DESENVOLVIMENTO DE OÓCITOS BOVINOS FECUNDADOS IN VITRO APÓS CENTRIFUGAÇÃO E/OU EXPOSIÇÃO À CITOCALASINA B

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1 ARS VETERINARIA, Jaboticabal, SP, Vol. 18, nº 1, 43-48, ISSN DESENVOLVIMENTO DE OÓCITOS BOVINOS FECUNDADOS IN VITRO APÓS CENTRIFUGAÇÃO E/OU EXPOSIÇÃO À CITOCALASINA B (DEVELOPMENT OF IN VITRO FERTILIZED BOVINE OOCYTES AFTER CENTRIFUGATION AND/OR TREATMENT WITH CYTOCHALASIN B) A. MEZZALIRA 1, C. L. VAZ 2, E. F. MORAES 2, D. S. BRUM 3, C. A. M. SILVA 4, M. L. BERNARDI 5, M. I. B. RUBIN 4 RESUMO O efeito da citocalasina B e da centrifugação antes da fecundação in vitro (FIV) sobre o desenvolvimento embrionário foi avaliado em oócitos bovinos aspirados de folículos com 2-8mm de diâmetro, de ovários obtidos em frigorífico. Os oócitos foram maturados in vitro em placas Nunc de quatro poços, contendo meio TCM-199 (sais de Earle), 5,96mg/ml de Hepes, 0,022 mg/ml de piruvato de sódio, 0,01UI de rfsh/ml, 0,5 μg/ml LHb e 10% de soro de vaca em estro, por 24h, a 39 o C, em atmosfera de 5% de CO 2 e 95% de umidade relativa. Após a maturação, os oócitos foram submetidos aos tratamentos descritos abaixo e, em seguida, fecundados em meio TALP-Fert e cultivados em meio CR-1. Nos experimentos I e II, foram efetuados 4 tratamentos: T1 - centrifugação a 2100 g por 5 minutos; T2 - exposição a 7,5 μg/ml de citocalasina B, por 15 minutos; T3 - centrifugação após exposição à citocalasina B e T4 - oócitos controle. No experimento III, os oócitos foram submetidos a três concentrações de citocalasina: 7,5 μg/ml (T1); 15 μg/ml (T2) e 45 μg/ml (T3). A clivagem (experimento I), a formação e eclosão de blastocistos (experimento II) não foram influenciadas pelos tratamentos efetuados. A exposição a doses mais elevadas de citocalasina não foi prejudicial para a clivagem e taxa de blastocistos. A polarização dos lipídios citoplasmáticos, bem como a exposição à citocalasina B, ou a associação dos dois tratamentos não prejudicaram o desenvolvimento embrionário após a fecundação e, por este motivo, poderiam ser pesquisados na criopreservação de oócitos bovinos. PALAVRAS-CHAVE: Oócitos bovinos. Citocalasina. Lipídios. Centrifugação. SUMMARY Bovine oocytes from slaughtered cows, aspirated from 2-8 mm ovarian follicles, treated with cytochalasin B and centrifuged just prior to IVF were used to evaluate cleavage and embryonic development post IVF. Oocytes were matured in vitro using 4 wells Nunc dishes with TCM-199 (Earle salts), 5.96mg/ml of Hepes, 0.022mg/ml of sodium pyruvate, 0.01 IU of rfsh/ml, 0.5mg/ml LHb and 10% Oestrum Cow Serum (OCS), for 24 hours, at 39 o C, in a humid atmosphere of 5% CO 2 in air. After maturation, oocytes were randomly distributed into treatments described below, before being fertilized into TALP-Fert medium and cultured into CR-1 medium. Oocytes of experiments I and II were submitted to the same following procedures: T1 - centrifugation at 2100g for 5 minutes; T2 - exposure to 7.5μg/ml Cytochalasin B for 15 minutes; T3 - centrifugation after exposure to Cytochalasin B, and T4 - control oocytes. Oocytes of experiment III were 1 Professor Adjunto, Centro de Ciências Agroveterinárias - UDESC, Lages, SC e Doutorando da UFSM. End. Eletrôn.: a2am@cav.udesc.br 2 Acadêmico, Bolsista de Iniciação Científica FAPERGS/CNPq, UFSM 3 Doutoranda em Reprodução Animal - UFSM 4 Professor Titular, Embryolab - Depto. de Clínica de Grandes Animais - CCR, UFSM Santa Maria, RS. End. Eletrôn.: mrubin@lince.hcv.ufsm.br 5 Professor Adjunto, Dept. de Zootecnia, Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS 43

2 exposed to three cytochalasin concentrations: 7.5 μg/ml (T1) and 15 μg/ml (T2) and 45 μg/ml (T3). Cleavage (Experiment I), blastocyst and hatching rates (Experiment II) were similar in the control and in all three tested groups. Exposure to higher doses of cytochalasin was not harmful to cleavage and blastocyst rate. Cytoplasmic lipid polarization and exposure to cytochalasin B, or the association of both treatments, did not impair the embryo development after fertilization thus could be tested for the cryopreservation of bovine oocytes. KEY-WORDS: Bovine oocytes. Cytochalasin. Lipids. Centrifugation. INTRODUÇÃO Oócitos da maioria das espécies de mamíferos são extremamente sensíveis ao resfriamento (PARKS & RUFFING, 1992; MARTINO et al., 1995), o que tem limitado a utilização da criopreservação para o armazenamento de gametas femininos de alto valor genético. O elevado conteúdo lipídico dos estádios iniciais de desenvolvimento embrionário tem sido apontado como uma das causas importantes do baixo sucesso da criopreservação. Nos embriões suínos, NAGASHIMA et al. (1994 a,b) demonstraram que a remoção dos lipídios aumenta a resistência ao resfriamento. A dificuldade em congelar oócitos bovinos devese a sua grande sensibilidade ao resfriamento até 0 C que, segundo SONGSANSEN et al. (1997), é similar à sensibilidade observada nos embriões suínos. O oócito bovino é uma célula única e grande, diferindo do embrião bovino em estádio avançado de desenvolvimento, tanto física quanto morfologicamente (HEYMAN et al., 1986; LEIBO et al., 1978; MOHR & TROUNSON, 1981). Além disto, a sensibilidade ao congelamento depende do estádio de maturação dos oócitos. De fato, LIM et al. (1992) constataram que oócitos bovinos imaturos, congelados na fase de vesícula germinativa, apresentaram menores taxas de clivagem, do que os oócitos que foram congelados em estádio mais avançado da maturação, ou após o final da mesma. A fase de transição dos lipídios de membrana acontece entre 13 e 20 C nos oócitos imaturos, enquanto nos maturados esta transição ocorre em uma faixa de temperatura mais ampla, situando-se, em média, ao redor de 10 C (ARAV et al., 1996). A exposição à temperatura de transição tem-se mostrado mais nociva do que a exposição a temperaturas mais baixas, sobretudo em oócitos imaturos (ZERON et al., 1999). AZAMBUJA et al. (1998) avaliaram o efeito da manutenção de oócitos maturos em diferentes temperaturas (39, 20, 10 e 0 C) e obtiveram índices decrescentes de clivagem (58, 45, 17 e 7,0%) à medida que decrescia a temperatura de manutenção. Durante a criopreservação de oócitos imaturos, há a destruição da comunicação entre as células do Cumulus oophorus e o oócito, enquanto que a criopreservação de oócitos maturados implica comumente danos nos microtúbulos, resultando em desarranjo dos cromossomos (HOCHI et al., 1997). Pela sua propriedade inibidora dos microfilamentos, a citocalasina tem sido considerada uma substância promissora para minimizar os efeitos prejudiciais do congelamento sobre os oócitos bovinos. O efeito da citocalasina na estabilização do citoesqueleto, o qual é reversível (DOBRINSKI et al., 1996), impede a ruptura dos microfilamentos durante a manipulação de oócitos e embriões. De fato, DOBRINSKY et al. (1995) constataram aumento do percentual de desenvolvimento de 23% para 61%, após a vitrificação de mórulas e blastocistos iniciais bovinos. A centrifugação de oócitos permite a polarização dos grânulos lipídicos do citoplasma, o que poderia determinar aumento da resistência ao resfriamento. OTOI et al. (1997) observaram tendência para menor incidência de polispermia e maior taxa de desenvolvimento até blastocisto para os oócitos que sobreviveram ao congelamento após a centrifugação, em relação ao grupo controle. O presente experimento foi efetuado no intuito de avaliar os efeitos da centrifugação e da citocalasina B, à temperatura ambiente, sobre o potencial fecundante de oócitos bovinos e desenvolvimento subseqüente até o estádio de blastocisto eclodido. MATERIAL E MÉTODOS OBTENÇÃO DOS OÓCITOS Ovários bovinos, provenientes de frigorífico situado a 22 km do laboratório, foram transportados em solução fisiológica 0,9% (w/v) de NaCl (Ref. S-5886, Sigma - P.O. Box 14508, St. Louis, MO USA) à temperatura de o C. Os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram aspirados, através de bomba de vácuo, de folículos com diâmetro de 2 a 8 mm, os quais foram puncionados, utilizando-se uma agulha 18 G, acoplada a um tubo de ensaio com capacidade de 15 ml. Após a punção, o líquido folicular aspirado permaneceu em repouso por 10 minutos para decantação, sendo em seguida removido o sedimento, o qual foi depositado em placas de 44

3 Petri 100 x 15 mm. Os CCOs foram identificados sob estereomicroscópio e selecionados no próprio líquido folicular, de acordo com os critérios descritos por De LOOS et al. (1989). MATURAÇÃO DOS OÓCITOS Após a seleção, os oócitos foram lavados 3 vezes com meio de maturação, composto de TCM-199 (Sais de Earle, Cultilab - Materiais para Cultura de Células Ltda., Av. Barão de Itapura, Campinas, SP) adicionado de 5,96 mg/ml de Hepes (Ref , Calbiochem Corporation - La Jolla CA 92037, USA), 0,022 mg/ml de piruvato de sódio (Ref. P4562, Sigma - P.O. Box 14508, St. Louis, MO USA), 0,01UI de rfshh/ ml (FSH recombinante humano; Ref. L , Serono Ltda - Alameda Arapoema, 480, Barueri, SP), 0,5 μg/ml LHb (hormônio luteinizante bovino; Ref. AFP B, USDA-ARS Animal Hormone Program, Beltsville, Maryland USA) e 10% de soro de vaca em estro (SVE). Os oócitos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de 25 a 40 oócitos em cada repetição, sendo a seguir depositados em placas Nunc de quatro poços (Cat , Nunc A/S Kamstrupvej 90 P.O. Box 280 DK-4000 Roskilde, Dinamarca), em 400 μl de meio e mantidos em estufa de cultivo (W.C. Heraeus GmbH- Postfach 1553 D-6459 Hannau 1, Alemanha) por 24 h a 39 o C, em atmosfera de 5% de CO 2 e 95% de umidade relativa. FECUNDAÇÃO IN VITRO Os oócitos maturados foram lavados em meio TALP-FERT e depositados para a fecundação em 400 μl desse mesmo meio, adicionado de 10 μg/ml de heparina (Ref. H-3393, Sigma Chemical Company - P.O. Box 14508, St. Louis, MO USA), sob óleo, em placas Nunc. Para a fecundação foi utilizado um pool de sêmen congelado em palhetas de 0,5 ml, proveniente de 3 touros da espécie Bos taurus. O sêmen foi descongelado a 39 o C por 20 segundos e depositado, em alíquotas de 100 μl, na parte inferior de tubos cônicos de 15 ml (Ref , Corning Incorporated - Corning, New York USA), os quais continham 1,0 ml de meio TALP-SPERM. O sêmen foi mantido nos tubos por uma hora a 39 o C para a migração dos espermatózides ( swim-up ). A seguir, foram aspirados 850 μl do sobrenadante de cada tubo, os quais foram depositados em outro tubo cônico estéril. Após centrifugação por 10 minutos a 500 g, foram aspirados 200 μl do fundo do tubo. O volume necessário para obter uma concentração final de 1 x 10 6 espermatozóides/ml foi utilizado para inseminar os oócitos. CULTIVO IN VITRO Após 24 h de incubação, os oócitos/zigotos foram transferidos do meio FERT-TALP para 400 μl de meio CR-1, em tubos cônicos de 15 ml, e foram submetidos à agitação em vortex por 1,2 minutos para a remoção das células do Cumulus oophorus. Em seguida, os oócitos/ zigotos foram lavados 3 vezes em CR-1 e cultivados a 39ºC por 24 horas, em 400 μl de CR-1, sob óleo mineral (Ref. M-8410, Sigma - P.O. Box 14508, St. Louis, MO USA), em placas Nunc de 4 poços, em estufa de cultivo com atmosfera de 5% CO 2. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA EXPERIMENTO I Neste experimento, 1849 oócitos foram utilizados para avaliar o efeito da centrifugação, da exposição à citocalasina e da associação de ambas sobre a taxa de clivagem após FIV. Vinte e três horas após o início da maturação, os oócitos de dois grupos (Tratamentos 2 e 3) foram colocados em placas contendo 1,0 ml de meio de maturação, acrescido de 7,5 μg/ml de citocalasina B (Ref. C6762 Sigma - P.O. Box 14508, St. Louis, MO USA), permanecendo nesta solução por 15 minutos. A cada repetição (n=14) do experimento, após o tratamento com citocalasina B, um grupo de oócitos foi envasado em uma palheta de 0,25 ml, lacrada com ponteira plástica, e submetido à centrifugação (2100 g) por 5 minutos (Tratamento 3). Simultaneamente, os oócitos não expostos à citocalasina B (Tratamento 1) também foram envasados e submetidos ao mesmo procedimento de centrifugação. Oócitos que não foram submetidos nem à centrifugação nem à exposição com citocalasina foram utilizados como controle (Tratamento 4). Após terem sido submetidos aos tratamentos, os oócitos foram novamente depositados nas suas placas de origem, sendo que os tratados com citocalasina B foram previamente submetidos a duas lavagens no meio de maturação. A taxa de clivagem foi avaliada 48 h após a inseminação in vitro. EXPERIMENTO II Oitocentos e vinte e nove (829) oócitos foram distribuídos aleatoriamente em 4 tratamentos, iguais aos efetuados no experimento I, totalizando 6 repetições. Neste segundo experimento, foi avaliado o efeito da centrifugação, da citocalasina ou da associação de ambas sobre a taxa de clivagem (48 h), o desenvolvimento até blastocisto (9 dias) ou blastocisto eclodido (11 dias após inseminação). 45

4 EXPERIMENTO III Oitocentos e quarenta e cinco (845) oócitos foram expostos a três concentrações de citocalasina B: 7,5 μg/ ml (Tratamento 1); 15 μg/ml (Tratamento 2) e 45 μg/ml (Tratamento 3), totalizando 10 repetições. Após fecundação e cultivo in vitro, foram avaliadas a taxa de clivagem (48 h) e o desenvolvimento até blastocisto expandido (9 dias após a inseminação). Os resultados foram submetidos à análise de variância pelo procedimento GLM (SAS, 1989). Foram avaliados os efeitos dos tratamentos e do dia do tratamento (efeito de bloco). As médias foram comparadas pelo teste de Tukey. O nível de significância utilizado para estabelecer as diferenças significativas foi de 5%. RESULTADOS E DISCUSSÃO Dos 1849 oócitos maturados, no experimento I, 1451 clivaram resultando numa taxa de 78,5%. Os percentuais de clivagem verificados (Tabela 1) não foram diferentes (P>0,05) entre os tratamentos, demonstrando que a centrifugação (Tratamento 1), bem como a citocalasina B (Tratamento 2), ou a associação de ambos (Tratamento 3) não tiveram efeito negativo sobre a clivagem. Resultados semelhantes também foram relatados por SONGSASEN et al. (1997), os quais obtiveram 72,5% de clivagem no grupo testemunha e 85,5% no grupo exposto por 10 minutos a 7,5 μg/ml de citocalasina B e posterior centrifugação (2200 g) por 5 minutos, a 35 o C. O fato de não ter sido constatada diferença na taxa de clivagem, entre os oócitos não tratados (T1 e T4) e os tratados com citocalasina B (T2 e T3), confirma a observação de DOBRINSKY (1996) de que a despolimerização causada por esta substância pode ser reversível após a diluição, reidratação e cultivo subseqüente. A sensibilidade ao resfriamento dos oócitos bovinos parece estar relacionada ao elevado conteúdo lipídico e conseqüente menor densidade de flutuação dos mesmos. LEIBO et al. (1995) reconstituíram mórulas de blastômeros concentrados em lipídios, livres de lipídios e controle e verificaram densidades de 1110, 1243 e 1187, respectivamente. Estas mórulas, quando submetidas ao resfriamento, apresentaram 0, 40 e 0% de sobrevivência, respectivamente. Estes resultados sugerem que as gotas lipídicas intracelulares são responsáveis pela diminuição da densidade de flutuação e pelo aumento da sensibilidade ao resfriamento dos oócitos e embriões bovinos produzidos in vitro. Segundo OTOI et al. (1997), a polarização das gotas lipídicas do citoplasma, por meio da centrifugação, poderia aumentar a resistência ao congelamento dos oócitos e embriões. O percentual de desenvolvimento até blastocisto não foi significativamente diferente entre os tratamentos. Da mesma forma, o percentual de blastocistos eclodidos, 11 dias após a inseminação foi semelhante entre os tratamentos (Tabela 2). NAGASHIMA et al. (1996) obtiveram taxas semelhantes de fecundação com oócitos suínos que tiveram os lipídios removidos (44%) e centrifugados (40%), muito embora apenas os primeiros tenham se desenvolvido até o estádio de 8 células ou mórula. Entretanto, o desenvolvimento embrionário até blastocisto, bem como o percentual de eclosão, semelhantes para todos os grupos testados, observados no experimento II do presente trabalho, demonstram que os oócitos bovinos, diferentemente dos oócitos suínos, são capazes de suportar a centrifugação, sem perder sua capacidade de desenvolvimento após a fecundação. Embora o conteúdo lipídico tenha sido considerado um fator que interfere na resistência à exposição a baixas temperaturas, a polarização dos lipídios pela centrifugação tem apresentado tanto efeitos negativos quanto positivos no congelamento de oócitos ou embriões bovinos. Apesar da taxa de clivagem e a produção de blastocistos ter sido maior para o grupo de oócitos que sobreviveram ao congelamento após a centrifugação, OTOI et al. (1997) verificaram menor índice de sobrevivência após o descongelamento de oócitos bovinos submetidos à centrifugação. TOMINAGA et al. (1998) mostraram que o grau de polarização dos lipídios após a centrifugação, sem micromanipulação, interfere no sucesso do congelamento, pois a remoção da maioria dos lipídios proporcionou maiores taxas de desenvolvimento até blastocisto do que a remoção parcial, tanto no estádio de zigoto como no de 2-células. No presente estudo, não houve diferença significativa (P>0,05) na taxa de clivagem e de blastocistos entre as diferentes concentrações de citocalasina B (Tabela 3). O fato de a concentração de 45 μg/ml não ter sido prejudicial ao desenvolvimento embrionário, após FIV, sugere a possibilidade de se efetuar a exposição dos oócitos a concentrações mais elevadas de citocalasina antes do congelamento, o que poderá resultar em maior estabilização do citoesqueleto e, talvez, menor sensibilidade à criopreservação. MARTINO et al. (1996) demonstraram que o tempo de exposição a baixas temperaturas tem uma influência significativa no posterior desenvolvimento dos oócitos bovinos. Estes autores obtiveram um alto desenvolvimento até o estádio de blastocisto (15%), utilizando volumes extremamente reduzidos da solução de congelamento, o que permitiu a obtenção de velocidades de congelamento bem mais rápidas do que as obtidas com 46

5 Tabela 1 - Taxa de clivagem de oócitos bovinos maturados e fecundados in vitro após centrifugação e exposição à citocalasina B Tratamentos Oócitos Clivados n n % Centrifugação ,1 Citocalasina B (7,5μ g/ml) ,5 Citocalasina B (7,5μ g/ml) + Centrifugação ,1 Controle ,1 Total ,5 (P>0,05) Tabela 2 - Desenvolvimento embrionário após a fecundação in vitro de oócitos bovinos submetidos à centrifugação e exposição à citocalasina B Tratamentos Oócitos n C liv a d o s n (%) Embriões Blastocistos n (% ) Eclodidos n (% ) Cen trifu g ação (78,1) 52 (34,0) 17 (11,1) C ito c a la s in a B (7,5μ g/ml) (80,4) 43 (26,2) 19 (11,6) Citocalasina B ( 7,5μ g/ml) + Centrifugação (76,4) 46 (28,4) 15 (9,25) Controle (80,2) 54 (31,0) 22 (12,6) Total (78,8) 195 (29,8) 73 (11,1) (P>0,05) Tabela 3 - Clivagem e desenvolvimento embrionário após a fecundação in vitro de oócitos bovinos submetidos a concentrações crescentes de Citocalasina B Citocalasina B (μ g/ml) Oócitos Cultivados Clivados (% ) Blastocistos (% ) (P>0,05) 7, (70,5) 33 (16,6) (73,5) 31 (14,7) (66,6) 28 (15,2) Total (70,3) 92 (15,5) os protocolos utilizados anteriormente. Trabalhando com palhetas estiradas (OPS), VAJTA et al. (1998) também conseguiram aumentar a produção de blastocistos (25%) após a vitrificação de oócitos bovinos com pequeno volume de solução e velocidades extremamente rápidas. Embora os oócitos submetidos à centrifugação e/ou à citocalasina não tenham sido submetidos ao congelamento, no presente estudo, os percentuais de clivagem e desenvolvimento embrionário semelhantes ao grupo controle, reforçam a expectativa de que oócitos bovinos submetidos à exposição à citocalasina B e/ou à centrifugação possam aumentar sua resistência mediante baixas temperaturas, facilitando o processo de criopreservação. Seria importante avaliar se a exposição à citocalasina ou a centrifugação poderiam aumentar o desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto, para os oócitos submetidos ao congelamento, sobretudo com protocolos (Martino et al., 1996; Vajta et al., 1998), nos quais foram 47

6 demonstrados os efeitos benéficos de velocidades extremamente rápidas. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao National Hormone and Pituitary Program - Baltimore, Md, USA, pela gentil cedência do LHb para o desenvolvimento desta pesquisa. Ao Frigorífico Silva pelo importante apoio na doação de ovários bovinos. Também agradecemos à Dra. Eunice Schossler Schmidt da Fundação Bradesco e ao Dr. Neimar Corrêa da Pecplan ABS - Rosário do Sul, RS, pela assistência técnica e imensurável apoio na preparação do sêmen bovino utilizado nos experimentos. REFERÊNCIAS ARAV, A.; ZERON, Y.; LESLIE, S.B.; BEHBOODI, E.; ANDERSON, G.B.; CROWE, J.H. Phase transition temperature and chilling sensitivity of bovine oocytes. Cryobiology, v. 33, n. 6, p , AZAMBUJA, R.M.; KRAEMER, D.C.; WESTHUSIN, M.E. Effect of low temperatures on in-vitro matured bovine oocytes. Theriogenology, v. 49, p , DOBRINSKY, J.R.; OVERSTROM, E.W.; DUBY, R.T.; JOHNSON, L.A. Effect of cytoskeletal stabilization on the development of bovine embryos cryopreserved by vitrification. Theriogenology, v. 43, n. 1, p Abstract. DOBRINSKY, J.R. Cellular approach to cryopreservation of embryos. Theriogenology, v. 45, p , De LOOS, F.; van VLIET, C.; van MAURIK, P.; KRUIP, T.A.M. Morphology of bovine immatures bovine oocytes. Gamete Research, v. 24, p , HOCHI, S.; KIMURA, K.; ITO, K.; HIRABAYASHI, M. Effect of nuclear stages during in vitro maturation on the survival of bovine oocytes following vitrification. Theriogenology, v. 47, n. 1, p. 345, HEYMAN, Y.; SMORAG, Z., KATSKA, L.; VINCENT, C.; GARNIER, V.; COGNIE, Y. Influence of carbohydrates, cooling and rapid freezing on viability of bovine non-maturated oocytes or 1-cell fertilized eggs. Cryo- Letters, v. 7, p , LEIBO, S.P.; McGRATH, J.J.; CARVALHO, E.G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology, v. 15, p , LEIBO, S.P.; POLLARD, J.W.; MARTINO, A. Chilling and freezing sensitivity of reassembled in vitro-derived bovine oocytes. Theriogenology, v. 43, n. 1, p. 265, Abstract. LIM, J.M.; FUKUI, Y.; ONO, H. Developmental competence of bovine oocytes frozen at various maturation stages followed by in vitro maturation and fertilization. Theriogenology, v. 37, n. 2, p , MARTINO, A.; POLLARD, J.W.; NAKAGAWA, A.; LEIBO, S.P The kinetics of chilling sensitivity of bovine oocytes cooled to non-physiological temperatures. Theriogenology, v. 43, n. 1, p Abstract. MARTINO, A.; SONGSASEN, N.; LEIBO, S.P. Development into blastocysts of bovine oocytes cryopreserved by ultra-rapid cooling. Biology of Reproduction, v. 54, p , MOHR, L.R.; TROUNSON, A.O. Structural changes associated with freezing of bovine embryos. Biology of Reproduction, v. 25, p , NAGASHIMA, H.; KASHIWAZAKI, N.; ASHMAN, R.; GRUPEN, C.; SEAMARK, R.F. Recent advances in cryopreservation of porcine embryos. Theriogenology, v. 41, n. 1, p , 1994a. NAGASHIMA, H.; KASHIWAZAKI, N.; ASHMAN, R.J.; GRUPEN, C.G.; SEAMARK, R.F.; NOTTLE, M.B. Removal of cytoplasmic lipid enhances the tolerance of porcine embryos to chilling. Biology of Reproduction, v. 51, p , 1994b. NAGASHIMA, H.; KUWAYAMA, M.; GRUPEN, C.G.; ASHMAN, R.J.; NOTTLE, M.B. Vitrification of porcine early cleavage stage embryos and oocytes after removal of cytoplasmic lipid droplets. Theriogenology, v. 45, n. 1, p. 180, Abstract. OTOI, T.; YAMAMOTO, K.; KOYAMA, N.; TACHIKAWA, S.; MURAKAMI, M.; KIKKAWA, Y.; SUZUKI, T. Cryopreservation of mature bovine oocytes following centrifugation treatment. Cryobiology, v. 34, p , SAS Institute Inc., SAS/STAT User s Guide, Version 6, 4.ed., v.2, Cary, NC: SAS Institute Inc., 846p. SONGSASEN, N.; RHO, G.J.; LEIBO, S.P. Effect of centrifugation on developmental competency of chilled bovine oocytes. Cryobiology, v. 35, n. 4, p. 352, Abstract. VAJTA, G.; HOLM, M.; BOOTH, P.J.; JACOBSEN, H.; GREVE, T.; CALLESEN, H. Open Pulled Straw (OPS) vitrification: a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos. Molecular Reproduction and Development, v. 51, p ,