REGISTRO: Protocolo nº 1e 2- Protocolo de FIV-ICSI e Protocolo de FIV-ICSI Avaliação Individual.

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1 REGISTRO: Protocolo nº 1e 2- Protocolo de FIV-ICSI e Protocolo de FIV-ICSI Avaliação Individual. A. OBJETIVO/ APLICAÇÃO CLÍNICA Executar as Técnicas Laboratoriais de Fertilização in vitro (ICSI) respeitando rigorosamente todas as etapas, tempos limites da cada passo, a ordem do procedimento e demais recomendações a fim de manter altos padrões de Controle de Qualidade e bons resultados. B. RESPONSABILIDADE Unidade de Reprodução Humana- HFE (Diretor de Laboratório) C. ALCANCE Equipe técnica de enfermagem, Estagiários e Embriologistas. D. EXECUÇÃO: Embriologistas. E. MATERIAL NECESSÁRIO: Tubos de 14ml fundo redondo Tubos de 15ml, fundo cônico Tubos de 5ml fundo redondo Coletor estéril Pipeta Paster desc. Grad. Estéril Pipetas Pasteur 14 cm de vidro Ponteiras de 0,2-10ul. Ponteiras de 1-200ul. Ponteiras de ul Filtros 0.22um Pipetas de Injeção Pipetas de fixação Placas ICSI- 60mm Placas 100x 20 mm Placa de 60mm, com duplo furo 1

2 Placas 60x15mm Placas 35x10mm Placas 4 Poços Placas 4 Poços (Won) e/ou IVF Corral Embryo Pipetas volumétricas de 5ml Seringas 1,0 ml Seringas 3,0 ml Seringas 20,0 ml Cateter de Wallace difícil Agulhas p/ Punção Folic. c/ sistema Luva de procedimento ñ estéril Luva de procedimento estéril Reagentes: H-HTF All Grade 45% All Grade 90% HTF Global PBS PVP SSS OIL HYASE Equipamentos: Cabine de Fluxo Laminar Cabine Biológica Microscópio Eclipse E200 Estereomicroscópio Placas Aquecidas Aquecedores de Tubos Blocos Aquecedores Estante para tubos cônicos Centrífuga Câmara de Makler Banho Maria Pipetador automático (Macropipetador) Pipetas Ajustáveis de volumes diferentes 2

3 F. DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES: 1. DIA ANTERIOR A PUNÇÃO: Recomenda-se deixar preparados aquecidos e/ou equilibrados, em incubadora sem e com tensão de CO2, os meios para coleta, fertilização dos oócitos e cultivo embrionário (PBS, H-HTF10%, HTF 10% e Global 10%), conforme POP nº DIA DA ASPIRAÇÃO FOLICULAR: Preparo dos Materiais a) Ao entrar no laboratório de FIV/ICSI verificar temperatura e CO2 da Incubadora; b) Ligar todos os equipamentos utilizados: Fluxo Laminar, Cabine Biológica, placas aquecidas,...; c) Colocar no Banho-maria, banho-seco ou sobre a placa aquecida o copo coletor contendo PBS; d) Colocar sobre a placa aquecida uma placa de 100 x 20 mm (para captura dos oócitos), uma placa de 60mm com duplo Furo (para deposição dos complexos cúmulos oócitos- acrescentar H-HTF 10%- 3mLsó no momento da punção) e uma seringa de 20 ml ( abrir a embalagem só no momento da punção); e) Preparar a placa de cultivo da paciente (Placas 4 Poços- Won) com 1ml de Global 10% (dividido entre o 1º e 2º fosso), cobrir com óleo e acrescentar 1,5 ml de HTF10% na parte central. Identificar com nome e data correspondente. Ex: Nome Data HTF 10% 3

4 E/ou placa de cultivo da paciente (IVF Corral Embryo) com 120 l de Global 10% (em cada um dos dois poços centrais observando o completo preenchimento dos quadrantes) e 30 l nos 8 poços periféricos, cobrir com óleo pré-equilibrado. Identificar com nome e data correspondente. Ex: Data 120 l Fulana de. Tal 30 l Screening (Seleção do Complexo Cúmulo Oócito-CCO) a) Na sala de procedimentos, os tubos de aspiração (Tubos de 14ml fundo redondo), já com o material aspirado (líquido folicular), devem ser depositados no Pass true dentro do aquecedor de blocos ao alcance da embriologista; b) Depois de receber o tubo contendo o líquido folicular aspirado, depositar todo o conteúdo do tubo na placa de 100 x 20 mm pré-aquecida para a realização do Screening; c) Com o auxílio do Estereomicroscópio, analisar o líquido quanto à presença Complexo Cúmulooócitos (CCO), identificando-os um a um e transferindo com a ajuda de uma pipeta Pasteur para a placa de poço central pré-aquecida e agora com Hepes 10%. Lavá-los 2 ou 3 vezes no compartimento marginal e transferi-los ao compartimento central. Armazenar no máximo 10 CCOs nesta placa e transferi-los para o um dos poços da placa de 4 poços contendo HTF10%; d) Com o auxílio da seringa de 20mL aspirar o líquido folicular da placa de 100 x 20 mm e devolvêlo ao tubo de 14mL de fundo redondo. Repetir passos dos itens b e d se necessário; e) Indicar no painel eletrônico da sala de procedimentos a quantidade de CCOs encontrados; f) No momento em que for identificada a presença de CCOs solicitar na recepção a coleta do sêmen do cônjuge da paciente; g) Guardar na Incubadora a placa de 4 poços contendo os CCOs em meio HTF10% até o momento da desnudação (retirada do cúmulo- no mínimo 2 horas após a aspiração). Durante este período preparar o sêmen do cônjuge da paciente conforme POP nº1. 4

5 Parâmetros Morfológicos Utilizados para Verificar a Maturidade Oocitária Antes de realizar a ICSI, avaliar a maturação dos CCOs de acordo com os aspectos morfológicos da seguinte Classificação: Imaturo GI - Cúmulo geralmente pequeno, com pouca filância. Corona compacta formando uma capa ao redor do oócito. Intermediário GII- Cúmulo grande, disperso e filante. Corona com início de dispersão, mas ainda formando uma capa ao redor do oócito. Maturo GIII- Cúmulo grande, disperso e filante. Corona com espaços entre as células, podendo-se ver os limites do oócito. Pós-maturo GIV- Cúmulo muito disperso, muito filante, Corona inexistente. Pode-se ver o oócito nitidamente e tbem o primeiro corpúsculo polar. (Veeck et al., 1983) 5

6 Desnudação (retirada do cúmulo) a) Após o período de 2 horas retirar do refrigerador a alíquota de Hyase (meio utilizado para desnudar) e pré-aquecer em bloco aquecido a 37ºC por 10 minutos. Preparar de acordo com POP nº12; b) Em uma placa de 4 poços, coloca-se a Hyase na 1º fossa da placa, Hepes 10% nas 2º e 3º fossas e PBS na 4º fossa. Veja no esquema. Hyase Nome Data Hepes 10% Hepes 10% PBS c) Manter os oócitos no máximo 30 segundos na 1º fossa. Realizar a desnudação através de pipetagens nas fossas seguintes. Após a desnudação, devolver os oócitos para a placa de 4 poços em HTF10% até o momento da ICSI. Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóides (ICSI) a) Antes de iniciar o preparo da placa de ICSI, colocar e ajustar as pipetas de injeção e fixação no micromanipulador do microscópio invertido; b) Para preparar a placa de ICSI- 60mm, utilizando o meio para micromanipulação Hepes+20% conforme descrito no POP nº 12. Fazer gotas de 20µl (duas para substituir por PVP-meio de imobilização dos espermatozóides) e as demais 5 l (9 gotas para depositar os oócitos). Cobrir com óleo mineral.ex: PVP PVP c) Adicionar a uma, ou nas duas gotas para selecionar espermatozóides, o sêmen pré-preparado de acordo com o POP nº 1,3,4,5,6,7 ou 8, dependendo do protocolo de preparação espermática utilizado; d) Transferir os oócitos a serem fertilizados para as gotas de injeção. Conferir a maturação e realizar a injeção dos oócitos maduros (MII); e) Transferir os oócitos injetados para a placa de cultivo (Won e/ ou IVF), lavando-os na 1º fossa contendo 0,5mL de Global 10% e posteriormente colocando-os nos micropoços da 2º fossa, contendo o mesmo meio; e/ou se a placa for IVF, lavando-os nos poços periféricos e depositando-os um em cada quadrante dos dois poços centrais. 6

7 3. DIA 1 (CHECAGEM DA FERTILIZAÇÃO): a)a checagem da fertilização deve ocorrer no período de 16-18h após a injeção; b) Avalia-se a fecundação identificando a presença de 2 pronúcleos (PN), ajustando o foco do microscópio para que todo o volume e conteúdo de cada PN sejam avaliados e classificados de acordo com os seguintes critérios: ex. resumo Escore de 4 pontos: Scott et al. (2000) Z1: 4 pontos; Z2: 3 pontos; Z3: 2 pontos; Z4: 1 ponto. c) Os corpúsculos polares também podem ser avaliados e classificados de acordo com o tamanho, distribuição, fragmentação e justaposição. A: Corpúsculos de tamanho normal, íntegros e justapostos; B: Corpúsculos de tamanho normal, íntegros e separados; C: Corpúsculos grandes(gigante) ou pequenos; D: Corpúsculos fragmentados. OBS: Outro critério utilizado para avaliar a qualidade embrionária esta baseada na formação de um halo no córtex do oócito, produto da concentração das organelas citoplasmáticas ao redor dos PN. 7

8 4. DIA 2 (AVALIAÇÃO DA CLIVAGEM- D2): Observar os pré- embriões 44-47h após a injeção e avaliar a clivagem de acordo com o seguinte critério: Características Embrionárias Pontos (1 ou 0) D2 Presença de clivagem 1 Ausência 0 Estágio Embrionário 4 células 1 Outros Estádios 0 Irregularidade celular Ausência 1 (tamanho e forma) Presença 0 Fragmentação (>20%) Ausência 1 Presença 0 Fonte: Terriou et al. (2001) OBS: A multinucleação também deve ser observada, pois esta associada com a diminuição do desenvolvimento e implantação, além de apresentar uma maior incidência de alterações cromossômicas. 5. DIA 3 (AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO- D3): Observar os pré- embriões 67-71h após a injeção e avaliar a clivagem de acordo com o seguinte critério: Classificação Características Embrionárias Pontos Grau I Embriões com blastômeros simétricos, 5 sem a presença de fragmentação, e citoplasma claro e homogêneo Grau II Embriões com blastômeros simétricos, 4 com fragmentação de 10 a 20 % Grau III Embriões com blastômeros de tamanhos 3 diferentes, zero % de fragmentação Grau IV Embriões com blastômeros assimétricos, 2 com fragmentação de 20 a 50 % Grau V Embriões com blastômeros assimétricos, com fragmentação maior que 50 % 1 L. Veeck Hsu et al

9 Aspecto embrionário para avaliação do desenvolvimento: 6. DIA 5 (SISTEMA DE GRADUAÇÃO SEQUENCIAL DO BLASTOCISTO- D5): Entre h pós- inseminação ou injeção, o blastocisto deve ter um blastocele definido, massa celular interna distinta e trofectoderma formando um aro simétrico. Grau de expansão do Bl: Blj= Blastocisto jovem- blastocele ocupa menos que a metade do volume total, a expansão não é muito notada; Bl= Blastocisto- blastocele ocupa mais que a metade do volume total, a expansão é notada e a zona pelúcida (ZP) esta afinada; Bl exp.= blastocele ocupa mais que a metade do volume total, o tamanho bem aumentado e a zona pelúcida (ZP) muito fina; Bl ecl.= trofectoderma começa a sair da ZP. 9

10 7. DIA 3 ou 5 (TRANSFERÊNCIA EMBRIONÁRIA- D3/D5): 1- Checar a evolução dos embriões e selecionar aqueles que serão transferidos; a) Seleção do(s) pré-embrião (ões) ideal (is): a.1) Zigoto: com PN Z1,Z2, pelo menos; a.2) D2: com 4 pontos ou, pelo menos com presença de 4 células, regulares e menor fragmentação; a.3) D3: os embriões que possuírem a maior pontuação e massa celular; a.4) D5: que atingirem o estádio de blastocisto no 5º dia com melhor grau de expansão. Os melhores embriões serão sem dúvida aqueles que associarem as melhores características destes aspectos. Anotar todos os dados no protocolo nº 2. b) Preparar o meio de transferência (TE) dos embriões (meio Global 30%) de acordo com POP nº 12; c) Deixar a placa de TE (placa de 60mm, com duplo furo) preparada (identificada, contendo o meio de TE e os embriões selecionados) na Incubadora; d) Manter a seringa de insulina (TERUMO-1mL) e o cateter de TE sobre a placa aquecida, até o momento da TE, momento em que as embalagens serão abertas e ambos conectados; e) Na hora da TE, juntar os embriões a serem transferidos no centro da placa pré-preparada e lavar o cateter; aspirando com o auxílio da seringa um pouco do meio de TE do compartimento central (cuidando para não aspirar os embriões) e soltando o líquido no compartimento marginal. f) Montar o cateter de TE aspirando: 1) menos de 0,1mL de ar, 2) uma quantidade menor ainda de meio, 3) ar novamente, 4) uma nova coluna de meio contendo os embriões que não deve ser superior a µl, 5) ar novamente e 6) meio. Ex: g) Rapidamente levar o cateter para a sala de TE e passá-lo através da guia já posicionada e visualizada ecograficamente até o limite indicado; h) A médica posiciona a ponta do cateter (extremidade distal) na localização adequada do fundo do útero e fixa o cateter e a guia para que nenhuma intercorrência ocorra; i) A Embriologista realiza a transferência, com a deposição do conteúdo do cateter na cavidade uterina e mantém o embolo da seringa friccionado para que o conteúdo desprenda e não retorne (durante 10 segundo), gira o cateter e começa a retirá-lo; j) Após a transferência, lavar o cateter, observando a presença ou ausência de embriões; k) Caso haja retorno de algum embrião, repetir atransferência; l) Anotar todos os dados da TE no protocolo nº 1. 10

11 G. PONTOS CRÍTICOS: Estabelecer uma ordem, metodologia para o manejo cotidiano das práticas laboratoriais; Executar todas as técnicas de forma eficiente e rápida, expondo as amostras biológicas o mínimo possível a fatores prejudiciais; Todo o procedimento deve ser realizado em capela de fluxo laminar, temperatura ambiente (23ºC - 27ºC), e exposição mínima de iluminação; Todo o procedimento deve ser realizado sob placa aquecida (37ºC); Tenha todos os materiais, ferramentas e equipamentos necessários separados antes de iniciar o procedimento; É recomendado fazer as placas de cultura pelo menos 12 horas antes dos procedimentos, deixandoas equilibrar durante este intervalo em incubação com CO2 de 5-7% (dependendo das condições particulares de cada laboratório e do ph a ser alcançado). H. AÇÕES CORRETIVAS E PREVENTIVAS: Utilizar técnicas de assepsia durante todos os procedimentos; Utilizar as ações corretivas e preventivas descritas em todos os POPs envolvidos nesta atividade. I. RESULTADO ESPERADO: Gestação Embriologista Responsável 11

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