicos. Os compostos de cadeias alifáticas são menos tóxicos que os aromáticos. Agravando a sua toxicidade desses compostos, esses são hidrofóbicos e tendem a se acumular em sedimentos. Em ambientes aquáticos, devido a sua maior solubilidade, hidrocarbonetos alifáticos de massa molar média (C 12 a C 24 ) são mais tóxicos (CLARK; ATTRILL; FRID, 2001) n-alcanos

17 13 Os hidrocarbonetos lineares ou n-alcanos, ou ainda n-parafinas, são hidrocarbonetos alifáticos saturados de cadeias abertas e não ramificadas. Em amostras derivadas de ambientes aquáticos, esses apresentam uma característica importante devido à sua síntese por organismos terrestres e marinhos, que é a predominância de n-alcanos com cadeias ímpares (VOLKMAN et al., 1992). De tal modo, n-alcanos podem ser utilizados como biomarcadores geoquímicos para indicar contaminação antrópica em ambientes contaminados por petróleo. Se em ambientes sem contaminação por petróleo os n-alcanos ímpares predominam, é de se esperar que com a contaminação o perfil seja diferente. Para ambientes contaminados essa predominância desaparece. A Figura 2 mostra um perfil característico de uma amostra não contaminada por petróleo. Figura 2: Cromatograma parcial de uma amostra típica não contaminada por derivados de petróleo, ilustrando a predominância de n-alcanos ímpares sobre pares (KILLOPS; KILLOPS, 2004). Portanto, para avaliar a origem da matéria orgânica, alguns índices foram elaborados, como o Índice Preferencial de Carbono (IPC) que é usado para determinar se a matéria orgânica é proveniente de plantas ou de contaminação por petróleo (BRAY; EVANS, 1961). Este índice se baseia precisamente na diferença de

18 14 concentração entre os n-alcanos de cadeias ímpares e pares. Esse índice é calculado de acordo com a equação 1 (KILLOPS; KILLOPS, 2004). Equação 1 Se o IPC apresentar valores entre 4 e 7, há uma forte indicação de que a presença de n-alcanos seja predominantemente de aporte biogênico. Porém, valores muito próximos a 1, sugerem contaminação por petróleo (GOGOU; BOULOUBASSI; STEPHANOU, 2000). Outro parâmetro usado para avaliar uma possível contaminação por petróleo, tanto em amostras de água quanto para amostras de sedimento, pode ser obtido através de análises cromatográficas. Durante uma análise por cromatografia gasosa com detector por ionização de chama (GC-FID), um perfil da elevação da linha base do cromatograma pode ser a maneira mais precisa de medir níveis de contaminação por petróleo (KILLOPS; KILLOPS, 2004). Esse perfil está ilustrado na Figura 3 abaixo. Figura 3: Cromatograma com uma elevação da linha base, linha tracejada, devido a uma UCM. Adaptado de (KILLOPS; KILLOPS, 2004).

19 15 A elevação da linha base se deve a uma mistura complexa não resolvida (do inglês unresolved complex mixture, UCM), formada por isômeros e homólogos de hidrocarbonetos ramificados e cíclicos provenientes por processos de biodegradação que não pode ser resolvida por cromatografia unidimensional com coluna capilar (POTTER; SIMMONS, 1998). Valores abaixo de 10 mg kg -1 para uma UCM são conferidos a locais considerados não contaminados por petróleo, onde a UCM devese à degradação de hidrocarbonetos de algas (PHILP, 1993). Hidrocarbonetos lineares naturais de origem terrestre, aporte de plantas superiores, possuem cadeias com números de átomos de carbono predominantemente em n-c 27, n-c 29 e n-c 31. Por outro lado, os n-alcanos de origem aquática, de aporte fitoplantônico, podem ser reconhecidos pela presença de cadeias de massa molar menor, consideradas cadeias médias, na faixa de n-c 15,n- C 17 e n-c 19 (EGLINTON; HAMILTON, 1967). A Razão Terrestre Aquática (RTA), é a razão entre a abundância de compostos de origem terrestre e aquático e é um índice muito utilizado. Quando RTA>1, predomina a matéria orgânica de origem terrestre, enquanto valores de RTA<1, sugerem a predominância de origem aquática (BOURBONNIERE; MEYERS, 1996). A fórmula para o cálculo da RTA é; RTA = (C 27 + C 29 + C 31 ) / (C 15 + C 17 + C 19 ) Esteróis Esteróis são compostos cíclicos alifáticos que podem ou não ter substituintes metílicos, especialmente nas posições 10 e 13, podendo conter entre 27 e 29 átomos de carbono (KILLOPS; KILLOPS, 2004), Figura 4. Esteróis, como biomarcadores, têm sido bastante usados para avaliar e distinguir entre diferentes fontes de contaminação por esgoto. Apesar de mais caros e mais complicados de serem utilizados do que os coliformes, esteróis permanecem no meio por mais tempo e apresentam maior especificidade (ADNAN et al., 2012).

20 16 Figura 4: Estrutura química geral dos esteróis com a respectiva numeração de átomos de carbono. Os esteróis podem ter tanto origem biológica como antropológica. Biologicamente, as principais fontes desses compostos são: plantas terrestres, que apresentam cadeias entre C 28 e C 29, tal como campesterol (24α-metilcolest-5-há-3βol), β-sitosterol (24α-etilcolest-5-há-3β-ol) e o estigmasterol (24α-etilcolest-5,22Edien-3β-ol); fitoplâncton, que normalmente apresentam cadeias com 28 átomos de carbono; e o zooplâncton, (geralmente a classe dominante) que contém esteróis C 27, principalmente o colesterol (5-colesten-3b-ol), entre outros (KILLOPS; KILLOPS, 2004). Esgotos domésticos não tratados são as principais fontes antrópicas de esteróis. Os mais usados na avaliação deste tipo de aporte são o coprostanol(h)- colestan-3β-ol) e o epicoprostanol ou colestanol (5β-colestan-3α-ol), pois estes são compostos estranhos a ambientes marinhos e até chamados de esteróis fecais (MACHADO et al., 2014; NOBLET et al., 2004). O coprostanol é formado pela hidrogenação bacteriana do colesterol no intestino de animais superiores, Figura 5. Contudo, como esta reação de redução pode ocorrer in situ, devido à degradação digenética em ambientes anóxicos, o uso do coprostanol por si só não confirma a presença de esgoto doméstico. Por isso, é proposto usar a razão entre coprostanol e epicoprostanol para aferir a contaminação por efluentes domésticos (NOBLET et al., 2004; VON DER LÜHE et al., 2013).

21 17 Figura 5: Conversão em três estágios do colesterol (I) para o coprostanol (IV), tendo como intermediários a colestenona (II) e a coprostanona (III) (ROSENFELD et al., 1954). A razão coprostanol / epicoprostanol com valores acima de 0.7 podem ser considerados indicativos de contaminação por esgoto doméstico, e valores abaixo de 0.3 indicam um ambiente não contaminado (CATARINA et al., 2006). Para melhorar o sinal cromatográfico durante uma análise de esteróis por cromatografia gasosa, pode ser feita uma silanização desses compostos com um agente silanizante como a N,Obis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA). O BSTFA converte as hidroxilas dos esteróis em seus correspondentes trimetilsilil ésteres. O produto formado é menos polar, mais volátil e tem maior estabilidade térmica, o que melhora a separação na coluna cromatográfica e consequentemente gera picos mais finos e que apresentam caudas menores (FARAJZADEH; NOURI; KHORRAM, 2014).

22 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos Os HPA são compostos orgânicos que têm mais de dois anéis aromáticos fundidos como característica estrutural e sua estabilidade resulta da deslocalização concomitante de pares de elétrons (POTTER; SIMMONS, 1998). Esses podem ser gerados a partir de bactérias, plantas ou fungos e são encontrados como constituintes de misturas complexas em todos os compartimentos ambientais. Porém, a procedência biogênica, que ocorre principalmente de modificação microbiana e diagênese, raramente ocorre e a origem antropogênica tem como seu principal contribuinte, que pode ser de fonte pirolítica e petrôgenica (REBOUÇAS et al., 2008). A fonte pirolítica é característica da combustão incompleta de combustíveis como madeira, carvão, óleo e gás natural, entre outros produtos de refinarias (BUDZINSKI et al., 1997; READMAN et al., 2002) e é caracterizada pela presença de compostos de maior massa molar sem derivados alquilados, mais de três anéis aromáticos (YUNKER; MACDONALD, 2003). A fonte petrogênica é caracterizada pela presença de compostos de menor massa molar, de 2 a 3 anéis aromáticos, e estão relacionada a processos de exploração, transporte, consumo e armazenamento de petróleo, além de descartes de efluentes de urbanos e industriais (IBRAHIM, 2004; YUNKER et al., 2011). Por serem resistentes à degradação e consequentemente persistentes no ambiente, os HPA são altamente tóxicos com potencial carcinogênico para moléculas de 4 a 6 anéis, podendo também apresentar atividade mutagênica (IBRAHIM, 2004). Por estes motivos a Agência Americana de Proteção Ambiental (USEPA), listou 16 HPA prioritários em relação ao monitoramento destes no meio ambiente, Figura 6.

23 19 Figura 6: Lista dos 16 HPA prioritários segundo a USEPA (BOJES; POPE, 2007; BUDZINSKI et al., 1997). Assim como os n-alcanos, algumas razões podem ser utilizadas para a determinação da origem dos HPA. Uma dessas razões é entre o fluoranteno e o pireno (FLUO/PIR), para discriminar a origem petrogênica e pirogênica. Valores menores que 1 indicam origem petrogênica e valores maiores que 1 indicam origem pirolítica (MILLE et al., 2007; READMAN et al., 2002). 2.4 Cromatografia à Gás A cromatografia em geral é definida como um método de separação que apresenta comprovada eficiência ao separar amostras complexas em seus constituintes, é sem dúvida, o procedimento mais importante para isolamento e purificação de substâncias químicas (MILLER, 2005). A separação de misturas de

24 20 componentes se dá pela interação diferencial dos seus compostos entre uma fase estacionária (líquido ou sólido) e uma fase móvel (líquido ou gás). A cromatografia gasosa, um dos tipos de cromatografia nomeada devido à fase móvel utilizada, possui como componentes principais do sistema cromatográfico o gás carregador, a coluna cromatográfica, o detector e o sistema computacional para processamento dos dados. O planejamento de um sistema cromatográfico deve ser orientado em função do gás que se deseja quantificar, a faixa de concentração que este se apresenta na amostra e quais outros componentes presentes dos quais se precisa separá-lo (MCNAIR; MILLER, 2009) GC-FID O detector por ionização em chama apresenta resposta aos compostos com ligações C-H e por isso é considerado por muitos autores como um detector virtualmente universal, uma vez que os seus compostos orgânicos são constituídos por este tipo de ligação. O seu princípio de funcionamento envolve a formação de íons quando um composto é queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio e a aplicação de uma diferença de potencial entre os eletrodos. Quando o composto orgânico chega até a chama, carregado por um gás de arraste, este é queimado gerando íons que então conduzirão corrente elétrica, na ordem de pa. A corrente resultante é então amplificada gerando o sinal cromatográfico (MCNAIR; MILLER, 2009) GC-MS A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas é uma técnica que combina o poder de separação da cromatografia com o poder de identificação da espectrometria de massas resultando em uma ferramenta analítica com alta sensibilidade e seletividade para análises qualitativas e quantitativas. Após serem

25 21 separados, os compostos são bombardeados por elétrons gerados por um filamento, nos quais os fragmentos gerados são encaminhados a um analisador de massas onde os íons serão separados e coletados individualmente de acordo com a razão massa/carga (m/z). Chegando ao detector, uma fotomultiplicadora gera uma corrente elétrica proporcional ao número de íons que incide sobre ele, sendo este sinal amplificado e registrado na forma de sinal cromatográfico. A maior vantagem desta técnica se deve à sua alta sensibilidade com a capacidade de gerar dois tipos de cromatogramas, um a partir de uma faixa de m/z escolhida (cromatograma de íons totais TIC ) e outro a partir da escolha de m/z específicos (monitoramento seletivo de íons SIM ) (MCNAIR; MILLER, 2009). 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Usar biomarcadores e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos para avaliar a qualidade de extratos provenientes de amostras aquosas e sedimentares na

26 22 Reserva Marinha Biológica do Arvoredo e Entorno, utilizando métodos padrões da EPA e análise por GC-FID e GC-MS. 3.2 Objetivos específicos Utilizar razões baseadas na distribuição de hidrocarbonetos para avaliar a origem da matéria orgânica; identificar os principais grupos de hidrocarbonetos presentes nas amostras do RMBA; avaliar a concentração de hidrocarbonetos totais de petróleo para verificar se há contaminação no RMBA; traçar um perfil dos dados utilizando gráficos de superfície. 4 METODOLOGIA 4.1 Amostragem A avaliação ambiental do local em estudo iniciou-se pela coleta das amostras de água e sedimento. As coletas foram realizadas em duas etapas, a coleta de verão foi realizada em Abril/2014, onde foram coletadas amostras de água e

27 23 sedimento. A coleta de inverno foi realizada em Julho/2014, onde somente foram coletadas amostras de água. Figura 7: Imagem da área de estudo e todos os pontos de coleta. Para a coleta das amostras de sedimento, foi utilizado um amostrador do tipo van Veen e posteriormente as amostras foram transferidas para frascos de vidro previamente calcinados para serem armazenadas. Para a coleta e armazenamento das amostras de água, foram usados frascos âmbar de 1 L que com um suporte metálico adequado podiam ser lançado ar mar para realizarem a coleta. Logo após a coleta as amostras foram armazenadas em caixa de isopor com gelo até serem transportadas para o Laboratório de Análise de Resíduos da UFSC. As amostras de água foram acondicionadas na geladeira e as amostras de sedimento no congelador a -4ºC.

28 24 Tabela 1: Posição geográfica das amostras coletadas no RBMA durante a campanha de verão AMOSTRA LATITUDE (W) LONGITUDE (S) P5-12m* P4-30m P4-15m* P3-53m P3-30m P3-12m* P2-51m P2-24m P2-5m* P1-3m* * Pontos de coleta onde além de amostras de sedimento também foram coletadas amostras de água, com suas respectivas profundidades de coluna de água (em metros). Tabela 2: Posição geográfica das amostras coletadas no RBMA durante a campanha de inverno AMOSTRA LATITUDE (W) LONGITUDE (S) P1-18m*

29 25 P1-32m P1-52m P2-6m P2-46m P2-52m P3-13,7m P3-30m P3-53m P4-12m P4-17m * Profundidades de coluna de água (em metros).

30 Equipamentos e Reagentes Equipamentos Todos os equipamentos utilizados neste estudo estão tabelados abaixo, com as respectivas marcas de modelos. Tabela 3: Equipamentos utilizados, seus fabricantes e seu modelo Equipamento Fabricante Modelo Agitador de tubos vortex Phoenix AP56 Agitador magnético Microquímica MQAMA301 Balança analítica Bel Mark 210ª Centrífuga Fanen 206R Cromatógrafo à Gás Shimadzu GC-2014 Espectômetro de Massas Agilent Technologies 7000C Estufa Quimis Q317B242 Liofilizador Heto CT 60 E Mufla Quimis Q317b243 Rota evaporador Fisaton 802 Ultra som Unique USC Reagentes Os reagentes e solventes utilizados para a extração e fracionamento das amostras estão descritos na Tabela 4. Os resíduos foram descartados

31 27 adequadamente em recipientes que foram encaminhados para tratamento de resíduos. Tabela 4: Reagentes e solventes utilizados, seus fabricantes e sua pureza Reagentes e solventes Origem Pureza Acetato de etila VETEC HPLC Ácido clorídrico Synth P.A. 37% Lã de vidro Synth P.A. Alumina Fluka Chemika BSTFA ALDRICH P.A. 9 Cobre metálico em pó VETEC P.A. Diclorometano TEDIA HPLC Extran MA 02 neutro MERCK Hexano TEDIA HPLC Metanol TEDIA HPLC Nitrogênio WHITE MARTINS Grau (ECD) Sílica gel 60 ( mesh) MERCK P.A. Sulfato de sódio NUCLEAR P.A. 4.3 Limpeza da Vidraria Quando se trabalha com determinações de compostos na faixa de micrograma ou nanograma, é fundamental a limpeza e manuseio adequados da vidraria. Para a remoção de qualquer matéria orgânica, todo o material utilizado foi deixado em uma solução de detergente comercial EXTRAN (5% v/v) por algumas horas, enxaguado em abundância com água comum e posteriormente lavado com água deionizada.

32 28 Depois de secas, as vidrarias que admitem altas temperaturas foram calcinadas na mufla a 450ºC por 4 horas, com exceção das vidrarias volumétricas. As demais vidrarias foram enxaguadas com hexano (PA) e secas na estufa a 150ºC por algumas horas até que todo o solvente fosse eliminado. As vidrarias foram então guardadas em local apropriado e só manuseadas com uso de luvas. 4.4 Extrações Os procedimentos de extração seguem os métodos padrões da EPA (Environmental Protection Agency) com algumas modificações. Para as amostras aquosas o método EPA utilizado foi o 3510 e para amostras de sedimento o método 3540c Amostras de água A técnica de extração líquido-líquido (LLE) foi utilizada para as extrações de amostras aquosas. A amostra foi transferida para um funil de separação de 1L até que a sua temperatura ficasse a temperatura ambiente. O padrão externo C30 d foi adicionado para que seja possível avaliar a eficiência da extração. A extração foi realizada em três repetições de 30 ml de hexano cada, e posteriormente secas com Na 2 SO 4 em um funil. Os extratos foram coletados em um balão de fundo redondo de 250 ml e concentrados em um rota evaporador (50ºC) até um volume adequado, aproximadamente 2 ml. Posteriormente, este volume foi transferido para um frasco de 2 ml, com auxílio de uma pipeta Pasteur, e o balão lavado três vezes com hexano. Ao extrato foi adicionado o padrão interno C16 d e este foi avolumado para 1 ml com uso de um leve fluxo de nitrogênio.

33 Amostras de sedimento Ativação do cobre Antes da etapa de extração, as amostras precisam ser tratadas com cobre ativado para a remoção do enxofre elementar molecular que causa interferência no sinal cromatográfico. Em um frasco com fundo redondo, pesou-se 1g de cobre em pó e adicionou-se 3 ml de HCl a 6 mol L -1. A mistura foi agitada e homogeneizada em um agitador de tubos vortex, centrifugada por aproximadamente 15 minutos e o sobrenadante descartado. Posteriormente foi feita a remoção de excesso de ácido Extração As amostras de sedimento foram previamente congeladas, liofilizadas, maceradas em almofariz de porcelana e peneiradas (malha 250 mesh; 250 µm) para a remoção de material indesejável proveniente da maceração. No frasco contendo o cobre ativado, 5g de sedimento foi pesado e homogeneizado no agitador vortex. Nesse procedimento foi utilizado como solvente extrator uma mistura de DCM:MeOH (2:1) com volume de 15 ml. Após a adição do solvente extrator, a amostra foi homogeneizada no agitador vortex. Em seguida, o frasco permaneceu por 30 minutos no ultrassom e posteriormente foi centrifugado. A etapa de extração foi realizada em três repetições. Por fim, o sobrenadante foi coletado em um balão de fundo redondo de 250 ml e concentrado em um rota evaporador até um volume adequado, aproximadamente 2 ml. Posteriormente, este volume foi transferido para um frasco de 2 ml, com auxílio de uma pipeta Pasteur. Ao extrato foi adicionado o padrão interno C16 d e este foi avolumado para 1 ml com uso de um leve fluxo de nitrogênio.

34 Fracionamento por cromatografia líquida em coluna Os extratos totais foram fracionados em coluna de vidro (30 cm x 13 cm) empacotada com 10 g de sílica 2% desativadas (m/m) e 1 g de alumina 5% desativada (m/m), sobre lã de vidro previamente calcinada. Antes da eluição, a coluna foi empacotada com a sílica e utilizou-se hexano como solvente para evitar a formação de bolhas ou rachaduras. Acima da sílica, adicionou-se alumina para a retenção de algum enxofre elementar remanescente. A fração 1 (F1), que contém os hidrocarbonetos alifáticos e os hopanos, foi eluida com 55 ml de hexano. A fração 2 (F2), contendo os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA), foi eluida com 70 ml de DCM:hexano (2:1). A fração 3 (F3), que comporta os esteróis, foi eluida com 50 ml de EtOAc:MeOH (3:1). As frações foram coletadas em balões de fundo redondo (250 ml) e em cada troca de solvente, o balão contendo o extrato foi lavado com o solvente da eluição. As frações foram então concentradas por rota evaporação, transferidas para um frasco de 2 ml e avolumadas para 1 ml com hexano e o padrão interno 16 d. As frações foram armazenadas no congelador até o momento da análise por cromatografia a gás Silanização O solvente das F3 foram secos com fluxo leve de nitrogênio. Adicionou-se 100 µl de BSTFA (N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida) aos frascos de vidro, e estes foram deixados na estufa por 1 hora a 60ºC. Em seguida, o agente sinalizante foi seco com fluxo de nitrogênio e as amostras avolumadas para 1 ml com hexano. Este processo foi realizado logo antes da análise por GC.

35 Análise, quantificação e identificação A quantificação dos n-alcanos foi realizada por meio de curva de calibração por padrão interno (C16 d, 10 µg ml -1 ), adicionado nos extratos das amostras de água e na F1 das amostras de sedimento. As soluções de calibração contendo n-alcanos (C 7 -C 38 ), foram preparadas nas concentrações de 1, 2, 4, 5, 10, 15, 20 µg ml -1 (Apêndice A). A curva de calibração foi usada para quantificar os n-alcanos, por comparação com o tempo de retenção de cada n-alcano individualmente (Apêndice B), e TPH, por somatória dos n-alcanos, tendo o fator de resposta corrigido em relação ao padrão interno. Estes compostos foram analisados por GC-FID e as condições cromatográficas estão sumarizadas na Tabela 5. Tabela 5: Condições cromatográficas usadas no GC-FID Coluna (J & W, DB-5) 30 m x 0,32 mm di x 0,25 µm de fase (5% de fenila) Estacionária Temperatura da coluna 50ºC (5 min) 6 ºC min -1 até 300 ºC (6 min) Gás de arraste He H fluxo constante de 3 mlmin -1 Modo de injeção splitless (1 min), Volume de amostra 1 µl Temperaturas 280 e 300 ºC (Injetor e Detector) As frações F2 (HPA) e F3 (esteróis) foram analisadas em GC-MS. A quantificação dos HPA e dos esteróis foi feita por comparação direta. Uma solução de 1 µg ml -1 de 16 HPA prioritários foi injetada e o sinal obtido das amostras foi comparado diretamente ao sinal dos padrões. Para os esteróis, uma solução de 1 µg ml -1 de coprostanol foi injetada e o sinal obtido das amostras foi comparado diretamente ao sinal do padrão. As condições cromatográficas estão sumarizadas na Tabela 6.

36 32 Tabela 6: Condições cromatográficas empregadas no GC-MS Coluna (DB-5MS) 30 m x 0,25 mm di x 0,25 µm de fase estacionária Temperatura da coluna 80ºC (1 min) 10 ºC min -1 até 270 ºC (20 min) Gás de arraste He fluxo constante de 1,0 ml min -1 Modo de injeção split 1:5 Modo de ionização 70eV; electron impact Volume de amostra 1µL Temperaturas 280, 230 e 275 ºC (injetor, fonte e interface)

37 33 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Hidrocarbonetos Alifáticos Como previamente discutido, a curva de calibração dos n-alcanos (C 7 -C 38 ) foi usada para calcular os valores de TPH nos extratos. Uma curva de calibração foi feita com a somatória das áreas dos 32 n-alcanos, dividida pelo padrão interno, sobre a somatória das concentrações. O valor de TPH é a soma de todos os picos resolvidos (PR) do cromatograma e a UCM. A curva (R 2 = ) obtida está no Apêndice C. Os valores de TPH e da UCM para todas as coletas estão tabelados abaixo e a partir destes, gráficos de superfície foram elaborados para mostrar as linhas de tendências nos pontos geométricos das coletas. Tabela 7: Valores de TPH para as amostras de água coletadas no verão Amostra Conc. PR (mg/l) Conc. UCM (mg/l) Conc. TPH (mg/l) P1 17m 0,11-0,11 P2 5m 0,47 0,1111 0,58 P3 12m 0,16 1,0206 1,18 P4 15m 1,04 2,2997 3,34 P5 12m 0,09 0,5869 0,68 Figura 8: Gráfico de superfície para os valores de TPH em amostras de água coletadas no verão.

38 34 Tabela 8: Valores de TPH para as amostras de sedimento coletadas no verão Amostra Conc. PR Conc. UCM Conc. TPH (µg/g) (µg/g) (µg/g) P5-12m 6,75-6,75 P4-30m 30,88-30,88 P4-15m 21,65-21,65 P3-53m 9,31-9,31 P3-30m 6,84-6,84 P3-12m 58,44-58,44 P2-51m 42,22-42,22 P2-24m 8,74-8,74 P2-5m 11,59-11,59 P1-3m 21,18-21,18 Figura 9: Gráfico de superfície para os valores de TPH em amostras de sedimento coletadas no verão.

39 35 Tabela 9: Valores de TPH para amostras aquosas coletadas no inverno Amostra Conc. PR (mg/l) Conc. UCM (mg/l) Conc. TPH (mg/l) P1-18m 0,10-0,10 P1-32m 0,03-0,03 P1-52m 0,04-0,04 P2-6m 0,04-0,04 P2-46m 0,03-0,03 P2-52m 0,03-0,03 P3-13,7m 0,03-0,03 P3-30m 0,03-0,03 P3-53m 0,14-0,14 P4-12m 0,04-0,04 P4-17m 0,04-0,04 Figura 10: Gráfico de superfície para os valores de TPH em amostras de água coletadas no inverno. Idealmente, um gráfico de superfície com todos os valores de TPH para todas as campanhas seria um bom modo para visualizar de maneira concisa os dados obtidos. Porém, devido à grande diferença entre o valor máximo e o mínimo, não é possível obter-se linhas de tendências suficientes no gráfico de superfície.

40 36 Primeiramente, é importante notar que nenhum dos valores de TPH ultrapassou 100 µg g -1 para as amostras de sedimento ou 100 mg L -1 para as amostras de água. Valores acima de 100 mg kg -1 são associados à contaminação por petróleo (READMAN et al., 2002). O valor mais alto de TPH foi de µg/g para a amostra de sedimento P3-12m. As amostras de sedimento apresentaram os maiores valores de TPH, visto que matéria orgânica fica adsorvida na superfície do sedimento. Somente as amostras de água P2, P3, P4 e P5 da campanha de verão apresentaram UCM. A Figura 10 ilustra a UCM formada na amostra P4. Mesmo a formação de uma mistura complexa não resolvida indicar contaminação por hidrocarbonetos de petróleo, as concentrações encontradas foram bastante baixas, ficando abaixo de 100 mg kg -1. O perfil formado pelas linhas de tendência nos gráficos demonstra que as concentrações de TPH dentro da área limite da reserva são as mais baixas entre todos os pontos de coleta, principalmente no entorno da Ilha do Arvoredo. Pelos gráficos da coleta de verão Figura 7 e Figura 8, sedimento e água, nota-se que as maiores concentrações estão entre a reserva e a baía de Tijucas. Entretanto, no gráfico das amostras de água coletadas no inverno, observa-se que a maior concentração está para o nordeste da reserva. Figura 11: Cromatograma da amostra de água P4 coletada no verão, ilustrando a formação de uma UCM.

41 37 Os valores da razão do Índice Preferencial de Carbono (IPC) e da Razão Terrestre Aquático (RTA) estão expostos na Tabela 10. Tabela 10: Valores para o IPC e RTA para todas as amostras Amostra IPC RTA Amostra IPC RTA SV-P5-12m 0,67 - AV-P4-15m 0, SV-P4-30m 0,88 3,89 AV-P5-12m 0, SV-P4-15m 0,59 0,93 AI-P1-18m 1, SV-P3-53m 0,90 1,26 AI-P1-32m 1,91 - SV-P3-30m 0,68 - AI-P1-52m 1,89 - SV-P3-12m 0,77 2,20 AI-P2-6m 1,85 - SV-P2-51m 0,82 18,27 AI-P2-46m 2,93 - SV-P2-24m 0,88 - AI-P2-52m - - SV-P2-5m 0,95 - AI-P3-13,7m 1,56 - SV-P1-3m 0,69 1,15 AI-P3-30m 1,78 - AV-P1-17m 1,00 0,91 AI-P3-53m 1,51 - AV-P2-5m 1,22 3,50 AI-P4-12m 0, AV-P3-12m 1,28 2,09 AI-P4-17m 1,11 - Legenda: SV: Sedimento Verão; AV: Água Verão; AI: Água Inverno Os valores de RTA indicam um aporte misto de matéria orgânica de origem terrestre e matéria orgânica de origem aquática, com predominância de origem terrestre. Não foi possível calcular os valores de RTA para algumas amostras pois a concentração das cadeias de massa molar menor ficaram abaixo do limite de detecção, indicando uma predominância de matéria orgânica de origem terrestre.

42 38 Uma explicação para a predominância de cadeias de massa molar maiores pode ser devido ao fato de que cadeias menores serem mais facilmente degradadas (HARJI; YVENAT; BHOSLE, 2008). Figura 12: Gráfico de superfície para os valores da razão de IPC para todas as amostras coletadas, valores próximos a 1 indicam contaminação por petróleo e valores acima de 1 indicam origem biogênica da matéria orgânica. Os valores de IPC que mais indicam uma contaminação por petróleo, com a menor predominância de hidrocarbonetos ímpares sobre os pares, está entre a Baía de Tijucas e a fronteira da reserva indicado pela cor rosa no gráfico. Dentro da reserva também se observa valores muito próximos a 1, indicados pelas coras azul clara e escura. A maior predominância de hidrocarbonetos ímpares está situada no entrono da ilha do Arvoredo, indicando um perfil maior de matéria orgânica de origem biogênica. 5.2 Esteróis As concentrações de esteróis ficaram abaixo do limite de detecção, apontando nenhuma contaminação por esgotos domésticos não tratados.

43 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos Tabela 11: Valores para os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos detectados e da razão FLUO/PIR Amostra Conc. Fenantreno (ug/g) Conc. Fluoranteno (ug/g) Conc. Pireno (ug/g) FLUO/PIR Sed-P5-12m 0,001 0,001 0,001 0,75 Sed-P4-30m 0,038 0,010 0,010 1,06 Sed-P4-15m 0,013 0,002 0,003 0,61 Sed-P3-53m 0,008 0,005 0,003 1,71 Sed-P3-30m 0,008 0,003 0,003 1,14 Sed-P3-12m 0,014 0,004 0,011 0,37 Sed-P2-51m Sed-P2-24m 0,002 0,001 0,001 2,46 Sed-P2-5m Sed-P1-3m 0,001 0,001 0,001 0,64 Figura 13: Gráfico de superfície para os valores da razão FLUO/PIR para as amostras de sedimento coletadas no verão.

44 40 A caracterização dos HPA foi realizada por análise de padrões autênticos (solução contendo os 16 HPA prioritários) pelos seus fragmentos característicos. Para as amostras de sedimento, somente foram identificados o fenantreno, o fluoranteno e o pireno. A razão FLUO/PIR permite diagnosticar a contribuição da fonte petrogênica dos hidrocarbonetos. Isso é devido a avaliação da estabilidade termodinâmica dos HPA, uma vez que HPA originados por processors de combustão incompleta (pirolítica) comumente apresentam uma maior proporção de isômeros menos estáveis termodinamicamente. Os HPA que se originam por processos de baixa temperatura como a formação dos HPA durante o processo catagênico de formação do petróleo são mais estáveis (MILLE et al., 2007). Sendo o pireno o isômero mais estável, com um maior calor de formação em comparação com o fluoranteno, é possível calcular a origem da fonte de HPA através da razão FLOU/PIR. O gráfico de superfície forma linhas claras com os dados da razão FLUO/PIR. Os pontos de coleta mais pertos da costa apresentam um perfil de fonte pirolítica, porém, entre a Ilha do Galé e a Ilha do Arvoredo, o perfil muda para uma fonte petrogênica. A contribuição pirolítica mais perto da costa pode ser devido a combustão queima incompleta de combustíveis de motores, assim como a combustão de madeira, carvão e vegetais provenientes do continente.

45 41 6 CONCLUSÃO Os extratos derivados das amostra de sedimento e água coletadas na Reserva Biológica Marinha do Arvoredo, apresentaram certos perfis de contaminação por petróleo como a formação de UCM e valores de IPC próximos a 1. Porém, todas as amostras apresentaram valores de TPH abaixo do considerado como contaminação por petróleo. Os valores mais altos de TPH majoritariamente ficaram entre a fronteira da RBMA. Os valores de RTA indicam um aporte misto de matéria orgânica de origem terrestre e de origem aquática, com predominância de matéria orgânica de origem terrestre. A análise de esteróis mostrou que a RBMA assim como o seu entorno não estão contaminados por esgoto doméstico não tratado. A razão FLUO/PIR indica que o perfil entre a Baía de Tijucas e aproximadamente a Ilha de Galé, apresenta hidrocarbonetos de fonte pirolítica. Enquanto que entre a Ilha do Arvoredo e o ponto de coleta mais distante no sentido oposto a baía, apresenta uma fonte petrogênica. Os dados coletados no presente trabalho irão ser usados para complementar outros dados de outras subáreas do projeto MAArE, para manter o monitoramento e assim auxiliar a preservação da Reserva Marinha Biológica do Arvoredo.

46 42 7 REFERÊNCIAS ADNAN, N. H. et al. Faecal sterols as sewage markers in the Langat River, Malaysia: Integration of biomarker and multivariate statistical approaches. Journal of Environmental Sciences, v. 24, n. 9, p , set BOJES, H. K.; POPE, P. G. Characterization of EPA s 16 priority pollutant polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in tank bottom solids and associated contaminated soils at oil exploration and production sites in Texas. Regulatory toxicology and pharmacology : RTP, v. 47, n. 3, p , abr BOURBONNIERE, R.; MEYERS, P. Sedimentary geolipid records of historical changes in the watersheds and productivities of Lakes Ontario and Erie. Limnology and Oceanography, v. 41, n. 2, p , BRAY, E..; EVANS, E.. Distribution of n-paraffins as a clue to recognition of source beds. Geochimica et Cosmochimica Acta, v. 22, n. 1, p. 2 15, fev BUDZINSKI, H. et al. Evaluation of sediment contamination by polycyclic aromatic hydrocarbons in the Gironde estuary. Marine Chemistry, v. 58, n. 1-2, p , out CATARINA, S. et al. Avaliação de Compostos Orgânicos em Sedimentos Superficiais da Baía de Babitonga. Geochimica Brasiliensis, v. 20, n. 2, p , CLARK, R.; ATTRILL, M.; FRID, C. Clark Marine.pdf. 5. ed. Oxford: OUP Oxford, p. 237 COLOMBO, J. C. et al. Determination of Hydrocarbon Sources Using n -Alkane and Potyaromatic Hydrocarbon Distribution Indexes. Case Study : Rio de La Plata Estuary, Argentina. v. 23, n. 7, p , EGLINTON, G.; HAMILTON, R. J. Leaf Epicuticular. Science, v. 156, p , FARAJZADEH, M. A.; NOURI, N.; KHORRAM, P. Derivatization and microextraction methods for determination of organic compounds by gas chromatography. TrAC Trends in Analytical Chemistry, v. 55, p , mar GOGOU, A.; BOULOUBASSI, I.; STEPHANOU, E. G. Marine organic geochemistry of the Eastern Mediterranean: 1. Aliphatic and polyaromatic hydrocarbons in Cretan Sea surficial sediments. Marine Chemistry, v. 68, n. 4, p , fev

47 43 HARJI, R. R.; YVENAT, A.; BHOSLE, N. B. Sources of hydrocarbons in sediments of the Mandovi estuary and the Marmugoa harbour, west coast of India. Environment international, v. 34, n. 7, p , out IBRAHIM, M. B. M. Levels and sources of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediments from the Gulf of Suez. Marine pollution bulletin, v. 49, n. 4, p , ago KILLOPS, S.; KILLOPS, V. Introduction to Organic Geochemistry. Malden, MA USA: Blackwell Publishing Ltd., MACHADO, K. S. et al. Assessment of historical fecal contamination in Curitiba, Brazil, in the last 400 years using fecal sterols. The Science of the total environment, v. 493, p , 15 set MARTINS, I. M.; MEDEIROS, R. P.; HANAZAKI, N. From fish to ecosystems: The perceptions of fishermen neighboring a southern Brazilian marine protected area. Ocean & Coastal Management, v. 91, p , abr MCNAIR, H. M.; MILLER, J. M. Basic Gas Chromatography. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., MILLE, G. et al. Hydrocarbons in coastal sediments from the Mediterranean sea (Gulf of Fos area, France). Marine pollution bulletin, v. 54, n. 5, p , maio MILLER, J. M. CHROMATOGRAPHY Concepts and Contrasts. New Jersey: Wiley- Interscience, MMA/IBAMA. Reserva Biológica Marinha do Arvoredo. Brasília: [s.n.]. NOBLET, J. A. et al. Use of Fecal Steroids To Infer the Sources of Fecal Indicator Bacteria in the Lower Santa Ana River Watershed, California: Sewage Is Unlikely a Significant Source. Environmental Science & Technology, v. 38, n. 22, p , nov PARRISH, C. C. et al. Marine Chemistry. Berlin/Heidelberg: Springer-Verlag, v. 5Dp PHILP, R. P. Oil-oil and oil-source rock correlations: techniques. In: ENGEL, M. H.; MACKO, S. A. (Eds.).. Organic Geochemistry: Principles and Applications. Topics in Geobiology. Boston, MA: Springer US, v. 11p POTTER, T.; SIMMONS, K. Composition of petroleum mixtures. 1. ed. Amherst, Massachusetts: Amherst Scientific Publishers, v. 2p. 114 READMAN, J.. et al. Petroleum and PAH contamination of the Black Sea. Marine Pollution Bulletin, v. 44, n. 1, p , jan

48 44 REBOUÇAS, L. M. C. et al. Hidrocarbonetos Saturados e Policíclicos Aromáticos em Óleos Do Campo Pilar, Sub-Bacia Alagoas: Identificação e Concentração. Geochimica Brasiliensis, v. 22, n. 2, p , ROSENFELD, R. S. et al. The transformation of cholesterol to coprostanol. The Journal of biological chemistry, v. 211, n. 1, p , nov VOLKMAN, J. K. et al. Identification of natural, anthropogenic and petroleum hydrocarbons in aquatic sediments. The Science of the total environment, v. 112, n. 2-3, p , mar VON DER LÜHE, B. et al. Investigation of sterols as potential biomarkers for the detection of pig (S. s. domesticus) decomposition fluid in soils. Forensic science international, v. 230, n. 1-3, p , 10 jul YUNKER, M. B. et al. Alkane and PAH biomarkers as tracers of terrigenous organic carbon in Arctic Ocean sediments. Organic Geochemistry, v. 42, n. 9, p , jun YUNKER, M. B.; MACDONALD, R. W. Petroleum biomarker sources in suspended particulate matter and sediments from the Fraser River Basin and Strait of Georgia, Canada. Organic Geochemistry, v. 34, n. 11, p , nov